CN110250210A

CN110250210A - 一种促玉米浸种生根的最优dse菌种

Info

Publication number: CN110250210A
Application number: CN201910505641.5A
Authority: CN
Inventors: 毕银丽; 薛子可; 全文智
Original assignee: Beijing Heshengyuan Ecological Environment Engineering Technology Co ltd; China University of Mining and Technology Beijing CUMTB
Current assignee: Beijing Heshengyuan Ecological Environment Engineering Technology Co ltd; China University of Mining and Technology Beijing CUMTB
Priority date: 2019-06-12
Filing date: 2019-06-12
Publication date: 2019-09-20
Anticipated expiration: 2039-06-12
Also published as: CN110250210B

Abstract

本发明公开了一种促玉米浸种生根的最优DSE菌种。本发明提供的促玉米浸种生根的最优DSE菌种为深色有隔内生真菌，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.17464。利用该菌株处理植物器官后的根长、根数以及根直径均显著高于未利用深色有隔内生真菌处理的对照组，且以深色有隔内生真菌的稀释为20％时最佳。本发明的深色有隔内生真菌菌株可以辅助植物生根，促进植物生长，对于提高土地复垦效率具有积极的生态意义，也为矿区土地复垦和生态重建提供一种微生物技术支撑。

Description

一种促玉米浸种生根的最优DSE菌种

技术领域

本发明涉及生物技术领域中，一种促玉米浸种生根的最优DSE菌种。

背景技术

深色有隔内生真菌(Dark Septate Endophytes，DSE)具有与菌根真菌类似的生物学功能，主要定殖于健康植物根的表皮、皮层甚至维管束组织的细胞内或细胞间隙，形成共生体，而不引起植物病变。DSE生态分布广泛，在不同生境植物中的定殖表明它们很少或没有宿主特异性，并能与植物建立了互惠互利以及相互调节的生理整体，但各自具有其形态特征。研究表明，DSE在胁迫环境中发挥着更为重要的作用，其通过菌丝的生长扩大了植物根系吸收面积，提高了原根系吸收范围以外的营养元素的吸收能力。

煤炭开采过程破坏了土壤结构，导致生物群落急剧减少，加之中国煤炭主要分布在西部干旱半干旱地区，该区干旱缺水，土壤沙化严重，严重制约着该区地表植被生长与生态重建。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何促进植物生根。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种促进植物生根的方法，所述方法包括：利用深色有隔内生真菌处理植物组织或器官，实现促进植物生根；

所述深色有隔内生真菌在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.17464。

上述方法中，利用深色有隔内生真菌处理植物组织或器官可包括：利用含有所述深色有隔内生真菌的液体浸泡所述植物组织或器官。

上述方法中，含有所述深色有隔内生真菌的液体中菌丝干重可为(0.468-1.404)mg/mL。含有所述深色有隔内生真菌的液体中菌丝干重具体可为0.468mg/mL。所述菌丝干重为利用滤纸过滤含有所述深色有隔内生真菌的液体收集菌丝并烘干至恒重得到的菌丝干重。

上述方法中，所述含有所述深色有隔内生真菌的液体可为所述深色有隔内生真菌的培养液或所述培养液的稀释液。

所述培养液可为利用MMN培养基培养所述深色有隔内生真菌所得培养液。

所述稀释液可利用水稀释所述培养液得到。

所述MMN培养基可通过将CaCl₂ 0.05g，MgSO₄ 0.15g，NaCl 0.025g，FeCl₃ 0.01g，KH₂PO₄ 0.5g，Vitamin B1(硫胺素)0.0001g，(NH₄)₂HPO₄ 0.25g，Glucose(葡萄糖)10g，Citric acid(柠檬酸)0.2g和Malt extract(麦芽提取物)10g混合后，加入蒸馏水1000ml，灭菌得到。

上述方法中，利用含有所述深色有隔内生真菌的液体浸泡所述植物组织或器官时，所述植物组织或器官的一半可处于空气中。

在处理过程中，可通过添加所述MMN培养基以使所述植物组织或器官的一半处于空气中。

上述方法中，所述处理的时间可为15天。

所述处理的条件可为：前3天在黑暗中进行，温度为22℃，空气相对湿度为70％；处理三天后，光照培养，光照强度为1500-2000Lux，光周期为16h光照/8h黑暗，光照和黑暗下培养温度分别为25和22℃，空气相对湿度70％。

