CN110257070B - 一种中空氧化锆@量子点复合球及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种中空氧化锆@量子点复合球，包括中空氧化锆纳米球和负载在中空氧化锆纳米球表面的量子点。中空氧化锆球较好的碱性耐受性，更适宜量子点的负载，同时可以在合成量子点复合球时保持中空结构，使得中空氧化锆球比同尺寸的实心球载体更轻质。本发明提供的复合球在免疫层析技术应用中，不仅保留了量子点优异的荧光性能，还由于负载在中空氧化锆上，复合颗粒更便于离心分离，优化并简化了后处理的步骤；且中空氧化锆球比同尺寸的实心球载体更轻质，有利于免疫层析技术的灵敏显色，具有更优良的检测灵敏度和准确性，以及更低的检出限。

Description

一种中空氧化锆@量子点复合球及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及无机纳米复合材料领域。更具体地，涉及一种中空氧化锆@量子点复合球及其制备方法和应用。
背景技术
免疫层析技术(Immunochromatographic Assay，ICA)是结合免疫技术和色谱层析技术的一种分析方法，具有特异性强、操作简单、快速等优点，已经广泛应用于临床诊断、环境监测、食品安全等领域。传统的免疫层析技术以胶体金为标记物，通过条带显色对目标物定性检测或半定量分析。这种方法虽然简单快速，但总体灵敏度较差，难以实现准确定量。近些年，荧光免疫层析技术得到了快速发展，这种技术既保留了传统胶体金试纸条现场快速检测的优点，又兼具荧光检测技术高灵敏度的特点，为提高免疫层析方法的检测性能提供了一种新思路。
量子点荧光材料由于具有激发光谱宽且连续分布、发射光谱窄而对称、发光颜色可调、光化学稳定性高、荧光寿命长等优越的荧光特性，受到了研究人员的广泛关注，有望应用于太阳能电池、显示技术、生物和医药领域，是荧光免疫技术中适宜的荧光标记物。但量子点在免疫层析技术的实际应用中还存在一些问题。最主要的问题是量子点与抗体的偶联。免疫层析技术的核心是基于抗体对抗原的检测，所以量子点与抗体的偶联直接影响免疫层析技术的应用效果。量子点与抗体偶联后，需要多次分离洗涤。由于量子点尺寸较小，抗体也大多为分子量较低的蛋白，这给分离洗涤带来了很大的困难。即便成功分离，量子点也容易团聚，不易复溶，很难在免疫层析技术中应用。
近年来，研究人员研制出一些新型量子点复合材料用于免疫层析技术，例如中国专利201510116609.X，一种二氧化硅@量子点复合纳米颗粒的制备方法，以二氧化硅球为载体，将量子点包覆在二氧化硅球表面，使其易于离心处理。但这种复合材料用于免疫层析技术时仍然存在两个问题。第一个问题是在复合材料的合成过程中，由于量子点的合成大多是在高温碱性环境下，而二氧化硅在高温下对碱性耐受性差；因此，作为载体时需要使用较大尺寸的二氧化硅实心球，并采用相对低的温度，延长反应时间来合成复合球。这样条件下合成的量子点发光亮度受到影响，应用于免疫层析技术时灵敏度较低。第二个问题是由于采用二氧化硅实心球，使得复合球比重较大，影响免疫层析技术的显色。
因此，为了满足免疫层析技术的实际应用要求，需要发展一种对碱性耐受性好，轻质，工艺简单，易于推广应用的量子点复合球的合成方法。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种中空氧化锆@量子点复合球，包括中空氧化锆纳米球和负载在中空氧化锆纳米球表面的量子点，不仅保留了量子点优异的荧光性能，还由于负载在中空氧化锆纳米球上，复合颗粒更便于离心分离，优化并简化了后处理的步骤。
本发明的第二个目的在于提供上述中空氧化锆@量子点复合球的制备方法，该制备方法简单易行，产量大，效率高，易于形成规模化生产。
本发明第三个目的在于提供上述中空氧化锆@量子点复合球作为免疫层析荧光标记物的应用。
为达到上述目的，本发明采用下述技术方案：
本发明第一个方面，提供了一种中空氧化锆@量子点复合球，包括中空氧化锆纳米球和负载在中空氧化锆纳米球表面的量子点；其中，所述中空氧化锆@量子点复合球的粒径为55～310nm，所述中空氧化锆纳米球的粒径为50～300nm。
优选地，所述中空氧化锆@量子点复合球的粒径为105～210nm，所述中空氧化锆纳米球的粒径为100～200nm。
