CN110272907B

CN110272907B - 一种调控番茄茎杆发育的基因sd1及其应用

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Publication number: CN110272907B
Application number: CN201910739714.7A
Authority: CN
Inventors: 张余洋; 叶志彪; 郑伟; 张俊红; 田冉文; 张廷艳
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2019-08-12
Filing date: 2019-08-12
Publication date: 2021-04-23
Anticipated expiration: 2039-08-12
Also published as: CN110272907A

Abstract

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种调控番茄茎杆发育的基因SD1及其应用。本发明通过对番茄茎粗位点直接进行基因定位，并通过与茎粗的关联性对其他一些性状进行研究，首次发现了与番茄茎杆发育相关的基因SD1基因，发现该基因的表达能够直接影响番茄茎杆的发育。其次，发现粗茎中SD1基因与细茎中SD1基因序列结构有所差异，粗茎中SD1基因相比细茎中SD1基因多出一个赤霉素响应元件，导致二者对赤霉素响应的幅度和频率不同。并通过从基因水平探索发现，其影响部分赤霉素信号转导途径的基因表达。

Description

一种调控番茄茎杆发育的基因SD1及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种调控番茄茎杆发育的基因SD1及其应用。

背景技术

番茄茎粗(Stem Diameter，SD)是影响植株长势和抗倒伏的重要因素。番茄的茎具有支持、运输、储藏等功能，主要由表皮、皮层、维管束和髓组成；维管形成层的不断分裂使得茎加粗，其向内形成初生木质部，向外形成初生韧皮部。

近年来，在小麦(Triticum aestivum)、水稻(Oryza sativa)、玉米(Zea mays)等作物中，对茎秆高度、抗倒伏能力、茎秆韧性等方面开展较多研究。在拟南芥(Arabidopsisthaliana)中则对茎尖分生组织进行了深入研究，陆续鉴定的茎秆发育相关基因有STM(SHOOT MERISTEMLESS)、WUS(WUSCHEL)、CLV(CLAVATA)、CUC(CUP-SHAPED COTYLEDOEN)等(胡珀和韩天富，2008)。杨树(Populus)是木本植物中茎秆发育研究较为透彻的模式植物，茎的次生生长是茎尖分生组织和形成层活动共同作用的结果，相关的基因主要有HD-ZIPIII(CLASS-III HOMEODOMAIN-LEUCINE ZIPPER)、KNAT1(BP,BREVIPEDICELLUS)、WOX4(WUSCHEL-RELATED HOMEOBOX 4)、WOX14、PXY(PHLOEM INTERCALATED WITH XYLEM)等(Groover,2005；Zhang et al.,2014)。

水稻中发现了许多抗倒伏的数量性状位点(Quantitative trait loci,QTL)。Taiichiro等(2010)确定了一个控制茎秆强度的基因SCM2(STRONG CULM 2)，该基因的图位克隆结果表明SCM2与控制穗型的基因APO1(ABERRANT PANICLE ORGANIZATION 1)相同(Ikeda et al.,2012)。含有SCM2片段的近等基因系(Near-isogenic lines,NILs)小穗数增加、茎秆强度增强，证明SCM2具有多效性。Kenji等(2015)发现SCM3(STRONG CULM 3)与正向调控独脚金内酯(Strigolactone,SL)信号的基因TB1(TEOSINTE BRANCHED 1)相同(Guoet al.,2013)。含有SCM3片段的近等基因系与含有SCM2片段的近等基因系表型一致，而同时含有SCM2和SCM3两个片段的近等基因系由于加性效应，与单独含有这两个基因片段的近等基因系相比，茎秆强度更高，分蘖数更多。水稻抽穗前会在茎秆中以非结构碳水化合物的形式积累过量的光合同化物，这些同化物之后在籽粒灌浆期间弥补光合产物的不足。茎秆光合同化物的储存对于水稻短季节品种最为关键，而水稻短季节品种能用于早熟稻的选育(Wang et al.,2016)。

在拟南芥中，施用氮能显著增加其茎秆直径、皮层厚度、莲座半径、叶片中脉厚度以及叶和茎维管系统的大小；随着氮供应的增加，叶背气孔长度增加，而表皮细胞密度显著下降。施用磷不影响茎秆直径和叶表皮的性状，但会增加茎木质部的厚度(Cai et al.,2017)。PGX2(POLYGALACTURONASE INVOLVED IN EXPANSION 2)影响拟南芥次生壁的形成。PGX2激活后促进茎秆木质化，增加茎秆机械强度，但会导致倒伏，可能与茎秆厚度减小有关(Xiao et al.,2017)。

