CN110227074A - 鹰嘴豆芽素a对海马神经元细胞的保护作用 - Google Patents

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宋欣欣
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Abstract

本发明公开了鹰嘴豆芽素A对海马神经元细胞的保护作用。鹰嘴豆芽素A对过氧化氢诱导大鼠原代海马神经元损伤的作用，包括Bio A预处理组能显著抑制H2O2作用引起的海马神经元损伤；Bio A处理组能明显降低细胞内ROS水平；Bio A作用后可剂量依赖性地上调模型细胞Bcl‑2蛋白表达，下调Bax、Casepase‑3蛋白表达。

Description

鹰嘴豆芽素A对海马神经元细胞的保护作用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及鹰嘴豆芽素A对海马神经元细胞的保护作用。
背景技术
阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)俗称老年痴呆，在中医属于“痴呆”、“呆症”、“呆病”等范畴，是老年期痴呆病中最常见的类型之一。国内外流行病学和临床实验研究表明，随着中老年女性绝经后体内雌激素水平的下降，其患AD的风险和比率也将大大增加，且AD患者的认知障碍损害程度明显高于老年男性。如对围绝经期女性(特别是卵巢摘除术后的女性)给予雌激素替代疗法(hormone replacement therapy，HRT)可大大降低AD的患病风险，改善AD患者的认知功能。尽管如此，但现在临床实践证明，长期应用雌激素的女性患者可增加患乳腺癌和子宫内膜癌的风险，因而对其是否适合使用及其使用时间备受争议。植物雌激素(Phytoestrogen)属于一类选择性雌激素受体调节剂(selective estrogenreceptor modulators，SERMs)，可选择性作用于某种雌激素受体，对不同组织或细胞产生不同的选择性调节作用，大量的基础、临床和流行病学研究表明，植物雌激素在动物和人身上发挥类似雌激素样的作用，能减轻更年期症状，并少有子宫内膜癌或乳腺癌的发生，从而克服HRT的治疗矛盾。生长激素(growth hormone，GH)与雌激素一样也是体内重要的内分泌激素之一，亦被证实可改善AD所致的记忆损害。GH与其受体二聚体结合，激活JAK2，促发一系列信号通路，其中JAK/STAT途径是最主要的信号途径。近年来，GH与雌激素的相互作用已被诸多实验证实，但两者对于神经系统的影响，目前研究甚少。
发明内容
本发明的目的在于提供鹰嘴豆芽素A对海马神经元细胞的保护作用。本发明所采用的技术方案是鹰嘴豆芽素A对过氧化氢诱导大鼠原代海马神经元损伤的作用。
进一步，取新生24小时内大鼠海马神经元细胞，进行原代细胞培养，镜下观察细胞生长状态，培养10天，加入神经元特异性抗体MAP-2，荧光鉴定神经元细胞纯度，以不同浓度梯度的BioA或不同浓度梯度的H2O2刺激海马神经元24h，CCK8法观察BioA对海马神经元细胞活力的影响，将培养的原代海马细胞分为正常组、H2O2组、BioA低中高三个剂量组，根据筛选出的BioA最佳作用浓度给予三个剂量组，药物作用24h后，除正常组外，其余组给予筛选出的H2O2最佳作用浓度造模12h，用CCK8法观察BioA对H2O2诱导海马神经元细胞活力的影响；利用流式细胞术，观察BioA对海马神经元细胞凋亡和胞内活性氧的影响，提取细胞总蛋白，Western Blot法测定Bcl-2、Bax、Casepase-3蛋白表达水平；培养至第10d的海马神经元用神经元特异性抗体MAP-2荧光检测海马神经元纯度，结果显示，在荧光相差显微镜下，海马神经元胞体和突触呈现绿色荧光，细胞核呈现蓝色荧光，经鉴定，纯度可达98％以上；以不同浓度梯度的BioA或不同浓度梯度的H2O2刺激海马神经元24h，结果显示，BioA在10-7-10- 4mol/L浓度范围内可以不同程度促进神经细胞的增殖，其中在10-5mol/L浓度附近，增殖作用最为显著；与正常对照组相比，100μmol/L、200μmol/L、400μmol/L、800μmol/L H2O2分别使细胞活力大约下降10％、20％、45％和89％，呈现明显的剂量依赖性；CCK8法观察Bio A对H2O2诱导海马神经元细胞活力的影响，结果显示，与H2O2组相比，BioA预处理组能显著抑制H2O2作用引起的海马神经元损伤，其中Bio A高剂量组作用明显；流式细胞术观察BioA对H2O2所致海马神经元ROS的影响，结果显示，与正常对照组比较，H2O2组DCF荧光明显增强，提示细胞内ROS水平升高，BioA处理组能明显降低细胞内ROS水平；流式细胞术观察BioA对H2O2所致海马神经元凋亡的影响，结果表明，正常对照组在收集过程中出现部分细胞损伤，有少许凋亡和坏死细胞存在。