CN110241100A - 粘质沙雷氏菌高产几丁质酶的合成培养基及其发酵方法 - Google Patents
粘质沙雷氏菌高产几丁质酶的合成培养基及其发酵方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种粘质沙雷氏菌高产几丁质酶的合成培养基及其发酵方法，属于微生物技术领域，合成培养基的配方为：牛肉膏3 g，蔗糖10 g，氮源5 g，NaCL10 g，琼脂粉15 g，蒸馏水1000 mL，制备方法是：将牛肉膏3 g，蔗糖10 g，氮源5 g，NaCL10 g，琼脂粉15 g，加1000 mL蒸馏水，加热至彻底融化，分装于锥形瓶中，121℃灭菌。本发明缓解了市面上对于几丁质酶的需求，且制作成本较低廉、制作工艺简单、属环境友好型，也提高了对于粘质沙雷氏菌TC‑1的利用率。
Description
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种粘质沙雷氏菌高产几丁质酶的合成培养基及其发酵方法。
背景技术
N-乙酰葡萄糖氨(NAG)是几丁质的单体，医学研究上有重要应用。可用于预防骨关节炎，此外还具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤的作用。它也可用于部分化学合成或者应用于食品添加剂。总之，NAG在化妆品、食物、药品方面都有十分广泛的利用。NAG的生产有三种方法：化学法、酶催化法和发酵法。化学法是主要方法，但是其反应剧烈，对环境影响大。酶催化法和发酵法相对于化学法属于环境友好型，但发酵法生产的主要菌株大肠杆菌在发酵过程中会分泌毒素，生产的氨基葡萄糖不能满足食品级需求。酶催化法用几丁质酶。虾蟹壳中含有丰富的几丁质，但目前几丁质酶的获取受底物虾蟹壳预处理困难、几丁质酶活性低的影响，导致出现NAG分离纯化困难、整体生产难度低等问题。
几丁质酶属于糖基水解酶家族，是用来降解甲壳素的一种水解酶。几丁质酶具有很多种作用，可应用于生物防治植物病原真菌、功能性几丁寡糖的制备、抗病基因工程中的基因资源应用等领域。几丁质酶普遍存在于微生物、动物和植物中，有很多种潜在作用，如对甲壳素废物的处理、功能性甲壳素寡糖的制备、真菌原生质体的制备、抗真菌剂以及在转基因植物等方面的应用。
第一次证明细菌和放线菌中含有水溶性几丁质酶以来，人们又从多种植物、动物和微生物中分离到几丁质酶。部分微生物可以产几丁质酶，如细菌、真菌等。能够分解几丁质的菌株分布较广，许多菌的许多属都具有产几丁质酶的能力。比较常见的就有粘质沙雷氏菌、斯氏假单抱菌、巨大芽抱杆菌、液化沙雷氏菌、液化肠杆菌等等，还有放线菌、灰色链霉菌、红色链霉菌、米曲霉和木霉等。
根据国内外的研究可知，粘质沙雷氏菌、灰色链霉菌产生几丁质酶的活性较强，且有更多的相关报道和研究记录。
几丁质是中肠围食膜和昆虫外骨骼的主要组成部分，这两种都被认为是昆虫抵抗外界病原微生物的主要保护膜。几丁质酶因具有对甲壳素特异性降解的作用，被普遍应用于植物病原真菌和农业害虫的生物防治中。现有的国内外研究表明，昆虫中肠围食膜中的几丁质能够被几丁质酶水解，这样能使苏云金芽胞杆菌，也就是杀虫毒素能更加容易地进入昆虫中肠，使杀虫效果得到了有效的提升。这证实了几丁酶具有提高苏云金芽孢杆菌杀虫效果方面的潜在价值。
在生物界中，一些生物体中存在能降解几丁质的几丁质酶，其中人们曾经证明，原核生物具有较高的几丁质酶活性，一些菌株或其几丁质酶已被用于真菌的防治。当培养基中有几丁质成份时可诱导粘质沙雷氏菌四种外切几丁质酶和菌体结合蛋白幼的生物合成。