而对番茄茎秆发育机制的研究较少，因此，随着植物发育研究的日渐深入，探索番茄茎秆发育的机制至关重要。

公布号为CN105981573A的中国发明专利披露了一种抗倒伏的番茄育苗方法，主要是采用苗系培育、补肥的方法培育抗倒伏育苗。但是，上述公布的抗倒伏的育苗技术，效果不够稳定，受环境因素影响较大，不利于大规模推广。

番茄(Solanum lycopersicum)作为大众主要消费的蔬菜作物，其种植面积和产量在我国稳居世界前列。由于番茄茎秆作为植株的重要组成部分，支撑着植物体的叶、花、果，其生长发育决定了植株的长势，同时影响了对矿质元素的吸收与转运，对后期生殖生长和产量形成意义重大，同时与植株的抗倒伏性密切相关。Anne通过研究盐胁迫下潘那利番茄(Solanum pennellii)渐渗系的植株重、茎粗、叶子树木、叶干重、根干重的变化以及抗氧化分析，将这些性状与番茄耐盐相关联，从而研究番茄耐盐的抗氧化反应QTL(Frary et al2010)。在番茄中DDB1(UV-Damaged DNA Binding Protein 1)基因可变剪切的35S启动超量表达导致番茄茎显著变细，并且转基因植株中细胞分裂负调控基因表达下调(Liu et al2012)。Wang等研究番茄Rin基因互作蛋白FUL2发现，FUL2的超量表达使得番茄植株茎杆变细，同时观察到扩张蛋白SlEXP1的表达量降低，而且FUL2主要在茎杆形成层表达，这些结果可能解释了茎粗变化机制(Wang et al 2014b)。人们并未对番茄茎粗位点直接进行基因定位，而通过与茎粗的关联性对其他一些性状进行研究。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种调控番茄茎杆发育的基因SD1及其应用。

本发明是这样实现的，一种调控番茄茎杆发育的基因SD1，SD1基因的序列见NCBI登录号：XM_004247540或NCBI登录号：XM_015232125。

如上所述的调控番茄茎杆发育的基因SD1在调控番茄茎杆发育中的应用。

进一步，所述应用表现为SD1基因调控番茄茎杆粗细。

进一步，所述应用表现为SD1基因调控茎杆生长发育相关基因的表达，所述茎杆生长发育相关基因包括茎尖分生组织和次生生长活动相关基因。

进一步，所述茎尖分生组织和次生生长活动相关基因包括WUS、WOX4和KNAT2中的任一种或几种。

进一步，所述应用表现为SD1基因调控番茄茎杆对赤霉素的响应。

进一步，所述对赤霉素的响应表现为对赤霉素信号转导途径相关基因表达的调控。

进一步，所述赤霉素信号转导途径相关基因包括RGL1-1、RGL1-2和GAI中的任一种或几种。

综上所述，本发明的优点及积极效果为：

本发明通过对番茄茎粗位点直接进行基因定位，并通过与茎粗的关联性对其他一些性状进行研究，首次发现了与番茄茎杆发育相关的基因SD1基因，发现该基因的表达能够直接影响番茄茎杆的发育。

其次，发现粗茎中SD1基因与细茎中SD1基因序列结构有所差异，粗茎中SD1基因相比细茎中SD1基因多出一个赤霉素响应元件，导致二者对赤霉素响应的幅度和频率不同。并通过从基因水平探索发现，其影响部分赤霉素信号转导途径的基因表达。