优选地，所述量子点包括硒化镉、碲化镉、硫化镉、硫化锌、硒化锌、硒化铅或硫化铅。
需要说明的是，本发明提供的中空氧化锆纳米球的粒径要远远大于量子点的粒径，在中空氧化锆纳米球的表面负载有数目众多的量子点，两者形成一种“核-壳”结构。中空氧化锆@量子点复合球的粒径主要是由中空氧化锆纳米球的粒径决定的，其表面量子点的包覆层较薄，当中空氧化锆纳米球粒径分布在50-300nm时，有利于表面抗体偶联处理和免疫层析试纸条测试，因为当中空氧化锆纳米球的粒径小于50nm时，复合球与抗体连接后不易离心分离；当中空氧化锆纳米球的粒径大于300nm时，粒度过大，不易显色
优选地，例如，所述中空氧化锆@量子点复合球的粒径包括但不限于85-285nm、105-255nm、125-235nm、155-215nm或175-195nm。
所述中空氧化锆纳米球的粒径包括但不限于80-280nm、100-250nm、120-230nm、150-210nm或170-190nm。
本发明中提供的中空氧化锆纳米球相对二氧化硅球，具有更好的碱性耐受性，可以在更高温度的碱性体系下合成中空氧化锆@量子点复合球，进而提高复合球的荧光强度；相比实心二氧化硅球，二氧化锆的中空结构有利于其通过离心而与抗体分离，且相同重量的复合球中，在二氧化锆@量子点复合球中量子点的比重更大，因此本发明提供的中空氧化锆@量子点复合球在免疫层析技术中具有优良的检测灵敏度、准确性以及较低的检出限。
另一方面，本发明采用的载体材料为中空氧化锆，由于量子点包覆在载体表面，无需利用载体内部，实心球作为载体往往比重较大，这使得应用于免疫层析技术时，测试的“C线”和“T线”显色较慢，检测时间过长。而中空氧化锆球由于较好的碱性耐受性，可以在合成量子点复合球时保持中空结构，因而比同尺寸的实心球载体更轻质，有利于免疫层析技术的显色。
此外，本发明制备的中空氧化锆@量子点复合球保留了量子点优异的荧光性能，不仅荧光强，还具有多色发光的特性，可以实现几种待测物不同颜色发光的同时检测，这是传统胶体金免疫层析技术无法做到的。
本发明第二个方面，提供了一种中空氧化锆@量子点复合球的制备方法，包括如下步骤：
(1)制备巯基化中空氧化锆球
在极性有机溶剂中加入中空氧化锆球和3-巯基丙基三甲氧基硅烷(MPS)，进行反应，离心分离，所得沉淀真空干燥，即制得巯基化中空氧化锆球；
(2)制备中空氧化锆@量子点复合球
将步骤(1)制备的巯基化中空氧化锆球分散在水溶液中，加入金属离子和巯基化合物，调节溶液的pH值为7～11，再加入非金属离子，得到前驱体混合液，水热反应；最后离心分离，所得沉淀真空干燥，即制得中空氧化锆@量子点复合球。
优选地，步骤(1)中，所述极性有机溶剂包括但不限于甲醇、乙醇以及丙酮。
优选地，步骤(1)中，混合液反应的条件为室温下反应2～6小时。
优选地，步骤(1)中，所述混合液中中空氧化锆球的浓度为6.2×10－3～0.23mol/L，3-巯基丙基三甲氧基硅烷的浓度为5.4×10－7～3.5×10－4mol/L。
在本发明中，3-巯基丙基三甲氧基硅烷的加入是为了在二氧化锆球表面引入巯基基团，实现中空氧化锆球的巯基化。巯基基团会吸附金属粒子，发生螯合反应。金属粒子能够很快与巯基基团络合配位，形成具有一定结构的配位化合物。因此增加纳米颗粒上巯基基团的含量就能形成更多的配位点，从而与更多金属离子键合。本发明提供的3-巯基丙基三甲氧基硅烷的加入量范围内，可以在二氧化锆纳米球表面形成足够的巯基，进而得到适宜的量子点负载量。
优选地，步骤(2)中，水热反应的条件为在120～250℃下反应0.2～3小时。
优选地，步骤(2)中，所述前驱体混合液中巯基化中空氧化锆球的浓度为5.7×10－4～8.3×10－2mol/L，金属离子的浓度为1.2×10－5～0.23mol/L，巯基化合物的浓度为2.5×10－5～3.7mol/L，非金属离子的浓度为6.3×10－6～8.7×10－2mol/L。
巯基化合物在量子点合成中作为表面修饰剂，能够与金属离子发生作用，从而络合在金属离子表面，另一端的长链分子起到空间位阻的作用，从而合成小尺寸、具有荧光性能的量子点。
优选地，步骤(2)中，所述金属离子包括但不限于Cd2+、Pd2+或Zn2+。可通过加入含有上述金属离子的化合物提供金属离子，如：氯化镉、氯化铅、氯化锌、氯酸镉、氯酸锌、高氯酸镉、高氯酸锌、硝酸镉、硝酸锌、硝酸铅、醋酸镉、醋酸锌、醋酸铅、硫酸镉、硫酸锌、碘化镉或溴化锌。