综上所述，微生物几丁质酶是一类具有广阔应用前景的新型生物酶，能有效用于生物防治、医学应用、废弃物处理、环境保护及食品加工等领域。
粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)又名灵杆菌，革兰氏阴性短杆菌。广泛在盐碱土壤中被分离，可以产生几丁质酶，但是目前对于粘质沙雷氏菌产几丁质酶的发酵方案研究的不多，而且培养基的组分大部分都含有MgSO4.7H2O、K2HPO4、(NH4)2SO4、FeSO4.7H2O等化学成分，对环境的影响较大，而且几丁质酶的活性不高。例如，施腾鑫等(施腾鑫,刘嘉,贺淹才.黏质沙雷氏菌产几丁质酶的发酵工艺优化[J].华侨大学学报(自然科学版)，2010,31(6):667-670)利用正交设计法优化其摇瓶发酵产酶的条件.研究结果表明,最佳培养基组分(质量分数):0.504％胶体几丁质，1.178％酵母粉，0.025％MgSO4.7H2O,0.095％K2HPO4，0.001％FeSO4.7H2O,0.005％山梨醇,0.030％KH2PO4；最佳摇瓶发酵工艺条件:培养时间为48h,发酵温度为30℃,初始pH值为9.0,装液量为30mL,接种量为1％，在此优化条件下,酶活力为9.39μkat.L-1。夏金兰等(夏金兰，熊晶，刘可可，张瑞永，等.粘质沙雷氏菌XJ-01几丁质酶合成条件的优化[J].现代生物医学进展，2009,9(17):3208-3211)利用正交实验确定该菌的最适酶合成条件，产酶培养基的组分为：胶体几丁质10g/L，(NH4)2SO45g/L，MgSO4.7H2O0.5g/L，K2HPO40.6g/L，结果显示几丁质酶最优合成条件是，胶体几丁质10g/L，(NH4)2SO45g/L，培养温度32度，酶活性为15.36U/mL。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种粘质沙雷氏菌高产几丁质酶的合成培养基及其发酵方法,缓解了市面上对于几丁质酶的需求，且制作成本较低廉、制作工艺简单、属环境友好型，提高了对于粘质沙雷氏菌TC-1的利用率。
为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：
粘质沙雷氏菌高产几丁质酶的合成培养基，所述合成培养基的配方为：牛肉膏3g，蔗糖10g，氮源5g，NaCL10g，琼脂粉15g，蒸馏水1000mL。
优选的，所述合成培养基的制备方法是：将牛肉膏3g，蔗糖10g，氮源5g，NaCL10g，琼脂粉15g，加1000mL蒸馏水，加热至彻底融化，分装于锥形瓶中，121℃灭菌。
优选的，所述氮源为蛋白胨、氯化铵、硫酸铵、牛肉膏中的一种。
优选的，所述氮源为蛋白胨。
优选的，所述的粘质沙雷氏菌高产几丁质酶的发酵方法：将实验室保存的粘质沙雷氏菌TC-1接种于灭菌后的基础产酶斜面上，使用接种环用“Z”形划线法接种，接种过程在超净工作台中完成，接种环及试管口均用酒精灯灼烧杀菌；将接种后的斜面放于恒温培养箱中观察，24h后取出；将活化后的粘质沙雷氏菌挑取一环接于装有几丁质培养液的三角锥形中，放置于24-32℃、150r/min震荡培养24-72h。
优选的，所述几丁质培养液是将牛肉膏3g，蔗糖10g，蛋白胨5g，NaCL10g，碳源7-13g，加1000mL蒸馏水，加热至彻底融化，分装于锥形瓶中，121℃灭菌后制得。
优选的，所述碳源为胶体几丁质、粉状几丁质、淀粉、纤维素中的一种。
优选的，所述碳源为胶体几丁质。