附图说明

图1是番茄茎粗关联分析的曼哈顿图；

图2是番茄茎粗关联分析的Q-Q图；

图3是不同番茄种质资源中SD1单倍型；

图4是茎秆直径极端材料SD1表达量；

图5是SD1干涉及超量转基因株系茎秆比较；

图6是SD1干涉及超量转基因株系茎秆直径及SD1表达量；

图7是Sd1^TK和Sd1^TN超量表达转基因株系茎秆比较；

图8是Sd1^TK和Sd1^TN超量表达转基因株系茎秆直径及SD1表达量；

图9是SD1基因结构图；

图10是转基因植株横切切片(4×)；

图11是SD1在LA1589成熟茎秆横切面的原位杂交分析；

图12是SD1启动子顺式元件分析；

图13是100μM GA₃处理前SD1干涉及超量转基因株系的茎秆直径；

图14是100μM GA₃处理前SD1干涉及超量转基因株系的幼苗；

图15是第一次100μM GA₃处理24h内AC和LA1589中SD1表达量变化；

图16是100μM GA₃处理21d后SD1干涉及超量转基因株系茎秆比较；

图17是SD1干涉及超量转基因株系中赤霉素信号转导途径基因的表达量；

图18是SD1干涉及超量转基因株系中赤霉素生物合成途径基因的表达量；

图19是SD1干涉及超量转基因株系中茎秆发育相关基因表达量；

图20是SD1粗茎基因型(SD1^TK)启动子11bp InDel片段(200bp)点对点验证；

图21是RR6结合SD1粗茎基因型(SD1^TK)启动子的Y1H实验。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明，各实施例及试验例中所用的设备和试剂如无特殊说明，均可从商业途径得到。此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明披露了一种调控番茄茎杆发育的基因SD1及其应用，具体如下各实施例所示。本发明涉及番茄材料：番茄常规品种Ailsa Craig(AC)，醋栗番茄LA1589、TS18，本实验室收集的360份番茄核心种质资源。

实施例1 目标基因的筛选

1.本发明对360份番茄核心种质进行全基因组测序，测量了279份材料的茎粗进行关联分析。全基因组关联分析：用于茎粗测定的番茄核心种质资源304份，测量标准为在第三穗果实成熟期，测定第二穗果实所在节位茎的直径。使用的游标卡尺测量，每个品种测量六株为一个技术重复。利用Excel对测得的茎粗数据值进行基本分析，计算平均值及其最大值、最小值等。使用DPS软件对T0代植株茎粗进行差异显著性分析。使用的基因分析数据为实验室前期合作发表的重测序数据(Lin et al 2014)。关联分析使用TASSEL4.0软件中的混合线性模型完成。SNP在番茄基因组中的定位参考SL2.40(SGN,Sol Genomics Network)。

候选基因：从细茎材料LA1589和粗茎材料A57、TS-52、TS-293中扩增候选基因全长gDNA。

SD1基因序列超过7kb，利用Primer 5软件对基因全长基因设计3组引物分3段扩增，利用多片段重组原理获得基因全长，3组引物分别为SD1-1、SD1-2、SD1-3，引物序列为：

SD1 gDNA-1-FW：5'-GCTGGAGTCATGGCAACCTTGCCAC-3'，见SEQ ID NO.1；

SD1 gDNA-1-RV：5'-CACCGACTGAAAGCTCACCATTAAGGC-3'，见SEQ ID NO.2；

SD1 gDNA-2-FW：5'-GCCTTAATGGTGAGCTTTCAGTCGGTG-3'，见SEQ ID NO.3；

SD1 gDNA-2-RV：5'-GCACATCCAGAGTCGTACACAATTCC-3'，见SEQ ID NO.4；

SD1 gDNA-3-FW：5'-GGAATTGTGTACGACTCTGGATGTGC-3'，见SEQ ID NO.5；

SD1 gDNA-3-RV：5'-AAGAAAAGTTAGAACCATTAGACGCG-3'，见SEQ ID NO.6；

利用多片段重组酶连接成完整gDNA，并同源重组到SD1超量表达载体pHELLSGATE8。

PCR扩增体系为20μL：10×PCR Buffer 2.0μL，10mM dNTPs 0.4μL，10mM引物0.4μL，5U/μL Taq酶0.1μL，20ng/μL DNA模板1.0μL，ddH₂O 15.7μL。PCR扩增程序为：94℃预变性3min，94℃变性45s，55℃退火1min，72℃延伸3min，30个循环，72℃延伸10min，4℃终止反应。

PCR检测后将正确的样品送与擎科公司测序。测序结果使用MultAlin(http://multalin.toulouse.inra.fr/multalin/multalin.html)网站进行比对分析。

