CN110272918A - miR-34a诱导沉默基因表达载体的构建及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了miR‑34a诱导沉默基因表达载体的构建，包括miR‑34a诱导沉默基因表达载体，其使用位于外源目的基因表达盒3’端非编码区的miR‑34a诱导沉默元件控制目的基因的表达，以获得针对miR‑34a表达阴性细胞的靶向性；本发明还公开了miR‑34a诱导沉默基因表达载体的应用，miR‑34a诱导沉默基因表达载体携带具有治疗作用的外源基因，其用于制备癌症基因治疗中使用的基因载体或药物；本发明应用于制备更安全高效的用于肿瘤基因治疗的载体和药物。

Description

miR-34a诱导沉默基因表达载体的构建及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及miR-34a诱导沉默基因表达载体的构建及其应用。
技术背景
小分子核糖核酸(microRNA)是一类长度约为20～25个核苷酸的单链非编码RNA，成熟的microRNA结合于RNA诱导沉默复合体(RISC)中，能以包含2-8个碱基的种子序列配对结合于同源的mRNA 3’端非编码区，当种子序列与目标基因mRNA的靶序列完全配对时可诱导mRNA降解；当不完全配对时可抑制mRNA翻译，以此方式对转录后靶基因的表达发挥负调控作用。
miR-34a是一个高度保守的，在人体所有组织中被广泛表达的microRNA，它通过控制参与细胞老化、凋亡、生长因子信号传导、细胞迁移、细胞周期G1停留等诸多与癌症产生过程密切相关的因子的表达发挥重要的抑癌作用。以p53/miR-34a/Sirt1路径为例，包含成熟mirR-34a-5p的RISC能够通过不完全配对结合Sirt1信使RNA上的3’端非翻译区抑制Sirt1的翻译，从而抑制Sirt1蛋白催化的p53抑癌蛋白去乙酰化失活(图1)(PNAS.105(36):13421-6.)。
启动子甲基化导致的miR-34a表达沉默以及纯合性或杂合性的miR-34a所在的1p36.23(1号染色体长臂3区6带)片段缺失经常发生于多种不同类型的癌细胞中。根据2008年的发布一项大规模筛查：(19/24；79.1％)的原发性前列腺癌，(6/24；25％)的乳癌，(7/24；29.1％)的肺癌，(3/23；13％)的肠癌，(3/14；21.4％)的肾癌，(2/6；33.3％)胆囊癌，(3/19；15.7％)的胰脏癌，(19/44；43.2％)黑色素瘤细胞株以及(20/32；62.5％)的原发性黑色素瘤细胞中发现miR-34a的启动子区域CpG岛甲基化导致miR-34a表达沉默，显示miR-34a表达阴性是一项非常广泛的肿瘤标记(Cell Cycle.7(16):2591-600.)。
在诸多潜在的肿瘤疗法中，选择性的缺乏使其在抑制癌细胞的同时，也会对正常细胞造成损伤，是制约临床应用的主要因素之一。重组腺相关病毒载体介导的单纯疱疹病毒胸苷激酶基因/更昔洛韦(rAAV-HSVtk/GCV)系统是一套比较成熟的肿瘤基因治疗的方法，其可通过依赖病毒血清型表现的特定组织嗜性，HSVtk基因结合GCV发挥的细胞复制毒性以及采用组织/癌细胞特异表达的自杀基因启动子获得对癌细胞的特异性。而寻找新的具有肿瘤靶向的载体元件使改进现有重组腺相关病毒载体介导基因治疗的途径之一。2015年，伦敦大学学院的AC Nathwani教授领导的实验通过将miR-122a反义序列插入到rAAV-HSVtk/GCV基因治疗系统HSK1tk基因的3’端非编码区成功地在裸鼠实验中使此系统获得了针对miR-122a表达阴性肝癌细胞额外的靶向特异性(Hum Gene Ther.26(2):94-103.)。
然而，到目前为止，针对miR-34a表达阴性癌症的实验和治疗思路主要集中于通过帮助沉默的miR-34a恢复表达或向细胞转染miR-34a前体或模拟物来抑制癌细胞发展的；而以miR-34a表达阴性为靶点杀灭癌细胞在现有技术和思路中尚未见报道。
发明内容
