CN110241203A - 一种骨关节炎诊治靶点及其应用 - Google Patents

一种骨关节炎诊治靶点及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种骨关节炎诊治靶点及其应用。本发明通过实验证明：DLEU7基因在骨关节炎患者的滑膜组织中高表达，根据DLEU7基因的表达水平来预测受试者的患病风险及疾病的状态。本发明还公开了DLEU7基因可以用于制备骨关节炎的治疗药物，细胞增殖实验证明干扰DLEU7基因能抑制滑膜细胞增殖。本发明为临床提供新的骨关节炎基因诊断和治疗的重要靶点。

Description

一种骨关节炎诊治靶点及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种骨关节炎诊治靶点及其应用，更具体地涉及DLEU7基因在诊治骨关节炎中的应用。
背景技术
骨关节炎(osteoarthritis，OA)是一种关节软骨的慢性退行性疾病，是临床常见的慢性疾病之一，好发于中老年人，女性明显多于男性，近年来，该病的致残率逐年上升。其主要病理改变为软骨基质降解，软骨周围骨质增生，骨赘形成。OA被认为是造成世界范围内慢性残疾的主要公共健康问题，对社会经济具有较深的影响。
最近，分子诊断学的重要性已经日趋增加，逐渐步入疾病的临床诊断中(例如传染性病原体的检测、基因组的突变的检测、患病细胞的检测和疾病的诱因的风险因子的鉴定)。
尤其是，通过核酸表达分析，可以为疾病的诊断和治疗提供重要的线索。待检测的感兴趣核酸包括基因组DNA、表达的mRNA和其他RNA诸如微小RNA等。它们可作为研究、诊断和治疗目的的生物靶点。目前关于OA相关生物靶点的研究逐渐受到临床关注，通过对生物靶点与骨关节炎关系的研究，以期能够及早发现关节软骨损伤，制定合理治疗方案，延缓、甚至逆转OA病情进展。
为实现上述目的，本发明首先通过高通量测序方法结合生物信息学方法筛选到候选基因DLEU7基因，然后进行QPCR验证，结果显示DLEU7基因在OA组织中高表达，与OA具有很好的相关性，可用于制备OA辅助诊断药物，具有重要的临床应用价值。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种通过检测DLEU7基因表达差异来诊断骨关节炎的方法。
本发明的目的之二在于提供一种通过抑制DLEU7基因表达来治疗骨关节炎的方法。
本发明的目的之三在于提供一种用于治疗骨关节炎的药物。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明提供了检测样本中DLEU7基因表达的产品在制备诊断骨关节炎的工具中的应用。
进一步，所述检测样本中DLEU7基因表达的产品采用高通量测序、定量PCR、探针杂交、免疫方法检测DLEU7基因的表达水平。
所述高通量测序能够使测序方法平行化，一次产生几千个或几百万个序列的高通量测序技术。例子包括大规模平行标签测序(Massively Pa rallel SignatureSequencing，MPSS)、Polony测序、454焦磷酸测序、Illumina测序、SOLiD测序、离子半导体测序、DNA纳米球测序、Helioscope(TM)单分子测序、单分子SMRT(TM)测序、单分子实时(RNAP)测序、纳米孔DNA测序。
所述“表达水平”是指DLEU7基因的确定的表达水平，表达水平可相对于不同组织、患者对健康对照等中的表达来评价。在一个特定方面，DLEU7的表达水平高于对照平均表达水平，则指示增加的骨关节炎风险，该风险与DLEU7表达水平成正比，从而对骨关节炎进行诊断。
进一步，所述定量PCR包括特异性扩增DLEU7基因的引物；所述探针杂交包括与DLEU7基因的核酸序列杂交的探针。优选的，扩增DLEU7基因的引物包括上游引物和下游引物，上游引物序列为SEQ ID NO.1，下游引物序列为SEQ ID NO.2。
本发明中的“样本”是源自生物学生物体或已同生物学生物体相接触的样本。样本的例子是细胞、组织、体液、活组织检查样本、血液、尿液、唾液、痰液、血浆、血清、细胞培养上清液，和其他。优选的，所述样本为组织。
本发明提供了DLEU7基因的抑制剂在制备治疗骨关节炎的药物中的应用。
进一步，所述抑制剂包括抑制DLEU7基因表达的试剂。
