CN110251995A - 一种富血小板血浆的经济制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种富血小板血浆的经济制备方法,其中,具体步骤如下:采用10ML的导管封管器;输入9ML患者静脉血;放入转速为2100rpm的离心机中离心,使血液分成三层;之后微量推注泵启动;利用微量推注泵均匀缓慢推压导管封管器;导管封管器放入转速为2100rpm的离心机中离心,血液仍分成三层;利用微量推注泵推血浆层约为2ML转移到L形式布局连接的一次性5Ml无菌注射器内;取血液标本到营养琼脂平板培养基血培养皿上进行细菌培养;关闭微量推注泵;如此完成提取PRP工作。本发明具有操作流程简单规范化可复制化,整个过程均在一个导管封管器中完成,避免操作过程细菌传染、微量推注泵控制代替手工操作提取PRP精准稳定,及避免血小板破坏或者被激活和成本低的效果。
Description
技术领域
本发明涉及医疗器械技术领域,特别涉及一种富血小板血浆的经济制备方法。
背景技术
富血小板血浆(platelet-rich plasma简称PRP)的应用在许多领域都有文献记载。1987年最早由M.Ferrari于1987年提出,作为心脏开放手术后的自体输血组件,以避免同源血液制品输血。现在有超过5200个条目在NCBI(美国国立生物技术信息中心)中,PRP范围从骨科领域,运动医学,牙科,耳鼻喉科、神经外科、眼科、泌尿科、伤口愈合、化妆品、心胸和颌面外科。PRP由纤维蛋白胶(fibrin glue,FG)发展而来。FG从自体或异体血浆中经过离心的方法提取出来,含有高浓度的纤维蛋白原,可以用来封闭创面,止血,加强创面收缩,促进伤口愈合。早期FG大部分从血库里的异体血中提取。最早在1982年Matras将FG应用于颌面外科取得了良好的临床疗效。其后Matras和她的同事将FG制作成商业产品Tissel(Immuno,Vienna,奥地利),在欧洲市场应用较广,但这种商业产品的临床应用一直没有获得美国FDA批准,因为FG的应用无法避免异体间的疾病传播,如HIV、肝炎等。由于异体FG的排异、制作过程复杂,自体FG费用昂贵等因素,人们逐渐开始寻找研究自体的、简化的、有更高疗效的替代物。与FG相似,PRP也是用离心的方式从血中提取。不同的是PRP不仅含有高浓度的纤维蛋白,更重要的是还含有高浓度的血小板。1993年Hood等首先提出富血小板血浆(PRP)概念,并发现PRP含有丰富的血小板,是经过自身静脉血离心得到的。PRP的制备原理是依据血液中各组分的比重不同而进行分层制备,离心后将血液分为下层、中层和上层,下层深红色液体为红细胞层,上层淡黄色液体为血浆层,二者之间一薄层白色不透明液体即富血小板血浆。PRP最初的流行源于其作为一种安全、自然的手术替代品的前景。PRP的倡导者将这种疗法推广为一种有机疗法,通过使用自身的自然生长因子来治愈疾病。血小板的α颗粒在血小板激活后能释放出大量的生长因子,早期对PRP生长因子的研究主要集中在在PDGF和TGF-β这两个生长因子。将PRP植入创面,生长因子PDGF和TGF-β与周围修复细胞膜上的受体结合,通过信号传导至细胞核,促进细胞的增殖与分化。PDGF可促进骨细胞增殖,加快血管再生与增加巨噬细胞活性。TGF-β可促进成纤维细胞、前成骨细胞和基质干细胞的增殖,刺激创面纤维基质的沉积,抑制骨吸收。随后的研究发现,PRP中其他生长因子如EGF、VEGF、IGF等均有较好的促进骨与软组织修复的作用。与FG相比,PRP制作操作简单,来源于自体,无免疫排斥反应和疾病传播可能,其中含有大量高浓度的生长因子在理论上支持PRP比FG可更有效的促进骨与软组织的修复。PRP目前主要被应用于修复骨组织、修复软组织创面,包括急性伤口和慢性伤口,修复软骨组织、肌腱韧带和慢性肌腱止点炎症(如网球肘、肩周炎、跖腱膜炎等)运动医学科、疼痛科及骨科等外科领域。PRP的制备原理是依据血液中各组分的比重不同而进行分层制备,离心后将血液分为下层、中层和上层,下层深红色液体为红细胞层,上层淡黄色液体为血浆层,二者之间一薄层白色不透明液体即富血小板血浆。目前国内外对PRP的制备有很多种方法。