CN110225972A - 免疫组库序列扩增方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明总体涉及免疫结合蛋白以及从基因组或其他来源获得免疫结合蛋白的方法的领域。本发明还涉及编码免疫结合蛋白的核酸，其中链的天然多聚结合在核酸和由其产生的免疫结合蛋白中维持。例如，使用本发明的方法编码从B细胞扩增的抗体的核酸维持来自B细胞的重链和轻链的天然配对。该配对(或多聚化)的维持产生免疫结合蛋白的文库和/或组库，其被富集用于有用的结合分子。

Description

免疫组库序列扩增方法及应用

技术领域

本发明总体涉及免疫结合蛋白领域以及从基因组或其它来源获得免疫结合蛋白的方法。本发明还涉及编码免疫结合蛋白的核酸，其中链的天然多聚结合维持在核酸和由其产生的免疫结合蛋白中。例如，编码使用本发明的方法从B细胞扩增的抗体的核酸维持来自B细胞的重链和轻链的天然配对。该配对(或多聚化)的维持产生免疫结合蛋白的文库和/或组库，其被富集用于有用的结合分子。

背景技术

对能够发现针对特定抗原的抗体存在相当的兴趣。这类抗体可用作研究工具并用于诊断和治疗应用。不过，这类有用抗体的识别是困难的，并且一旦被识别，这些抗体在适合于人类的治疗应用之前通常需要相当多的重新设计。

用于识别抗体的很多方法涉及通过扩增来自B细胞或其他组织的核酸而衍生的抗体文库的展示。这些方法的局限性限制了从文库中获得的有用抗体。例如，大多数抗体文库并不配对从记忆B细胞或浆细胞获得的重链和轻链，所述记忆B细胞或浆细胞已经对免疫应激产生了有效的免疫应答。此外，大多数已知的人类抗体文库仅包含可以通过实验从生物来源(例如，B细胞)捕获或克隆的抗体序列多样性。因此，这类文库可能过度代表某些序列，而完全缺乏或未充分代表其他序列，尤其是形成有用抗体的配对轻链和重链，特别是来自成功的免疫应答的那些。

本发明的一个目的是提供被富集用于有用的免疫结合蛋白的免疫结合蛋白文库。本发明的另一个目的是提供制备被富集用于免疫结合蛋白的有用多聚体的此类文库的方法。本发明的另一个目的是提供用于从B细胞和浆细胞扩增核酸的方法，从而维持轻链和重链的配对。本发明的一个目的是通过获得来自个体的配对轻链和重链抗体来获得与疾病治疗相关的抗体文库，所述个体已经对与例如传染性疾病、癌症、自身免疫性疾病、神经退化性疾病和过敏症相关的各种免疫应激产生了抗体应答。

发明内容

本发明涉及编码免疫结合蛋白的核酸，其保留构成免疫结合蛋白(例如，抗体、T淋巴细胞受体或先天免疫受体)的免疫多肽链的体内多聚结合。在一些实施例中，本发明涉及被富集用于编码多聚体的核酸的免疫结合蛋白文库，所述多聚体功能性地代表在获得免疫结合蛋白文库的细胞中发现的多聚复合物。在一些实施例中，编码免疫结合蛋白的多肽链的核酸来源于已经产生了与例如传染性疾病、癌症、自身免疫性疾病、过敏症或神经退化性疾病相关的免疫应答的个体。在一些实施例中，传染性疾病由流感病毒引起。在一些实施例中，传染性疾病由病毒引起，例如，HIV(艾滋病毒)、Ebola(埃博拉病毒)、Zika(寨卡病毒)、HSV(单纯疱疹病毒)、RSV(呼吸道合胞病毒)或CMV(巨细胞病毒)。在一些实施例中，癌症是黑色素瘤。在一些实施例中，癌症是响应免疫疗法的癌症。

本发明涉及编码本发明的免疫结合蛋白的多肽链(例如，重链和轻链抗体多肽)的核酸，其保留体内功能性配对的多肽链(例如，抗体的轻链和重链)。在一些实施例中，本发明的免疫结合蛋白文库被富集用于编码多肽链的核酸的功能性多聚体，所述多肽链构成免疫结合蛋白(例如，抗体的轻链和重链)并在从中获得免疫结合蛋白文库的组库中结合在一起。在一些实施例中，编码免疫结合蛋白的相关多肽链(例如，配对的轻链和重链)的核酸来源于个体，所述个体已经产生了与例如传染性疾病、癌症、自身免疫性疾病、过敏症和神经退化性疾病相关的免疫应答。在一些实施例中，传染性疾病由流感病毒引起。在一些实施例中，传染性疾病由病毒引起，例如，HIV、Ebola、Zika、HSV、RSV或CMV。

在一些实施例中，本发明涉及多种核酸，包括编码多聚免疫结合蛋白的第一链的多种多核苷酸，编码多聚体免疫结合蛋白的第二链的多种多核苷酸，其中编码多聚体免疫结合蛋白的第一链的每个多核苷酸与编码免疫结合蛋白的第二链的多核苷酸配对，以形成编码第一链和第二链的多个成对的多核苷酸，其中多个成对的多核苷酸代表多个在从中衍生出多聚免疫结合蛋白的多个宿主细胞中发现的成对的第一链和第二链。在一些实施例中，多聚免疫结合蛋白是抗体、T细胞受体或先天免疫受体。在一些实施例中，抗体是scFv、Fab、F(ab’)₂、Fab’、Fv或双体(diabody)。在一些实施例中，抗体是IgG、IgM、IgA、IgD或IgE。在一些实施例中，抗体来自B细胞、浆细胞、B记忆细胞、前B细胞或祖B细胞。在一些实施例中，T细胞受体是单链T细胞受体。在一些实施例中，T细胞受体来自CD8+T细胞、CD4+T细胞、调节性T细胞、记忆T细胞、辅助T细胞或细胞毒性T细胞。在一些实施例中，多聚免疫结合蛋白来自自然杀伤细胞、巨噬细胞、单核细胞或树突状细胞。

在一些实施例中，将含有编码免疫结合蛋白的核酸的各细胞置于微孔和/或乳剂中。在一些实施例中，引入编码免疫结合蛋白的多肽(例如，抗体重链(H)和轻链(L))的核酸的正(F)向和反(R)向引物(例如，HF、HR、LF和LR)，以及聚合酶和dNTP，以进行模板导向的扩增。在一些实施例中，F1(例如，HF)和R2(例如，LR)引物(或可替换地，LF和HR引物)包含重叠延伸区(OE)，使得在循环扩增期间这些引物彼此相互延伸。在一些实施例中，联合的多肽(例如，scFv)可以由扩增的核酸编码，OE区也可以编码氨基酸接头序列(图1A)。在可替换的实施例中，扩增的核酸用于测序反应，并且一个或多个引物可以包括条码区(例如，BC1、BC2、BC3和/或BC4)(图1B)。在一些实施例中，进行扩增反应，产生编码免疫结合蛋白的两条多肽链(例如，抗体的重链和轻链)的核酸。在一些实施例中，从每个孔和/或乳剂中获得的核酸是同质的，并编码由置于微孔和/或乳剂中的单个细胞制备的抗体。在一些实施例中，从孔和/或乳剂中获得的核酸被汇集以形成免疫结合蛋白(例如，重链/轻链对)的文库，反映来自源细胞或遗传物质的多肽(例如，配对的抗体链)的结合。

在一些实施例中，将得到的编码免疫结合蛋白的相关多肽(例如，抗体的配对的重链和轻链)的核酸池克隆到表达载体中或可以进行处理以供测序。在一些实施例中，表达载体被改造用于噬菌体展示、酵母展示或其他展示技术。在一些实施例中，表达载体用于免疫结合蛋白的分泌表达和重组产生。在一些实施例中，表达载体用于制备嵌合抗原受体库，其中每个CAR具有从扩增反应获得的相关免疫结合蛋白克隆中的一个。在一些实施例中，对应于重链或轻链的引物可被靶向抗体的单个同种型(例如，IgG)，或者可以使用对应于所有可用的同种型的引物池或其某些部分。