上述方法中，所述促进植物生根可体现在促进植物根的伸长、根数增加和/或根的加粗上。

上述方法中，所述植物器官可为植物种子。

所述植物可为a1)或a2)或a3)：

a1)单子叶植物或双子叶植物；

a2)禾本科植物；

a3)玉米。

所述植物组织或器官可为无菌组织或器官。

所述处理可在无菌环境中进行。

所述深色有隔内生真菌，也属于本发明的保护范围。

本发明还提供了下述任一应用：

X1)所述促进植物生根的方法在植物生产中的应用；

X2)所述促进植物生根的方法在植物种植中的应用；

X3)所述促进植物生根的方法在促进植物生长中的应用；

X4)所述促进植物生根的方法在促进土地复垦中的应用；

X5)所述深色有隔内生真菌在促进植物组织或器官生根中的应用；

X6)所述深色有隔内生真菌在制备促进植物组织或器官生根产品中的应用；

X7)所述深色有隔内生真菌在植物生产中的应用；

X8)所述深色有隔内生真菌在植物种植中的应用；

X9)所述深色有隔内生真菌在促进植物生长中的应用；

X10)所述深色有隔内生真菌在制备促进植物生长产品中的应用；

X11)所述深色有隔内生真菌在促进土地复垦中的应用；

X12)所述深色有隔内生真菌在制备促进土地复垦产品中的应用。

上述应用中，所述植物器官可为植物种子。

所述植物可为a1)或a2)或a3)：

a1)单子叶植物或双子叶植物；

a2)禾本科植物；

a3)玉米。

在本发明的一个实施例中，所述玉米为中糯一号。

本发明的促进植物生根的方法中，采用在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.17464的深色有隔内生真菌的培养液处理植物器官后的根长、根数以及根直径均显著高于未利用深色有隔内生真菌处理的对照组，在利用该深色有隔内生真菌处理植物器官时，以深色有隔内生真菌的为20％最佳。本发明的深色有隔内生真菌菌株以及促进植物生根的方法可以辅助植物生根，促进植物生长，对于提高土地复垦效率具有积极的生态意义，也为矿区土地复垦和生态重建提供一种微生物技术支撑。

生物材料保藏说明

生物材料的分类命名：链格孢(Alternaria sp.)

生物材料的菌株编号：001

生物材料的保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

生物材料的保藏单位简称：CGMCC

生物材料的保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101

生物材料的保藏日期：2019年4月8日

生物材料的保藏中心登记入册编号：CGMCC No.17463

生物材料保藏说明

生物材料的分类命名：Darksidea zeta

生物材料的菌株编号：针A1-3

生物材料的保藏单位简称：CGMCC

生物材料的保藏日期：2019年4月8日

生物材料的保藏中心登记入册编号：CGMCC No.17464

生物材料保藏说明

生物材料的分类命名：Darksidea sp.

生物材料的菌株编号：针A2-1

生物材料的保藏单位简称：CGMCC

生物材料的保藏日期：2019年4月8日

生物材料的保藏中心登记入册编号：CGMCC No.17465

附图说明

图1为各菌株不同浓度的DSE培养液浸种对玉米根的影响。CK表示利用无菌水浸种，MMN CK表示利用无菌MMN液体培养基浸种，20％、40％和60％分别表示利用20％DSE培养液、40％DSE培养液和60％DSE培养液浸种；同图中，标有不同小写字母的数据间有显著差异，标有相同小写字母的数据间无显著差异。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中，接菌的实验方法如无特殊说明，均在无菌操作台中完成。DSE与玉米种子共培养在人工气候箱中(RXZ智能型人工气候箱)。

实施例1、不同菌株及浓度对玉米生根的影响

待测菌株为1、2和3号菌，均由发明人从内蒙古自治区锡林郭勒盟锡林浩特市北电胜利矿区的针茅根系中分离纯化所得。

检测1号菌的ITS序列，其序列为序列表中序列1，鉴定为链格孢属(Alternariasp.)，命名为001，该菌株已于2019年4月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号分别为CGMCC No.17463。

检测2号菌的ITS序列，其序列为序列表中序列2，鉴定为深色有隔内生真菌(DSE)(Darksidea zeta)，命名为针A1-3，该菌株已于2019年4月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号分别为CGMCC No.17464。

检测3号菌的ITS序列，其序列为序列表中序列3，鉴定为深色有隔内生真菌(DSE)(Darksidea sp.)，命名为针A2-1，该菌株已于2019年4月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号分别为CGMCC No.17465。

玉米品种为中糯一号(认证号：0103006-2000，北京中农作科技发展有限公司)。

一、DSE的培养

PDA培养基：将马铃薯浸粉3.0g，葡萄糖20.0g和琼脂14.0g混合后，加入蒸馏水1000ml，加热煮沸溶解，分装，121℃高压灭菌15min，备用。

将各待测菌株接种到PDA培养基中，28℃下黑暗倒置培养15天。

二、DSE培养液的制备

MMN液体培养基：将CaCl₂ 0.05g，MgSO₄ 0.15g，NaCl 0.025g，FeCl₃ 0.01g，KH₂PO₄0.5g，Vitamin B1(硫胺素)0.0001g，(NH₄)₂HPO₄ 0.25g，Glucose(葡萄糖)10g，Citric acid(柠檬酸)0.2g和Malt extract(麦芽提取物)10g混合后，加入蒸馏水1000ml，分装，121℃高压灭菌15min，备用。