优选地，步骤(2)中，所述巯基化合物包括但不限于巯基乙酸、巯基丙酸、N-乙酰-L-半胱氨酸、谷胱甘肽、半胱氨酸，巯基琥珀酸、巯基乙胺、巯基丙胺或巯基丁胺。
优选地，步骤(2)中，可通过加入氢氧化钾或氢氧化钠来进行溶液pH的调节。
优选地，步骤(2)中，所述非金属离子包括但不限于Te2-、Se2-或S2-。可通过加入含有上述非金属离子的化合物提供非金属离子，如：碲氢化钠、碲氢化钾、硒氢化钠、硒氢化钾、硫化钠或硫化钾。
本发明第三个方面提供了上述中空氧化锆@量子点复合球作为免疫层析荧光标记物的应用。
利用本发明的制备方法合成出的中空氧化锆@量子点复合球不仅具有常规量子点的优异性能，并且由于氧化锆的中空结构，使得复合球比相同尺寸的其他复合球更轻质，有利于免疫层析技术的显色，更适于应用在免疫层析技术中。
本发明的有益效果如下：
本发明提供一种中空氧化锆@量子点复合球，包括中空氧化锆纳米球和负载在中空氧化锆纳米球表面的量子点。
氧化锆纳米球具有更好的碱性耐受性，可以在更高温度的碱性体系下合成中空氧化锆@量子点复合球，进而提高复合球的荧光强度；中空氧化锆球更适宜量子点的负载，同时可以在合成量子点复合球时保持中空结构，使得中空氧化锆球比同尺寸的实心球载体更轻质，有利于复合球的离心分离，并可提高检测显色速率；中空氧化锆@量子点复合球保留了量子点优异的荧光性能，不仅荧光强，还具有多色发光的特性，可以实现几种待测物不同颜色发光的同时检测，这是传统胶体金免疫层析技术无法做到的。
因此，本发明制备的中空氧化锆@量子点复合球在免疫层析技术中具有更高的检测灵敏度、准确度以及更低的检出限，且兼具多色发光特性，实现几种待测物不同颜色发光的同时检测。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。
图1示出本发明实施例1制备的中空氧化锆@碲化镉复合球的电镜照片。
图2示出本发明实施例1制备的中空氧化锆@碲化镉复合球用于检测C反应蛋白(CRP)的免疫层析试纸的照片。
图3示出本发明实施例1中的中空氧化锆@碲化镉复合球用于检测C反应蛋白(CRP)的免疫层析试纸在手持式紫外灯照射下的照片。
图4示出本发明对比例1中的碲化镉量子点用于检测C反应蛋白(CRP)的免疫层析试纸在手持式紫外灯照射下的照片。
图5示出实施例2和对比例2中的免疫层析试纸在手持式紫外灯照射下的照片；其中，5A和5B为实施例2中空氧化锆@碲化镉复合球用于检测C反应蛋白(CRP)的结果；5C为对比例2中实心二氧化硅@量子点复合球用于检测C反应蛋白(CRP)的结果。
图6示出实施例3和对比例3中的免疫层析试纸在手持式紫外灯照射下的照片；其中，6A为对比例3中实心二氧化硅@量子点复合球用于检测C反应蛋白(CRP)的结果；6B为实施例3中空氧化锆@碲化镉复合球用于检测C反应蛋白(CRP)的结果。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例和附图对本发明做进一步的说明。附图中相似的部件以相同的附图标记进行表示。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。
实施例1
1、制备巯基化中空氧化锆球
在无水乙醇中加入中空氧化锆球和3-巯基丙基三甲氧基硅烷(MPS)，混合液中中空氧化锆球的浓度为1.2×10－3mol/L，MPS的浓度为5.3×10－5mol/L，室温下反应4小时，离心分离，所得沉淀真空干燥，制得巯基化中空氧化锆球；
2、制备中空氧化锆@碲化镉复合球
将步骤1制备的巯基化中空氧化锆球分散在水溶液中，加入氯化镉和N-乙酰-L-半胱氨酸，用氢氧化钠调节溶液的pH值为7.2，再加入碲氢化钠，得到前驱体混合液，其中巯基化中空氧化锆球的浓度为2.3×10－3mol/L，氯化镉的浓度为3.1×10－4mol/L，碲氢化钠的浓度为5.2×10－5mol/L，N-乙酰-L-半胱氨酸的浓度为2.2×10－5mol/L。将前驱体混合液倒入水热釜中，在180℃下反应0.5小时；将混合液离心分离，所得沉淀真空干燥后，得到中空氧化锆@碲化镉复合球(ZrO2@CdTe)，电镜照片见附图1，其中中空氧化锆纳米球的粒径为155nm，复合球的粒径为160nm。
