CN110257470A - 一种快速判定植物防腐剂km防腐效力的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种快速判定植物防腐剂KM防腐效力的方法，包括以下步骤：S1、菌悬液的制备：取多种微生物菌种分别制备成菌悬液，每种菌悬液中微生物的浓度为105～106cfu/ml；S2、试验平板的制作：在已灭菌的平板中分别加入所述步骤S1制得的菌悬液，然后在每块所述平板上打孔，去除孔内的培养基并向孔内加入防腐剂，将加入防腐剂后的平板在培养箱中培养；S3、抑菌圈的测量：测量培养结束后的各平板中的抑菌圈直径，根据抑菌圈直径的大小定性判定植物防腐剂KM的防腐效力；若所述抑菌圈直径在10mm以上，判定所述植物防腐剂KM的抑菌效果较好且抑菌圈的直径越大，抑菌效果越好。
Description
技术领域
本发明涉及防腐技术领域，具体涉及一种快速判定植物防腐剂KM防腐效力的方法。
背景技术
由于化妆品的制备材料中通常包含多种有机物，这些有机物可为微生物提供碳源和氮源，同时，化妆品通常还含有水分，极易滋生细菌等微生物。因此，化妆品在生产、储藏和使用过程中极易受到不同程度的微生物污染。根据《化妆品安全技术规范》(2015版)的规定，可依据造成污染的微生物来源，将化妆品中发生的污染分为一次污染和二次污染。一次污染是指化妆品在生产过程中导致的污染，可通过对生产设备、人员操作进行控制；二次污染指化妆品使用过程中造成的污染，这一污染较难控制。同时，该规范中还对化妆品中微生物的限度给出了明确规定；目前，化妆品行业内评价防腐体系的防腐效力是采用美国化妆品盥洗用品和香水协会(Cosmetic，Toiletry and Fragrance Association，CTFA)的评价方法，该方法的评价结果有效可靠，但需要历经28天的防腐挑战试验，加上前期的微生物培养及菌液浓度确定和防腐测试总计需要58天左右。然而，对于前期确定防腐剂是否有防腐效力来说，若使用该评价方法，则会使得时间成本太高，不利于推进整个实验进程。因此，如何快速且有效地定性确定防腐剂是否对化妆品中限定微生物有杀菌、抑菌效果是化妆品领域中亟待解决的问题。
植物防腐剂KM(中文名：茵陈蒿花提取物/萝卜根发酵滤液/牡丹根提取物，INCI：ARTEMISIA CAPILLARIS FLOWER and EXTRACT，RADISH ROOT FERMENT FILTRATE andPAEONIA SUFFRUTICOSA ROOT EXTRACT)，是一种常用的天然防腐剂。由于来源广泛且对人体伤害小，在各种化妆品的制备中具有广泛的应用前景。在应用于化妆品前需对其防腐效力及最佳浓度进行测定，现有技术中，针对植物防腐剂KM的前期定性防腐效力通常采用纸片法进行测定，然而传统纸片法未能完全反映防腐剂的防腐效力，仍需进一步改善。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：提供一种评价结果有效可靠且操作简便的快速判定植物防腐剂KM防腐效力的方法。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：一种快速判定植物防腐剂KM防腐效力的方法，包括以下步骤：
S1、菌悬液的制备：取多种微生物菌种分别制备成菌悬液，每种菌悬液中微生物的浓度为105～106cfu/ml，所述微生物包括大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、白假丝酵母菌、黑曲霉菌和肺炎克雷伯氏菌；
S2、试验平板的制作：在已灭菌的平板中分别加入所述步骤S1制得的菌悬液，然后在每块所述平板上打孔，去除孔内的培养基并向孔内加入防腐剂，将加入防腐剂后的平板在培养箱中培养，其中，含细菌类微生物的平板在37℃下培养24h，含有真菌类微生物的平板在28℃下培养3天，霉菌类微生物的平板在28℃下培养5～7天，防腐剂的添加量为0.00125～0.02mg/ml；
S3、抑菌圈的测量：测量培养结束后的各平板中的抑菌圈直径，根据抑菌圈直径的大小定性判定植物防腐剂KM的防腐效力；若所述抑菌圈直径小于10mm，则判定所述植物防腐剂KM的抑菌效果较差；若所述抑菌圈直径在10mm以上，判定所述植物防腐剂KM的抑菌效果较好且抑菌圈的直径越大，抑菌效果越好。
优选地，若所述抑菌圈的直径大于20mm，则表明抑菌效果极佳。
优选地，所述防腐剂的添加体积为10～20μl；优选为15μl。
优选地，所述防腐剂的浓度为0.0025g/ml。