GWAS关联到的茎粗相关的SNPs位于9号染色体上，筛选出Lead SNP上下游50kb范围内的基因，见表1，候选了包含Lead SNP位于编码区并预测造成编码氨基酸变异的SD1基因。

表1 与番茄茎粗显著相关的leadSNP上下游各50kb内的基因

根据SD1单倍型及茎秆直径分布，将SD1基因结构分为粗茎基因型(SD1^TK)与细茎基因型(SD1^TN)(图9)。SD1^TK与SD1^TN的基因序列差异如下：SD1^TK启动子缺失11bp，第一个内含子缺失82bp。5923处的碱基由A突变为G，是有义突变，使氨基酸由异亮氨酸(I)变为缬氨酸(V)，2129、4240、4690、4738处碱基的变化均为无义突变，863、880、1119、1737、4653、6612处碱基的变化没有使氨基酸发生变化。SD1序列由美国生物技术信息中心NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)公开获取。SD1^TK代表序列为Heinz 1706番茄SD1(NCBI登录号：XM_004247540)，SD1^TN代表序列为潘那利番茄SD1(NCBI登录号：XM_015232125)。

gDNA全长7390bp，cDNA全长5857bp，基因注释为激酶互作家族蛋白(Kinaseinteracting family protein,KIP1-like)。详细结果分别见图1和图2。

2.根据360份番茄种质资源SNP及InDel差异，将SD1分为4大类、8种单倍型。从醋栗番茄(Solanum pimpinellifolium)到樱桃番茄(Solanum lycopersicum varcerasiforme)再到大果番茄(Solanum lycopersicum)的驯化改良过程中，SD1是从单倍型Ⅴ、Ⅵ到其他6种单倍型的演变，见图3，并伴随着茎秆直径的增加。对极端材料进行表达分析发现，结果见图4，极端粗茎材料SD1表达量比极端细茎材料略高，说明SD1的表达影响茎秆直径。

基于360份番茄种质资源重测序数据，根据SNP及InDel差异，将SD1分为8种单倍型。SD1启动子有11bp的InDel差异，内含子有82bp的InDel差异。SNP差异中有4个位于内含子，8个位于外显子。在单倍型Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ中主要为大果番茄和樱桃番茄，大多为粗茎材料；Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ中主要为樱桃番茄和醋栗番茄，大多为细茎材料。

实施例2 干扰SD1的表达，验证其对番茄性能的影响

基因功能验证：确定候选基因后，分析得出基因序列超过7kb，利用Primer 5软件对基因全长设计引物，用A57gDNA作为模板利用多片段重组原理将基因分为3段扩增，分别为SD1-1、sd1-2、SD1-3，在SD1-1的正向引物前加上位点(CATTTGGAGAGGACACGCTCGAG)，在SD1-3的反向引物前加上位点(TCTCATTAAAGCAGGACTCTAGA)，利用多片段重组酶连接成完整gDNA并同源重组到超量表达载体PHELLSGATE 8。热击转化大肠杆菌Trans-T1菌株(购于北京全式金生物技术有限公司)。挑取单克隆进行菌落PCR检测，将检测结果正确的阳性克隆测序后，挑选正确的克隆进行活化，提取质粒。

上述中重组构建载体详细方法如下：多片段同源重组反应体系包括1μL Exnase，2μL5×CE buffer，1μL pHellstage8载体(XhoI+XbaI)，3μL目的片段(每片段1μL)，3μLddH₂O，37℃反应30min。通过热激法将同源重组产物转入大肠杆菌感受态Trans T1，用80mg/L的Spec平板LB培养基在37℃培养箱培养10-18h，挑取单克隆于80mg/L的Spec液体LB培养基，在37℃摇床摇菌，PCR检测后，选取有正确条带的菌液测序，测序结果正确的菌液在37℃摇床摇菌并提取质粒，按菌液：50％甘油为7:3的比例将菌液保存至-80℃冰箱。采用电激法将质粒转入农杆菌感受态C58，用80mg/L Spec+25mg/L Rif的平板LB培养基在30℃培养箱培养2-3d，挑取单克隆于80mg/L的Spec+25mg/L Rif的液体LB培养基，在30℃摇床摇菌，PCR检测后最终确定阳性菌液，将菌液保存至-80℃冰箱。