为了利用肿瘤细胞中广泛存在的miR-34a低表达水平，本发明公开应用于制备更安全高效的用于肿瘤基因治疗的载体和药物的miR-34a诱导沉默基因表达载体的构建及其应用。
为了实现上述目的，本发明所提供的技术方案是：miR-34a诱导沉默基因表达载体的构建，包括miR-34a诱导沉默基因表达载体，其使用位于外源目的基因表达盒3’端非编码区的miR-34a诱导沉默元件控制目的基因的表达，以获得针对miR-34a表达阴性细胞的靶向性。
作为本发明进一步限制地，所述miR-34a诱导沉默基因表达载体衍生自的裸DNA、脂质体、蛋白质多肽及重组慢病毒载体、重组腺病毒载体、重组腺相关病毒基因载运体。
作为本发明进一步限制地，所述miR-34a诱导沉默基因表达载体包含miR-34a诱导沉默元件，其为miR-34a诱导沉默复合体所识别的靶序列，含有一段或若干段编码hsa-miR-34a-3p的反义序列，hsa-miR-34a-5p的反义序列或其他含有hsa-miR-34a-5p种子反义序列5’-CAC(U/T)GCC-3’的序列。
作为本发明进一步限制地，所述miR-34a诱导沉默基因表达载体衍生的病毒载体，为抑制其在生产时的降解，挑选miR-34a表达阴性细胞作为生产载体的寄主细胞或者通过加入mir-34a抑制剂或其他方法降低寄主细胞内的miR-34a水平。
作为本发明进一步限制地，miR-34a诱导沉默基因表达载体携带具有治疗作用的外源基因，其用于制备癌症基因治疗中使用的基因载体或药物。
作为本发明进一步限制地，所述miR-34a诱导沉默基因表达载体衍生的基因载体或药物用于治疗miR-34a表达阴性癌症，其癌细胞miR-34a启动子区域CpG岛甲基化，p53表达异常和/或miR-34a所在的1p36.23染色体片段缺失导致其miR-34a表达水平显著低于周围正常细胞miR-34a表达水平。
作为本发明进一步限制地，所述miR-34a诱导沉默基因表达载体衍生的基因载体或药物使用包括各种类型的核酸细胞导入方法导入细胞。
本发明的有益效果：本发明与现有癌症基因治疗中所使用的基因载体载体技术相比具有如下优点：
1.在基因表达载体中引入一段用于控制基因表达的序列元件，用于优化现有基因表达载体肿瘤靶向性，专注减小其脱靶副作用，其中不涉及开发新的小分子类药物，不涉及形成新代谢产物，作用机理明确，容易实现，安全性和有效性都比较容易预见；
2.miR-34a在大多数人体正常细胞尤其是在成人干细胞中都有表达，因此大多数正常细胞都能抑制miR-34a诱导沉默基因表达载体中目的基因的表达，而且miR-34a诱导表达沉默治疗基因的策略不依赖细胞复制为靶向标志物，可较全面地减小以往基因治疗中经常出现的脱靶副作用，提升病人对治疗的耐受力；
3.miR-34a表达阴性作为一肿瘤标记，在几乎所有癌症类型种都发现有相当的出现比例，这预示着使用miR-34a诱导表达沉默的基因治疗可针对多种不同癌症，具有广泛应用前景；
4.在以往的病毒血清型的细胞嗜性，肿瘤特异性启动子和外源目的基因作用方式之外，通过在与上述三者互不相干的机理层面——miRNA诱导表达沉默来为基因疗法提供靶向性的途径，因而miRNA诱导表达沉默可与其他靶向策略兼容，易于联合使用，发挥协同效应；
5.无启动子miR-34a诱导沉默腺相关病毒载体，rAAV-MCS-34a5pi8系统，允许用户根据使用需要，自主整合入各种目的基因、启动子及其他基因元件以实现不同功能，为日后肿瘤基因治疗系统的开发和研究提供了一个广阔的技术平台。
附图说明
图1是miR-34a在人体细胞内发挥抑癌和抗病毒miRNA(Avirmir)双重作用的示意图。
图2是包含以若干重复miR-34a-5p的反义序列编码为例的miR-34a诱导沉默元件的基因表达载体示意图。
图3是本发明实施例中所涉及到的三种miR-34a诱导沉默基因表达载体质粒图谱示意图。
具体实施方式
