CN110241253B - 用于检测登革感染的方法 - Google Patents

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Abstract

公开了用于检测登革感染的方法。本发明涉及用于在患者血液样本中检测登革感染的方法，包括以下步骤：a）执行对样本中的血液血小板的预指定参数和血液细胞的预指定类型的分析并且确定用于血小板的预指定参数和细胞的预指定类型的参数值；b）从在步骤a）中确定的值获得样本参数；以及c）关于预指定准则来评价样本参数，其中，如果满足该准则，则存在登革感染。

Description

用于检测登革感染的方法
本发明涉及用于在患者血液样本中检测登革感染的方法。
登革感染，诸如例如由属于黄病毒科黄病毒属的四种不同的登革病毒血清型：DEN-1、DEN-2、DEN-3和DEN-4中的一种引起的登革热，是全世界每年数千万新感染的原因。根据来自世界卫生组织（World Health Organization，WHO）的数据，每年新感染的估计数范围在从50到100百万人。登革被认为在超过100个国家流行。几乎一半的世界人口有被感染的风险。如果未被治疗，则登革感染有可能变得致命。
感染是蚊媒（mosquito-borne）的。传播引起登革的病毒的主要媒介是埃及伊蚊。病毒被通过有感染性的雌性伊蚊的叮咬而传递到人身上。蚊子在被感染人员的血液上取食时获取病毒。
被感染的人是病毒的主要载体和增殖者，因为他们充当了针对未感染蚊子的病毒来源。典型地，当患者发烧时，病毒在被感染人员的血液中循环2至7天。在此时间期间，感染可能经由伊蚊传播到其他人。
针对疟原虫感染的诊断存在许多可用的方法。根据美国疾病预防控制中心（Centers of Disease Control and Prevention, CDC）用于检测登革病毒的当前方法包括聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction, PCR）和实时（real time，RT）-PCR（（RT）-PCR），虽然对于后者而言测定在商业上不可用。PCR基于病毒基因组序列为已知的原理进行操作。将来自患者的血清样本与将要选择用于病毒的已知序列的片段的引物进行组合。如果存在病毒，则DNA的该已知片段将被放大到可检测的水平。
另一已知方法是ELISA 测定，其涉及针对在感染后2至5天的血液血清中出现的NS1，IgG和/或IgM抗体的存在来测试来自患者的血清样本。然而，假阳性和与其它蚊媒病毒的交叉反应可能混淆结果。
进一步地，另一方法是PRNT测定，该测定是基于特定病毒血清型由于特定抗体而变成去活从而其不再能够感染细胞培养物的原理的生物学测定。这是通过斑块存在上的减小来评估的。虽然存在WHO指南，但是截至目前，执行PRNT的方法不是标准的，导致结果上的变化性。
当前不存在能够作为标准血液细胞计数测试的部分而被执行的登革检测方法。
用于自动使用的所谓的自动化细胞计数器正在被越来越成功地采用。这样的计数器的示例是Advia 2120、Sysmex XE-2100并且还有CellaVision DM96。这些自动化设备除了它们的高产出率之外还提供许多益处，诸如例如更高的客观性（没有依赖于观察者的变化性）、通常与手动计数（对高的细胞数量进行计数）关联的统计涨落的消除、还有在手动计数期间将不可获得的众多参数的确定以及如上面提到的更高效并且更成本有效的治疗。这些设备中的一些能够每小时处理120个和150个之间的患者样本。
自动单细胞计数的技术原理或者基于阻抗测量，或者基于光学系统（散射光或者吸收测量）。
在阻抗方法的情况下，细胞的计数并且还有其大小的确定是在对由移动通过小开口的颗粒引起的电导率（阻抗）上的变化的检测和测量的基础上完成的。例如诸如血液细胞的颗粒虽然其本身不导电，但是悬浮在导电的稀薄介质中。如果这样的细胞悬浮液通过开口，则在单个单独细胞的通过期间，位于开口的每一侧上的两个电极之间的电路径的阻抗暂时地增加。