在一些实施例中，将免疫结合蛋白的多肽链(例如，抗体的轻链和重链)的引物连接在一起，使每个引物能够引发反应。在一些实施例中，5’叠氮化物-炔烃反应(“点击”)偶联可以使引物聚集在一起。在该实施例中，双引物与孔或乳剂中的单个细胞一起温育，并且获得核酸，其中编码免疫结合蛋白的一条多肽链的核酸与编码相同免疫结合蛋白的相关多肽链的核酸相连接(例如，重链与编码配对轻链的核酸连接)。在一些实施例中，微表面(例如，珠或微孔)被制备并含有能够结合编码免疫结合蛋白的多个相关多肽的核酸(例如，重链和轻链核酸)的引物序列。在来自空间限制的单个细胞的mRNA捕获、cDNA合成或PCR(其中引物在孔中或珠上)之后，编码相关多肽链(例如，配对的重链和轻链)的核酸与固相的引物共定位。

在一些实施例中，将编码免疫结合蛋白的相关多肽(例如，重链和轻链多肽)的核酸的核酸探针置于固体表面上。在该实施例中，编码免疫结合蛋白的相关多肽(例如，重链和轻链多肽)的核酸的探针用来自单个细胞的核酸例如mRNA进行询问。固相上的探针将从细胞捕获编码免疫结合蛋白的相关多肽(例如，重链和轻链多肽)的核酸。在一些实施例中，捕获的mRNA被逆转录以产生编码来自单个细胞的免疫结合蛋白的相关多肽(例如，重链和轻链多肽)的成对cDNA。

在一些实施例中，编码免疫结合蛋白亚基的核酸被条形码，能够识别独特的分子。在一些实施例中，具有细胞特异性条形码的固相由多个单个模板分子的空间限制的PCR反应制成，所述单个模板分子包含接头/适配子引物序列、随机条形码序列和二级引物序列。在一些实施例中，使用有限稀释的模板分子，并且模板分子以非常低的加载率与固相连接，以确保在每个位点仅有单个分子可用作模板。在该实施例中，该PCR反应中的至少一个引物应当附着于固相。在一些实施例中，可添加额外的分子以加载额外的位点，知道先前结合的位点不能反应，因为他们在前几轮PCR期间被耗尽。在一些实施例中，寡核苷酸可以以极低的加载率附着于表面，并且珠子在表面流动以确保每个珠子结合单个寡核苷酸。在一些实施例中，珠子在表面回流而不受泊松载荷的限制。在一些实施例中，每个结合的珠子会保证有且仅有一个模板序列。在一些实施例中，每个空间限制的位点(图案化表面上的位置或孔，或乳剂中的珠子)会包含紧密邻近的相同条形码化的DNA，而其他位点会包含紧密邻近的源自其他单个分子模板的单独的条形码化的DNA。在一些实施例中，可以通过使用5'核酸酶或解偶联的第二链的变性来产生单链DNA。在该实施例中，次级引物序列可用于执行后续的条形码延伸反应，或者可直接用于从单个细胞中捕获核酸。在一些实施例中，可以将珠子连接到包含接头部分和用作独特的分子标识符的完全随机序列的序列，和三级引物序列。在该实施例中，三级引物序列可用于执行后续的条形码延伸反应，或者可直接用于从单个细胞中捕获核酸。

在一些实施例中，识别本发明的免疫结合蛋白的抗原。在一些实施例中，本发明的核酸编码免疫结合蛋白的亚基(或对)和由免疫结合蛋白结合的抗原。在一些实施例中，编码免疫结合蛋白的相关多肽(例如，重链和轻链多肽)的核酸和用抗原特异性序列条形码化的抗原之间的三向耦联。在一些实施例中，抗体显示在细胞的表面上，用条形码化的抗原群体探测，然后产生的结合物可以被封装到微孔或乳剂中，并且序列扩增方法用于恢复免疫结合蛋白的相关多肽(例如，重链和轻链多肽)的序列和条形码化的抗原序列。在一些实施例中，多个抗原是条形码化的。条形码化的抗原可以针对免疫结合蛋白进行筛选，以找到与特定抗原结合的免疫结合蛋白。这种筛选可以用本文描述的文库中的免疫结合蛋白、从对抗原天真(naive)的受试者中获得的免疫细胞、或从已经产生了相关免疫应答(例如，与传染性疾病、癌症、自身免疫性疾病、过敏症或神经退化性疾病相关的免疫应答)的受试者中获得的免疫细胞进行。与条形码化的抗原配对的免疫细胞随后可用于扩增方法中，以获得编码免疫结合蛋白的核酸和免疫结合蛋白。

在一些实施例中，对编码免疫结合蛋白的核酸进行测序。在一些实施例中，测序通过高通量测序进行。在一些实施例中，获得的序列信息用于基于序列比对的推定的谱系信息。

附图说明

图1A-C示出了用于本发明的引物和由本发明制备的核酸产物的示图。图1A示出了使用轻链正向(LF)和轻链反向(LR)引物的反应，其中LR引物包括重叠延伸区(OE)。图1A还示出了重链正向(HF)和重链反向(HR)引物，其中HF引物还包括重叠延伸区(OE)。图1B示出了一个实施例，其中一个或多个引物包括用于识别由引物产生的核酸的条形码区。图1C示出了一个实施例，其中抗原包括识别抗原的核酸，并且所述核酸还具有正向和反向引物(抗原正向AF和抗原反向AR)，其中AR引物具有重叠区，会对应于重链或轻链引物中的一个的重叠区，例如，LF引物可以包括的OE会对应于AR引物的OE。

具体实施方式

在描述各个实施例之前，应当理解，本文的教导并不限于所描述的特定实施例，并且因此当然可以变化。还应当理解，本文使用的术语仅用于描述特定实施例的目的，并不旨在限制，因为本发明的范围将仅由所附权利要求限定。

除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。尽管与本文描述的那些相似或等同的任何方法和材料也可以用于本发明的实施或测试，现在描述的是一些示例性方法和材料。

必须指出，如本文和所附权利要求中所使用的，单数形式“一个/种(a)”，“一个/种(an)”和“所述/该(the)”包括复数的所指对象，除非上下文另有明确指示。还应当指出，权利要求可被撰写成排除任何可选的要素。同样的，本声明旨在用作使用结合记载的权利要求要素的排他性术语例如“仅/仅仅/单独(solely)”、“仅/仅仅(only)”或使用“否定”限定的在先基础。除非上下文另有明确规定，否则关于物质的浓度或水平所给出的数值限制旨在为近似值。因此，当浓度表示为(例如)10μg时，意图将浓度理解为至少近似或大约10μg。

本领域技术人员在阅读本文后将显而易见的是，本文描述和示出的各个实施例中的每一个具有分离的成分和特征，其可以容易地与其它几个实施例中的任何一个的特征分离或组合而不偏离本教导的范围或精神。任何记载的方法可按照所记载的事件的顺序或以逻辑上可行的任何其它顺序进行。

定义

如本文所使用的，“抗体”指的是一种蛋白质，其在功能上被定义为结合蛋白，并且在结构上被定义为包括被识别为来源于动物产生抗体的免疫球蛋白编码基因的框架区的氨基酸序列。抗体可由一个或多个多肽组成，基本上由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因片段编码。识别的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因，以及无数个免疫球蛋白可变区基因。轻链被分类为κ或λ。重链被分类为γ、μ、α、δ或ε，依次分别限定免疫球蛋白类别IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。

已知典型的免疫球蛋白(抗体)结构单元包括四聚体。每个四聚体由两对相同的多肽链组成，每对具有一个“轻链”(约25kD)和一个“重链”(约50-70kD)。每条链的N-末端限定了大约100到110或更多个氨基酸的可变区，主要负责抗原识别。术语可变轻链(V_L)和可变重链(V_H)分别指这些轻链和重链。