微生物几丁质酶是一类具有广阔应用前景的新型生物酶，能有效用于生物防治、医学应用、废弃物处理、环境保护及食品加工等领域。随着热稳定微生物几丁质酶分子结构、催化机理及其基因水平调控机理研究的深入，微生物几丁质酶将实现标准化的大规模生产，其应用领域将被进一步扩宽，市场发展前景也将越来越广阔。现阶段微生物几丁质酶的研究多集中在菌种选育及产酶条件等方面，加之几丁质酶结构及应用原理复杂，自然分离的酶活性不高，热稳定性差等因素，使微生物几丁质酶的应用及市场开发受到严重限制。
无机盐是微生物生长繁殖的营养之一，镁是微生物内酶的重要成分，如硫酸镁为培养各种乳酸菌提供生长因子，还能抑制杂菌。磷酸二氢钾起的是缓冲PH值的作用，同时也在培养基中增加磷和钾的成分。磷是蛋白质、核酸、细胞膜的组成部分，在培养基中起缓冲作用。钾作为酶的辅因子，维持电位差和渗透压，而且还是具有重要的PH值缓冲作用。硫酸亚铁组成细胞色素、细胞色素氧化酶和过氧化氢酶的活性基团，铁还是是电子呼吸传递链的重要成员之一。本领域的技术人员认为，缺少镁，肯定会影响细菌的生长繁殖。营养物质是提供细菌生长繁殖所需要的能量、合成菌体的原料以及激活细菌酶的活性核调节渗透压等作用。故现在的培养基中的成分均含有蛋白胨、氯化钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸镁、硫酸亚铁等，长期以来，人们普遍认为，这些物质是培养基中的必备成分，而通过这样的培养，产出的酶含量较低。例如，授权公告号为CN101942401B的专利公开了一株产几丁质酶菌株及高产几丁质酶的方法，培养基：磷酸二氢钾(0.05-0.1)，磷酸氢二钾(0.02-0.06)，硫酸镁(0.03-0.07)，七水硫酸亚铁(0.001-0.005)，酵母浸出物(0.2-0.4)，葡萄糖(0.10-0.30)，尿素(0.4-1.0)，几丁质粉粒(1-2)。通过种子培养、筛选、产酶培养、发酵等方法得到菌株及几丁质酶，该产酶培养包含多种化学物质，工艺复杂，任一因素把控不好，便会造成菌株死亡，得到的酶活为5.4U/mL。再如，黄小龙等(黄小龙.彭可.周双清.黄东益.粘质沙雷氏菌产几丁质酶发酵条件的研究[J].生物技术,2010,20,3:64-66)，优化质沙雷氏菌的发酵条件，培养基中加入蛋白胨、KH2PO4等物质，得到最佳发酵条件，最高产酶量仅为5.49U/mL，无法满足市场的广大需求量。本领域的技术人员认为，几丁质酶的获取受原料限制、几丁质酶活性低的影响，导致NAG分离纯化困难、整体生产难度低，而市面上对N-乙酰葡萄糖氨的需求较大，但其生产工艺较复杂，导致几丁质酶短缺，这也是至今未能有效解决的一个关键难题。而本领域的技术人员未对常规工艺进行突破性改进，也是目前几丁质酶产量低，无法突破的技术瓶颈。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
本发明通过单因素和响应面法优化了产酶条件，以粘质沙雷氏菌TC-1作为研究菌株，以基础培养基为基础，选取不同的温度、时间、碳源、氮源、胶体几丁质浓度等因素进行试验，在最优条件培养温度为28℃、培养时间为64h、胶体几丁质含量为9g/L下，产酶量达到19.061U/mL。与其他研究结果相比，该菌株产酶量相对较高，证明粘质沙雷氏菌TC-1产几丁质酶的功能应用前景较广。例如粘质沙雷氏菌TC-1分离出的几丁质酶可直接用于酶解法生产N-乙酰氨基葡萄糖，能够在一定程度上解决N-乙酰氨基葡萄糖短缺的问题；也可用于生物防止、医学运用以及废弃物处理等；在杀虫剂的研究上，可以根据几丁质酶对于昆虫食膜的降解作用加以利用，使杀虫剂能够有更高的杀虫率。
本发明研究的菌株产几丁质酶的能力较强，有效解决了酶催化法制作N-乙酰葡萄糖氨时面临的几丁质酶短缺的问题，使酶催化法不再受制于几丁质酶分离纯化困难，解决了制作工艺复杂等问题。