3、中空氧化锆@碲化镉复合球用于荧光免疫层析试纸条
(1)向2ml吗啉乙磺酸缓冲溶液(pH值为5.5)中加入2.4μmol中空氧化锆@碲化镉复合球、10μg EDC和15μg NHS溶液，室温搅拌45min，离心分离。得到的沉淀分散在2ml磷酸盐缓冲溶液(pH值为7.0)中，加入10μg C反应蛋白(CRP)的单抗溶液，室温搅拌1小时。加入500μl的10％牛血清蛋白封闭，室温搅拌1小时，离心分离纯化，得到CRP抗体修饰的中空氧化锆@碲化镉复合球，将CRP抗体修饰的中空氧化锆@碲化镉复合球分散到200μl磷酸盐缓冲溶液(pH值为7.0)中，4℃下保存。
(2)以划膜仪在弱荧光层析膜上划四条平行条带，条带间隔5mm，条带宽都约为1mm。其中左侧两条为质控带(C带)，右侧两条检测带(T带)。质控带上喷涂羊抗鼠IgG多克隆抗体，浓度为1mg/ml。定量带喷涂CRP单克隆抗体2，浓度为3mg/ml。37℃干燥后密封，4℃下保存。
(3)在黑色底板上，依次粘贴样品垫(长30cm，宽16mm)、过滤膜(长30cm，宽10mm)、标记垫(长30cm，宽8mm)、层析膜(长30cm，宽2.5cm)和吸水垫(长30cm，宽16mm)。膜与膜之间都要紧密相连，制成免疫层析试纸大板。用切条机将粘贴好的试纸大板纵向切成4mm宽的试纸条，放入低荧光扣卡中，干燥后密封，4℃下保存。拍摄的照片如图2所示。
(4)用100μl的浓度为5μg/L CRP抗原样品与20μlCRP抗体修饰的中空氧化锆@碲化镉复合球溶液混合，将样品滴加到上样孔上，之后显色，用手持式紫外灯照射观察。所得结果如图3所示。
从图3可以看到，在紫外灯照射下，中空氧化锆@碲化镉复合球免疫层析试纸的阴线有一条明显的条带，阳线中的检测带(T带)出现了两条明显的条带，说明免疫层析试纸可以检测出加入样品中的CRP抗原，并且具有较好的检测特异性。
对比例1
碲化镉量子点用于荧光免疫层析试纸条
对比例1中碲化镉量子点荧光免疫层析试纸条采用和实施例1同样的方法制作，用0.1μmol碲化镉量子点代替2.4μmol中空氧化锆@碲化镉复合球，对比例1的所得结果如图4所示。采用电感耦合等离子体光谱仪检测发现0.1μmol碲化镉量子点中镉元素的含量与2.4μmol中空氧化锆@碲化镉复合球中镉元素的含量相当，即实施例1和对比例1中所使用的碲化镉量子点含量相当。
图4中，作为对比的碲化镉量子点免疫层析试纸中，阴线和阳线基本都只有一条带，阳线中的检测带(T带)几乎看不到。
实施例1的结果图3和对比例1的结果图4对比说明，在同样的操作条件下，荧光复合球比单独的量子点更易后处理，并且可以避免颗粒间的团聚，能够更有效的偶联抗体，达到了灵敏检测的效果。
实施例2
中空氧化锆@碲化镉复合球用于荧光免疫层析试纸条
将实施例1制备得到的中空氧化锆@碲化镉复合球用于荧光免疫层析试纸条，试纸条的制作方法与实施例1相同，只是加入CRP抗原的浓度修改为6μg/L和1.5μg/L，所得结果如图5A和5B所示。
图5A和5B显示，当加入的CRP抗原的浓度为6μg/L时，阳线中的检测带(T带)有明显的条带，随着CRP量的减少，T线的条带逐渐变弱，但是当CRP抗原的浓度为1.5μg/L时还能观察到T线的条带。
对比例2
实心二氧化硅@碲化镉复合球用于荧光免疫层析试纸条
对比例2中碲化镉量子点荧光免疫层析试纸条采用和实施例2同样的方法制作，用2.4μmol的实心二氧化硅@碲化镉复合球代替2.4μmol中空氧化锆@碲化镉复合球，加入CRP抗原的浓度为6μg/L，所得结果如图5C所示。
图5C显示，当加入的CRP抗原的浓度为6μg/L时，阳线中的检测带(T带)看不到条带。
当抗原浓度相同时，5A和5C的结果对比说明，本发明提供的中空氧化锆@量子点复合球具有更好的灵敏度和准确度。5B和5C的结果对比则说明，本发明提供的中空氧化锆@量子点复合球在免疫层析技术中的检出限更低。
实施例3
中空氧化锆@碲化镉复合球用于荧光免疫层析试纸条
将实施例1制备得到的中空氧化锆@碲化镉复合球用于荧光免疫层析试纸条，试纸条的制作方法与实施例1相同，加入CRP抗原的浓度为12μg/L。加入CRP抗原10min后，阳线中的检测带(T带)已经清晰可见，如图6B所示。
对比例3
实心二氧化硅@碲化镉复合球用于荧光免疫层析试纸条