进一步地，所述步骤S1具体包括以下步骤：将微生物菌种经复苏培养后确定菌液初始浓度，并稀释得到最终浓度为105～106cfu/ml浓度的菌悬液。
优选地，将复苏后的微生物菌种培养至第2代或第3代时，确定菌液初始浓度，并稀释得到最终浓度为105～106cfu/ml浓度的菌悬液。
优选地，通过稀释涂布平板法确定菌液中微生物的浓度。
优选地，所述大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和肺炎克雷伯氏菌均采用Luria-Bertani(LB)培养基进行培养，所述白假丝酵母菌选用麦芽浸膏培养基培养，所述黑曲霉菌选用马铃薯葡萄糖琼脂培养基(Potato Dextrose Agar，PDA)进行培养。
进一步地，所述步骤S2中，在已灭菌的平板中添加菌悬液80～120μl，优选为100μl。
优选地，所述孔为方孔，所述方孔为0.5cm*0.5cm的正方形结构。
本发明的有益效果在于：本发明方案检测时间短且检测结果可靠，通过本发明方案可实现快速确定植物防腐剂KM防腐效力，操作便捷；与传统抑菌圈法相比，本发明方案可简去部分繁琐细节操作，检测结果更能真实反映防腐剂的防腐效力；本发明方案将判定时间控制在一星期左右，大大提升了评价效率，节省了时间，加快了产品的开发进度，采用大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、白假丝酵母菌、黑曲霉菌和肺炎克雷伯氏菌组合判定防腐效力，结果可靠性好，具有良好的工业应用前景。
具体实施方式
为详细说明本发明的技术内容、所实现目的及效果，以下结合实施方式予以说明。
本发明的实施例为：一种快速判定植物防腐剂KM防腐效力的方法，包括以下步骤：
1)取大肠埃希氏菌(CICC 10389)、金黄色葡萄球菌(CICC 10384)、铜绿假单胞菌(CICC 21636)、肺炎克雷伯氏菌(CICC 21519)、白假丝酵母菌(CICC 1965)、黑曲霉菌(CICC2487)共6种微生物的菌种；
2)将大肠埃希氏菌(CICC 10389)、金黄色葡萄球菌(CICC 10384)、铜绿假单胞菌(CICC 21636)、肺炎克雷伯氏菌(CICC 21519)用LB培养基进行培养，白假丝酵母菌(CICC1965)用麦芽浸膏培养基进行培养，黑曲霉菌(CICC 2487)选用马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)进行培养；
3)取大肠埃希氏菌菌种冷冻干粉中加入附带悬液稀释液600μL，溶解冻干粉，溶解冻干粉，取100μL接种至平板中，用灭菌涂布棒涂抹均匀；用灭菌接种环蘸菌悬液，在斜面培养基中划线接种；取100μL菌悬液至10ml液体培养基中；
4)重复上述操作制作接种其他5种菌的培养基，每种菌重复3次；固体培养基静置培养，液体培养基振荡培养，完成菌种复苏(即一代培养)；
5)将各种菌培养至3代时，用稀释平板计数法(稀释7个浓度)，确定菌液浓度，配制105～106cfu/ml；
6)将悬菌液加入到灭菌平板上，用灭菌小刀在试验平板上切割正方形(0.5cm×0.5cm)孔结构，用镊子将中间培养基挑去，往正方形孔中加入防腐剂(购自于广州启正化工科技有限公司)，细菌(大肠埃希氏菌(CICC 10389)、金黄色葡萄球菌(CICC 10384)、铜绿假单胞菌(CICC 21636)、肺炎克雷伯氏菌(CICC 21519))培养基在37℃培养箱中培养24h，真菌(白假丝酵母菌)放置28℃下培养3天，霉菌(黑曲霉菌)放置28℃下培养6天；
7)用游标卡尺通过十字交叉法测量抑菌圈直径，以直径表示抑菌圈的大小。
防腐剂添加量的影响验证如下：
1、添加不同体积下浓度为0.00125g/ml的防腐剂后的抑菌效果定性测试结果如下表1所示：
表1 植物防腐剂KM(浓度为0.00125g/ml)抑菌效果定性结果表
从上表1可以看出，当KM的浓度为0.00125g/ml时，添加量为15μL和20μL时，各种菌种的抑菌圈直径相当。
2、添加不同体积下浓度为0.0025g/ml的防腐剂后的抑菌效果定性测试结果如下表2所示：
表2 植物防腐剂KM(浓度为0.0025g/ml)抑菌效果定性结果表
从上表2可以看出，当KM的浓度为0.0025g/ml时，添加量为15μL和20μL时，各种菌种的抑菌圈直径相当，且在该浓度下各体积的添加量的抑菌效果均为极佳水平。
3、添加不同体积下浓度为0.005g/ml的防腐剂后的抑菌效果定性测试结果如下表3所示：
表3 植物防腐剂KM(浓度为0.005g/ml)抑菌效果定性结果表