抗体作为完整的免疫球蛋白或作为许多充分表征的片段存在。因此，例如，胃蛋白酶消化铰链区中二硫键以下的抗体以产生F(ab)'2，它是Fab的二聚体，本身是通过二硫键与VH-CH1连接的轻链。可以在温和条件下还原F(ab)'2，以断开铰链区中的二硫键，从而将F(ab)'2二聚体转化为Fab'单体。Fab'单体基本上是具有部分的铰链区的Fab(其他抗体片段的更详细描述参见，Fundamental Immunology，W.E.Paul,ed.,Raven Press,N.Y.(1993))。虽然多种抗体片段是根据完整抗体的消化来定义的，技术人员会理解，可以通过化学方法或利用重组DNA方法从头合成片段。因此，本文使用的术语抗体还包括通过完整抗体修饰产生的或利用重组DNA方法合成的抗体片段。优选的抗体包括V_H-V_L二聚体，包括单链抗体(作为单条多肽链存在的抗体)，例如单链F_V抗体(sFv或scFv)，其中可变重区和可变轻区(直接或通过肽接头)连接在一起形成连续的多肽。单链F_V抗体是共价连接的V_H-V_L杂二聚体，可由核酸表达，所述核酸包括直接连接或通过肽编码接头连接的V_H-和V_L-编码序列(例如，Huston等人，Proc.Nat.Acad.Sci.USA,85:5879-5883,1988)。虽然V_H和V_L作为单个多肽链与每个连接，V_H和V_L结构域非共价结合。可替换地，抗体可以是另一片段。还可以产生其他片段，包括使用重组技术。例如，如果一条链(重链或轻链)与g3衣壳蛋白融合并且互补链作为可溶性分子输出到周质，则Fab分子可以展示在噬菌体上。两条链可以在相同或不同的复制子上编码；每个Fab分子中的两条抗体链在翻译后组装，并且通过一条链连接到g3p将二聚体掺入噬菌体颗粒中(参见，例如，美国专利号5,733,743)。将天然聚集的但化学上分离的轻和重多肽链从抗体V区转换成折叠成基本上类似于抗原结合位点结构的三维结构的分子的scFv抗体和多个其他结构对本领域技术人员来说是已知的(参见，例如，美国专利号5,091,513、5,132,405和4,956,778)。在一些实施例中，scFv是双体(双特异抗体，diabody)，披露于Holliger等人，Proc.Nat’l Acad.Sci.vol.90.pp.6444-6448(1993)，该篇文献出于所有目的以其全文形式被援引加入本文。在一些实施例中，抗体包括已经在噬菌体上展示或通过重组技术利用载体产生的所有那些，其中链作为可溶性蛋白质分泌，例如，scFv、Fv、Fab、pr(Fab')₂，或通过重组技术利用载体产生，其中链作为可溶性蛋白质分泌。抗体还可以包括二抗体和微抗体。

本发明的抗体还包括重链二聚体，例如来自骆驼科的抗体。由于骆驼科中重链二聚体IgG的V_H区不需要与轻链发生疏水性相互作用，因此通常接触轻链的重链中的区域变为骆驼科中的亲水性氨基酸残基。重链二聚体IgG的V_H结构域称为V_HH结构域。

在骆驼科中，抗体组库的多样性由V_H或V_HH区中的互补决定区(CDR)1、2和3确定。骆驼V_HH区中的CDR3的特征在于其相对长的长度，平均为16个氨基酸(Muyldermans等人，1994，Protein Engineering 7(9)：1129)。这与许多其他物种的抗体的CDR3区形成对比。例如，小鼠V_H的CDR3平均有9个氨基酸。

维持骆驼科的可变区的体内多样性的骆驼科衍生的抗体可变区的文库可以由，例如，2005年2月17日公开的美国专利申请序列号20050037421中披露的方法制备。

如本文所使用的，术语“天然存在的”是指组分由未通过重组方式改变并且预先存在于生物体中(例如，在从原初细胞或暴露于抗原的细胞产生的抗体文库中)的单个基因编码。

如本文所使用的，术语“抗原”是指在适当条件下能够诱导特异性免疫应答并且能够与该应答的产物反应的物质，例如，与特异性抗体或特异性致敏T淋巴细胞，或两者。抗原可以是可溶性物质，例如，毒素和外来蛋白质，或颗粒，例如，细菌和组织细胞；不过，只有被称为抗原决定簇(表位)的蛋白质或多糖分子的部分与抗体或淋巴细胞上的特异性受体结合。更广义地，术语“抗原”可用于指抗体所结合或抗体希望的任何物质，无该所述物质是否具有免疫原性。对于这些抗原，可以通过重组方法识别抗体，而与任何免疫应答无关。

如本文所使用的，术语“表位”是指特异性B细胞和/或T细胞响应的抗原或半抗原上的位点。该术语还可与“抗原决定簇”或“抗原决定簇位点”互换使用。表位包括能够形成与抗体的可变区结合口袋相互作用的结合相互作用的抗原或其他大分子的那部分。

如本文所使用的，术语抗体的“结合特异性”是指抗体结合的抗原的识别，优选指抗体结合的表位的识别。

如本文所使用的，术语“嵌合多核苷酸”是指多核苷酸包括野生型区域和突变区域。它还可以表示多核苷酸包括来自某一多核苷酸的野生型区域和来自另一相关多核苷酸的野生型区域。

如本文所使用的，术语“互补决定区”或“CDR”是指本领域公认的术语，如Kabat和Chothia所举例。CDR一般也称为超可变区或超可变环(Chothia and Lesk(1987)JMol.Biol.196:901；Chothia等人(1989)Nature 342:877；E.A.Kabat等人，Sequences ofProteins of Immunological Interest(National Institutes of Health,Bethesda,Md.)(1987)；和Tramontano等人(1990)J Mol.Biol.215:175)。“框架区”或“FR”是指位于CDR侧翼的V结构域的区域。可以使用各种本领域众所周知的定义来确定CDR和框架区的位置，例如，Kabat,Chothia，international ImMunoGeneTics database(IMGT)，和AbM(参见，例如，Johnson等人，supra；Chothia&Lesk，1987，Canonical structures for thehypervariable regions of immunoglobulins.J.Mol.Biol.196,901-917；Chothia C.等人，1989，Conformations of immunoglobulin hypervariable regions.Nature 342,877-883；Chothia C.等人，1992，structural repertoire ofthe human VH segmentsJ.Mol.Biol.227,799-817；Al-Lazikani等人，J.Mol.Biol 1997,273(4))。抗原结合位点的定义还披露如下：Ruiz等人，IMGT，the international ImMunoGeneTicsdatabase.NucleicAcids Res.，28，219-221(2000)；和Lefranc,M.-P.IMGT，theinternational ImMunoGeneTics database.Nucleic Acids Res.，Jan 1；29(1)：207-9(2001)；MacCallum等人，Antibody-antigen interactions:Contact analysis andbinding site topography,J.Mol.Biol.262(5),732-745(1996)；和Martin等人，Proc.Natl Acad.Sci.USA,86,9268-9272(1989)；Martin等人，Methods Enzymol.,203,121-153,(1991)；Pedersen等人，Immunomethods,1,126,(1992)；和Rees等人，InSternberg M.J.E.(ed.)，Protein Structure Prediction.Oxford University Press,Oxford,141-172(1996)。

如本文所使用的，术语“半抗原”是小分子，当与较大的载体如蛋白质连接时，可以在生物体内引起免疫应答，例如，产生与其特异性结合的抗体(在自由或结合状态)。“半抗原”能够结合预先形成的抗体，但可能无法自身刺激抗体产生。在本发明的上下文中，术语“半抗原”包括天然存在的或非天然存在的修饰的氨基酸。因此，例如，术语“半抗原”包括天然存在的修饰的氨基酸，例如磷酸酪氨酸、磷酸苏氨酸、磷酸丝氨酸或硫酸化残基，例如硫酸酪氨酸(磺基酪氨酸)、硫酸丝氨酸(磺基丝氨酸)或硫酸苏氨酸(磺基苏氨酸)；并且还包括非天然存在的修饰的氨基酸，例如对硝基苯丙氨酸。

如本文所使用的，术语“异源的”当结合多核苷酸的部分使用时表示，核酸包括两个或更多个通常在自然界中未发现彼此存在相同关系的子序列。例如，核酸通常是重组产生的，具有两个或更多个序列，例如，来自排列以产生新的功能性核酸的不相关基因。类似地，“异源的”多肽或蛋白质指的是两个或更多个在自然界中未发现彼此存在相同关系的子序列。