对比例3中碲化镉量子点荧光免疫层析试纸条采用和实施例3同样的方法制作，用2.4μmol的实心二氧化硅@碲化镉复合球代替2.4μmol中空氧化锆@碲化镉复合球。可以发现加入CRP抗原10min后，阳线中的检测带(T带)几乎无法观测得到，如图6A所示，且直至40min后，6A中的阳线中的检测带(T带)才能够清晰可见。
图6所示的实施例3和对比例3的结果说明，本发明提供的中空氧化锆@量子点复合球在免疫层析技术中的显色速率更快。
实施例4
1、制备巯基化中空氧化锆球
在无水乙醇中加入中空氧化锆球和3-巯基丙基三甲氧基硅烷(MPS)，混合液中中空氧化锆球的浓度为6.2×10－3mol/L，MPS的浓度为2.5×10－6mol/L，室温下反应2小时，离心分离，所得沉淀真空干燥，即制得巯基化中空氧化锆球；
2、制备中空氧化锆@硒化镉复合球
将步骤1制备的巯基化中空氧化锆球分散在水溶液中，加入硝酸镉和巯基乙酸，用氢氧化钾调节溶液的pH值为8.5，再加入硒氢化钾，得到前驱体混合液，其中巯基化中空氧化锆球的浓度为3.4×10－2mol/L，硝酸镉的浓度为7.3×10－4mol/L，硒氢化钾的浓度为1.9×10－4mol/L，巯基乙酸的浓度为5.2×10－4mol/L。将前驱体混合液倒入水热釜中，在160℃下反应1小时；将混合液离心分离，所得沉淀真空干燥后，得到中空氧化锆@硒化镉复合球(ZrO2@CdSe)，其中中空氧化锆纳米球的粒径为50nm，复合球的粒径为55nm。
3、中空氧化锆@硒化镉复合球用于荧光免疫层析试纸条
(1)向2ml吗啉乙磺酸缓冲溶液(pH值为5.5)中加入2.4μmol中空氧化锆@硒化镉复合球、10μg EDC和15μg NHS溶液，室温搅拌45min，离心分离。得到的沉淀分散在2ml磷酸盐缓冲溶液(pH值为7.0)中，加入10μg肌红蛋白(MYO)的单抗溶液，室温搅拌1小时。加入500μl的10％牛血清蛋白封闭，室温搅拌1小时，离心分离纯化，得到MYO抗体修饰的中空氧化锆@硒化镉复合球，将MYO抗体修饰的中空氧化锆@硒化镉复合球分散到200μl磷酸盐缓冲溶液(pH值为7.0)中，4℃下保存。
(2)以划膜仪在弱荧光层析膜上划四条平行条带，条带间隔5mm，条带宽都约为1mm。其中左侧两条为质控带(C带)，右侧两条检测带(T带)。质控带上喷涂羊抗鼠IgG多克隆抗体，浓度为1mg/ml。定量带喷涂MYO单克隆抗体2，浓度为3mg/ml。37℃干燥后密封，4℃下保存。
(3)在黑色底板上，依次粘贴样品垫(长30cm，宽16mm)、过滤膜(长30cm，宽10mm)、标记垫(长30cm，宽8mm)、层析膜(长30cm，宽2.5cm)和吸水垫(长30cm，宽16mm)。膜与膜之间都要紧密相连，制成免疫层析试纸大板。用切条机将粘贴好的试纸大板纵向切成4mm宽的试纸条，放入低荧光扣卡中，干燥后密封，4℃下保存。
(4)用不同浓度100μl MYO抗原样品与20μl MYO抗体修饰的中空氧化锆@硒化镉复合球溶液混合，将样品滴加到上样孔上，15分钟后，用手持式紫外灯照射观察，结果显示随MYO抗原浓度增加，阳线中的检测带(T带)的红色条带逐渐加深。
实施例5
1、制备巯基化中空氧化锆球
在无水乙醇中加入中空氧化锆球和3-巯基丙基三甲氧基硅烷(MPS)，混合液中中空氧化锆球的浓度为0.15mol/L，MPS的浓度为3.5×10－4mol/L，室温下反应3小时，离心分离，所得沉淀真空干燥，即制得巯基化中空氧化锆球；
2、制备中空氧化锆@硒化锌复合球
将步骤1制备的巯基化中空氧化锆球分散在水溶液中，加入硝酸锌和巯基丙酸，用氢氧化钠调节溶液的pH值为9.2，再加入硒氢化钠，得到前驱体混合液，其中巯基化中空氧化锆球的浓度为5.7×10－4mol/L，硝酸锌的浓度为1.2×10－5mol/L，硒氢化钠的浓度为3.4×10－3mol/L，巯基丙酸的浓度为6.8×10－3mol/L。将前驱体混合液倒入水热釜中，在120℃下反应3小时；将混合液离心分离，所得沉淀真空干燥后，得到中空氧化锆@硒化锌复合球(ZrO2@ZnSe)，其中中空氧化锆纳米球的粒径为250nm，复合球的粒径为260nm。
3、中空氧化锆@硒化锌复合球用于荧光免疫层析试纸条