综上所述，本发明缓解了市面上对于几丁质酶的需求，且制作成本较低廉、制作工艺简单、属环境友好型。另外，也提高了对于粘质沙雷氏菌TC-1的利用率，具有广阔的市场应用前景，极高的经济开发价值和积极的推广意义。
附图说明
下面结合附图对本发明作进一步的详细说明。
图1是本发明N-乙酰葡萄糖胺标准曲线图。
图2是本发明培养时间对酶活性影响的折线图。
图3是本发明培养温度对酶活性影响的折线图。
图4是本发明碳源对酶活性影响的柱状图。
图5是本发明氮源对酶活性影响的柱状图。
图6是本发明胶体几丁质含量对酶活性影响的折线图。
图7是本发明胶体几丁质含量和培养时间对酶活性影响的响应面分析图。
图8是本发明胶体几丁质含量和培养温度对酶活性影响的响应面分析图。
图9是本发明本发明培养时间和培养温度对酶活性影响的响应面分析图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例的附图1-9，对本发明实施例的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于所描述的本发明的实施例，本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
几丁质酶活测定
将菌株培养液通过以下方式处理，并使用紫外可见光分光光度计测540nm的OD值。
取摇床培养72h的菌液，用低温离心机4℃、8000r/min离心10分钟，按下表1进行处理，于540nm波长下测OD值。空白对照为对照组。以N-乙酰葡萄糖胺(NAG)标准曲线做为对照。
表1酶活性测定方法
其中，所述N-乙酰葡萄糖胺标准曲线为：取0.1g N-乙酰葡萄糖胺用蒸馏水溶解并定容至100mL，此时为1mg/mL的N-乙酰葡萄糖胺标准溶液。根据表2测量不同浓度的N-乙酰葡萄糖胺在540nm下的OD值。
表2 N-乙酰葡萄糖胺标准曲线配制方法
所述DNS试剂的制备方法是：酒石酸钾钠36.4g，溶于100mL蒸馏水中，加热溶解，在热溶液中依次加入1.26g3，5-二硝基水杨酸，4.2g NaOH，1.0g苯酚晶体，搅拌至溶解，定容至200mL。
酶活力单位的定义：在以上反应条件下，每小时释放相当于1μmol N-乙酰葡萄糖胺(NAG)所需要的酶量为一个酶活力单位(U/m L)
确定粘质沙雷氏菌产几丁质酶之后，研究其产酶条件，寻找最佳产酶环境，通过培养时间、培养温度、培养基碳源、培养基氮源、胶体几丁质浓度几个方面的研究，确定使其高产的因素。本发明粘质沙雷氏菌保藏编号为CCTCCM 2015634，保藏日期为2015年10月22日，参见公开号为CN105861376A的专利文献。
实施例1
培养时间对TC-1菌株产几丁质酶的影响
所述合成培养基的制备方法是：将牛肉膏3g，蔗糖10g，蛋白胨5g，NaCL10g，琼脂粉15g，加1000mL蒸馏水，加热至彻底融化，分装于锥形瓶中，121℃灭菌。
所述的粘质沙雷氏菌高产几丁质酶的发酵方法：将实验室保存的粘质沙雷氏菌TC-1接种于灭菌后的基础产酶斜面上，使用接种环用“Z”形划线法接种，接种过程在超净工作台中完成，接种环及试管口均用酒精灯灼烧杀菌；将接种后的斜面放于恒温培养箱中观察，24h后取出；将活化后的粘质沙雷氏菌挑取一环接于装有几丁质培养液的三角锥形中，放置于28℃、150r/min的摇床中震荡培养24-72h。
所述基础产酶斜面是用所述合成培养基配制之后，分装于试管中，七个试管为一组包扎好灭菌，灭菌后使其倾斜成斜面凝固。
所述几丁质培养液是将牛肉膏3g，蔗糖10g，蛋白胨5g，NaCL10g，胶体几丁质10g，加1000mL蒸馏水，加热至彻底融化，分装于锥形瓶中，121℃灭菌后制得。