在步骤一培养结束后，取各待测菌株的直径6mm的菌饼，分别接种到MMN液体培养基中，在25℃震荡培养，摇床转速24h前为180r/min，24h后开始改为160r/min，培养15天后，分别得到1、2和3号菌培养液，培养液中DSE菌丝干重(即DSE培养液经滤纸过滤，收集菌丝烘干至恒重后的菌丝干重)分别为3.11mg/mL，2.34mg/mL和2.39mg/mL，备用。

三、不同DSE菌种在不同浓度培养液条件下对植物根系生长效果的影响

用无菌水对步骤二所得的不同DSE菌种培养液进行稀释，每种菌均得到三个浓度的培养液：20％DSE培养液(20％DSE培养液：取步骤二所述DSE培养液20ml，用无菌水稀释至100ml)、40％DSE培养液(40％DSE培养液：取步骤二所述DSE培养液40ml，用无菌水稀释至100ml)和60％DSE培养液(60％DSE培养液：取步骤二所述DSE培养液60ml，用无菌水稀释至100ml)，待用。

按照如下方法检测每种菌对玉米种子生根的影响：取无菌三角瓶(100ml)，分为五组，每组3个，每个三角瓶中放入5粒中糯一号玉米种子。将以上获得的三个浓度的DSE培养液分别加入三组三角瓶中，每组一种浓度的DSE培养液，保证每瓶培养液5ml(即液体刚好没过种子的一半)。剩下一组用无菌水作为对照，另一组采用无菌MMN液体培养基作为对照。所有三角瓶用无菌PVA膜封口。每隔5天添加一次无菌MMN营养液共培养15天后，利用CI600软件统计分析玉米根系生长情况，所测指标为玉米平均单株总根长、平均单株根数、平均根直径。培养前3天在黑暗中进行，温度为22℃，空气相对湿度为70％；培养三天后，光照培养，光照强度为1500-2000Lux(在培养箱内，光照处于1500-2000Lux范围内，平均为1800Lux)，光周期为16h光照/8h黑暗，光照和黑暗下培养温度分别为25和22℃，空气相对湿度70％。

各菌株不同浓度的DSE培养液对玉米种子生根的影响结果如图1和表1所示，用DSE培养液培养的玉米种子的平均单株总根长和平均单株根数均显著高于两个对照组，2号菌的平均单株总根长、平均单株根数和平均根直径均显著高于两个对照组；2号菌的20％DSE培养液的玉米平均单株总根长、平均根直径均显著高于该菌株的40％DSE培养液、60％DSE培养液以及1号菌、3号菌的三种DSE培养液，2号菌的20％DSE培养液的玉米平均单株根数显著高于该菌株的40％DSE培养液、60％DSE培养液以及1号菌的三种DSE培养液。因此，2号菌株的20％DSE培养液具有较高的经济价值及应用前景。

表1、不同浓度的DSE培养液浸种对玉米根的影响

表1中，总根长表示平均单株总根长，根数表示平均单株根数。

序列表

<110> 中国矿业大学（北京）、北京合生元生态环境工程技术有限公司

<120> 一种促玉米浸种生根的最优DSE菌种

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 608

<212> DNA

<213> 链格孢(Alternaria sp.)

<400> 1

cccttccgta gggtgaacct gcggagggat cattacacaa tatgaaagcg ggctggatac 60

tctgtagtag tggattgctt tacggcgtgc gctgctggag agcctagcct tgctgaatta 120

ttcacccgtg tcttttgcgt acttcttgtt tccttggtgg gctcgcccgc cacaaggaca 180

actcataaac cttttgtaat agcaatcagc gtcagtaaca acataataat tacaactttc 240

aacaacggat ctcttggttc tggcatcgat gaagaacgca gcgaaatgcg atacgtagtg 300

tgaattgcag aattcagtga atcatcgaat ctttgaacgc acattgcgcc ctttggtatt 360

ccaaagggca tgcctgttcg agcgtcattt gtaccctcaa gctttgcttg gtgttgggcg 420

tcttgtctcc agtccgctgg agactcgcct taaagtcatt ggcagccggc ctactggttt 480

cggagcgcag cacaagtcgc actcttttcc agccaaggtc agcgtccaac aagccttttt 540

tcaacttttg acctcggatc aggtagggat acccgctgaa cttaagcata tcaataagcg 600

gaggaaaa 608

<210> 2

<211> 590

<212> DNA

<213> 深色有隔内生真菌(Darksidea zeta)