(1)向2ml吗啉乙磺酸缓冲溶液(pH值为5.5)中加入2.4μmol中空氧化锆@硒化锌复合球、10μg EDC和15μg NHS溶液，室温搅拌45min，离心分离。得到的沉淀分散在2ml磷酸盐缓冲溶液(pH值为7.0)中，加入10μg D-二聚体(D-Dimer)的单抗溶液，室温搅拌1小时。加入500μl的10％牛血清蛋白封闭，室温搅拌1小时，离心分离纯化，得到D-Dimer抗体修饰的中空氧化锆@硒化锌复合球，将D-Dimer抗体修饰的中空氧化锆@硒化锌复合球分散到200μl磷酸盐缓冲溶液(pH值为7.0)中，4℃下保存。
(2)以划膜仪在弱荧光层析膜上划四条平行条带，条带间隔5mm，条带宽都约为1mm。其中左侧两条为质控带(C带)，右侧两条检测带(T带)。质控带上喷涂羊抗鼠IgG多克隆抗体，浓度为1mg/ml。定量带喷涂D-Dimer单克隆抗体2，浓度为3mg/ml。37℃干燥后密封，4℃下保存。
(3)在黑色底板上，依次粘贴样品垫(长30cm，宽16mm)、过滤膜(长30cm，宽10mm)、标记垫(长30cm，宽8mm)、层析膜(长30cm，宽2.5cm)和吸水垫(长30cm，宽16mm)。膜与膜之间都要紧密相连，制成免疫层析试纸大板。用切条机将粘贴好的试纸大板纵向切成4mm宽的试纸条，放入低荧光扣卡中，干燥后密封，4℃下保存。
(4)用不同浓度100μl D-Dimer抗原样品与20μl D-Dimer抗体修饰的中空氧化锆@硒化锌复合球溶液混合，将样品滴加到上样孔上，15分钟后，用手持式紫外灯照射观察，结果显示随D-Dimer抗原浓度增加，阳线中的检测带(T带)的绿色条带逐渐加深。
实施例6
1、制备巯基化中空氧化锆球
在无水乙醇中加入中空氧化锆球和3-巯基丙基三甲氧基硅烷(MPS)，混合液中中空氧化锆球的浓度为0.23mol/L，MPS的浓度为6.3×10－5mol/L，室温下反应5小时，离心分离，所得沉淀真空干燥，即制得巯基化中空氧化锆球。
2、制备中空氧化锆@硫化锌复合球
将步骤1制备的巯基化中空氧化锆球分散在水溶液中，加入醋酸锌和半胱氨酸，用氢氧化钠调节溶液的pH值为7，再加入硫化钠，得到前驱体混合液，其中巯基化中空氧化锆球的浓度为8.3×10－2mol/L，醋酸锌的浓度为4.2×10－2mol/L，硫化钠的浓度为8.7×10－ 2mol/L，半胱氨酸的浓度为3.7mol/L。将前驱体混合液倒入水热釜中，在250℃下反应0.2小时；将混合液离心分离，所得沉淀真空干燥后，得到中空氧化锆@硫化锌复合球(ZrO2@ZnS)，其中中空氧化锆纳米球的粒径为100nm，复合球的粒径为106nm。
3、中空氧化锆@硫化锌复合球用于荧光免疫层析试纸条
(1)向2ml吗啉乙磺酸缓冲溶液(pH值为5.5)中加入2.4μmol中空氧化锆@硫化锌复合球、10μg EDC和15μg NHS溶液，室温搅拌45min，离心分离。得到的沉淀分散在2ml磷酸盐缓冲溶液(pH值为7.0)中，加入10μg N末端B型脑钠钛前体(NT-proBNP)的单抗溶液，室温搅拌1小时。加入500μl的10％牛血清蛋白封闭，室温搅拌1小时，离心分离纯化，得到NT-proBNP抗体修饰的中空氧化锆@硫化锌复合球，将NT-proBNP抗体修饰的中空氧化锆@硫化锌复合球分散到200μl磷酸盐缓冲溶液(pH值为7.0)中，4℃下保存。
(2)以划膜仪在弱荧光层析膜上划四条平行条带，条带间隔5mm，条带宽都约为1mm。其中左侧两条为质控带(C带)，右侧两条检测带(T带)。质控带上喷涂羊抗鼠IgG多克隆抗体，浓度为1mg/ml。定量带喷涂NT-proBNP单克隆抗体2，浓度为3mg/ml。37℃干燥后密封，4℃下保存。
(3)在黑色底板上，依次粘贴样品垫(长30cm，宽16mm)、过滤膜(长30cm，宽10mm)、标记垫(长30cm，宽8mm)、层析膜(长30cm，宽2.5cm)和吸水垫(长30cm，宽16mm)。膜与膜之间都要紧密相连，制成免疫层析试纸大板。用切条机将粘贴好的试纸大板纵向切成4mm宽的试纸条，放入低荧光扣卡中，干燥后密封，4℃下保存。
(4)用不同浓度100μl NT-proBNP抗原样品与20μl NT-proBNP抗体修饰的中空氧化锆@硫化锌复合球溶液混合，将样品滴加到上样孔上，15分钟后，用手持式紫外灯照射观察，结果显示随NT-proBNP抗原浓度增加，阳线中的检测带(T带)的蓝色条带逐渐加深。
实施例7
1、制备巯基化中空氧化锆球