目前,美国FDA认证并商业化生产的PRP制备系统有9种,其中大部分制备系统能快速稳定的获得高质量的PRP,采血量均大于50mI,但由于这些制备系统价格昂贵,不利于PRP技术在临床上的广泛应用。与目前已在我国较为广泛使用的进口的瑞±REGEN富血小板血浆(PRP)制备用套装,型号:Ⅰ型(Regen ACRC Plus)比较,该产品由瑞±国家实验室授权Regen实验室生产,已通过以下认证:符合ISO10993,ISO 13485认证,英国Bsi认证号MD642990,美国FDA认证和欧盟CE认证(IIb级),中国CFDA认证(三类器械),其拥有核心分离胶专利技术,只需一步分离,因制备成本高(大大几千元人民币),仅适合少数中高端自费人群使用,不利于此项技术的推广及普惠性。国内的PRP提取工具及技术,大多采用开放式的手工二次离心法制备PRP,与进口套件相比价格可大幅度下降,有利于此项技术推广让更多的患者受益,但存在以下缺点,极大限制了其在临床的应用:1、容易受到外界污染,多个容器中转移,增加了血小板激活和被污染的机会;2、血小板回收率较低;3、易受操作因素的影响,制备方法不够稳定;4、操作者目测手工排红细胞易造成宁愿少排也不多排的结果,增加了制备的难度,也不利于随时监测PRP的浓度,无法确保每次提取的稳定性;5、转移需要使用到注射器针头,手工操作对血液及血小板容易产生压力,容易意外激活血小板;6、虽然目前国内已有厂商生产出专门的分离工具,仍需二次离心,但因制备成本仍较高(仍在千元大关之上),使用亦不方便,仍不利于此项技术的推广使用。
发明内容
鉴于上述问题,本发明的目的在于提供一种避免操作过程细菌传染、提取PRP精准,及避免血小板破坏或者被激活和成本低的富血小板血浆的经济制备方法。
为实现上述目的,本发明提供的一种富血小板血浆的经济制备方法,其中,具体步骤如下:
(1)采用10ML且内部预封装有抗凝剂的导管封管器(一次性耗材),之后将抗凝剂挤压出剩下1ML;
(2)按照9:1的比例,往导管封管器内输入9ML患者静脉血;
(3)将静脉血与抗凝剂混匀后取约0.1Ml血液标本进行血小板数量检测,之后将拧下芯杆并拧紧帽头的导管封管器垂直放入转速为2100rpm的离心机中,离心时间10min,使血液分成三层从上到下依次为血浆层、血小板血浆层和红细胞层;
(4)之后戴上无菌手套对预先消毒30分钟的工作台上直立固定安放的微量推注泵进行启动,把取下帽头并拧上芯杆的装有分层血液的导管封管器垂直装于微量推注泵并识别确认,在导管封管器对应微量推注泵下方再放置废液杯;
(5)利用微量推注泵均匀缓慢推压导管封管器,使血液中最底层的大部分为3.5~4Ml红细胞层从导管封管器排出到废液杯内,直到下层红细胞层仅余0.5Ml时停止推泵;此时导管封管器内的血液仍为三层从上到下依次为血浆层、血小板血浆层和仅少量的红细胞层;
(6)为进一步从上述(5)中分离出富血小板层,将剩余的三层血液的导管封管器拧下芯杆并拧紧帽头垂直放入设定转速为2100rpm的离心机中,再次离心时间10min,使血液再次分成三层从上到下依次为血浆层、富血小板血浆层和少量的红细胞层;
(7)从离心机取出导管封管器取下帽头并拧上芯杆,及另一个一次性5Ml无菌注射器以L形式布局分别与三通阀连接,此时上述的导管封管器和无菌注射器两个管器可通过三通阀的蓝色开关来控制关闭和相通;
将调节三通阀的蓝色开关旋转为L方向关闭并保持1字形方向开通,后安装于微量推注泵,此时的导管封管器和无菌注射器两个管器不相通,利用预先直立固定的微量推注泵均匀缓慢推压已识别确认的导管封管器,使血液中的最底层约0.5Ml红细胞层通过1字形方向开通的三通阀通道从导管封管器排出0.3Ml落到废液杯内,直到保留0.2Ml左右的红细胞层;
此时,将调节三通阀的蓝色开关旋转为L方向打开并关闭1字形方向,此时的导管封管器和无菌注射器两个管器相通,再利用微量推注泵均匀缓慢推压导管封管器内下段的富血小板血浆层约为2ML转移到一次性5Ml无菌注射器内;