如本文所使用的，术语“宿主细胞”是指原核或真核细胞，其中可以引入、表达和/或增殖本发明的载体。微生物宿主细胞是原核或真核微生物的细胞，包括细菌、酵母、微观真菌以及真菌和黏菌的生命周期中的微观相。典型的原核宿主细胞包括各种大肠杆菌菌株。典型的真核宿主细胞是酵母或丝状真菌，或哺乳动物细胞，例如，中国仓鼠卵巢细胞、鼠科NIH 3T3成纤维细胞、人胚胎肾193细胞、或啮齿动物骨髓瘤或杂交瘤细胞。

如本文所使用的，术语对组合物或疫苗的“免疫应答”是在宿主中发展对感兴趣的组合物或疫苗的细胞和/或抗体介导的免疫应答。通常，“免疫应答”包括但不限于下述效应的一种或多种：产生抗体、B细胞、辅助T细胞和/或细胞毒性T细胞，特异性针对抗原或包括在感兴趣的组合物或疫苗中的抗原。优选地，宿主将显示治疗性或保护性免疫应答，从而提高对新感染的抵抗力和/或降低疾病的临床严重程度。这种保护将通过感染的宿主通常表现出的症状减轻或消失、恢复时间更快和/或感染的宿主中的病毒滴度降低来证实。

如本文所使用的，术语“分离的”是指核酸或多肽不仅与存在于核酸或多肽的天然来源中的其他核酸或多肽分离，而且还与多肽分离，并且优选地是指在仅存在(如果有的话)溶剂、缓冲液、离子或通常存在于上述的溶液中的其他组合物的情况下发现的核酸或多肽。术语“分离的”和“纯化的”并不包括存在于其天然来源中的核酸或多肽。

如本文所使用的，术语“哺乳动物”是指温血脊椎动物，它们都拥有毛发并哺育幼崽。

如本文所使用的，“序列同一性百分比”和“百分比同源性”在本文中可互换使用，指的是多核苷酸或多肽之间的比较，并通过在比较窗口上比较两个最佳比对序列来确定，其中比较窗口中的多核苷酸或多肽序列的部分与参考序列相比可能包括添加或缺失(即，缺口)，用于两个序列的最佳比对。可以通过确定在两个序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置数以产生匹配的位置数，将匹配的位置数除以比较窗口中的位置总数，并将结果乘以100来计算百分比，以得到序列同一性的百分比。可替换地，可以通过确定在两个序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置数或核酸碱基或氨基酸残基与缺口比对以得到匹配的位置数，将匹配的位置数除以比较窗口中的位置总数，并将结果乘以100来计算百分比，以得到序列同一性的百分比。本领域技术人员理解，有许多已确立的算法可用于比对两个序列。用于比较的序列的最佳比对可以例如通过Smith和Waterman，AdvApplMath.2:482,1981的局部同源性算法；通过Needleman和Wunsch，JMol Biol.48:443,1970的同源性比对算法；通过Pearson和Lipman，Proc Natl Acad Sci.USA 85:2444,1988的相似性检索法；通过这些算法的计算机化实现(GCG Wisconsin Software Package中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)，或通过目视检查(通常参见，Current Protocols in MolecularBiology，F.M.Ausubel等人，eds.，Greene Publishing Associates,Inc.和John Wiley&Sons,Inc.,(1995 Supplement))进行。适用于确定序列同一性百分比和序列相似性的算法的示例是BLAST和BLAST2.0算法，分别披露于Altschul等人，J.Mol.Biol.215:403-410,1990；和Altschul等人，Nucleic Acids Res.25(17):3389-3402,1977。用于进行BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心网站(National Center for BiotechnologyInformation website)公开获得。用于核苷酸序列的BLAST可以使用具有默认参数的BLASTN程序，例如，字长(W)为11，期望值(E)为10，M＝5，N＝-4，并比较两条链。氨基酸序列的BLAST可以使用具有默认参数的BLASTP程序，例如，字长(W)为3，期望值(E)为10，以及BLOSUM62评分矩阵(参见，Henikoff和Henikoff,ProcNatlAcadSci.USA 89:10915,1989)。序列比对和％序列同一性的示例性确定也可以采用GCG Wisconsin软件包中的BESTFIT或GAP程序(Accelrys,Madison WI)，使用提供的默认参数。

如本文所使用的，术语“蛋白质”、“肽”、“多肽”和“多肽片段”在本文中可互换使用，是指任意长度的氨基酸残基的聚合物。聚合物可以是线性的或支化的，它可以包括修饰的氨基酸或氨基酸类似物，并且它可以被氨基酸以外的化学部分中断。术语还包括自然地或通过干预而被修饰的氨基酸聚合物，例如，二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其他的操作或修饰，例如，与标记或生物活性成分的缀合。

如本文所使用的，术语“纯化的”表示所指核酸或多肽以基本上无其他生物大分子，例如，多核苷酸、蛋白质等的形式存在。在一个实施例中，纯化多核苷酸或多肽，使其构成当前所指生物大分子的按重量计至少95％，更优选按重量计至少99.8％(但是可以存在水、缓冲液和其他小分子，尤其是分子量小于1000道尔顿的分子)。

如本文所使用的，术语“重组核酸”是指通常未在自然界发现的核酸形式。也就是说，重组核酸的侧翼是非天然位于核酸侧翼的核苷酸序列，或者具有通常未在自然界发现的序列。重组核酸最初可以通过限制性内切核酸酶操作核酸在体外形成，或者可替换的使用例如聚合酶链式反应等技术。应当理解，一旦制备重组核酸并将其重新引入宿主细胞或生物体中，它将以非重组的方式复制，即，使用宿主细胞的体内细胞机制而不是体外操作；不过，这类核酸一旦重组产生，尽管随后非重组地复制，对于本发明的目的仍然被视为重组体。

如本文所使用的，术语“重组多肽”是指由重组核酸表达的多肽，或在体外化学合成的多肽。

如本文所使用的，术语“重组变体”是指通过使用重组DNA技术产生的氨基酸插入、缺失和取代而不同于天然存在的多肽的任何多肽。通过比较特定多肽的序列与同源肽的序列并最小化高度同源区域中氨基酸序列变化的数量，可以找到确定哪些氨基酸残基可以被替换、添加或缺失而不消除感兴趣的活性(例如，酶促或结合活性)的指导。

优选地，氨基酸“取代”是用结构和/或化学性质相似的另一种氨基酸来取代一种氨基酸的结果，即，保守氨基酸取代。氨基酸取代可以基于所涉及残基的极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性和/或两亲性质的相似性来进行。例如，非极性(疏水)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸；极性中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺；带正电荷的(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸；带负电荷的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。

如本文所使用的，术语“组库”或“文库”是指编码抗体或抗体片段的基因文库，例如Fab、scFv、Fd、LC、V_H或V_L，或可变区的亚片段，例如，交换盒，其是从存在于例如人类供体的抗体基因的天然整体或“组库”中获得的，以及主要从外周血和脾脏细胞获得。在一些实施例中，人类供体是“非免疫的”，即，没有表现出感染症状。在本发明中，文库或组库通常包括V区的给定部分的交换盒的成员。

如本文所使用的，术语“合成抗体文库”是指编码一个或多个抗体或抗体片段的基因文库，例如Fab、scFv、Fd、LC、V_H或V_L，或可变区的亚片段，例如，交换盒，其中一个或多个互补决定区(CDR)已被部分或全部改变，例如通过寡核苷酸定向的突变。“随机的”是指编码CDR的部分或全部序列已经被随机编码所有二十种氨基酸或氨基酸的某些子集的序列取代。

如本文所使用的，“T细胞”被定义为通常在胸腺中发育的造血细胞。T细胞包括但不限于自然杀伤T细胞、调节性T细胞、辅助T细胞、细胞毒性T细胞、记忆T细胞、γδT细胞和粘膜不变性T细胞。T细胞还包括但不限于CD8+T细胞、CD4+T细胞、Th1T细胞和Th2T细胞。