在无水乙醇中加入中空氧化锆球和3-巯基丙基三甲氧基硅烷(MPS)，混合液中中空氧化锆球的浓度为7.5×10－2mol/L，MPS的浓度为5.4×10－7mol/L，室温下反应6小时，离心分离，所得沉淀真空干燥，即制得巯基化中空氧化锆球；
2、制备中空氧化锆@硫化铅复合球
将步骤1制备的巯基化中空氧化锆球分散在水溶液中，加入氯化铅和谷胱甘肽，用氢氧化钾调节溶液的pH值为10，再加入硫化钠，得到前驱体混合液，其中巯基化中空氧化锆球的浓度为6.1×10－3mol/L，氯化铅的浓度为8.3×10－3mol/L，硫化钠的浓度为6.3×10－ 6mol/L，半胱氨酸的浓度为1.4×10－2mol/L。将前驱体混合液倒入水热釜中，在220℃下反应1.5小时；将混合液离心分离，所得沉淀真空干燥后，得到中空氧化锆@硫化铅复合球(ZrO2@PbS)，其中中空氧化锆纳米球的粒径为300nm，复合球的粒径为305nm。
3、中空氧化锆@硫化铅复合球用于荧光免疫层析试纸条
(1)向2ml吗啉乙磺酸缓冲溶液(pH值为5.5)中加入2.4μmol中空氧化锆@硫化铅复合球、10μg EDC和15μg NHS溶液，室温搅拌45min，离心分离。得到的沉淀分散在2ml磷酸盐缓冲溶液(pH值为7.0)中，加入10μg CRP的单抗溶液，室温搅拌1小时。加入500μl的10％牛血清蛋白封闭，室温搅拌1小时，离心分离纯化，得到CRP抗体修饰的中空氧化锆@硫化铅复合球，将CRP抗体修饰的中空氧化锆@硫化铅复合球分散到200μl磷酸盐缓冲溶液(pH值为7.0)中，4℃下保存。
(2)以划膜仪在弱荧光层析膜上划四条平行条带，条带间隔5mm，条带宽都约为1mm。其中左侧两条为质控带(C带)，右侧两条检测带(T带)。质控带上喷涂羊抗鼠IgG多克隆抗体，浓度为1mg/ml。定量带喷涂CRP单克隆抗体2，浓度为3mg/ml。37℃干燥后密封，4℃下保存。
(3)在黑色底板上，依次粘贴样品垫(长30cm，宽16mm)、过滤膜(长30cm，宽10mm)、标记垫(长30cm，宽8mm)、层析膜(长30cm，宽2.5cm)和吸水垫(长30cm，宽16mm)。膜与膜之间都要紧密相连，制成免疫层析试纸大板。用切条机将粘贴好的试纸大板纵向切成4mm宽的试纸条，放入低荧光扣卡中，干燥后密封，4℃下保存。
(4)用不同浓度100μl CRP抗原样品与20μl CRP抗体修饰的中空氧化锆@硫化铅复合球溶液混合，将样品滴加到上样孔上，15分钟后，用手持式紫外灯照射观察，结果显示随CRP抗原浓度增加，阳线中的检测带(T带)的红色条带逐渐加深。
实施例8
1、制备巯基化中空氧化锆球
在无水乙醇中加入中空氧化锆球和3-巯基丙基三甲氧基硅烷(MPS)，混合液中中空氧化锆球的浓度为4.8×10－3mol/L，MPS的浓度为8.2×10－6mol/L，室温下反应3.5小时，离心分离，所得沉淀真空干燥，即制得巯基化中空氧化锆球；
2、制备中空氧化锆@碲化镉复合球
将步骤1制备的巯基化中空氧化锆球分散在水溶液中，加入氯化镉和巯基琥珀酸，用氢氧化钾调节溶液的pH值为11，再加入碲氢化钠，得到前驱体混合液，其中巯基化中空氧化锆球的浓度为3.2×10－2mol/L，氯化镉的浓度为0.23mol/L，碲氢化钠的浓度为5.5×10－ 2mol/L，巯基琥珀酸的浓度为2.5×10－5mol/L。将前驱体混合液倒入水热釜中，在200℃下反应2.2小时；将混合液离心分离，所得沉淀真空干燥后，得到中空氧化锆@碲化镉复合球(ZrO2@CdTe)，其中中空氧化锆纳米球的粒径为180nm，复合球的粒径为184nm。
3、中空氧化锆@碲化镉复合球用于荧光免疫层析试纸条
(1)向2ml吗啉乙磺酸缓冲溶液(pH值为5.5)中加入2.4μmol中空氧化锆@碲化镉复合球、10μg EDC和15μg NHS溶液，室温搅拌45min，离心分离。得到的沉淀分散在2ml磷酸盐缓冲溶液(pH值为7.0)中，加入10μg降钙素原(PCT)的单抗溶液，室温搅拌1小时。加入500μl的10％牛血清蛋白封闭，室温搅拌1小时，离心分离纯化，得到PCT抗体修饰的中空氧化锆@碲化镉复合球，将PCT抗体修饰的中空氧化锆@碲化镉复合球分散到200μl磷酸盐缓冲溶液(pH值为7.0)中，4℃下保存。
(2)以划膜仪在弱荧光层析膜上划四条平行条带，条带间隔5mm，条带宽都约为1mm。其中左侧两条为质控带(C带)，右侧两条检测带(T带)。质控带上喷涂羊抗鼠IgG多克隆抗体，浓度为1mg/ml。定量带喷涂PCT单克隆抗体2，浓度为3mg/ml。37℃干燥后密封，4℃下保存。