(8)将上述(7)中载有2Ml的PRP无菌注射器取出充分混匀后,取约0.1Ml血液标本进行血小板数量检测和取约0.1Ml血液标本接种到营养琼脂平板培养基(血培养皿)上,将其放入35±2℃培养箱进行细菌培养,分别在3,5天进行观察,确保提取过程中没有受到杂菌的污染,做到事后监管;保证了临床应用的安全性。
(9)关闭微量推注泵,将剩余约4Ml左右贫血小板血浆层的导管封管器及其连接的三通阀从微量推注泵的卡槽上取出弃用;
分离前后全自动血液分析仪进行血小板数量检测对比,达原计数的2.5~3.5倍符合临床需求;如此完成提取PRP工作。由此,虽然采用的是二次离心法,但未对富含血小板的血浆进行管间的转移,整个过程均在一个导管封管器中完成,减少了血小板在转移过程中的污染和激活;且两次均为2100rpm离心10min,避免了离心力过大离心时间过长导致血小板活化及生长因子的过早释放;采用微量推注泵代替手工操作,匀速两次排红细胞,可精准到0.1Ml,避免了手工操作导致排红过多或过少导致PRP提取的不稳定性,通过规范化培训可完全复制整个方法。该制备方法操作简单,耗材不超过50元,价格低廉,适合在临床上的推广应用。
在一些实施方式中,导管封管器采用10ML可提取2Ml的PRP。可根据需求递增倍数,例如,20Ml可提取4Ml的PRP,30Ml可提取6Ml的PRP等,根据临床需求非常方便选择。由于目前美国FDA认证并商业化生产的PRP制备系统有9种,其中大部分制备系统能快速稳定的获得高质量的PRP,采血量均大于50MI,但由于这些制备系统价格昂贵,不利于PRP技术在临床上的广泛应用。
在一些实施方式中,一次性导管封管器由注射器和锥头帽组成。
所述注射器包括针筒、芯杆和位于芯杆前端的密封胶塞。针筒的前端设有乳头和环绕该乳头的筒状接头,该乳头设有与针筒内部相通的内腔;所述的芯杆置于所述针筒内,其前端设有密封胶塞,后端设有芯杆的推置末端。针筒前端的筒状接头内壁设有内螺纹,芯杆端部的接头位置设置有与内螺纹连接的外螺纹,在两次离心过程中提供了相对密闭洁净的环境。
在一些实施方式中,微量推注泵由控制器和执行机构组成。
本发明的有益效果是具有避免操作过程细菌传染、提取PRP精准,及避免血小板破坏或者被激活和成本低的效果。具体如下:(1)PRP的提取分离操作全程在密封的环境下进行,避免外界污染。(2)不受操作因素的影响,避免了多个容器之间的转运,简化操作流程,制备方法稳定。(3)两排出红细胞和提取2ML富血小板血浆层都是采用微量推注泵进行操作,因此十分精准。(4)该PRP制备方法所需的抗凝全血的量少,减少了患者不必要的血液浪费;可根据需求递增倍数,例如,20Ml可提取4Ml的PRP,30Ml可提取6Ml的PRP等,根据临床需求非常方便选择。(5)该PRP制备方法无需购买制备PRP的专门仪器及在常温无菌条件下即可制备,减轻了患者的经济负担;(6)该PRP制备方法避免了离心过程中血小板的激活,保持了血小板原有的活性;(7)此方法可以稳定的制备出富含高浓度血小板的PRP,且PRP中生长因子的浓度较高,能够很好的满足临床的需求。(8)PRP制备的过程均在无菌操作间和超净工作台中进行,但其仍然为体外开放式操作。为了保障PRP的绝对无菌及患者的临床使用安全,本实验对标本均做了细菌培养:将标本接种到营养琼脂平板培养基上,将其放入35±2℃培养箱进行培养,分别在3,5天进行观察,做到事后监管;保证了临床应用的安全性。
附图说明
图1为管封管器的结构示意图;
图2为管封管器应用于微量推注泵上的结构示意图;
图3为本发明导管封管器,及另一个一次性5Ml无菌注射器通过一个T字型三通阀以L形式布局的结构示意图。
图4为T字型三通阀的结构示意图;
图5为本发明排出红细胞的结构示意图。
图6为本发明微量推注泵的结构示意图。
图7为本发明离心机的结构示意图。
图8为本发明第一次离心后导管封管器的结构示意图。
图9为本发明第二次离心后导管封管器的结构示意图。
具体实施方式
下面结合附图对发明作进一步详细的说明。
如图1-9所示,一种富血小板血浆的经济制备方法,具体步骤如下:
(1)采用10ML且内部预封装有抗凝剂的导管封管器01,之后将抗凝剂挤压出剩下1ML;(2)按照9:1的比例,往导管封管器01内输入9ML患者静脉血;(3)将静脉血与抗凝剂混匀后取约0.1Ml血液标本进行血小板数量检测,之后将拧下芯杆并拧紧帽头的导管封管器01垂直放入转速为2100rpm的离心机04中,离心时间10min,使血液分成三层从上到下依次为血浆层、血小板血浆层和红细胞层;(4)之后戴上无菌手套对预先消毒30分钟的工作台上直立固定安放的微量推注泵02进行启动,把取下帽头并拧上芯杆的装有分层血液的导管封管器01垂直装于微量推注泵02并识别确认,在导管封管器01对应微量推注泵02下方再放置废液杯03;(5)利用微量推注泵02均匀缓慢推压导管封管器01,使血液中最底层的大部分为3.5~4Ml红细胞层从导管封管器01排出到废液杯03内,直到下层红细胞层仅余0.5Ml时停止推泵;此时导管封管器01内的血液仍为三层从上到下依次为血浆层、血小板血浆层和仅少量的红细胞层;(6)为进一步从上述(5)中分离出富血小板层,将剩余的三层血液的导管封管器01拧下芯杆并拧紧帽头垂直放入设定转速为2100rpm的离心机04中,离心时间10min,使血液再次分成三层从上到下依次为血浆层、富血小板血浆层和少量的红细胞层;(7)从离心机04取出导管封管器01取下帽头并拧上芯杆,及另一个一次性5Ml无菌注射器以L形式布局分别与三通阀05连接,此时上述的导管封管器01和无菌注射器两个管器可通过三通阀05的蓝色开关来控制关闭和相通;将调节三通阀05的蓝色开关旋转为L方向关闭并保持1字形方向开通,后安装于微量推注泵02,此时的导管封管器01和无菌注射器两个管器不相通,利用预先直立固定的微量推注泵02均匀缓慢推压识别的导管封管器01,使血液中的最底层约0.5Ml红细胞层通过1字形方向开通的三通阀05通道从导管封管器01排出0.3Ml落到废液杯03内,直到保留0.2Ml左右的红细胞层;此时,将调节三通阀05的蓝色开关旋转为L方向打开并关闭1字形方向,此时的导管封管器01和无菌注射器两个管器相通,再利用微量推注泵02均匀缓慢推压导管封管器01内下段的富血小板血浆层约为2ML转移到一次性5Ml无菌注射器内;(8)将上述(7)中载有2Ml的PRP无菌注射器取出充分混匀后,取约0.1Ml血液标本进行血小板数量检测和取约0.1Ml血液标本接种到营养琼脂平板培养基(血培养皿)上,将其放入35±2℃培养箱进行细菌培养,分别在3,5天进行观察,确保提取过程中没有受到杂菌的污染,做到事后监管;,保证了临床应用的安全性;(9)关闭微量推注泵02,将剩余约4Ml左右贫血小板血浆层的导管封管器01及其连接的三通阀05从微量推注泵02的卡槽上取出弃用。分离前后全自动血液分析仪进行血小板数量检测对比,达原计数的2.5~3.5倍符合临床需求;如此完成提取PRP工作。由此,虽然采用的是二次离心法,但未对富含血小板的血浆进行管间的转移,整个过程均在一个导管封管器01(一次性耗材)中完成,减少了血小板在转移过程中的污染和激活;且两次均为2100rpm离心10min,避免了离心力过大离心时间过长导致血小板活化及生长因子的过早释放;采用微量推注泵02代替手工操作,匀速两次排红细胞,精准到0.1Ml,避免了手工操作导致排红过多或过少导致PRP提取的不稳定性,通过规范化培训可完全复制整个方法。该制备方法操作简单,耗材不超过50元,价格低廉,适合在临床上的推广应用。
导管封管器01采用10ML可提取2Ml的PRP,可根据需求递增倍数,例如,20Ml可提取4Ml的PRP,30Ml可提取6Ml的PRP等,根据临床需求非常方便选择。由于目前美国FDA认证并商业化生产的PRP制备系统有9种,其中大部分制备系统能快速稳定的获得高质量的PRP,采血量均大于50MI,但由于这些制备系统价格昂贵,不利于PRP技术在临床上的广泛应用。导管封管器01由注射器11和组成。所述注射器11包括针筒13、芯杆14和位于芯杆14前端的密封胶塞。针筒13的前端设有乳头和环绕该乳头的筒状接头,该乳头设有与针筒13内部相通的内腔;所述的芯杆14置于所述针筒13内,其前端设有密封胶塞,后端设有芯杆14的推置末端。针筒13前端的筒状接头内壁设有内螺纹,芯杆14端部的接头位置设置有与内螺纹连接的外螺纹。微量推注泵02由控制器和执行机构组成。
以下是临床实验数据:
(1)石某采血两管10Ml×2=20Ml进行提取后PRP总量2Ml×2=4Ml;在离心前的数据,血小板是258。
(2)一管10Ml经过两次离心排出红细胞后,血小板是782,PRP为3.0X。
(3)另一管经过两次离心排出红细胞后,血小板是953,PRP为3.7X。
以上所述的仅是本发明的一些实施方式。对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明创造构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于发明的保护范围。
Claims (4)
1.一种富血小板血浆的经济制备方法,其中,具体步骤如下:
(1)采用10ML且内部预封装有抗凝剂的导管封管器,之后将抗凝剂挤压出剩下1ML;
(2)按照9:1的比例,往导管封管器内输入9ML患者静脉血;
(3)将静脉血与抗凝剂混匀后取0.1Ml血液标本进行血小板数量检测,之后将导管封管器垂直放入转速为2100rpm的离心机中,离心时间10min,使血液分成三层从上到下依次为血浆层、血小板血浆层和红细胞层;
(4)之后戴上无菌手套对预先消毒30分钟的工作台上直立固定安放的微量推注泵进行启动,把装有分层血液的导管封管器垂直装于微量推注泵并识别确认,在导管封管器对应微量推注泵下方再放置废液杯;
(5)利用微量推注泵均匀缓慢推压导管封管器,使血液中最底层3.5~4Ml的红细胞层从导管封管器排出到废液杯内,直到下层红细胞层仅余0.5Ml时停止推泵;此时导管封管器内的血液仍为三层从上到下依次为血浆层、血小板血浆层和仅少量的红细胞层;
(6)为进一步从上述(5)中分离出富血小板层,将剩余的三层血液的导管封管器垂直放入设定转速为2100rpm的离心机中,再次离心时间10min,血液仍分成三层从上到下依次为血浆层、富血小板血浆层和少量的红细胞层;
(7)从离心机取出导管封管器,及另一个一次性5Ml无菌注射器以L形式布局分别与三通阀连接,此时上述的导管封管器和无菌注射器两个管器可通过三通阀来控制关闭和相通;
将调节三通阀L方向关闭并保持1字形方向垂直开通,后安装于微量推注泵,此时的导管封管器和无菌注射器两个管器不相通,利用预先直立固定的微量推注泵均匀缓慢推压已识别确认的导管封管器,使血液中的最底层0.5Ml红细胞层通过1字形方向开通的三通阀通道从导管封管器排出0.3Ml落到废液杯内,直到保留0.2Ml左右的红细胞层;
此时,将调节三通阀旋转L方向打开并关闭1字形方向,此时的导管封管器和无菌注射器两个管器相通,再利用微量推注泵均匀缓慢推压导管封管器内下段的富血小板血浆层为2ML转移到L形式布局连接的一次性5Ml无菌注射器内;
(8)将上述(7)中载有2Ml的PRP无菌注射器取出充分混匀后,取0.1Ml血液标本进行血小板数量检测和取0.1Ml血液标本放置接种到营养琼脂平板培养基血培养皿上,将其放入35±2℃培养箱进行细菌培养,分别在3,5天进行观察,确保提取过程中没有受到杂菌的污染,保证了临床应用的安全性,做到事后监管;
(9)关闭微量推注泵,将剩余4Ml左右贫血小板血浆层的导管封管器及其连接的三通阀从微量推注泵的卡槽上取出弃用;
分离前后全自动血液分析仪进行血小板数量检测对比,达原计数的2.5~3.5倍符合临床需求;
如此完成提取PRP工作。
2.根据权利要求1所述的一种富血小板血浆的经济制备方法,其特征在于,所述的导管封管器采用10ML可提取2Ml的PRP。
3.根据权利要求2所述的一种富血小板血浆的经济制备方法,其特征在于,所述的导管封管器由注射器和锥头帽组成;
所述注射器包括针筒、芯杆和位于芯杆前端的密封胶塞;
所述针筒的前端设有乳头和环绕该乳头的筒状接头,该乳头设有与针筒内部相通的内腔;所述的芯杆置于所述针筒内,其前端设有密封胶塞,后端设有芯杆的推置末端;
所述针筒前端的筒状接头内壁设有内螺纹;所述芯杆端部的接头位置设置有与内螺纹连接的外螺纹。
4.根据权利要求2所述的一种富血小板血浆的经济制备方法,其特征在于,所述的微量推注泵由控制器和执行机构组成。
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