pHellstage8载体同源重组位点序列：

FW：5'-CATTTGGAGAGGACACGCTCGAG-3'，见SEQ ID NO.7；

RV：5'-TCTCATTAAAGCAGGACTCTAGA-3'，见SEQ ID NO.8；

用电击法转化进入农杆菌C58感受态中，PCR检测正确后加入50％甘油保存于-70℃。

番茄遗传转化参照公开文献报道的方法进行(欧阳波等，华中农业大学学报,2002(3):206-209)。

利用primer3网站(http://primer3.ut.ee/)设计干涉引物，在正向引物前加上attB1位点(5’GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT3’)，反向引物前面加上attB2位点(5’GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT3’)，用A57gDNA作模板扩增干涉序列，通过BP重组反应构建到RNAi抑制表达载体pHELLSGATE 2。热击转化大肠杆菌，之后步骤同上。

原位杂交：在植株第二苔果成熟时取LA1589近茎顶端成熟茎秆，先做好番红固绿染色的石蜡切片，再设计寡核苷酸探针，进行荧光原位杂交。该实验由武汉巴菲尔生物技术服务有限公司完成。

石蜡切片：为了观察粗、细茎材料以及转基因植株的茎秆组织微观结构的差异，在植株果实成熟时，将LA1589、AC、超量、干涉植株第二花序所在节位的茎横切成1cm的小段经FAA固定液处理24h后。将FAA固定液处理后的茎段送与武汉生物技术研究所制成石蜡切片，通过Olympus BX-61显微镜进行观察并拍照。

结果：分别在番茄AC中干涉SD1表达，LA1589中超量表达SD1粗茎gDNA发现，干涉转基因株系SD1表达量显著低于AC，表达量为对照的9％，茎秆直径显著小于AC，由对照的12.1mm降低至8.9，降幅达26.5％。超量转基因株系SD1表达量高于LA1589，是LA1589的2.7倍，茎秆直径显著大于LA1589，茎秆直径从对照的5.3mm上升至9.3mm，上升幅度达75.5％，说明SD1能够正向调控茎秆直径。并且，SD1对果实横、纵径和单果重也有一定影响，详细结果见图5和图6。在TS18中分别超量表达粗茎和细茎SD1gDNA发现，两种超量转基因株系中SD1表达量均略高于TS18，表达水平分别是对照的1.7倍和2.1倍。超量表达SD1后茎秆直径均显著大于TS18，超量表达粗茎SD1后，茎秆直径由对照的5.3mm上升至8.9mm，上升幅度达67.9％；而超量表达细茎SD1后，茎秆直径由对照的5.3mm上升至9.1mm，上升幅度达71.7％。结果证明粗茎基因型SD1(SD1^TK)和细茎基因型SD1(SD1^TN)均能够调控茎秆直径，结果见图7和图8，其中SD1^TK和SD1^TN的基因结构比较图见图9。石蜡切片结果见图10，其中A：OE受体材料LA1589；B：OE材料；C：RNAi受体材料AC；D：RNAi材料。原位杂交分析结果图见图11。对SD1^TK和SD1^TN两种基因进行启动子顺式元件分析，结果如图12所示。

SD1基因表达量检测方法如下：

(1)SD1 qPCR引物序列：SD1 qPCR-FW：5'-ACCCGTCAGAAGCGAGTGTC-3'，见SEQ IDNO.9；SD1 qPCR-RV：5'-CCCGTGCTGCTCCTGGAAAA-3'，见SEQ ID NO.10；

(2)进行qPCR前，需将cDNA稀释至80-200ng/μL。qPCR反应体系：

(3)内对照基因引物：β-actin-FW：ATGGCAGACGGAGAGGATATTCA，见SEQ ID NO.11；β-actin-RV：GCCTTTGCAATCCACATCTGCTG，见SEQ ID NO.12。

(4)qPCR反应程序为：95℃预变性5min，95℃变性5s，58℃退火15s，72℃延伸20s，40个循环。由LightCycler 480实时定量PCR仪进行分析。