所述胶体几丁质的制备方法是，取粉状几丁质15g，加100mL浓盐酸，冰浴搅拌20min，离心，取出上清液，倒入冷蒸馏水中再次沉淀，同时将沉淀物用浓盐酸再次同样的方法处理，最后在沉淀物中加入足量的蒸馏水，搅拌成奶油状，最后用NaOH调pH，使其呈中性，即pH为7。
摇床设置为28℃、150r/min进行培养，分别培养24h、30h、36h、42h、48h、54h、60h、66h、72h后，按上述几丁质酶活测定法测定其酶活性，每个处理设三个重复。
实施例2
培养温度对TC-1菌株产几丁质酶的影响
所述合成培养基的制备方法同时实施例1。
所述的粘质沙雷氏菌高产几丁质酶的发酵方法：与实施例1不同的是，将活化后的粘质沙雷氏菌挑取一环接于装有几丁质培养液的三角锥形中，放置于摇床中震荡培养。摇床转速设置为150r/min后进行菌株的培养，在温度24℃、26℃、28℃、30℃、32℃的设定下分别进行培养，每个温度设立三个重复，培养60h后，按上述几丁质酶活测定法测定其酶活性。
所述基础产酶斜面的制备方法同实施例1。
所述几丁质培养液和胶体几丁质的制备方法同实施例1。
实施例3
碳源对TC-1菌株产几丁质酶的影响
所述合成培养基的制备方法同实施例1。
所述的粘质沙雷氏菌高产几丁质酶的发酵方法：与实施例1不同的是，将活化后的粘质沙雷氏菌挑取一环接于装有几丁质培养液的三角锥形中，放置于28℃、150r/min的摇床中震荡培养60h。
所述基础产酶斜面的制备方法同实施例1。
所述几丁质培养液是将牛肉膏3g，蔗糖10g，蛋白胨5g，NaCL10g，碳源10g，加1000mL蒸馏水，加热至彻底融化，分装于锥形瓶中，121℃灭菌后制得。
所述碳源为胶体几丁质、粉状几丁质、淀粉、纤维素中的一种。
其中，所述胶体几丁质的制备方法是，取粉状几丁质15g，加100mL浓盐酸，冰浴搅拌20min，离心，取出上清液，倒入冷蒸馏水中再次沉淀，同时将沉淀物用浓盐酸再次同样的方法处理，最后在沉淀物中加入足量的蒸馏水，搅拌成奶油状，最后用NaOH调pH，使其呈中性，即pH为7。
分别以10g/L的胶体几丁质、粉状几丁质、淀粉、纤维素作为碳源，研究粘质沙雷氏菌TC-1产几丁质酶时不同碳源对其的影响。将不同碳源的培养液接入粘质沙雷氏菌TC-1菌株，摇床设定为28℃、150r/min，放入菌液震荡培养60h。按上述几丁质酶活测定法测定其酶活性，每个处理设三个重复。
实施例4
氮源的选择对TC-1菌株产几丁质酶的影响
所述合成培养基的制备方法是：将牛肉膏3g，蔗糖10g，氮源5g，NaCL10g，琼脂粉15g，加1000mL蒸馏水，加热至彻底融化，分装于锥形瓶中，121℃灭菌。
所述氮源为蛋白胨、氯化铵、硫酸铵、牛肉膏中的一种。
所述的粘质沙雷氏菌高产几丁质酶的发酵方法：与实施例1不同的是，将活化后的粘质沙雷氏菌挑取一环接于装有几丁质培养液的三角锥形中，放置于8℃、150r/min的摇床中震荡培养60h。
所述基础产酶斜面的制备方法同实施例1。
所述几丁质培养液和胶体几丁质的制备方法同实施例1。
分别以10g/L的蛋白胨、氯化铵、硫酸铵、牛肉膏作为氮源研究不同氮源对粘质沙雷氏菌TC-1产几丁质酶的影响。将不同氮源的培养基接入同样且等量的粘质沙雷氏菌TC-1菌株，放入28℃、150r/min的摇床中震荡培养60h。按上述几丁质酶活测定法测定其酶活性，每个处理设三个重复。
实施例5
胶体几丁质含量对TC-1菌株产几丁质酶的影响
所述合成培养基的制备方法同实施例1。
所述的粘质沙雷氏菌高产几丁质酶的发酵方法：与实施例1不同的是，将活化后的粘质沙雷氏菌挑取一环接于装有几丁质培养液的三角锥形中，共接三瓶放置于28℃、150r/min的摇床中震荡培养60h。