与阻抗方法相反，光学方法包括使激光光束经稀薄的血液样本通过，在连续的流中通过激光束来检测该稀薄的血液样本。经流通池的检测区域通过的每个细胞使聚焦光散射。散射的光然后由光电检测器检测并且被转换成电脉冲。在此生成的脉冲的数量与在特定的时间段内通过检测区域的细胞的数量直接成比例。
在光学方法中，在不同的角度下测量通过检测区域的各单独的细胞的光散射。通过这样来检测与细胞结构、形状和反射能力有关的信息。这些特性能够被用于在不同类型的血液细胞之间进行区分并且将所得出的参数用于血液细胞与正常情况的偏离的诊断。
通过这两种测量方法获得的值被借助于鉴别诊断逻辑地链接进有意义的诊断结果中。
诊断方法的灵敏度和特异性在鉴别诊断的框架内起主要角色的作用，因此正不断地开展有关改善这些特性的工作。
就黄金标准而言，PCR已经示出了具有近似80-90%的真阳性率（灵敏度）的正确地标识病毒的最高的成功。因此在提供具有高灵敏度和特异性的方法（即，用于检测登革感染的方法，其还识别像这样的生病患者并且另一方面能够将健康的患者识别为健康）方面，利用常规测试方法并未实现足够程度的成功。
为了测试患者样本中登革病毒的存在，用于登革病毒的检测的当前可用的方法都要求特定的测定和血液血清的分离。
因此本发明的目标是提供一种用于在血液样本中检测登革感染的方法，该方法产生具有更高灵敏度和特异性的测试结果。本发明的进一步的目标是提供一种用于登革感染的检测方法，该方法通过使用一些独立参数而允许无关于患者的其它感染或者不同的健康状态的针对登革的高特异性和灵敏度。本发明的又一目标是提供如下这样的方法：其能够借助于自动化血液分析设备来执行。
该目标是通过具有在权利要求1中要求保护的特征的方法来创新地实现的。
本发明创建了用于在患者血液样本中检测登革感染的方法，包括以下步骤：
a) 执行对样本中的血液血小板的预指定参数和血液细胞的预指定类型的分析并且确定用于血小板的预指定参数和细胞的预指定类型的参数值。
b) 从在步骤a）中确定的值获得样本参数；以及
c) 关于预指定准则来评价样本参数，其中，如果满足该准则，则存在登革感染。
根据本发明作为规则而检查的患者血液样本涉及人类血液样本，然而还可能检查哺乳动物的血液样本。
全血细胞计数（Complete Blood Count，CBC）仪器通过计数存在于全血中的细胞的类型以及血液血小板来操作，因而不需要隔离血清以执行根据本发明的方法。用于检测登革感染的方法是基于特定类型的细胞和血小板的数量的升高或者降低的水平而执行的。因为一旦执行计数这些细胞和血小板的计数就立即可用，所以然后可以采用根据本发明的样本参数的自动化评价来检测登革病毒的存在，几乎没有额外的时间、成本或者费用。
从在步骤a）中获得的测量结果获得样本参数并且关于先前限定的准则来评估样本参数，其中如果满足该准则，则存在登革感染。
在尤其基于细胞体积参数、细胞数量参数和细胞密度参数以及血小板数量的本发明的情况中，如在此使用的术语“预指定准则”涉及在一个或多个样本参数的基础上建立的准则。在感染的血液样本和正常的血液样本的对应的值之间进行的比较的基础上确定准则，例如，针对本发明所基于的实验调查，执行许多登革感染的血液样本与许多正常的血液样本的对应的值的比较。在总共1585个患者中采用样本以确定预指定准则。
在创新方法的优选的实施例中，用于在患者血液样本中检测登革感染的方法包括以下步骤：
a) 执行有效过氧化物酶细胞分析，包括确定被检测为经流路池从过氧化物酶通道（有效过氧化物酶细胞）通过的细胞的数量；
b) 执行红细胞分析，包括确定红细胞计数（Red Blood Count，RBC）；
c) 在样本中执行血小板分布分析，包括确定血小板分布、其标准差和其百分比平均值，以及通过将标准差除以百分比平均值来确定血小板分布宽度（PlateletDistribution Width, PDW）。
d) 执行中性粒细胞簇分析，包括确定中性粒细胞簇在x轴上的定位平均值和确定中性粒细胞簇在y轴上的定位平均值；