单数术语“一个/一种(a)”、“一个/一种(an)”和“所述/该(the)”包括复数指代物，除非上下文另有明确说明。类似地，词语“或/或者(or)”旨在包括“和/以及(and)”，除非上下文另有明确说明。关于物质例如抗原的浓度或水平给出的数值限制旨在是近似的。因此，当浓度表示为至少(例如)200μg时，意指浓度应理解为至少近似“大约”或“大约”200μg。

免疫结合蛋白

在一些实施例中，免疫结合蛋白是抗体、T细胞受体或先天免疫受体。在一些实施例中，免疫结合蛋白来自免疫系统的细胞，包括例如B细胞、浆细胞、T细胞、自然杀伤细胞、树突状细胞或巨噬细胞。

在一些实施例中，抗体是免疫结合蛋白，其在结构上被定义为包括被识别为来源于免疫球蛋白的框架区的氨基酸序列。在一些实施例中，抗体由基本上由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因片段编码的一个或多个多肽组成。在一些实施例中，免疫球蛋白基因包括例如κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因，以及无数免疫球蛋白可变区基因。在一些实施例中，抗体轻链被分类为κ或λ。在一些实施例中，抗体重链被分类为γ、μ、α、δ或ε，其依次分别定义免疫球蛋白类别IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。

在一些实施例中，抗体作为完整的免疫球蛋白或作为许多已知的片段存在。在一些实施例中，胃蛋白酶消化铰链区中二硫键以下的抗体以产生F(ab)'₂，其是Fab的二聚体，自身是轻链，通过二硫键与VH-CH1连接。在一些实施例中，F(ab)'₂可以在温和的条件下被还原以断开铰链区中的二硫键，从而将F(ab)'₂二聚体转换为Fab'单体。在一些实施例中，Fab'单体是具有部分的铰链区的Fab(参见，Fundamental Immunology，W.E.Paul，ed.，Raven Press，N.Y.(1993)，该篇文献出于所有目的以其全文形式被援引加入本文)。在一些实施例中，通过化学方法或通过利用重组DNA方法从头合成抗体片段。在一些实施例中，抗体包括V_H-V_L二聚体，包括单链抗体(作为单条多肽链存在的抗体)，例如双体(双特异抗体)，或单链F_V抗体(sFv或scFv)，其中可变重链和可变轻链区(直接或通过肽接头)连接在一起以形成连续的多肽(例如，Huston等人，Proc.Nat.Acad.Sci.，USA，85:5879-5883,1988，该篇文献出于所有目的以其全文形式被援引加入本文)。在一些实施例中，抗体可以是另一片段，包括例如展示在噬菌体上的Fab分子，如果其中一条链(重链或轻链)与g3衣壳蛋白融合并且互补链作为可溶性分子输出到周质中(例如，美国专利号5,733,743，该篇专利出于所有目的以其全文形式被援引加入本文)。在一些实施例中，抗体是scFv抗体或许多其他结构，将天然聚集的但化学上分离的轻和重多肽链从抗体V区转变成折叠成基本上类似于本领域技术人员已知的抗原结合位点的结构的三维结构的分子(参见，美国专利号5,091,513、5,132,405和4,956,778，上述专利出于所有目的以其全文形式被援引加入本文)。在一些实施例中，scFv是如在Holliger等人，Proc.Nat’l Acad.Sci.vol.90，pp.6444-6448(1993)中所述的双体(双特异抗体)，该篇文献出于所有目的以其全文形式被援引加入本文。在一些实施例中，抗体包括已经在噬菌体上展示或通过重组技术使用载体产生的所有那些，其中链作为可溶性蛋白质分泌，例如，scFv、Fv、Fab、pr(Fab')₂。抗体还可以包括微型抗体。在一些实施例中，抗体来自B细胞、浆细胞、B记忆细胞、前B细胞或祖B细胞。

在一些实施例中，免疫结合蛋白是T细胞受体。在一些实施例中，T细胞受体来自CD8+T细胞、CD4+T细胞、调节性T细胞、记忆T细胞、辅助T细胞或细胞毒性T细胞。在一些实施例中，T细胞受体从T细胞(或T细胞亚群)的基因组DNA和/或T细胞(或T细胞亚群)的mRNA中的任一者(或两者)获得。在一些实施例中，T细胞受体的组库使用本领域公知的技术和引物获得，并披露于例如SMARTer Human TCR a/b Profiling Kits sold commercially byClontech,Boria等人，BMC Immunol.9:50-58(2008)；Moonka等人，J.Immunol.Methods169:41-51(1994)；Kim等人，PLoS ONE 7:e37338(2012)；Seitz等人，Proc.NatlAcad.Sci.103:12057-62(2006)，所有文献均出于所有目的以其全文形式被援引加入本文。在一些实施例中，T细胞受体用作单独的链以形成免疫结合蛋白。在一些实施例中，T细胞受体转化为单链抗原结合结构域。在一些实施例中，单链T细胞受体由使用本领域公知的技术编码人α和β链的核酸制成，包括例如那些披露于美国专利申请公开号US2012/0252742，Schodin等人，Mol.Immunol.33:819-829(1996)；Aggen等人，“Engineering Human Single-Chain T Cell Receptors”，Ph.D.Thesis with the University Illinois at Urbana-Champaign(2010)，其副本可以在ideals.illinois.edu/bitstream/handle/2142/18585/ AggenDavid.pdf？sequence＝1中找到，所有文献均出于所有目的以其全文形式被援引加入本文。

在一些实施例中，免疫结合蛋白是先天免疫受体。在一些实施例中，自然杀伤细胞、树突状细胞、巨噬细胞、T细胞和/或B细胞用于制备NKG受体结合蛋白和/或类Toll受体结合蛋白。在一些实施例中，自然杀伤细胞、树突状细胞、巨噬细胞、T细胞和/或B细胞获自已经对疾病免疫或对疾病或状况具有免疫应答的受试者。在一些实施例中，免疫结合蛋白获自CD94/NKG2受体家族(例如，NKG2A、NKG2B、NKG2C、NKG2D、NKG2E、NKG2F、NKG2H)，2B4受体，NKp30、NKp44、NKp46和NKp80受体，类Toll受体(例如，TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、RP105)和/或先天免疫受体获自受试者免疫细胞(自然杀伤细胞、树突状细胞、巨噬细胞、T细胞和B细胞)。在一些实施例中，本发明的免疫结合蛋白如美国专利号5,359,046、5,686,281和6,103,521(上述专利出于所有目的以其全文形式被援引加入本文)中所述制备。在一些实施例中，免疫结合蛋白是受体的一部分，所述受体是单体的、同源二聚体、异二聚体或与非共价复合物中的大量蛋白质结合。在一些实施例中，多聚受体只有一条多肽链，主要作用在于结合至配体。在这些实施例中，免疫结合蛋白可以来源于结合配体的多肽链。在一些实施例中，免疫结合蛋白是来自几种蛋白质的细胞外部分的复合物，通过二硫键形成共价键。在一些实施例中，免疫结合蛋白由受体的截短部分组成，其中所述截短部分对结合配体起作用。

扩增编码多聚免疫蛋白的核酸的方法

本发明涉及用于制备编码免疫结合蛋白的核酸的方法，所述免疫结合蛋白保留组成免疫结合蛋白(例如抗体、T淋巴细胞受体或先天免疫受体)的免疫多肽链的体内多聚结合。在一些实施例中，本发明的免疫结合蛋白文库被富集用于编码多聚体的核酸，所述多聚体是代表在获得免疫结合蛋白文库的组库中发现的多聚复合物的功能多肽。在一些实施例中，编码免疫结合蛋白的多肽链的核酸来源于个体，所述个体已经产生与例如传染性疾病、癌症、自身免疫性疾病、过敏症或神经退化性疾病相关的免疫应答。在一些实施例中，传染性疾病由流感病毒引起。在一些实施例中，传染性疾病由病毒引起，例如，HIV、Ebola、Zika、HSV、RSV或CMV。

在一些实施例中，免疫结合蛋白是抗体或来源于抗体的免疫结合蛋白。在一些实施例中，免疫结合蛋白是来自例如细胞毒性T细胞、辅助T细胞和记忆T细胞的T细胞受体。在一些实施例中，免疫结合蛋白是先天免疫受体，例如CD94/NKG2受体家族(例如，NKG2A、NKG2B、NKG2C、NKG2D、NKG2E、NKG2F、NKG2H)，2B4受体，NKp30、NKp44、NKp46和NKp80受体，类Toll受体(如TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、RP105)。