所述基础产酶斜面的制备方法同实施例1。
所述几丁质培养液是将牛肉膏3g，蔗糖10g，蛋白胨5g，NaCL10g，胶体几丁质7-13g，加1000mL蒸馏水，加热至彻底融化，分装于锥形瓶中，121℃灭菌后制得。
所述胶体几丁质的制备方法同实施例1。
以浓度分别为7g/L、8g/L、9g/L、10g/L、11g/L、12g/L、13g/L的胶体几丁质作为培养基的碳源，接入菌株后放入28℃、150r/min的摇床中震荡培养60h后，按上述几丁质酶活测定法测定其酶活性，每个处理设三个重复。
实施例6
响应面优化设计
在单个影响因素实验和实施例1的基础上，应用Box-benhken的实验设计原理，使用响应面法对该菌株的产酶条件进行了三要素三水平的设计优化，碳源是胶体几丁质，氮源为蛋白胨，实验因素和水平如表3所示。
表3实验因素和水平
实验结果
N-乙酰葡萄糖胺曲线
N-乙酰葡萄糖胺标准曲线如图1所示。曲线标准方程为y＝0.0109x-0.0365，R2＝0.0931,说明该标准曲线可信。
实施例1培养时间对粘质沙雷氏菌TC-1产几丁质酶的影响
不同的培养时间对粘质沙雷氏菌TC-1产几丁质酶的影响，结果见图2。由图2可知培养时间在54h到66h之间酶活性较高，在第60h达到最高值17.44U/m L。可得出结论，最佳培养时间是60h。
实施例2培养温度分析
不同的培养温度对粘质沙雷氏菌产几丁质酶的影响，结果见图3所示。分析可得，培养温度在26℃到30℃之间酶活性较强，在28℃时达到最高酶活性17.33U/m L。可得出结论，最佳培养温度是28℃。
实施例3碳源结果分析
分别以胶体几丁质、粉状几丁质、淀粉、纤维素作为碳源，研究不同碳源对于粘质沙雷氏菌产几丁质酶的影响，找出最适碳源。探究结果如图4所示，在选用胶体几丁质作为碳源是酶活性达到最高值18.89U/m L。可得出结论，最佳碳源是胶体几丁质。
实施例4氮源结果分析
分别以蛋白胨、氯化铵、硫酸铵、牛肉膏作为氮素，研究粘质沙雷氏菌产几丁质酶是单元的变化对其的影响，找出最适氮源。结果如图5所示。在选用蛋白胨作为氮源时酶活性达到最高值17.8U/m L。可得出结论，最佳氮源为蛋白胨。
实施例5几丁质浓度结果分析
不同的胶体几丁质含量对粘质沙雷氏菌产几丁质酶的影响，研究结果如图6所示：胶体几丁质含量在8.5g/L到10g/L之间酶活力较高，在9.5g/L时达到最高值20.79U/m L。可得出结论，最佳胶体几丁质浓度为9.5g/L。
实施例6响应面优化设计结果分析
响应面的设计分别以胶体几丁质含量、培养时间和培养温度作为三个自变量，分别将其编号为A、B、C。以几丁质酶活性作为响应值，编号为Y，进行的响应面优化实验方案及结果如表4所示。
表4响应面实验方案及结果
表5响应面回归模型的方差分析
根据表5回归模型的方差分析。P<0.05，则表示该项指标显著；模型的指标<0.0001，失拟项的P值为0.0579，大于0.05，此项数据不显著，则说明该模型是合适的，没有偏失；单次项中胶体培养温度、几丁质含量的P值分别为0.0160和<0.0001，表示培养温度、胶体几丁质含量对响应值的影响显著；AB、AC、BC的P值分别为0.0568、0.2512、0.2669，均大于0.05，说明他们之间的交互影响对酶活性的影响不显著；二次项A2、B2、C2的P值都是<0.0001，说明实验3个因素的二次项对响应值影响显著。一般的，如果F值越大，P值越小，那么结果越显著。结果表明，在所选的各个因素中，对几丁质酶活力的影响大小依次为：胶体几丁质含量>培养温度>培养时间。
表6回归模型的可信度分析