e) 执行原始红细胞分析，包括确定在红细胞（RBC）通道上的原始红细胞计数；
f) 确定具有小于60费升（fL）的体积的红细胞（RBC）的百分比；
g) 从在步骤a)至步骤f）中确定的值获得样本参数；以及
h) 关于预指定准则来评价样本参数，其中，如果满足该准则，则存在登革感染。
在创新方法的优选的实施例中，在c）中确定的更低的参数值，和/或在d）中确定的在y轴上的更低的参数值，和/或在f）中确定的更高的参数值是针对存在登革感染的预测。
在创新方法的优选的实施例中，在a）中确定的参数值小于3723.5的细胞计数、以及在b）中确定的参数值大于每微升(μL)3.77389×106个细胞、以及在c）中确定的参数值小于64.1605的百分比是针对存在登革感染的预测，以及/或者在a）中确定的参数值大于3723.5的细胞计数、以及在d）中确定的在x轴上的参数值如果标度为0到99则小于63.8149、以及在e）中确定的参数值小于75的细胞计数、以及在b）中确定的参数值大于每微升3.94312×106个细胞、以及在d）中确定的在y轴上的参数值如果标度为0到99则小于78.6959是针对存在登革感染的预测，以及/或者在a）中确定的参数值大于3723.5的细胞计数、以及在d）中确定的在x轴上的参数值如果标度为0到99则大于63.8149、以及在f）中确定的参数值大于29.1512的百分比是针对存在登革感染的预测。这具有如下优点：方法的性能增加到90%的灵敏度并且还具有90%的特异性。
在创新方法的另一优选的实施例中，用于在患者血液中检测登革感染的方法包括以下步骤：
a) 在样本中执行血小板体积分析并且确定血小板体积的分布；
b) 确定样本中的具有大于预限定的限度的吸收值的过氧化物酶细胞的百分比；
c) 确定样本中的多形核细胞（Polymorphonucleocyte，PMN）在Y方向上的平均值；
d) 确定样本中的平均血小板浓度；
e) 从在步骤a)至步骤d)中确定的值获得样本参数；以及
f) 关于预指定准则来评价样本参数，其中如果满足准则，则存在登革感染。
在创新方法的优选的实施例中，在d）中确定的更高的参数值，和/或在c）中确定的更高的参数值是针对存在登革感染的预测。
在创新方法的优选的实施例中，在a）中确定的参数值大于每微升0.758244×103个细胞、以及在b）中确定的参数值小于0.126523的百分比、以及在d）中确定的参数值大于每分升（dL）26.9465克（gram）是针对存在登革感染的预测，以及/或者在a）中确定的参数值大于每微升0.758244×103个细胞、以及在c）中确定的参数值大于11.2002是针对存在登革感染的预测。这具有如下优点：方法的性能增加到96%的灵敏度并且具有99%的特异性。这意味着在全覆盖自动化血液检查的情况下假阳性诊断结果或者假阴性诊断结果的数量可以被减小到以前未知的程度。这意味着在可靠登革感染诊断方面的巨大进步并且将导致整体健康状态的显著改善和及时并且合理的医疗行为。
在创新方法的优选的实施例中，通过散射光的测量来确定参数。相比于阻抗测量，散射光测量涉及如上面说明的其中使用激光的方法（“光学方法”），其中血液样本（逐个细胞地）通过激光并且激光束的偏转可以由合适的设备检测。使用激光束执行的方法在所附的图1中解释。在这种方法中以各种角度范围（低角度和高角度）检测被各单独的细胞散射的光束，这分别允许获得关于体积（低角度）和密度（高角度）的信息。根据本发明，从激光轴偏离大约2o到3o的角度指的是“低角度”，从激光轴偏离大约5o到15o的角度指的是“高角度”。已经知悉的是在对于测量结果的误差的更低的受影响度方面散射光测量优于阻抗测量。
在创新方法的优选的实施例中，登革感染涉及具有登革病毒血清型DEN-1、DEN-2、DEN-3和/或DEN-4的感染。
在创新方法的优选的实施例中，在a）中确定血小板体积的分布包括将血小板体积与对数正态分布拟合。
在创新方法的优选的实施例中，在a）中确定血小板体积的分布包括确定血小板体积的分布的标准差。