下面结合实施方案和操作过程对本发明作进一步说明，但本发明的保护范围不仅限于下述的实施例，也应包括根据miR-34a诱导沉默基因表达载体的思路设计其他基因表达载体，其特点为基因表达载体外源基因3’非编码去含有miR-34a诱导沉默复合体的识别序列可用于沉默外源基因的表达，而组成上述载体的其他元件和构建方法容许有诸多变形且均在本发明的保护范围之内。
如图2-3所示，miR-34a诱导沉默基因表达载体的构建，包括miR-34a诱导沉默基因表达载体，其使用插入于其外源目的基因表达盒3’端非编码区的miR-34a诱导沉默元件控制目的基因的表达，以获得针对miR-34a表达阴性细胞的靶向性。
所述miR-34a诱导沉默基因表达载体可以衍生自的裸DNA、脂质体、蛋白质多肽及重组慢病毒载体、重组腺病毒载体、重组腺相关病毒的基因载运体。
所述miR-34a诱导沉默基因表达载体包含miR-34a诱导沉默元件，其为miR-34a诱导沉默复合体所识别的靶序列，含有一段或若干段编码hsa-miR-34a-3p的反义序列，hsa-miR-34a-5p的反义序列或其他含有hsa-miR-34a-5p种子反义序列5’-CAC(U/T)GCC-3’的序列。
所述miR-34a诱导沉默基因表达载体衍生的病毒载体，为抑制其在生产时的降解，挑选miR-34a表达阴性细胞作为生产载体的寄主细胞或者通过加入mir-34a抑制剂或其他方法降低寄主细胞内的miR-34a水平。重组所述miR-34a诱导沉默基因表达载体的携带用于癌症治疗的基因，并通过位于3’端非编码区的miR-34a诱导沉默元件抑制上述基因在miR-34a表达阳性细胞中的表达。
miR-34a诱导沉默基因表达载体携带具有治疗作用的外源基因应用于制备癌症基因治疗中使用的基因载体或药物。
所述miR-34a诱导沉默基因表达载体衍生的基因载体或药物用于治疗miR-34a表达阴性癌症，其癌细胞miR-34a启动子区域CpG岛甲基化，p53表达异常和/或miR-34a所在的1p36.23染色体片段缺失导致其miR-34a表达水平显著低于周围正常细胞miR-34a表达水平。
所述miR-34a诱导沉默基因表达载体衍生的基因载体或药物使用包括各种类型的核酸细胞导入方法导入细胞。
含有miR-34a诱导沉默元件的miR-34a诱导沉默基因表达载体系统。
miR-34a诱导沉默元件是一段或若干段重复的miR-34a诱导沉默复合体的靶序列或其编码DNA片段，以供细胞内miR-34a诱导沉默复合体识别并降解含有此元件的转录产物。
靶序列可以是，如SEQ ID NO:1，2所示，编码miR-34a-3p反义序列、miR-34a-5p反义序列或是其他含有5’-CACUGCC-3’序列片段的序列。
miR-34a诱导沉默元件位于miR-34a诱导沉默基因表达载体系统中的多克隆位点与poly(A)加尾信号元件之间，故当插入有插入目的基因后，miR-34a诱导沉默元件位于目的基因表达盒的3’端非编码区。以重组miR-34a-5p诱导沉默的病毒表达载体为例，其结构如图2所示。
所述含有miR-34a诱导沉默元件的miR-34a诱导沉默基因表达载体包括各种类型的核酸细胞导入载体，其可以是但不仅限于如裸DNA/RNA、脂质体、蛋白质多肽等非病毒载体以及如慢病毒、腺病毒、腺相关病毒等病毒载体。
所述miR-34a诱导沉默基因表达载体可通过miR-34a诱导沉默元件感知细胞内miR-34a表达水平，能选择性地在miR-34a低表达的细胞中表达其目的基因，而在miR-34a正常表达或过表达的细胞中抑制其目的基因的表达。
更进一步地，本发明还提供了较佳的miR-34a诱导沉默重组腺相关病毒载体系统构建方法并以重组腺相关病毒rAAV2-HSV1tk-34a5pi8(如图3所示)为例说明此方法在制备可用于基因治疗的溶瘤病毒载体方面的应用，其包含如下步骤：
1.构建miR-34a诱导沉默重组腺相关病毒载体质粒骨架：取一现有腺相关病毒载体质粒，移除其原有启动子和目的基因并在原处重建多克隆位点(MCS)，合成miR-34a诱导沉默元件并插入到MCS与poly(A)加尾信号元件之间。