实施例3 赤霉素响应实验及酵母单杂交实验

SD1^TK由于启动子缺失11bp而多出一个赤霉素响应元件。

赤霉素处理：实验材料采用O-5-2、O-8-2、O-22-1为超量转基因株系，背景材料是LA1589；R-2-3、R-11-1、R-17-2为干涉转基因株系，背景材料是AC。分别用水和100μM GA3超量表达O-5-2、O-8-2、O-22-1、R-2-3、R-11-1、R-17-2的T3代转基因株系和AC、LA1589的幼苗进行叶片喷施。每个系选取长势良好一致的幼苗6株，其中3株用100μM GA3喷施叶面，另外3株喷施水作为对照，每隔3d喷施一次，连续喷施6次。喷施前测量第一片叶和第二片叶之间的茎秆直径，同一位置分3个方向各测量1次，每次测量3株。8d后，测量第二片叶和第三片叶之间的茎秆直径，15d、21d后测量第三片叶和第四片叶之间的茎秆直径。第一次喷施后，测定0h、1h、2h、4h、7.5h、12h、24h内AC和LA1589中SD1的表达量。

对SD1干涉和超量转基因株系进行100μM GA₃处理后发现，SD1^TK和SD1^TN响应赤霉素的幅度和频率不同，详细结果见图13-16。

在SD1干涉和超量转基因株系中，对部分赤霉素信号转导途径的基因进行表达分析发现，SD1影响该途径部分基因的表达，如RGL1-1、RGL1-2和GAI在干涉转基因株系中表达上调。基因检测采用qPCR方法，具体实施方法参照文献公开方法(Ye et al.,2015,PLoSOne.10(7):e0130885)。其中正向引物SlRGL1-1-F：GCTAGTGTTTTGCTTGTCAATATCA，见SEQ IDNO.13；反向引物SlRGL1-1-R：GCTAGTGTTTTGCTTGTCAATATCA，见SEQ ID NO.14；正向引物SlRGL1-2-F：TGGATCTGAATCTCGTGACTGTT，见SEQ ID NO.15；反向引物SlRGL1-2-R：TCCTCCCATTTGTGAAACTGAA，见SEQ ID NO.16；正向引物SlGAI-F：ATTCTCTAATGGTGCTGTTTCTTCA，见SEQ ID NO.17；反向引物SlGAI-R：TTTGAGCAACATCCGCCATA，见SEQ ID NO.18。

对部分赤霉素生物合成途径的基因进行表达分析发现，SD1表达变化不影响该途径基因的表达。对部分茎秆生长发育相关的基因进行表达分析发现，SD1影响茎尖分生组织和次生生长活动中部分基因的表达，如WUS在超量转基因株系中表达上调，WOX4和KNAT2在干涉转基因株系中表达下调。基因检测采用qPCR方法，具体实施方法参照文献公开方法(Yeet al.,2015,PLoS One.10(7):e0130885)。

其中SlWUS基因正向引物SlWUS-F：TGGAACATCAACACAACATAGAAGA，见SEQ IDNO.19；反向引物SlWUS-R：CTGTTCAGCAGTTGGAGACCTAA，见SEQ ID NO.20；SlWOX4基因正向引物SlWOX4-F：GGATCATCATCAGGAAGCTTAAGTA，见SEQ ID NO.21；反向引物SlWOX4-R：CTGTTCAGCAGTTGGAGACCTAA，见SEQ ID NO.22；；SlKNAT2基因正向引物SlKNAT2-F：ATGGTTTTAATTCCACAAGAGATGA，见SEQ ID NO.23；反向引物SlKNAT2-R：TTGAAGCGTTTGTTCCGATG，见SEQ ID NO.24。

结果见图17-19。

酵母单杂交实验：

酵母单杂交筛选文库：以TS327gDNA为模板扩增ATG上游2kb及11bp InDel启动子片段，通过单片段同源重组连接到pAbAi载体(KpnI+XhoI)上，热激法转入大肠杆菌(抗生素为80mg/L Amp)的步骤同超量表达载体的构建。对构建好的pAbAi载体质粒进行线性化、磷酸化后，通过小量法转酵母将质粒转入Y1Hgold，用SD/-Ura平板培养基在30℃培养箱培养2-3d。长出单克隆后，刮取适量单克隆于400μL ddH2O中吸打混匀，划线于SD/-Ura平板培养基，在30℃培养箱培养(可保留该平板培养基，用于后续筛选文库)。当单克隆长至2-3mm时，再次通过小量法转酵母将pGADT7质粒转入该酵母菌株中，用SD/-Leu(或SD/-Leu-Ura)平板培养基在30℃培养箱培养。待长出单克隆后，挑取适量单克隆在400μL ddH2O中稀释至同一浓度，在含有不同AbA浓度梯度的SD/-Leu(或SD/-Leu-Ura)平板培养基上点斑，置于30℃培养箱培养2-3d。筛选出AbA浓度后，进行酵母单杂交筛选文库。PCR检测后，选取不同大小条带测序。