从上表3可以看出，当KM的浓度为0.005g/ml时，添加量为15μL和20μL时，各种菌种的抑菌圈直径相当。
4、添加不同体积下浓度为0.01g/ml的防腐剂后的抑菌效果定性测试结果如下表4所示：
表4 植物防腐剂KM(浓度为0.01g/ml)抑菌效果定性结果表
从上表4可以看出，当KM的浓度为0.01g/ml时，添加量为15μL和20μL时，各种菌种的抑菌圈直径相当。
5、添加不同体积下浓度为0.02g/ml的防腐剂后的抑菌效果定性测试结果如下表5所示：
表5 植物防腐剂KM(浓度为0.02g/ml)抑菌效果定性结果表
从上表5可以看出，当KM的浓度为0.02g/ml时，添加量为15μL和20μL时，各种菌种的抑菌圈直径相当。
结合表1-5的数据以看出，防腐剂KM的添加量为15μL且浓度为0.0025g/ml时，进行效力判定时，效果最佳。
对照例：利用传统纸片法测定植物防腐剂KM(同样购置于广州启正化工科技有限公司，与实施例中同一批次)的防腐效力，区别仅在于：植物防腐剂KM的浓度梯度不同，依次为0.00125、0.0025、0.004、0.008、0.016g/ml，将不同浓度的KM涂布于纸片上后，分别贴在试验平板上，培养条件与实施例一致，结果发现植物防腐剂KM浓度为0.004g/ml且体积为15μL时防腐效力最佳。
将本发明方案鉴定出的最佳防腐效果浓度的KM实际用于实际面霜及洁面乳的制备中并对制得的面霜和洁面乳的防腐性能通过CTFA的28天评价测试法进行验证。
其中，面霜的制备原料成分表如下表6所示：
表6 面霜的成分及含量表
表6中，实施例组面霜中KM的含量为0.0025g/ml，对照例组面霜中KM的含量为0.004g/ml。
上述面霜的制备工艺具体操作如下：
步骤1)：用纯热水洗净消毒乳化锅；
步骤2)：将A组物料加入乳化锅，高速搅拌均匀分散完全；
步骤3)：均匀搅拌下升温至90℃，匀速搅拌保温20分钟以灭菌；
步骤4)：另取一锅，依次加入B相物料，加热至85℃，溶解后加入至A相锅内，开始降温；
步骤5)：加305时，需预先摇匀，降温至60℃，加入305，搅拌均匀后，开启中速均质，时间为5分钟，边均质边搅拌。
步骤6)：继续搅拌降温至45℃，将C相其它物料投入体系中，并继续搅拌约10分钟至分散均匀，停止搅拌、降温、然后送检待出料。
洁面乳的制备原料成分表如下表7所示：
表7 洁面乳的成分及含量表
表7中，实施例组洁面乳中KM的含量为0.0025g/ml，对照例组洁面乳中KM的含量为0.004g/ml。
上述洁面乳的制备工艺，包括以下步骤：
步骤1)：用纯热水洗净消毒乳化锅；
步骤2)：将A组物料加入乳化锅，高速搅拌均匀分散完全；
步骤3)：均匀搅拌下升温至85℃，3500rpm均质3-5min，保温搅拌30分钟以灭菌；
步骤4)：在均匀搅拌下徐徐降温至45℃左右，将B组物料加入乳化锅，并继续搅拌至分散均匀；
步骤5)：降温至40℃以下，加入C相，搅拌均匀。
步骤6)：停止搅拌、降温、然后送检待出料。
取上述操作制得洁面乳和面霜分别进行28天防腐挑战实验，具体操作如下：
1)选用大肠埃希氏菌(CICC 10389)、金黄色葡萄球菌(CICC 10384)、铜绿假单胞菌(CICC 21636)、白假丝酵母(CICC 1965)、黑曲霉(CICC 2487)肺炎克雷伯氏菌(CICC21519)；相应的大肠埃希氏菌(CICC 10389)、金黄色葡萄球菌(CICC 10384)、铜绿假单胞菌(CICC 21636)、肺炎克雷伯氏菌(CICC 21519)用LB培养基，白假丝酵母(CICC 1965)选用麦芽浸膏培养基，黑曲霉(CICC 2487)选用马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)进行培养；
2)用上述操作中活化培养至3代的菌悬液配制成一定浓度，供试化妆品分装成30g，分别加入菌液使供试化妆品中含细菌量为106CFU/g(mL)，细菌浓度为104CFU/g(mL)，加入植物防腐剂KM于供试化妆品中(化妆品中浓度分别为0.0025g/mL、0.004g/mL)重复振荡混匀。接种后的受试样品分别置于37℃(细菌)、28℃(真菌)培养箱中培养，分别在接种后的第0、2、7、14、21、28天采用稀释涂布法检测样品中的含菌量，每个样做三次平行实验，取其平均值计数。
评价标准：真菌菌落数在第七天时下降90％，细菌菌落数降低99.9％，并且在28天的实验过程中持续减少。
对照组和实施例组的面霜及洁面乳的防腐性能进行测试结果如下表8-11所示：