2.构建目的基因表达盒：视用途选择组成型启动子如CMV、SV40等启动子或肿瘤特异诱导型启动子如Tet-On、hTERT、CXCR-4、癌胚抗原等启动子克隆至上述MCS。将具有肿瘤治疗或标记功能的外源基因克隆至上述启动子之后miR-34a诱导沉默元件之前。所述的具有肿瘤治疗或标记功能的外源基因视用途可以是但不限于免疫应答基因、报告基因、细胞凋亡或自杀基因等，比如EGFP、Luciferase、TRAIL、HSV1tk。视具体用途亦可选择整合入其他表达控制元件，如内含子、内部核糖体进入位点或其他miRNA诱导沉默元件等。继而得到miR-34a诱导沉默联合重组腺病毒载体质粒。
3.病毒制备：选择适用的病毒血清型及与之对应的rep-cap质粒与转移质粒，通过三质粒共转染法生产重组腺病毒，生产过程采用miR-34a低表达的寄主细胞或者通过加入mir-34a抑制剂或其他方法降低寄主细胞内的miR-34a表达水平，以抑制miR-34a诱导沉默病毒载体在生产过程中的降解。
由于miR-34a表达阴性是一个广泛的肿瘤细胞标记，此处采用了含有编码若干重复的hsa-miR34a-5p反义序列的miR-34a诱导沉默元件34a5pi8以利用正常细胞内miR-34a诱导沉默复合体降解外源目的基因的转录产物，而使外源目的基因的表达限制在miR-34a表达阴性的肿瘤细胞中，其作为一种具有潜在肿瘤靶向性的载体元件，可以用于开发肿瘤基因治疗的载体或药物。
本发明利用了2型腺相关病毒载体(AAV2)和CMV启动子以确保发挥复制毒性的自杀基因HSV1tk高效的转染和足量的转录，联合miR-34a诱导沉默元件构建了可用作溶瘤病毒的重组腺相关病毒。所述miR-34a诱导沉默基因表达载体衍生的基因载体或药物中miR-34a诱导沉默元件亦可联合其他包括癌细胞特异表达启动子、病毒载体特定血清型、具有选择性抗肿瘤特性的目的基因或其他miRNA诱导沉默元件共同提供针对特定肿瘤细胞系的靶向特异性。
实施例1：
miR-34a诱导3’端非编码区包含miR-34a-5p反义序列的表达盒表达沉默。
1.合成miR-34a诱导荧光素酶报告载体；
操作如下：
使用上海生工合成的以下序列的寡核苷酸，1：1混合后使用PCR仪退火。
5’-CTGGCAGTGTCTTAGCTGGTTGTGAA-3’；
5’-CTAGTTCACAACCAGCTAAGACACTGCCAGAGCT-3’
Ambion的pMIR-REPORT Luciferase vector载体经SacI，SpeI酶切提取后与上述退火产物连接。所得miR-34a诱导荧光素酶报告载体中荧光素酶的3’端非编码区含有一段编码miR-34a-5p反义序列(SEQ ID NO:2)。其中miR-34a-5p序列依据miRBase:MI0000268设计。
2.合成对照荧光素酶报告载体。
操作如下：
合成以下引物：
5’-CAATGGCCATGAACTAGTGCGCAGCTTTCAT-3’；
5’-TCATGGCCAGCTAAGACACTGCCAGAG-3’
使用上述引物以上述miR-34a诱导荧光素酶报告载体为模板通过PCR扩增6.5kb的DNA片段，PCR反应退火温度取68℃，提取扩增产物后进行MscI酶切并连接。连接产物经BstUI酶切，转染DH10细胞后进行耐氨苄青霉素筛选，扩增并提取质粒。得到荧光素酶表达盒3’端非编码区含有“5‘-TGGCAGTGTCTTAGCTGGCCAT-3”序列的荧光素酶报告载体，其中斜体代表由此步骤引入的miR-34a反义序列突变。
3.荧光素酶表达检测。
HCT116细胞以含10％胎牛血清的McCoy’s 5a培养液培养，转染前以5x104个/孔接种于24孔板中隔夜，分六组，分别使用Invitrogen的脂质体2000转染试剂(Lipofectamine2000Reagent)以每孔200ng的miR-34a诱导荧光素酶报告载体或对照荧光素酶报告载体，或与50pmol购自上海吉玛制药技术有限公司的miR-34a模拟物或miR-34a抑制剂混合经行转染。转染48小时后，使用Promega公司的荧光素酶检测系统检测细胞内荧光素酶活性。同时回收并裂解细胞，使用abcam公司的Anti-Firefly Luciferase antibody为一抗，GoatAnti-Rabbit IgG H&L(HRP)为二抗，采用西方墨点法检测荧光素酶表达量。