H2O2损伤后，凋亡细胞数和坏死细胞数明显增加，给予BioA预处理后，可明显减少H2O2引起的凋亡和坏死细胞数；Western Blot方法观察BioA对海马细胞中Bcl-2、Bax和Casepase-3蛋白表达的影响，结果所示，与正常对照组比较，模型组细胞Bcl-2蛋白表达下调，Bax、Casepase-3蛋白表达上调；Bio A作用后可剂量依赖性地上调模型细胞Bcl-2蛋白表达，下调Bax、Casepase-3蛋白表达。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行详细说明。
鹰嘴豆芽素A对过氧化氢诱导大鼠原代海马神经元损伤的作用。取新生24小时内大鼠海马神经元细胞，进行原代细胞培养，镜下观察细胞生长状态，培养10天左右，加入神经元特异性抗体MAP-2，荧光鉴定神经元细胞纯度。以不同浓度梯度的Bio A(10-7、10-6、10-5、10-4、10-3mol/L)或不同浓度梯度的H2O2(100、200、400、800μmol/L)刺激海马神经元24h，CCK8法观察BioA对海马神经元细胞活力的影响。将培养的原代海马细胞分为正常组、H2O2组、Bio A低中高三个剂量组，根据筛选出的BioA最佳作用浓度给予三个剂量组，药物作用24h后，除正常组外，其余组给予筛选出的H2O2最佳作用浓度造模12h，用CCK8法观察BioA对H2O2诱导海马神经元细胞活力的影响；利用流式细胞术，观察BioA对海马神经元细胞凋亡和胞内活性氧(ROS)的影响。提取细胞总蛋白，Western Blot法测定Bcl-2、Bax、Casepase-3蛋白表达水平。
培养至第10d的海马神经元用神经元特异性抗体MAP-2荧光检测海马神经元纯度，结果显示，在荧光相差显微镜下，海马神经元胞体和突触呈现绿色荧光，细胞核呈现蓝色荧光，经鉴定，纯度可达98％以上。以不同浓度梯度的BioA或不同浓度梯度的H2O2刺激海马神经元24h，结果显示，BioA在10-7-10-4mol/L浓度范围内可以不同程度促进神经细胞的增殖，其中在10-5mol/L浓度附近，增殖作用最为显著。与正常对照组相比，100μmol/L、200μmol/L、400μmol/L、800μmol/L H2O2分别使细胞活力大约下降10％、20％、45％和89％，呈现明显的剂量依赖性。CCK8法观察Bio A对H2O2诱导海马神经元细胞活力的影响，结果显示，与H2O2组相比，BioA预处理组能显著抑制H2O2作用引起的海马神经元损伤，其中BioA高剂量组作用明显(P<0.05)。流式细胞术观察Bio A对H2O2所致海马神经元ROS的影响，结果显示，与正常对照组比较，H2O2组DCF荧光明显增强，提示细胞内ROS水平升高，BioA处理组能明显降低细胞内ROS水平(P﹤0.001)。流式细胞术观察BioA对H2O2所致海马神经元凋亡的影响，结果表明，正常对照组在收集过程中出现部分细胞损伤，有少许凋亡和坏死细胞存在。H2O2损伤后，凋亡细胞数和坏死细胞数明显增加，给予BioA预处理后，可明显减少H2O2引起的凋亡和坏死细胞数。Western Blot方法观察BioA对海马细胞中Bcl-2、Bax和Casepase-3蛋白表达的影响，结果所示，与正常对照组比较，模型组细胞Bcl-2蛋白表达下调，Bax、Casepase-3蛋白表达上调；BioA作用后可剂量依赖性地上调模型细胞Bcl-2蛋白表达，下调Bax、Casepase-3蛋白表达。
以上所述仅是对本发明的较佳实施方式而已，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施方式所做的任何简单修改，等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。