优选地，在a）中确定血小板体积的分布包括确定对数正态分布的标准差。
在创新方法的优选的实施例中，通过自动化细胞计数设备来执行方法。
本发明的另一主题是被配置为执行用于在患者血液样本中检测登革感染的创新方法的自动化细胞计数设备。
在自动化细胞计数设备的优选的实施例中，该设备包括至少一个散射光测量设备、至少一个流式细胞仪和/或至少一个数字全息显微镜。
以下还参照所附各图更详细地描述创新方法的实施例，在各图中：
图1示出用于执行创新方法的流式细胞仪设备1的示意图。
图2示出在红细胞11的基础上的大角度散射的光的示意图，其与细胞的粒度和密度相关联并且是在5o到15o的典型范围中测量的。这对应于细胞密度的确定。
图3示出在低角度散射的光的范围（2o到3o）中的细胞11的细胞体积（或者细胞大小）的确定。
图4示出通过其来确定预指定准则的处理，预指定准则被用于在根据本发明的用于在患者血液样本中检测登革感染的方法中评价样本参数。
首先，获得训练数据（20）。在此，从在印度的实验室获得患者样本，该患者样本针对登革病毒的任何血清型都是阳性的。没有根据血清型再划分数据，因为本发明的目的并不是在登革株之间进行区别而是警告病毒的存在。
第二，从患者样本提取相关的特征向量。利用来自西门子医疗系统有限公司（SIMENS HEALTHNEERS GMBH）的ADVIA 2120i血液系统测量样本。ADVIA 2120i仪器能够产生超过400个结果。用那些特征来执行统计分析以确定哪些特征在登革患者样本和非登革患者样本之间明显地不同。选择示出明显不同（校正后p﹤0.05）的特征以训练分类器。
第三，训练分类器以基于所选择的特征在阳性患者样本和阴性患者样本之间进行区分。在此选取的分类方法是用于分类的决策树。通过使用贪心算法来训练分类树模型，所述贪心算法基于特征来分割数据集并且计算所得到的分割有多好地将数据分类到阳性患者样本和阴性患者样本中。分类算法（22）以不同的分割值/组合在所有特征上运行并且只保留提供最高预测能力的那些特征。不提供任何附加预测力的那些特征被丢弃。在这种情况中使用的分类算法（22）是如在MATLAB中实现的标准分类和回归树预测器分割算法。
第四，存储用以诊断未来未知患者的样本的所得到的预测模型。预测模型（23）是将最终标识在未知情况中为登革阳性的那些样本的算法。分别在图5 和图6中示出两种不同模型（用以标识登革阳性血液样本的分类树）的可视化。在图5中示出的模型基于如下这样的特征：这些特征一般仅从血液学分析仪可获得。在图6中示出的模型使用一般从血液学分析仪可获得的特征以及可能不容易从除了ADVIA 2120i血液学系统之外的血液学分析仪可获得的特征。在关于上面描述的那些特征训练模型之后，参照图5中示出的模型而最终提供最佳的分类精确性的特征是在表1中列出的那些特征，并且参照图6中示出的模型的那些是下面在表2中列出的那些特征。
ADVIA 2120 基于本质上细胞使光散射的程度来产生细胞直方图（cytogram）。每个细胞都具有散射高值（低角度散射光，例如参见图3）和散射低值（大角度散射光，例如参见图2），其来自有多少光（强度）在0至49的标度上击中高检测器或者低检测器。散射高和散射低然后被绘制成散射图（细胞直方图），其中在x轴上为高，在y轴上为低。PMN Y峰值（PMNY peak）是在Y方向上细胞的PMN簇的峰值。
随后是所生成的用以标识登革病毒的模型。在图5和图6中示出的决策树中的每个节点表示血液学参数（分别参见表1和表2）和相应的预指定准则。终结的分支决定新的样本是否将取决于要被分类的样本的对应的测量参数值而被分类为登革阳性（P）或者登革阴性（N）。
在1585个患者样本的集合上训练这些模型。为了防止过拟合，通过将数据划分为5个集合来执行交叉验证，其中4个集合被用于训练模型并且1个集合被用于验证。针对每个子集这样执行5次以测试模型和平均的结果。为了在所得到的模型以前从未见过的数据上评判该所得到的模型，在整个分析当中还置留出10%的数据。