(3)在黑色底板上，依次粘贴样品垫(长30cm，宽16mm)、过滤膜(长30cm，宽10mm)、标记垫(长30cm，宽8mm)、层析膜(长30cm，宽2.5cm)和吸水垫(长30cm，宽16mm)。膜与膜之间都要紧密相连，制成免疫层析试纸大板。用切条机将粘贴好的试纸大板纵向切成4mm宽的试纸条，放入低荧光扣卡中，干燥后密封，4℃下保存。
(4)用不同浓度100μl PCT抗原样品与20μl PCT抗体修饰的中空氧化锆@碲化镉复合球溶液混合，将样品滴加到上样孔上，15分钟后，用手持式紫外灯照射观察，结果显示随PCT抗原浓度增加，阳线中的检测带(T带)的黄色条带逐渐加深。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

Claims (11)

1.一种中空氧化锆@量子点复合球作为免疫层析荧光标记物的应用，其特征在于，所述中空氧化锆@量子点复合球包括中空氧化锆纳米球和负载在中空氧化锆纳米球表面的量子点；其中，所述中空氧化锆@量子点复合球的粒径为55～310nm，所述中空氧化锆纳米球的粒径为50～300nm。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述中空氧化锆@量子点复合球的粒径为105～210nm，所述中空氧化锆纳米球的粒径为100～200nm。
3.根据权利要求1所述的应用， 其特征在于，所述量子点包括硒化镉、碲化镉、硫化镉、硫化锌、硒化锌、硒化铅或硫化铅。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述中空氧化锆@量子点复合球的制备方法，包括如下步骤：
(1)制备巯基化中空氧化锆球
在极性有机溶剂中加入中空氧化锆球和3-巯基丙基三甲氧基硅烷，进行反应，离心分离，所得沉淀真空干燥，即制得巯基化中空氧化锆球；
(2)制备中空氧化锆@量子点复合球
将步骤(1)制备的巯基化中空氧化锆球分散在水溶液中，加入金属离子和巯基化合物，调节溶液的pH值为7～11，再加入非金属离子，得到前驱体混合液，水热反应；最后离心分离，所得沉淀真空干燥，即制得中空氧化锆@量子点复合球。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：步骤(1)中，所述反应的条件为室温下反应2～6小时。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：步骤(1)中，所述中空氧化锆球的浓度为6.2×10－3～0.23mol/L，3-巯基丙基三甲氧基硅烷的浓度为5.4×10－7～3.5×10－4mol/L。
7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：步骤(2)中，所述水热反应的条件为在120～250℃下反应0.2～3小时。
8.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：步骤(2)中，所述前驱体混合液中巯基化中空氧化锆球的浓度为5.7×10－4～8.3×10－2mol/L，金属离子的浓度为1.2×10－5～0.23mol/L，巯基化合物的浓度为2.5×10－5～3.7mol/L，非金属离子的浓度为6.3×10－6～8.7×10－2mol/L。
9.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：步骤(2)中，所述金属离子包括Cd2+、Pd2+或Zn2+。
10.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：步骤(2)中，所述巯基化合物包括巯基乙酸、巯基丙酸、N-乙酰-L-半胱氨酸、谷胱甘肽、半胱氨酸，巯基琥珀酸、巯基乙胺、巯基丙胺或巯基丁胺。
11.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：步骤(2)中，所述非金属离子包括Te2-、Se2-或S2-。
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