在一些实施例中，免疫结合蛋白由置于微孔和/或乳剂中的个体细胞制成。在一些实施例中，正向(F)和反向(R)引物用于免疫结合蛋白的每条单独链(例如，称为HF、HR、LF和LR的重(H)链和轻(L)链引物)，以及聚合酶和dNTP以进行模板导向的扩增。在一些实施例中，免疫结合蛋白的单条链的引物(例如，抗体重链的HF和HL引物和/或可替换的抗体轻链的LF和HR引物)包括重叠延伸区(OE)，使得在循环扩增期间，一条链的引物延伸(扩增)编码免疫结合蛋白的其他链的核酸。在一些实施例中，接合多肽(例如，scFv或单链T细胞受体)可以由扩增的核酸编码，并且OE区可以可选地编码氨基酸接头序列。

在一些实施例中，进行扩增反应，产生编码来自免疫结合蛋白(例如，抗体的重链和轻链)的每一多肽的核酸。在一些实施例中，从每个孔和/或乳剂中获得的核酸是同源的，并编码由置于微孔和/或乳剂中的单个细胞制成的免疫结合蛋白(例如抗体)。在一些实施例中，汇集从孔和/或乳状液中获得的核酸以形成重/轻链对的文库，其反映来自源细胞或遗传物质的抗体链的配对。

在一些实施例中，产生的编码抗体的成对重链和轻链的核酸池被克隆到表达载体中或可以进行处理以进行测序。在一些实施例中，表达载体被工程化用于噬菌体展示、酵母展示或其他展示技术。在一些实施例中，表达载体用于抗体的分泌表达和重组产生。在一些实施例中，表达载体用于构建嵌合抗原受体文库，其中每个CAR具有从扩增反应获得的成对抗体克隆中的一个。在一些实施例中，对应于重链或轻链的引物可被靶向单个的同型抗体(例如，IgG)，或者可以使用对应于所有可用同型或其一些部分的引物池。

在一些实施例中，轻链和重链的引物连接在一起，使得每个引物能够引发反应。在一些实施例中，5'叠氮化物-炔烃反应(“点击”)耦联可以将重链和轻链引物聚集在一起。在该实施例中，双引物与孔或乳剂中的单个细胞一起温育，并获得核酸，其中编码重链的核酸与编码成对轻链的核酸连接。在一些实施例中，微表面(如珠子或微孔)被制备并包含能够结合重链或轻链核酸的引物序列。在来自空间限制中(孔中或珠子上具有引物)的单个细胞的mRNA捕获、cDNA合成或PCR后，编码成对的重链和轻链的核酸与固相中的重链和轻链引物共定位(co-locate)。

在一些实施例中，将编码重链和轻链多肽的核酸的核酸探针置于固体表面。在该实施例中，编码重链和轻链抗体多肽的核酸探针用来自单个细胞的核酸(例如，mRNA)进行询问。固相上的探针将捕获来自细胞的成对轻链和重链编码核酸。在一些实施例中，将捕获的mRNA逆转录以制成编码来自单个细胞的轻链和重链多肽的成对cDNA。

在一些实施例中，编码免疫结合蛋白亚基的核酸被条形码化以能够识别独特的分子。在一些实施例中，用多个单个模板分子的空间限制性PCR反应形成具有细胞特异性条形码的固相，所述单个模板分子包含接头/适配子引物序列、随机的条形码序列和二级引物序列。在一些实施例中，使用有限稀释的模板分子，并且模板分子以非常低的加载率与固相连接，以确保在每个位点仅有单个分子可用作模板。在该实施例中，该PCR反应中的至少一个引物应当附着于固相。在一些实施例中，可能添加额外的分子以加载额外的位点，知道先前结合的位点不能反应，因为他们在前几轮PCR期间被耗尽。

在一些实施例中，寡核苷酸可以以极低的加载率附着于表面，并且珠子在表面流动以确保每个珠子结合单个寡核苷酸。在一些实施例中，珠子在表面回流而不受泊松载荷的限制。在一些实施例中，100cm²的中等表面，数亿个珠子可以与单个分子结合。在一些实施例中，每个结合的珠子会保证有且仅有一个模板序列。在一些实施例中，每个空间限制位点(图案化表面上的位置或孔，或乳剂中的珠子)将包含紧密邻近的相同条形码化的DNA，而其他位点将各自包含紧密邻近的源自其他单个分子模板的单独的条形码化的DNA。在一些实施例中，可以通过使用5'核酸酶或解偶联的第二链的变性来产生单链DNA。在该实施例中，次级引物序列可用于执行后续的条形码延伸反应，或者可直接用于从单个细胞中捕获核酸。在一些实施例中，可以将珠子连接到包含接头部分和用作独特的分子标识符的完全随机序列的序列，以及三级引物序列。在该实施例中，三级引物序列可用于执行后续的条形码延伸反应，或者可直接用于从单个细胞中捕获核酸。

在一些实施例中，表面(例如，玻璃表面)被选择性地硅烷化，并且功能性烷烃或PEG(例如，FSL、氨基、叠氮化物、DBCO、florous基团)附着在小于珠子尺寸或要捕获的细胞直径的点阵列中。在一些实施例中，用钝化硅烷(如烷烃或PEG)将剩余表面硅烷化。可以用蛋白质或部分另外修饰功能位点以捕获所需细胞或特定类型的细胞。例如，CD19可以附着在表面上，用于从细胞混合物中捕获B细胞。将靶细胞与表面一起温育，其浓度为每个位点捕获少量的细胞。细胞随后被非泊松式(non-poisonnianly)地加载到阵列中。在一些实施例中，在每个细胞的顶部产生自组装的水凝胶，例如，使用PEG x4树状聚合物DBCO和PEG10kda叠氮化物和异双官能连接例如DBCO NHS用于初始附着于细胞或阵列位置。可以在水凝胶中结合入额外的分子用于捕获所需的靶标。在一些实施例中，附着蛋白G用于抗体捕获，或者附着多聚dT寡核苷酸用于mRNA捕获。然后可以将该基质中的细胞与分子一起温育，用于捕获基质结合的试剂，并因此进行标记例如引物、DNA分子、蛋白抗原或抗体。在一些实施例中，将裂解液加入到表面的细胞中，裂解细胞，并将其内容物捕获在水凝胶基质内。在一些实施例中，使各种试剂流过表面，例如洗涤缓冲液，以去除先前步骤中的试剂，同时保持结合RNA。在一些实施例中，以这种方式添加用于下一步骤的新试剂，例如，用于合成每个细胞的cDNA文库的含有酶和合适缓冲液的反转录酶溶液。在一些实施例中，可优选用烃或florous油相代替非水凝胶水相，以防止细胞内或细胞外结合的物质扩散出基质。

在一些实施例中，表面用疏水或florous背景上的亲水斑点进行图案化。在该实施例中，液滴将在表面自组装并为后续反应做好准备。使用如上文所述的电击化学，这些液滴也可用于产生水凝胶。在一些实施例中，斑点在细胞大小的量级上，并且可以以非泊松方式捕获单个细胞。在一些实施例中，斑点比单个细胞大得多，并且单个细胞的捕获以泊松方式进行。在一些实施例中，图案化是随机的而不是排列的，尽管这可能导致较低的加载密度。

在一些实施例中，每个斑点包含多个具有相同5'随机DNA条形码的多聚dt引物，从而可以特异性标记每个细胞的mRNA。在一些实施例中，图案化的表面首先用于捕获小于细胞但比捕获位点大的单个珠子。例如，1μm的捕获位点与2μm大小的珠子结合。在一些实施例中，珠子被功能化，使得它们可以附着于细胞和捕获位点。例如，珠子可以用NHS和DBCO涂覆，而捕获位点具有叠氮化物。在将珠子附着到捕获位点后，细胞流动，使得每个珠子捕获单个细胞。