进一步，所述抑制DLEU7基因表达的试剂包括核酸抑制物，蛋白抑制剂，蛋白水解酶，蛋白结合分子。其中核酸抑制物选自：以DLEU7基因或其转录本为靶序列、且能够抑制DLEU7基因表达的干扰分子，包括：shRNA(小发夹RNA)、小干扰RNA(siRNA)、dsRNA、微小RNA、反义核酸，或能表达或形成shRNA、小干扰RNA、dsRNA、微小RNA、反义核酸的构建物。蛋白结合分子选自：与DLEU7蛋白特异性结合的物质，如能够抑制DLEU7蛋白活性的抗体或配体。
进一步，所述抑制DLEU7基因表达的试剂包括抑制DLEU7基因的siRNA或DLEU7蛋白的抗体。为了确保DLEU7基因能够高效剔除或沉默，根据DLEU7基因的mRNA序列设计了siRNA特异性片段。siRNA的设计根据已发表的通用设计原则(Elbashir et.al 2001，Schwarzet.al 2003，Khvorova et.al 2003，Reynolds et.al 2004，Hsieh et.al 2004，Ui-Teiet.al 2004)，通过在线工具完成设计，该在线工具为：siRNASelection Program ofWhitehead Institute(Bingbing Yuan et.al 2004，http://jura.wi.mit.edu/bioc/siRNAext/)和BLOCK-iTTM RNAi Designer of INVITROGEN(winner of the2004Frost&Sullivan Excellence in Research Award，https://rnaidesigner.invitrogen.com/sirna/)。为了进一步提高siRNA片段的有效性，综合两个在线设计工具的优点来设计用于筛选的siRNA片段。最后通过同源性比对(NCBI BLAST)来过滤siRNA序列，以提高siRNA片段的特异性并减少RNAi干扰的脱靶效应。
优选的，抑制DLEU7基因的siRNA序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。
本发明还提供了一种用于治疗骨关节炎的药物，所述药物包括上面所述的抑制DLEU7基因的试剂。
本发明的药物还包括药剂学上可接受的载体，这类载体包括(但并不限于)：稀释剂、赋形剂如水等、填充剂如淀粉、蔗糖等；粘合剂如纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮；湿润剂如甘油；崩解剂如琼脂、碳酸钙和碳酸氢钠；吸收促进剂如季铵化合物；表面活性剂如十六烷醇；吸附载体如高岭土和皂粘土；润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙和镁、聚乙二醇等。药剂学上许可的适合的载体和制剂详细记载于雷明登氏药学全书。
本发明的药物的适合的给药剂量根据制剂化方法、给药方式、患者的年龄、性别、体重、病态、食物、给药时间、给药途径、排泄速度以及反应灵敏性之类的因素而可以进行多种处方，通常，熟练的医生能够容易地决定处方对所希望的治疗或预防，进而给出有效的给药剂量。
本发明的药物还可与其他治疗骨关节炎的药物联用，多种药物联用可大大提高治疗的成功率。
在本发明的上下文中，“DLEU7基因”包括DLEU7基因以及DLEU7基因的任何功能等同物的多核苷酸。DLEU7基因(NC_000013.11(50711026..50843945,complement))序列可在国际公共核酸序列数据库GeneBank中查询到。
在本发明的上下文中，DLEU7蛋白包括DLEU7蛋白以及DLEU7蛋白的部分肽。所述DLEU7蛋白的部分肽含有与骨关节炎相关的功能域。
“DLEU7蛋白”包括DLEU7蛋白以及DLEU7蛋白的任何功能等同物。所述功能等同物包括DLEU7蛋白保守性变异蛋白质或其活性片段，或其活性衍生物、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧条件下能与DLEU7的DNA杂交的DNA所编码的蛋白质。
通常，已知的是，一个蛋白质中一个或多个氨基酸的修饰不会对蛋白质的功能造成影响。本领域技术人员会认可改变单个氨基酸或小百分比的氨基酸或对氨基酸序列的个别添加、缺失、插入、替换是保守修饰，其中蛋白质的改变会产生相似功能的蛋白质。提供功能相似的氨基酸的保守替换表是本领域公知的。
在本发明的上下文中，“诊断骨关节炎”既包括判断受试者是否已经患有骨关节炎，也包括受试者是否存在患有骨关节炎的风险。
在本发明的上下文中，“治疗骨关节炎”从疾病的状态变化来分，可以包括疾病的缓解和疾病的完全治愈。