较之于受miR-34a抑制剂转染的HCT116细胞，在受miR-34a模拟物转染的HCT116细胞中，miR-34a诱导荧光素酶报告载体的荧光素酶表达量与荧光素酶信号强度都显著下降；而对照荧光素酶报告载体的荧光素酶表达量与荧光素酶信号强度无明显变化则可证实细胞内miR-34a可诱导以miR-34a-5p反义序列为编码序列的miR-34a诱导沉默元件对其所在表达盒中荧光素酶的表达发挥抑制作用。
实施例2：
较佳的miR-34a诱导沉默腺相关病毒载体系统rAAV-MCS-34a5pi8promoterless的构建方案；
如图3所示的无启动子miR-34a诱导沉默腺相关病毒载体载体质粒pAAV-MCS-34a5pi8promoterless，其基于Stratagene公司pAAV-MCS载体的构建，包括如下步骤:
1.移除pAAV-MCS载体的CMV启动子与内含子，其操作为:
通过PCR以pAAV-MCS表达载体为模板扩增3.5kb的DNA片段并通过此步骤在CMV启动子上游插入CalI内切酶识别序列，所用到的引物序列为：
5’-ACCATCGATTGAATTCCCCGGGGATCCTCTA-3’；
5’-AAAATCGATGCGGCCGCAGGAACCC-3’
所得扩增产物经CalI酶切后提取并连接。连接产物经BstUI酶切，转染DH10细胞后进行耐氨苄青霉素筛选，扩增并提取质粒。通过NotI酶切电泳检验产物，得到2887，594bp条带表示CMV启动子与内含子已被移除。
2.MCS中插入PmeI和SpeI酶切位点，去除原有HindIII酶切位点。操作为：
合成以下序列的寡核苷酸，1：1混合后使用PCR仪退火。
5’-TCGACCTGTTTAAACCTCGAGCACTAGTGCTCGAGA-3；
5’-GATCTCTCGAGCACTAGTGCTCGAGGTTTAAACAGG-3’
所得退火产物与步骤2所得质粒经BglII与SalI双酶切提取质粒后产物连接，转染DH10细胞后进行耐氨苄青霉素筛选，扩增并提取质粒。通过PvuI与PmeI双酶切电泳检验产物，得到2024，1453bp条带表明酶切位点插入成功。
3.以SV40多聚腺苷酸化信号(SV40pA)替换原hGHpA多聚腺苷酸化信号。由上海生工合成寡核苷酸，1：1混合后使用PCR仪退火。
5’
-GATCTAAGCTTAATAAAGGATCTTTTATTTTCATTGGATCTGTGTGTTGGTTTTTTGTATGCGGCCGCTTG-3’；5’
-GTTACCAAGCGGCCGCATACAAAAAACCAACACACAGATCCAATGAAAATAAAAGATCCTTTATTAAGCTTA-3’，所得退火产物与步骤3所得质粒经BglII与BstEII双酶切提取后产物连接，转染DH10细胞后进行耐氨苄青霉素筛选，扩增并提取质粒。通过NotI酶切电泳检验产物，得到2887，138，30bp条带表明转录终止信号替换成功。
4.3端非编码区中插入miR-34a诱导沉默元件。步骤为：
由上海生工合成序列如下的双链DNA片段，其中含包含八段重复反义hsa-miR-34a-5p序列(方框中)的miR-34a诱导沉默元件34a5pi8如SEQ ID NO:3所示，以及两翼延伸的HindIII靶序列(下划线)。
步骤3所得质粒经HindIII酶切后使用Anza碱性磷酸酶的去磷酸化处理，之后与经HindIII酶切的上述连接，转染DH10细胞后进行耐氨苄青霉素筛选，选取若干菌落，分别扩增并提取质粒。
5.使用以下引物测序验证所得提取产物为pAAV-MCS-34a5pi8 promoterless质粒。
R-ITR-F:5’-CCTGCAGGCAGCTG-3’；
L-ITR-R:5’-CTGCAGGCAGCTGC-3’
实施例3：
较佳的重组miR-34a诱导沉默腺相关病毒系统rAAV-CMV-Luc-34a5pi8(如图3所示)及其构建方法和效用测试。