一旦排列细胞，将它们转移到含有其他试剂的微孔阵列以进行额外的检查(例如裂解并捕获mRNA到涂覆引物的珠子)可能是有优势的。这使得能够将非泊松负载的细胞和/或珠子加载到微孔阵列。

这些技术可用于捕获单个细胞以在条形码化的珠子上进行RNA捕获，或精确定位每个捕获位点的单个珠子以进行额外的检查/后处理(workup)。例如，珠子上的条形码化的cDNA可以放在捕获阵列上，使得每个斑点处有单个珠子。在一些实施例中，可以进行PCR反应，其扩增每个分子的条形码部分并扩增感兴趣的分子子集(例如，重链和轻链)的特定区域，然后通过连接或组装PCR将条形码连接到感兴趣的特定区域。以这种方式，测序读数将包含感兴趣的区域和条形码，并且不受长度比测序读取长度长的分子的5'或3'末端的条形码的影响。

免疫结合蛋白的测序

在一些实施例中，扩增后的核酸用于测序反应，并且OE区可以侧接一个或多个条形码区(BC1和BC2)(图1b)。在一些实施例中，对编码免疫结合蛋白的多条链的核酸进行测序以识别形成免疫结合蛋白的链(例如，抗体的重链和轻链)。

测序工具、方法、设备和试剂是本领域普通技术人员公知的，并包括例如，单分子实时测序(Pacific Biosciences)、离子半导体(Ion Torrent sequencing of ThermoFisher)、焦磷酸测序(454 Life Sciences of Roche Diagnostics)、合成测序(Illumina)、连接测序(SOLiD测序，Thermo Fisher)、DNA纳米球测序(CompleteGenomics)、heliscope测序(Helicos Biosciences)和链终止(Sanger测序)。测序机器和试剂可商业用于包括例如来自Pacific Biosciences、Thermo Fisher、Roche Diagnostics、Illumina、Complete Genomics和Helicos Biosciences的所有这些技术。

在一些实施例中，基于序列比对表征所得到的序列的推定谱系信息。在一些实施例中，利用生物信息学工具(例如，BLAST)为序列之间的相似性得分来分析序列信息，然后根据该信息可选地分组成系统发育树。

在一些实施例中，使用本领域普通技术人员公知的技术比较序列，包括例如，Smith和Waterman，AdvApplMath.2:482,1981的局部同源性算法；Needleman和Wunsch,JMolBiol.48:443,1970的同源性比对算法；Pearson和Lipman，ProcNatl Acad Sci.USA85:2444，1988的相似性检索法；这些算法的计算机化实现(GCG Wisconsin SoftwarePackage中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)，或视觉检查(通常参见，Current Protocolsin Molecular Biology，F.M.Ausubel等人，eds.，Greene Publishing Associates,Inc.和John Wiley&Sons,Inc.,(1995Supplement))。适用于比较百分比序列同一性和序列相似性的算法的示例是BLAST和BLAST 2.0算法，其分别披露于Altschul等人，J.Mol.Biol.215:403-410,1990；和Altschul等人，Nucleic Acids Res.25(17):3389-3402,1977。用于执行BLAST分析的软件可通过National Center for Biotechnology Information网站公开获得。核苷酸序列的BLAST可以使用具有默认参数的BLASTN程序，例如，字长(W)为11，期望值(E)为10，M＝5，N＝-4，和两条链的比较。氨基酸序列的BLAST可以使用具有默认参数的BLASTP程序，例如，字长(W)为3，期望值(E)为10，和BLOSUM62评分矩阵(参见Henikoff和Henikoff,Proc Natl Acad Sci.USA 89:10915,1989)。序列比对和％序列同一性的示例性确定也可以使用GCG Wisconsin软件包(Accelrys,Madison WI)中的BESTFIT或GAP程序，使用提供的默认参数。

免疫结合蛋白的组库

本发明涉及编码免疫结合蛋白的核酸，其保留组成免疫结合蛋白(例如，抗体、T淋巴细胞受体或先天免疫受体)的免疫多肽链的体内多聚结合。在一些实施例中，本发明的免疫结合蛋白文库被富集用于编码多聚体的核酸，所述多聚体是代表在获得免疫结合蛋白文库的组库中发现的多聚复合物的功能多肽。

在一些实施例中，核酸代表已经对传染性疾病、癌症或其他免疫原性攻击免疫的受试者的抗体组库。在一些实施例中，核酸代表已经对传染性疾病、癌症或其他免疫原性攻击具有免疫反应的受试者的抗体组库。在一些实施例中，抗体组库来自对靶抗原天真(naive)的受试者。在一些实施例中，抗体组库代表受试者或物种的种系组库。在一些实施例中，编码抗体的重链和轻链的核酸以适当的组合方式组合以产生来自重链和轻链的抗原结合结构域的组库。

在一些实施例中，组库代表已经对传染性疾病、癌症或其他免疫原性攻击免疫的受试者的T细胞受体组库。在一些实施例中，核酸代表已经对传染性疾病、癌症或其他免疫原性攻击具有免疫反应的受试者的T细胞受体组库。在一些实施例中，T细胞受体组库来自对靶抗原天真的受试者。在一些实施例中，T细胞受体组库代表受试者或物种的种系组库。在一些实施例中，编码T细胞受体的α、β、γ和ζ链的核酸以适当的组合方式组合以产生来自T细胞受体链的抗原结合结构域的组库。

在一些实施例中，核酸代表已经对传染性疾病、癌症或其他免疫原性攻击免疫的受试者的先天免疫受体组库。在一些实施例中，核酸代表已经对传染性疾病、癌症或其他免疫原性攻击具有免疫反应的受试者的先天免疫受体组库。在一些实施例中，先天免疫受体组库来自对靶抗原天真的受试者。在一些实施例中，先天免疫受体组库代表受试者或物种的种系组库。

在一些实施例中，编码免疫结合蛋白的多肽链的核酸来源于已经产生与例如传染性疾病、癌症、自身免疫性疾病、过敏症和神经退化性疾病相关的免疫应答的个体。在一些实施例中，传染性疾病由流感病毒引起。在一些实施例中，传染性疾病由病毒引起，例如，HIV、Ebola、Zika、HSV、RSV或CMV。

本发明的免疫结合多肽的同源物意图在本发明的范围内。如本文所使用的，术语“同源物”包括类似物和旁系同源物。术语“类似物”是指具有相同或相似功能但在不相关的宿主生物中单独演变的两个多核苷酸或多肽。术语“旁系同源物”是指通过基因组内的复制而相关的两个多核苷酸或多肽。旁系同源物通常具有不同的功能，但这些功能可能是相关的。免疫结合蛋白的类似物和旁系同源物可以通过翻译后修饰、通过氨基酸序列差异、或两者而不同于免疫结合蛋白。具体地，本发明的同源物一般表现出与全部或部分的免疫结合蛋白或其多核苷酸序列的至少80-85％、85-90％、90-95％或95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性，并将表现出类似的功能。变体包括等位基因变体。术语“等位基因变体”是指含有多态性的多核苷酸或多肽，其导致蛋白质的氨基酸序列的改变并存在于天然群体(例如病毒种类或变种)中。所述天然等位基因变异通常可导致多核苷酸或多肽中1-5％的变异。可以通过对许多不同物种中感兴趣的核酸序列进行测序来识别等位基因变体，这可以通过使用杂交探针容易地进行以识别那些物种中的相同基因座。任何和所有这类核酸变异和由天然等位基因变异导致的并且不改变免疫结合蛋白的功能活性的所产生的氨基酸多态性或变异旨在本发明的范围内。

如本文所使用的，术语“衍生物”或“变体”是指免疫结合蛋白或编码免疫结合蛋白的核酸，其具有一个或多个保守氨基酸变异或其他微小修饰，使得相应多肽与野生型多肽相比具有基本上等同的功能。这些变体或衍生物包括具有免疫结合蛋白一级氨基酸序列的微小修饰的多肽，其可以产生与未修饰的对应多肽相比具有基本上等同的活性的肽。所述修饰可以是有意的，像通过定点突变，或可以是自发的。术语“变体”进一步涵盖序列的缺失、添加和取代，只要多肽起免疫结合蛋白的作用。术语“变体”还包括多肽的修饰，其中天然信号肽被异源信号肽取代，以促进多肽从宿主物种的表达或分泌。