本发明使用体外培养的滑膜细胞来研究DLEU7基因对骨关节炎的治疗效果。本领域技术人员可知，骨关节炎发生的一个重要生理特征在于滑膜细胞的增殖加快，分泌更多的因子促进骨关节炎的发生和发展，因此本发明利用滑膜细胞的增殖实验来验证DLEU7基因对骨关节炎的治疗效果。
本发明的优点和有益效果：
本发明发现了一种新的生物靶点—DLEU7基因，并且首次发现DLEU7基因与骨关节炎相关，通过检测受试者滑膜组织中DLEU7基因的表达，可以判断受试者是否患有骨关节炎、或者是否存在患有骨关节炎的风险，进而指导临床医师给受试者提供预防方案或治疗方案。
附图说明
图1是利用QPCR检测DLEU7基因在滑膜组织中的表达情况图；
图2是利用QPCR检测siRNA对DLEU7基因的干扰效果图。
具体实施方式
通过下面实例说明本发明的实施例，不以任何方式将所述实施例理解为对本发明的范围强加限制。相反，可以清楚地了解，在不脱离本发明精神的情况下，可以采用在阅读本文中的描述之后，本领域的技术人员能够联想到各种其他实施例、其修改和等效物。下文出于说明的目的，描述一些程序。
实施例1 OA滑膜组织和正常滑膜组织中DLEU7基因的表达差异
5例OA患者的滑膜组织(OA组)来自于行膝关节置换或滑膜切除术的OA病人，所用病例符合Altam提出的关于OA的诊断标准。3例正常滑膜组织(Nor组)来自于外伤手术病人关节滑膜组织。OA患者滑膜液(SF)高速离心后去上清，转移至-80℃冰箱中储存。
1、总RNA提取
利用TRIzol RNA提取方法提取OA患者滑膜液和正常滑膜组织中的总RNA。
(1)用液氮预冷研钵，组织样品放入加有液氮的研钵中，在液氮下把组织样品充分研磨成粉末；
(2)把样品粉末转入到装有TRIzol裂解液的2.0ml EP管中，(每ml裂解液可加50mg组织样品)剧烈震荡，充分混匀，平放室温静置5-10min；
(3)10000rpm，4℃离心5min；
(4)吸取上清液至新的2.0ml EP管中，每毫升裂解液加入200μl氯仿/异戊醇，剧烈颠倒混匀；
(5)10000rpm，4℃离心10min；
(6)吸取上清液至新的1.5ml离心管，注意不要吸到中间蛋白层，加入等上清液体积的异丙醇，轻轻颠倒混匀；
(7)放入-20℃冰箱沉淀1h；
(8)13600rpm，4℃离心20min；
(9)吸弃上清，加入1ml 75％乙醇，用移液器吹洗沉淀；
(10)10000rpm，4℃离心3min，吸弃上清，短暂离心，吸去残留液体，晾干3-5min；
(11)用30-100μl DEPC水或者RNase Free水溶解沉淀；
(12)置于-80℃冰箱保存；
(13)检测RNA的浓度以及完整性，RNA的纯度在1.8-2.2之间。
2、高通量测序及分析
由测序公司进行测序文库的建立及上机程序，测序平台为Illumina公司的HiSeqx-ten第二代高通量测序平台，进行高通量转录组深度测序。根据测序公司提供的数据进行统计学分析，P<0.05，log2(FC)绝对值>1。对差异表达基因人为挑选其中差异表达明显的基因，与OA相关性非常好的分子标志物DLEU7进入我们的研究范围，DLEU7在OA滑膜组织中的表达量高于正常滑膜组织。
实施例2 OA组和Nor组DLEU7基因表达情况
按照实施例1中的方法收集OA滑膜组织和正常滑膜组织各33例。
1、总RNA提取
提取步骤同实施例1。
2、逆转录
利用TIANGEN公司的逆转录试剂盒进行RNA的逆转录，具体反应体系如下：
(1)去除基因组DNA的反应体系
将1.0μg的总RNA模板与2.0μl的5×gDNA buffer和RNase Free水混合，终体积为10μl，42℃孵育3min。
(2)逆转录PCR反应体系
将2.0μl的10×Fast RT buffer、1.0μl的PrimerScript RT Enzyme Mix I与2.0μl的FQ-RT Primer Mix混合，加入10μl的去除基因组DNA的反应体系和5.0μl的RNase Free水，共20μl，42℃反应15min，之后95℃反应3min。
3、QPCR扩增
(1)引物设计
根据GeneBank中DLEU7基因和GAPDH基因(内参)的编码序列设计QPCR扩增引物，具体引物序列如下：
DLEU7基因：
正向引物为5’-GAAGGATAGTGTTGAGTT-3’(SEQ ID NO.1)；
反向引物为5’-ATTAGCAAGTGACTGAAT-3’(SEQ ID NO.2)；
GAPDH基因：