1.使用以下引物自pMIR-REPORT Luciferase vector中克隆含CMV启动子与荧光素酶的2.3kb片段至pAAV-MCS-34a5pi8载体系统的SpeI与SalI酶切位点之间，得到pAAV-CMV-Luc-34a5pi8质粒。
5’-CCCGTCGACTGAATTCAAGGTACCAGATC-3’
5‘-ATAACTAGTGCGCAGCTTTCATCACTCGAGCAATTTG-3’
作为对照，以HindIII酶切pAAV-CMV-Luc-34a5pi8质粒后提取质粒并连接，得到移了除miR-34a诱导沉默元件的pAAV-CMV-Luc质粒。
2.脂质体2000转染试剂与100pmol上海吉玛制药技术有限公司的miR-34a抑制剂混合转染AAV293细胞，5小时后换液，继续培养48小时。
3.通过三质粒共转染磷酸钙沉淀法生产腺相关病毒载体，操作如下：步骤2所得AAV293细胞平铺于10cm培养皿。pAAV-CMV-Luc或pAAV-CMV-Luc-34a5pi8质粒，stratagene公司AAV Helper-Free System的pAAV-RC和pHelper质粒各10μg与1mL 0.3M氯化钙、1mL2xHBS均匀混合，形成颗粒后转染AAV293细胞，72小时后以干冰/37℃水浴冻融三次，4000rpm离心2分钟收集上清，氯化铯纯化病毒，所得病毒分别为rAAV2-CMV-Luc和rAAV2-CMV-Luc-34a5pi8。
4.以5000细胞/孔平铺HEK293细胞于96孔板中，培养24小时分两组后以1x108/孔分别加入rAAV-CMV-Luc或rAAV-CMV-Luc-34a5pi8病毒感染细胞。48小时后，检测细胞荧光素酶活性。
观测到转染了rAAV-CMV-Luc病毒的细胞中，荧光素酶信号较强；而转染了rAAV-CMV-Luc-34a5pi8病毒的细胞中，荧光素酶信号微弱，则可证实rAAV-CMV-Luc-34a5pi8病毒载体中miR-34a诱导沉默元件可沉默目的基因的表达。
5.以0.1pmol，1pmol，10pmol的上海吉玛制药技术有限公司的miR-34a抑制剂或miR-34a模拟物转染HCT116细胞。培养24小时后分两组以5000细胞/孔平铺于96孔板中，培养24小时后分别加入rAAV-CMV-Luc或rAAV-CMV-Luc-34a5pi8病毒感染细胞。48小时后，检测细胞内荧光素酶活性。
观测到转染miR-34a模拟物可使受rAAV-CMV-Luc-34a5pi8病毒感染细胞内荧光素酶信号微弱，转染miR-34a抑制物可使受rAAV-CMV-Luc-34a5pi8病毒感染细胞内荧光素酶信号增强；而转染miR-34a模拟物或miR-34a抑制物对受rAAV-CMV-Luc病毒感染的细胞内荧光素酶信号强度没有显著影响，则可证实rAAV-CMV-Luc-34a5pi8病毒载体中miR-34a诱导沉默元件可响应细胞内miR-34a表达水平发挥其表达沉默作用。
6.miR-34a表达阳性肿瘤细胞系U138，SH-SY5Y，正常细胞系U87和miR-34a表达阴性肿瘤细胞系U251，SK-N-AS均可购自ATCC细胞库，用含有10胎牛血清，10U/ml盘尼西林G和10mg/ml链霉素的DMEM培养基(Gibco)于37℃、5％CO2孵箱中培养(Oncogene 32(9):1155-63；BMC Cancer 11:33)。加入rAAV-CMV-Luc或rAAV-CMV-Luc-34a5pi8病毒48小时后，检测细胞内荧光素酶活性。
观测到rAAV-CMV-Luc转染的细胞中荧光素酶信号都很微弱；在rAAV-CMV-Luc-34a5pi8病毒转染的U251，SK-N-AS细胞中荧光素酶信号较强，而受rAAV-CMV-Luc-34a5pi8病毒转染的U138，SH-SY5Y，U87细胞中荧光素酶信号对比在rAAV-CMV-Luc转染的细胞中显著下降，则可实证明miR-34a诱导沉默rAAV-CMV-Luc-34a5pi8病毒载体具有仅在miR-34a表达阴性细胞中表达其目的基因的靶向性。