<400> 2

cttccgtaag gtgacctgcg gaaggatcat tacctggcct tgggccgctc gcgggagcta 60

gtcgcttgcg acgacgctac cgagggcgct tagcccttga ctatcacctt gactacgtgc 120

accttttgtt gtttcctcgg caggtcacct gccgccagga accctctaaa ccttttgcaa 180

tagcatccaa acttctgaaa acaaaccaaa ttatttacaa cttttaacaa tggatctctt 240

ggttctggca tcgatgaaga acgcagcgaa atgcgataag tagtgtgaat tgcagaattc 300

agtgaatcat cgaatctttg aacgcacatt gcgccccatg gtattccgtg gggcatgcct 360

gttcgagcgt catttacccc ctcaagctcc gcttggtgtt gggcgtctgt cccgcttcgc 420

gcgcggactc gccccaaagg tattggcagc ggtcgtgcca gcttctcgcg cagcacattg 480

cgcttctcga ggcaccggcg ggcccgcgtc catcaagctc acccccccag tttgacctcg 540

gatcaggtag ggatacccgc tgaacttaag catatcaata agcggaggaa 590

<210> 3

<211> 589

<212> DNA

<213> 深色有隔内生真菌(Darksidea sp.)

<400> 3

cttccgtagg tgaacctgcg gaaggatcat tacctggcct tgggccgctc gcgggagcta 60

gtcgcttgcg acgacgctac cgagggcgct tagcccttga ctatcacctt gactacgtgc 120

accttttgtt gtttcctcgg caggtcacct gccgccagga accccctaaa ccttttgtaa 180

tagcatccaa acttctgaaa acaaaccaaa ttatttacaa cttttaacaa tggatctctt 240

ggttctggca tcgatgaaga acgcagcgaa atgcgataag tagtgtgaat tgcagaattc 300

agtgaatcat cgaatctttg aacgcacatt gcgccccatg gtattccgtg gggcatgcct 360

gttcgagcgt catttacccc ctcaagctcc gcttggtgtt gggcgtctgt cccgcttcgc 420

gcgcggactc gccccaaagg tattggcagc ggtcgtgcca gcttctcgcg cagcacattg 480

cgcttctcga ggcaccggcg ggcccgcgtc catcaagctc accccccagt ttgacctcgg 540

atcaggtagg gatacccgct gaacttaagc atatcaataa gcggaggaa 589

Claims

1.促进植物生根的方法，包括：利用深色有隔内生真菌处理植物组织或器官，实现促进植物生根；

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：利用深色有隔内生真菌处理植物组织或器官包括：利用含有所述深色有隔内生真菌的液体浸泡所述植物组织或器官。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：含有所述深色有隔内生真菌的液体中菌丝干重为(0.468-1.404)mg/mL。

4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于：所述含有所述深色有隔内生真菌的液体为所述深色有隔内生真菌的培养液或所述培养液的稀释液。

5.根据权利要求2-4中任一所述的方法，其特征在于：利用含有所述深色有隔内生真菌的液体浸泡所述植物组织或器官时，所述植物组织或器官的一半处于空气中。

6.根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于：所述处理的时间为15天；

和/或，所述处理的条件为：前3天在黑暗中进行，温度为22℃，空气相对湿度为70％；处理三天后，光照培养，光照强度为1500-2000Lux，光周期为16h光照/8h黑暗，光照和黑暗下培养温度分别为25和22℃，空气相对湿度70％。

7.根据权利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于：所述促进植物生根体现在促进植物根的伸长、根数增加和/或根的加粗上。

8.根据权利要求1-7中任一所述的方法，其特征在于：所述植物器官为植物种子；

和/或，所述植物为a1)或a2)或a3)：

a1)单子叶植物或双子叶植物；

a2)禾本科植物；

a3)玉米。

9.深色有隔内生真菌，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.17464。

10.下述任一应用：

X1)权利要求1-8中任一所述方法在植物生产中的应用；

X2)权利要求1-8中任一所述方法在植物种植中的应用；

X3)权利要求1-8中任一所述方法在促进植物生长中的应用；

X4)权利要求1-8中任一所述方法在促进土地复垦中的应用；

X5)权利要求9所述深色有隔内生真菌在促进植物组织或器官生根中的应用；

X6)权利要求9所述深色有隔内生真菌在制备促进植物组织或器官生根产品中的应用；

X7)权利要求9所述深色有隔内生真菌在植物生产中的应用；

X8)权利要求9所述深色有隔内生真菌在植物种植中的应用；

X9)权利要求9所述深色有隔内生真菌在促进植物生长中的应用；

X10)权利要求9所述深色有隔内生真菌在制备促进植物生长产品中的应用；

X11)权利要求9所述深色有隔内生真菌在促进土地复垦中的应用；

X12)权利要求9所述深色有隔内生真菌在制备促进土地复垦产品中的应用。