表2 SD1粗茎基因型(SD1^TK)启动子2kb片段酵母单杂交筛选文库结果

酵母单杂交点对点验证：扩增需要验证基因的cDNA，通过单片段同源重组连接到pGADT7载体(NdeI+XhoI)上，热激法转入大肠杆菌(抗生素为80mg/L Amp)的步骤同超量表达载体的构建，PCR检测后，测序正确的菌液摇菌并提取质粒。将该质粒与pGADT7质粒通过小量法转酵母转入有pAbAi载体的Y1Hgold中，用SD/-Leu(或SD/-Leu-Ura)平板培养基在30℃培养箱培养2-3d。待长出单克隆后，挑取适量单克隆在400μL ddH2O中稀释至同一浓度，在含有不同AbA浓度梯度的SD/-Leu(或SD/-Leu-Ura)平板培养基上点斑，30℃培养箱培养2-3d。

酵母单杂交实验结果见图20和图21，结果表明，PARB能结合SD1^TK启动子11bpInDel(200bp)区域，但结合能力不强；RR6能与SD1^TK启动子区域(2kb)结合。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 一种调控番茄茎杆发育的基因SD1及其应用

<160> 24

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(SD1 gDNA-1-FW)

<400> 1

gctggagtca tggcaacctt gccac 25

<210> 2

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(SD1 gDNA-1-RV)

<400> 2

caccgactga aagctcacca ttaaggc 27

<210> 3

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(SD1 gDNA-2-FW)

<400> 3

gccttaatgg tgagctttca gtcggtg 27

<210> 4

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(SD1 gDNA-2-RV)

<400> 4

gcacatccag agtcgtacac aattcc 26

<210> 5

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(SD1 gDNA-3-FW)

<400> 5

ggaattgtgt acgactctgg atgtgc 26

<210> 6

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(SD1 gDNA-3-RV)

<400> 6

aagaaaagtt agaaccatta gacgcg 26

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(FW)

<400> 7

catttggaga ggacacgctc gag 23

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(RV)

<400> 8

tctcattaaa gcaggactct aga 23

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(SD1 qPCR-FW)

<400> 9

acccgtcaga agcgagtgtc 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(SD1 qPCR-RV)

<400> 10

cccgtgctgc tcctggaaaa 20

<210> 11

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(β-actin-FW)

<400> 11

atggcagacg gagaggatat tca 23

<210> 12

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(β-actin-RV)

<400> 12

gcctttgcaa tccacatctg ctg 23

<210> 13

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(SlRGL1-1-F)

<400> 13

gctagtgttt tgcttgtcaa tatca 25

<210> 14

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(SlRGL1-1-R)

<400> 14

gctagtgttt tgcttgtcaa tatca 25

<210> 15

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(SlRGL1-2-F)

<400> 15

tggatctgaa tctcgtgact gtt 23

<210> 16

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(SlRGL1-2-R)

<400> 16

tcctcccatt tgtgaaactg aa 22

<210> 17

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(SlGAI-F)

<400> 17

attctctaat ggtgctgttt cttca 25

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(SlGAI-R)

<400> 18

tttgagcaac atccgccata 20

<210> 19

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(SlWUS-F)

<400> 19

tggaacatca acacaacata gaaga 25

<210> 20

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(SlWUS-R)

<400> 20

ctgttcagca gttggagacc taa 23

<210> 21

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(SlWOX4-F)

<400> 21

ggatcatcat caggaagctt aagta 25

<210> 22

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(SlWOX4-R)

<400> 22

ctgttcagca gttggagacc taa 23

<210> 23

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(SlKNAT2-F)

<400> 23

atggttttaa ttccacaaga gatga 25

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(SlKNAT2-R)

<400> 24

ttgaagcgtt tgttccgatg 20

Claims

1.超量表达细茎SD1基因在提高番茄茎杆直径中的应用，所述细茎SD1序列见NCBI登录号：XM_015232125。