实施例4：
重组miR-34a诱导沉默自杀腺相关病毒系统rAAV2-CMV-HSV1tk/GCV-34a5pi8及其构建方法和体外测试。
1.构建重组miR-34a诱导沉默自杀腺相关病毒系统质粒pAAV-CMV-HSV1tk-34a5pi8(图3)：
合成以下包含CMV启动子序列的寡核苷酸，1：1混合后使用PCR仪退火，克隆至pAAV-MCS-34a5pi8载体的EcoRI，BamHI酶切位点之间。
5’
-AATTCAAGGTACCAGATCTTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCG-3’；5’-GATCCGCTATGAACTAATGACCCCGTAATTGATTACTATTAATAACTAAGATCTGGTACCTTG-3’进而使用如下引物自InvivoGen公司的pUNO1-HSV1tk载体中克隆含HSV1tk基因的1.4bp片段至上述所得载体的SalI，PmeI酶切位点之间。
5’-AATGTCGACATGGCCTCGTACCCC-3’
5’-ATAGTTTAAACTCAGTTAGCCTCCCCCATCTCC-3’
进而得到pAAV-CMV-HSV1tk-34a5pi8质粒。
作为对照，以HindIII酶切pAAV-CMV-HSV1tk-34a5pi8质粒后提取质粒并连接，构建移了除miR-34a诱导沉默元件的pAAV-CMV-HSV1tk质粒。
2.通过使用miR-34a抑制剂的三质粒共转染磷酸钙沉淀法生产腺相关病毒载体。
3.以上述步骤所得rAAV2-CMV-HSV1tk-34a5pi8和rAAV2-CMV-HSV1tk病毒分别感染U138，SH-SY5Y，U87，U251，SK-N-AS细胞系。48小时后，换成含10μg/ml GCV的培养液或不含GCV的对照培养液，继续培养72小时后以MTT法和CCK-8法检测各组细胞存活率。
4.MTT法测细胞存活率。以5000细胞，100μl/孔接种细胞培养液于96孔板，将含有病毒的培养液更换成含5mg/ml MTT的DMEM新培养液，分别培养4小时后吸除培养液，加入150μl DMSO裂解，使用酶标仪测定570nm处吸光度。
CCK-8法测细胞存活率。接种细胞于96孔板，将含有病毒的培养液更换成含0.1ml/ml Dojindo公司生产CCK-8溶液的DMEM新培养液，培养后裂解，使用酶标仪测定450nm处吸光度。
细胞存活率＝(A样品-A空白)/(A对照-A空白)
可观测到对于U251和SK-N-AS细胞，添加GCV后，受rAAV2-CMV-HSV1tk-34a5pi8感染和受rAAV2-CMV-HSV1tk感染的两组之间的存活率差异不大，且皆显著低于未添加GCV的对照组；而对于U138，SH-SY5Y，U87细胞，添加GCV后，受rAAV2-CMV-HSV1tk-34a5pi8感染的平均存活率显著高于受rAAV2-CMV-HSV1tk感染的细胞，则可证实rAAV2-CMV-HSV1tk-34a5pi8病毒联合GCV能够针对miR-34a表达阴性细胞发挥靶向杀伤作用。
实施例5：
重组miR-34a诱导沉默自杀腺相关病毒系统rAAV2-CMV-HSV1tk/GCV-34a5pi8作为溶瘤病毒治疗裸鼠体内移植瘤。
10-12周龄的无胸腺裸鼠后腿注射1x106SK-N-AS或U87细胞，通过SPECT/CT法检测肿瘤大小，待肿瘤体积增至120-150mm3进行动物分组。治疗组通过尾静脉以1x1011vg/鼠注射溶于200μl PBS的rAAV2-CMV-HSV1tk-34a5pi8病毒载体，两组对照组分别注射相同剂量的rAAV2-CMV-HSV1tk病毒载体与不含病毒的PBS缓冲剂。自注射病毒后第二周起，以25mg/kg/天的剂量注射CGV连续三周。每隔3天记录测肿瘤大小。
观测到以下结果：