正向引物为5’-TTTAACTCTGGTAAAGTGGATAT-3’(SEQ ID NO.3)；
反向引物为5’-GGTGGAATCATATTGGAACA-3’(SEQ ID NO.4)。
(2)按照表1配制PCR反应体系：
SuperReal PreMix Plus试剂盒购自TIANGEN公司。
表1 PCR反应体系
试剂 体积
2×SuperReal PreMix Plus 10μl
正向引物(10uM) 0.6μl
反向引物(10uM) 0.6μl
50×ROX Reference Dye 2μl
DNA模板 2μl
去离子水 4.8μl
(3)PCR反应条件：95℃15min，(95℃10s，55℃30s，72℃32s)进行40个循环，之后95℃15s，60℃60s，95℃15s。以SYBR Green作为荧光标志物，在ABI 7300型荧光定量PCR仪上进行PCR反应，通过熔解曲线分析和电泳确定目的条带，2-ΔΔCT法进行相对定量。
4、统计学方法
实验设置3次平行实验，结果数据以平均值±标准差的方式来表示，采用统计软件来进行统计分析，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。
5、结果
统计结果如图1所示，与正常滑膜组织相比，OA滑膜组织DLEU7基因表达量显著增加，差异具有统计学意义(P<0.05)。
实施例3干扰DLEU7基因的表达
1、siRNA设计合成
SiRNA设计与合成依据在线设计软件，根据基因序列参照NCBI：DLEU7(NM_001306135.1)，设计相应的siRNA，具体序列如下：
siRNA-DLEU7：
5’-AAACUCAACACUAUCCUUCAG-3’(SEQ ID NO.5)；
5’-GAAGGAUAGUGUUGAGUUUAG-3’(SEQ ID NO.6)；
siRNA-NC(阴性对照siRNA序列)：
5’-CGUACGCGGAAUACUUCGA-3’(SEQ ID NO.7)；
5’-UCGAAGUAUUCCGCGUACG-3’(SEQ ID NO.8)；
将OA成纤维样滑膜细胞细胞按1×104/孔接种到24孔细胞培养板中，在37℃、5％CO2培养箱中细胞培养24h，在无双抗、含10％FBS的DMEM培养基中，转染按照脂质体转染试剂2000(购自于Invitrogen公司)的说明书转染，实验分为空白对照组(Con)、阴性对照组和实验组(20nM)，其中，阴性对照组siRNA-NC与DLEU7基因的序列无同源性，浓度为20nM/孔，同时分别转染。
2、QPCR检测siRNA的干扰效率
2.1提取细胞总RNA
(1)取一定量的细胞样品，液氮下迅速将样品研磨成粉末；
(2)加入Trizol，于漩涡振荡器上混匀，室温静置5min；
(3)4℃，12000×g离心10min，将上层水相转入新的1.5ml EP管(约400～500μl)，室温静置5min，使细胞充分裂解；
(4)加入氯仿，盖紧管盖，漩涡振荡器上振荡混匀，室温静置3-5min，使其自然分相；
(5)4℃，12000×g离心10min，混合物分成三层：下层红色为苯酚－氯仿有机相，中间蛋白层和无色上层水相，RNA主要集中在水相；
(6)转移上层水相(约400～500μl)，加入等体积氯仿/异戊醇(24:1)，混匀后，冰上静置5min，4℃，12000×g离心10min；
(7)必要时重复一次氯仿/异戊醇抽提，至中间层较干净；
(8)向转移的上清中加入等体积的异丙醇，-20℃放置1h；
(9)4℃，13600rpm离心20min，弃掉上清；
(10)RNA沉淀用1.0ml 75％乙醇漂洗两次，每次静置3min，期间颠倒洗涤，4℃13600rpm离心3min；
(11)移去残留的乙醇，将沉淀置于超净工作台吹干，用30～50μl Nuclease-freewater溶解RNA沉淀，必要时可于55～60℃下孵育10min助溶。
2.2逆转录和QPCR
步骤同实施例2。
3、统计学方法
实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用统计软件来进行统计分析的，干扰DLEU7基因表达组与对照组之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。
4、结果
结果如图2显示，siRNA-NC与空白对照组之间无显著的差异，而siRNA-DLEU7能够有效的抑制DLEU7基因的表达，差异具有统计学意义(P<0.05)。
实施例4 OA滑膜组织细胞增殖的抑制作用