Claims (2)

1.鹰嘴豆芽素A对海马神经元细胞的保护作用，其特征在于：鹰嘴豆芽素A对过氧化氢诱导大鼠原代海马神经元损伤的作用。
2.按照权利要求1所述鹰嘴豆芽素A对海马神经元细胞的保护作用，其特征在于：取新生24小时内大鼠海马神经元细胞，进行原代细胞培养，镜下观察细胞生长状态，培养10天，加入神经元特异性抗体MAP-2，荧光鉴定神经元细胞纯度，以不同浓度梯度的Bio A或不同浓度梯度的H2O2刺激海马神经元24h，CCK8法观察Bio A对海马神经元细胞活力的影响，将培养的原代海马细胞分为正常组、H2O2组、Bio A低中高三个剂量组，根据筛选出的Bio A最佳作用浓度给予三个剂量组，药物作用24h后，除正常组外，其余组给予筛选出的H2O2最佳作用浓度造模12h，用CCK8法观察Bio A对H2O2诱导海马神经元细胞活力的影响；利用流式细胞术，观察Bio A对海马神经元细胞凋亡和胞内活性氧的影响，提取细胞总蛋白，WesternBlot法测定Bcl-2、Bax、Casepase-3蛋白表达水平；培养至第10d的海马神经元用神经元特异性抗体MAP-2荧光检测海马神经元纯度，结果显示，在荧光相差显微镜下，海马神经元胞体和突触呈现绿色荧光，细胞核呈现蓝色荧光，经鉴定，纯度可达98％以上；以不同浓度梯度的Bio A或不同浓度梯度的H2O2刺激海马神经元24h，结果显示，Bio A在10-7-10-4mol/L浓度范围内可以不同程度促进神经细胞的增殖，其中在10-5mol/L浓度附近，增殖作用最为显著；与正常对照组相比，100μmol/L、200μmol/L、400μmol/L、800μmol/L H2O2分别使细胞活力大约下降10％、20％、45％和89％，呈现明显的剂量依赖性；CCK8法观察Bio A对H2O2诱导海马神经元细胞活力的影响，结果显示，与H2O2组相比，Bio A预处理组能显著抑制H2O2作用引起的海马神经元损伤，其中Bio A高剂量组作用明显；流式细胞术观察Bio A对H2O2所致海马神经元ROS的影响，结果显示，与正常对照组比较，H2O2组DCF荧光明显增强，提示细胞内ROS水平升高，Bio A处理组能明显降低细胞内ROS水平；流式细胞术观察Bio A对H2O2所致海马神经元凋亡的影响，结果表明，正常对照组在收集过程中出现部分细胞损伤，有少许凋亡和坏死细胞存在。H2O2损伤后，凋亡细胞数和坏死细胞数明显增加，给予Bio A预处理后，可明显减少H2O2引起的凋亡和坏死细胞数；Western Blot方法观察Bio A对海马细胞中Bcl-2、Bax和Casepase-3蛋白表达的影响，结果所示，与正常对照组比较，模型组细胞Bcl-2蛋白表达下调，Bax、Casepase-3蛋白表达上调；Bio A作用后可剂量依赖性地上调模型细胞Bcl-2蛋白表达，下调Bax、Casepase-3蛋白表达。
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