即证实rAAV2-CMV-HSV1tk-34a5pi8病毒可选择性地抑制miR-34a表达阴性的肿瘤细胞的生长。即移植两种细胞细胞形成的肿瘤皆在注射rAAV2-CMV-HSV1tk和GCV后体积缩小，注射PBS缓冲剂和GCV后体继续生长。而注射rAAV2-CMV-HSV1tk-34a5pi8和GCV可使SK-N-AS细胞形成的肿瘤体积缩小，但U87细胞则继续生长。
本发明在基因表达载体中引入一段用于控制基因表达的序列元件，用于优化现有基因表达载体肿瘤靶向性，减小其脱靶副作用，其中不涉及开发新的小分子类药物，不涉及形成新代谢产物，作用机理明确，容易实现，安全性和有效性都比较容易预见；
miR-34a在大多数人体正常细胞尤其是在成人干细胞中都有表达，因此大多数正常细胞都能抑制miR-34a诱导沉默基因表达载体中目的基因的表达，而且miR-34a诱导表达沉默治疗基因的策略不依赖细胞复制为靶向标志物，可较全面地减小以往基因治疗中经常出现的脱靶副作用，提升病人对治疗的耐受力；
miR-34a表达阴性作为一肿瘤标记，在几乎所有癌症类型种都发现有相当的出现比例，这预示着使用miR-34a诱导表达沉默的基因治疗可针对多种不同癌症，具有广泛应用前景；
在以往的病毒血清型的细胞嗜性，肿瘤特异性启动子和外源目的基因作用方式之外，通过在与上述三者互不相干的机理层面——miRNA诱导表达沉默来为基因疗法提供靶向性的途径，因而miRNA诱导表达沉默可与其他靶向策略兼容，易于联合使用，发挥协同效应；
无启动子miR-34a诱导沉默腺相关病毒载体，rAAV-MCS-34a5pi8系统，允许用户根据使用需要，自主整合入各种目的基因、启动子及其他基因元件以实现不同功能，为日后肿瘤基因治疗系统的开发和研究提供了一个广阔的技术平台。
需要指出的是，上述较佳实施例仅为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.miR-34a诱导沉默基因表达载体的构建，其特征在于，包括miR-34a诱导沉默基因表达载体，其使用位于外源目的基因表达盒3’端非编码区的miR-34a诱导沉默元件控制目的基因的表达，以获得针对miR-34a表达阴性细胞的靶向性。
2.如权利1中所述的miR-34a诱导沉默基因表达载体的构建，其特征在于，所述miR-34a诱导沉默基因表达载体衍生自的裸DNA、脂质体、蛋白质多肽及重组慢病毒载体、重组腺病毒载体、重组腺相关病毒基因载运体。
3.如权利1或2中所述的miR-34a诱导沉默基因表达载体的构建，其特征在于，所述miR-34a诱导沉默基因表达载体包含miR-34a诱导沉默元件，其为miR-34a诱导沉默复合体所识别的靶序列，含有一段或若干段编码hsa-miR-34a-3p的反义序列，hsa-miR-34a-5p的反义序列或其他含有hsa-miR-34a-5p种子反义序列5’-CAC(U/T)GCC-3’的序列。
4.如权利1中所述的miR-34a诱导沉默基因表达载体的构建，其特征在于，所述miR-34a诱导沉默基因表达载体衍生的病毒载体，为抑制其在生产时的降解，挑选miR-34a表达阴性细胞作为生产载体的寄主细胞或者通过加入mir-34a抑制剂或其他方法降低寄主细胞内的miR-34a水平。
5.miR-34a诱导沉默基因表达载体的应用，其特征在于，miR-34a诱导沉默基因表达载体携带具有治疗作用的外源基因，其用于制备癌症基因治疗中使用的基因载体或药物。
6.如权利5中所述的miR-34a诱导沉默基因表达载体的应用，其特征在于，所述miR-34a诱导沉默基因表达载体衍生的基因载体或药物用于治疗miR-34a表达阴性癌症，其癌细胞miR-34a启动子区域CpG岛甲基化，p53表达异常和/或miR-34a所在的1p36.23染色体片段缺失导致其miR-34a表达水平显著低于周围正常细胞miR-34a表达水平。
7.如权利5中所述的miR-34a诱导沉默基因表达载体的应用，其特征在于，所述miR-34a诱导沉默基因表达载体衍生的基因载体或药物使用包括各种类型的核酸细胞导入方法导入细胞。
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