表8 实施例组制备的面霜的防腐性能测试结果表
表9 对照例组制备的面霜的防腐性能测试结果表
表10 实施例组制备的洁面乳的防腐性能测试结果表
表11 对照例组制备的洁面乳的防腐性能测试结果表
从表8-11可以看出，通过本发明方案的改良抑菌圈法和传统纸片法测试结果，本发明方案鉴定该植物防腐剂的最佳防腐效力浓度是0.0025g/mL，而纸片法的鉴定的防腐效力最佳浓度是0.004g/mL。用28天防腐挑战实验检测植物防腐剂KM浓度0.0025g/mL、0.004g/mL加入面霜与洁面乳中，由表8、9、10、11结果可知，植物防腐剂KM浓度为0.0025g/mL时也确实能达到最佳效果，因此也证明了本发明方案改良抑菌圈法能快速确定植物防腐剂KM防腐效力。同时，选取其他厂家或其他批次的防腐剂验证，结果一致，表明本发明方案稳定可靠。
本发明实施例中的微生物菌种均为市购，括号中的菌种编号为生产厂商在中国工业微生物菌种保藏管理中心(China Center of Industrial Culture Collection，CICC)的保藏编号。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等同变换，或直接或间接运用在相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (10)
1.一种快速判定植物防腐剂KM防腐效力的方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1、菌悬液的制备：取多种微生物菌种分别制备成菌悬液，每种菌悬液中微生物的浓度为105～106cfu/ml，所述微生物包括大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、白假丝酵母菌、黑曲霉菌和肺炎克雷伯氏菌；
S2、试验平板的制作：在已灭菌的平板中分别加入所述步骤S1制得的菌悬液，然后在每块所述平板上打孔，去除孔内的培养基并向孔内加入防腐剂，将加入防腐剂后的平板在培养箱中培养，其中，含细菌类微生物的平板在37℃下培养24h，含有真菌类微生物的平板在28℃下培养3天，霉菌类微生物的平板在28℃下培养5～7天，防腐剂的添加量为0.00125～0.02mg/ml；
S3、抑菌圈的测量：测量培养结束后的各平板中的抑菌圈直径，根据抑菌圈直径的大小定性判定植物防腐剂KM的防腐效力；若所述抑菌圈直径小于10mm，则判定所述植物防腐剂KM的抑菌效果较差；若所述抑菌圈直径在10mm以上，判定所述植物防腐剂KM的抑菌效果较好且抑菌圈的直径越大，抑菌效果越好。
2.根据权利要求1所述的快速判定植物防腐剂KM防腐效力的方法，其特征在于：若所述抑菌圈的直径大于20mm，则表明抑菌效果极佳。
3.根据权利要求1所述的快速判定植物防腐剂KM防腐效力的方法，其特征在于：所述防腐剂的添加体积为10～20μl；优选为15μl。
4.根据权利要求1所述的快速判定植物防腐剂KM防腐效力的方法，其特征在于：所述防腐剂的浓度为0.0025g/ml。
5.根据权利要求1所述的快速判定植物防腐剂KM防腐效力的方法，其特征在于：所述步骤S1具体包括以下步骤：将微生物菌种经复苏培养后确定菌液初始浓度，并稀释得到最终浓度为105～106cfu/ml浓度的菌悬液。
6.根据权利要求5所述的快速判定植物防腐剂KM防腐效力的方法，其特征在于：将复苏后的微生物菌种培养至第2代或第3代时，确定菌液初始浓度，并稀释得到最终浓度为105～106cfu/ml浓度的菌悬液。
7.根据权利要求6所述的快速判定植物防腐剂KM防腐效力的方法，其特征在于：通过稀释涂布平板法确定菌液中微生物的浓度。
8.根据权利要求5所述的快速判定植物防腐剂KM防腐效力的方法，其特征在于：所述大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和肺炎克雷伯氏菌均采用LB培养基进行培养，所述白假丝酵母菌选用麦芽浸膏培养基培养，所述黑曲霉菌选用PDA培养基进行培养。
9.根据权利要求1所述的快速判定植物防腐剂KM防腐效力的方法，其特征在于：所述步骤S2中，在已灭菌的平板中添加菌悬液80～120μl，优选为100μl。
10.根据权利要求1所述的快速判定植物防腐剂KM防腐效力的方法，其特征在于：所述孔为方孔，所述方孔为0.5cm*0.5cm的正方形结构。
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