可信度分析如表6所示，回归模型的复相关系数为0.9965，校正相关系数为0.9919，表明本实验结果拟合的比较好，模型的预测值和实验值差距不大，Y的变异系数相对较低，则此实验具有较高的可信度。信噪比较大，说明该模型能较好的反映实验结果。因此，这个回归模型可以用于确定产几丁质酶的最优方案。最终拟合得到的二次回归方程为：酶活性＝20.90+0.73A-0.12B+0.25C-0.26AB+0.14AC-0.13BC-2.55A2-2.82B2-2.36C2(A、B、C分别代表几丁质含量、培养时间和培养温度)。
采用响应面回归分析和回归方程拟合，绘制了响应面分析图。见图7～9。
分析图7可得，随着胶体几丁质含量和培养时间的变大，酶活性也在增大。在胶体几丁质含量和培养时间达到一定量即最佳条件时，，酶活性达到最大，但胶体几丁质含量和培养时间继续上升，酶活性不再继续增加反而会有一定程度的降低，说明当这两个变量取一定的合适值时，几丁质酶活性可以达到最大。同样，图8和图9也有类似的规则。通过软件自动分析、模拟得最优产几丁质酶的方案为：培养时间为63.83h、培养温度为28.12℃、胶体几丁质含量为9.06g/L，预测酶活力为20.964U/mL。经3次验证试验，实际酶活力为18.637U/mL。根据实际实验条件进行调整，将实验方案调整为：培养温度为28℃、培养时间为64h、胶体几丁质含量为9g/L，根据此方案测量结果，酶活力为19.061U/mL。实验结果显示，预测值与理论值差异较小，证明响应面法优化的产酶方案的数据可靠准确，具有很高的应用价值。
以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (8)
1.粘质沙雷氏菌高产几丁质酶的合成培养基，其特征在于：所述合成培养基的配方为：牛肉膏3 g，蔗糖10 g，氮源5 g，NaCL10 g，琼脂粉15 g，蒸馏水1000 mL。
2.如权利要求1所述的粘质沙雷氏菌高产几丁质酶的合成培养基，其特征在于：所述合成培养基的制备方法是：将牛肉膏3 g，蔗糖10 g，氮源5 g，NaCL10 g，琼脂粉15 g，加1000mL蒸馏水，加热至彻底融化，分装于锥形瓶中，121 ℃灭菌。
3.如权利要求2所述的粘质沙雷氏菌高产几丁质酶的合成培养基，其特征在于：所述氮源为蛋白胨、氯化铵、硫酸铵、牛肉膏中的一种。
4.如权利要求3所述的粘质沙雷氏菌高产几丁质酶的合成培养基，其特征在于：所述氮源为蛋白胨。
5.如权利要求1至4任意一项所述的粘质沙雷氏菌高产几丁质酶的发酵方法，其特征在于：将实验室保存的粘质沙雷氏菌TC-1接种于灭菌后的基础产酶斜面上，使用接种环用“Z”形划线法接种，接种过程在工作台中完成，接种环及试管口均用酒精灯灼烧杀菌；将接种后的斜面放于恒温培养箱中观察，24 h后取出；将活化后的粘质沙雷氏菌挑取一环接于装有几丁质培养液的三角锥形中，放置于24-32 ℃、150 r/min的摇床中震荡培养24-72 h。
6. 如权利要求5所述的粘质沙雷氏菌高产几丁质酶的发酵方法，其特征在于：所述几丁质培养液是将牛肉膏3g，蔗糖10 g，蛋白胨5 g，NaCL10 g，碳源7-13 g，加1000 mL蒸馏水，加热至彻底融化，分装于锥形瓶中，121 ℃灭菌后制得。
7.如权利要求6所述的粘质沙雷氏菌高产几丁质酶的发酵方法，其特征在于：所述碳源为胶体几丁质、粉状几丁质、淀粉、纤维素中的一种。
8.如权利要求7所述的粘质沙雷氏菌高产几丁质酶的发酵方法，其特征在于：所述碳源为胶体几丁质。
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