1、细胞转染
按照实施2的方法对OA成纤维样滑膜细胞进行siRNA-DLEU7和siRNA-NC的转染。
2、转染24小时后将OA成纤维样滑膜细胞以2×105/ml密度接种至96孔培养板中，每孔100μl，每组设3个复孔，培养48小时后，分别在所需检测的培养孔内每孔加入10μlCCK-8溶液，在细胞培养箱内继续孵育1h，测定450nm处各孔吸光度值(OD值)。
3、统计学方法
实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。
4、结果
siRNA-NC转染细胞后，OD值为0.19±0.03，siRNA-DLEU7转染细胞后的OD值为0.11±0.04，可以看出与转染siRNA-NC细胞组相比，转染siRNA-DLEU7的细胞增殖减慢，差异具有统计学意义(P<0.05)。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围之内。
序列表
<110> 北京泱深生物信息技术有限公司
<120> 一种骨关节炎诊治靶点及其应用
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gaaggatagt gttgagtt 18
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
attagcaagt gactgaat 18
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tttaactctg gtaaagtgga tat 23
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ggtggaatca tattggaaca 20
<210> 5
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
aaacucaaca cuauccuuca g 21
<210> 6
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gaaggauagu guugaguuua g 21
<210> 7
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
cguacgcgga auacuucga 19
<210> 8
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ucgaaguauu ccgcguacg 19

Claims (10)

1.检测样本中DLEU7基因表达的产品在制备诊断骨关节炎的工具中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品采用高通量测序、定量PCR、探针杂交、免疫方法检测DLEU7基因的表达水平。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，定量PCR包括特异性扩增DLEU7基因的引物；探针杂交包括与DLEU7基因的核酸序列杂交的探针。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，扩增DLEU7基因的引物包括上游引物和下游引物，上游引物序列为SEQ ID NO.1，下游引物序列为SEQ ID NO.2。
5.根据权利要求1-4任一项所述的应用，其特征在于，所述样本为组织。
6.DLEU7基因的抑制剂在制备治疗骨关节炎的药物中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述抑制剂包括抑制DLEU7基因表达的试剂。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，抑制DLEU7基因表达的试剂包括抑制DLEU7基因的siRNA或DLEU7蛋白的抗体。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述抑制DLEU7基因的siRNA序列如SEQ IDNO.5和SEQ ID NO.6所示。
10.一种用于治疗骨关节炎的药物，其特征在于，所述药物包含抑制DLEU7基因的试剂。
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