各模型的性能分别展现为90%的灵敏度和90%的特异性（在图5中示出的模型）以及96%的灵敏度和99%的特异性（在图6中示出的模型）。两种模型的组合能够有附加的优点。
在如上面确定的预指定准则的基础上，创新方法使得能够使用标准血液学系统来评价所确定的参数并且以高的特异性和灵敏度预测登革感染。
参考标号列表
1 用于流式细胞仪的设备
2 激光器
3 传感器模块
4 光学透镜
5 半透明镜面
6 光圈
7 镜面
8 传感器
9 传感器
10 传感器
11 细胞
20 训练数据
21 特征向量
22 分类算法
23 模型
P 阳性
N 阴性。

Claims (5)

1.一种存储介质，具有存储在其上的程序，所述程序在被执行时实施一种用于在患者血液样本中检测登革感染的方法，所述方法包括以下步骤：
a)执行有效过氧化物酶细胞分析，包括确定被检测为经流路池从过氧化物酶通道通过的细胞的数量；
b)执行红细胞分析，包括确定红细胞计数RBC；
c)在样本中执行血小板分布分析，包括确定血小板分布、其标准差和其百分比平均值，以及通过将标准差除以百分比平均值来确定血小板分布宽度PDW；
d)执行中性粒细胞簇分析，包括确定中性粒细胞簇在x轴上的定位平均值和确定中性粒细胞簇在y轴上的定位平均值；
e)执行原始红细胞分析，包括确定在红细胞RBC通道上的原始红细胞计数；
f)确定具有小于60fL的体积的红细胞RBC的百分比；
g)从在步骤a)至步骤f)中确定的值获得样本参数；以及
h)关于预指定准则来评价样本参数，其中
如果被检测为经流路池从过氧化物酶通道通过的细胞的数量小于3723.5的细胞计数，红细胞计数RBC大于每微升3.77389×106个细胞，并且血小板分布宽度PDW小于64.1605的百分比，则确定存在登革感染；
或
如果被检测为经流路池从过氧化物酶通道通过的细胞的数量大于3723.5的细胞计数，中性粒细胞簇在x轴上的定位平均值如果标度为0到99则小于63.8149，在红细胞RBC通道上的原始红细胞计数小于75的细胞计数，红细胞计数RBC大于每微升3.94312×106个细胞，并且中性粒细胞簇在y轴上的定位平均值如果标度为0到99则小于78.6959，则确定存在登革感染；
或
如果被检测为经流路池从过氧化物酶通道通过的细胞的数量大于3723.5的细胞计数，中性粒细胞簇在x轴上的定位平均值如果标度为0到99则大于63.8149，并且小于60fL的体积的红细胞RBC的百分比大于29.1512的百分比，则确定存在登革感染。
2.一种存储介质，具有存储在其上的程序，所述程序在被执行时实施一种用于在患者血液样本中检测登革感染的方法，所述方法包括以下步骤：
a)在样本中执行血小板体积分析并且确定血小板体积的分布；
b)确定样本中的具有大于预限定的限度的吸收值的过氧化物酶细胞的百分比；
c)确定样本中的多形核细胞PMN在Y方向上的平均值；
d)确定样本中的平均血小板浓度MPC；
e)从在步骤a)至步骤d)中确定的值获得样本参数；以及
f)关于预指定准则来评价样本参数，其中
如果血小板体积的分布的标准差小于每微升0.758244×103个细胞，样本中的具有大于预限定的限度97的吸收值的过氧化物酶细胞的百分比小于0.126523的百分比，并且样本中的平均血小板浓度MPC大于每分升26.9465克，则确定存在登革感染；
或
如果血小板体积的分布的标准差大于每微升0.758244×103个细胞，并且样本中的多形核细胞PMN在Y方向上的平均值在标度为0到49的情况下大于11.2002，则确定存在登革感染。
3.如权利要求1或2中要求保护的存储介质，其中通过散射光测量确定参数。
4.如权利要求1或2中要求保护的存储介质，其中登革感染涉及具有登革病毒血清型DEN-1、DEN-2、DEN-3和/或DEN-4的感染。
5.如权利要求2中要求保护的存储介质，其中所述血小板体积的分布通过将血小板体积与对数正态分布拟合来确定。
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