本发明的免疫结合蛋白还可能包括氨基酸序列，用于引入糖基化位点或其他位点，用于多肽的修饰或衍生化。在一个实施例中，上述本发明的多肽可能包括可充当糖基化位点的氨基酸序列N-X-S或N-X-T。在糖基化过程中，寡糖链与三肽序列N-X-S或N-X-T中存在的天冬酰胺(N)连接，其中X可以是除脯氨酸以外的任何氨基酸。该序列称为糖基化序列子。该糖基化位点可以位于用于本发明多肽的蛋白质序列的N-末端、C-端或内部序列中。

免疫结合蛋白的展示文库

在一些实施例中，将编码本发明的免疫结合蛋白的核酸工程化到载体中，用于在细胞或病毒颗粒的表面展示免疫结合蛋白。在一些实施例中，免疫结合蛋白(例如，抗体、T细胞受体或先天免疫受体)的组库展示在丝状噬菌体(例如，McCafferty等人，1990，Nature348:552-554，该篇文献出于所有目的以其全文形式被援引加入本文)、酵母细胞(例如，Boder和Wittrup，1997，Nat Biotechnol 15:553-557，该篇文献出于所有目的以其全文形式被援引加入本文)和核糖体(例如，Hanes和Pluckthun，1997，Proc NatlAcad Sci USA94:4937-4942，该篇文献出于所有目的以其全文形式被援引加入本文)上。噬菌体展示的其他实施例披露于例如，美国专利号5,750,373、5,733,743、5,837,242、5,969,108、6,172,197、5,580,717和5,658,727中，上述专利文献均出于所有目的以其全文形式被援引加入本文。

在一些实施例中，噬菌体展示文库用于制备来自免疫的人、未免疫的人、种系序列或初始组库的人类抗体、T细胞受体(或其部分)或先天免疫受体(或其部分)(Barbas&Burton，Trends Biotech(1996)，14:230；Griffiths等人，EMBO J.(1994)，13:3245；Vaughan等人，Nat.Biotech.(1996)，14:309；Winter EP 0368 684 B1，上述文献均出于所有目的以其全文形式被援引加入本文)。在一些实施例中，使用多种淋巴样组织产生初始或非免疫的抗原结合文库。这些文库中的一些是商业上可获得的，例如，由CambridgeAntibody Technology and Morphosys开发的那些(Vaughan等人(1996)Nature Biotech14:309；Knappik等人(1999)J.Mol.Biol.296:57，上述文献均出于所有目的以其全文形式被援引加入本文)。

在一些实施例中，如果一条链(重链或轻链)与g3衣壳蛋白融合并且互补链作为可溶性分子输出到周质，则Fab分子可以展示在噬菌体上。两条链可以在相同或不同的复制子上编码；每个Fab分子中的两条抗体链在翻译后组装，并且通过与一条g3p链的连接将二聚体掺入噬菌体颗粒中(参见，例如，美国专利号5,733,743，该专利出于所有目的以其全文形式被援引加入本文)。可替换地，可以将scFv与g3衣壳蛋白融合以在噬菌体颗粒上展示。

在一些实施例中，将编码免疫结合蛋白组库的核酸工程化到载体中，以在细菌、酵母或哺乳动物细胞上展示。在一些实施例中，展示本发明的免疫结合蛋白的细菌、酵母或哺乳动物细胞与荧光标记的抗原接触，结合荧光标记的抗原的细胞将是荧光的，然后可以使用荧光激活细胞分选进行分离。在一些实施例中，淘选方法用于将免疫结合蛋白与由免疫结合蛋白结合的抗原联系在一起。

在一些实施例中，将免疫结合蛋白文库工程化到噬菌体展示载体中并转化到细胞中以产生噬菌体，所述噬菌体在与一种噬菌体外壳蛋白融合时展示感兴趣的免疫结合蛋白。噬菌体文库可以与涂有感兴趣的测试抗原的表面(例如，微量滴定板)接触(又称为淘选)。然后用缓冲液清洗板一次或多次。包含与感兴趣的抗原结合的抗体变体的噬菌体将被保留，而那些不与抗原结合的抗体将被洗掉。随后可以将得到的噬菌体文库转化到其他宿主细胞中用于进一步筛选或复制和/或通过测序进行表征。

在一些实施例中，可以将抗体的重链/轻链对插入表面展示载体中，并且可以用该载体转化细胞以在表面上展示抗体。单独地，一组一种或多种抗原可以与一组识别核酸条形码序列连接，使得每种不同的抗原与独特的序列连接。连接可以化学方式进行，或者可替换地通过将一组条形码化的抗原克隆到合适的展示载体中并在噬菌体或细胞表面上表达抗原来进行。然后可以将目前与核酸标识符连接的抗原组与在表面上展示抗体的细胞接触。温育后，可以通过乳剂、单细胞分选或其他方法分离单独的细胞。得到的分离物将由单个细胞组成，在其表面上展示同源抗体，与一种或多种条形码化的抗原结合。然后可以将编码抗体重链、轻链和抗原条形码的核酸一起扩增并测序。得到的序列信息将产生抗体/抗原偶联信息。例如，如果一种抗体排他性地与单个抗原结合，则得到的序列信息将产生独特的抗体/抗原序列。如果抗体结合多种抗原，它将产生抗体/抗原偶联序列的混合群体。因此，可以确定群体中每种抗体相对于一组抗原的相对特异性。此外，不同偶联物种的相对丰度可以与抗体对组中每种抗原的相对亲和力相关。

在一些实施例中，可以将所述对克隆到嵌合抗原受体中。嵌合抗原受体构建体至少由结合区(通常为scFv)和细胞内信号传递区组成。它可能另外包含其他组分，例如跨膜区、间隔区/接头区、多个信号传递区、和/或蛋白靶向和易位序列。嵌合抗原受体是本领域公知的，如在美国专利申请US20140242701和美国专利号5,359,046、5,686,281和6,103,521中所述，上述专利文献均出于所有目的以其全文形式被援引加入本文。将构建体置于细胞中并表达受体，通常但不一定在哺乳动物T细胞的表面上。在scFv与抗原结合后，信号传递结构域启动一连串事件，最终导致基因的转录和激活。在一个示例中，用表达标记蛋白的构建体进一步修饰细胞，所述标记蛋白例如荧光蛋白、发光蛋白、酶或选择标记，其允许该细胞与群体中的其他非激活细胞之间的区分。因此，可以为那些细胞筛选含有抗体构建体文库的细胞群体，所述细胞通过与靶标结合而被激活。

免疫结合蛋白和抗原

免疫结合蛋白结合非常多样的抗原谱，具有不同水平的亲和力和特异性。在一些实施例中，免疫结合蛋白结合非常特异性的抗原，而其他免疫结合蛋白结合更广泛的抗原。取决于应用，可能希望这些选项中的任何一个。例如，可以识别多种流感病株的免疫结合蛋白对抗多种流感病株会是有利的，而用于抗肿瘤治疗的免疫结合蛋白可能只需要结合一种非常特异性的抗原构象，以避免攻击存在于健康细胞和组织上的正常形式的抗原。

在一些实施例中，针对一组抗原筛选通过本发明的方法制备的免疫结合蛋白(例如抗体、T细胞受体和/或先天免疫受体)的组库。在一些实施例中，抗原组的每个成员用编码每种抗原的独特条形码的核酸标记。在一些实施例中，筛选多种抗原之后是扩增反应，所述扩增反应产生编码免疫结合蛋白的多肽链(例如，抗体的重链和轻链)和抗原(例如，如果抗原是多肽)的核酸或抗原的核酸条形码。在一些实施例中，免疫结合蛋白展示在细胞表面，并针对一组条形码化的抗原进行筛选。将具有结合抗原的展示的免疫结合蛋白的那些细胞置于微孔(每个微孔中的单个细胞)中和/或在乳剂中捕获，并进行扩增反应以制备编码免疫结合蛋白的链的核酸和抗原的条形码。

在一些实施例中，上述的免疫蛋白的扩增反应用来添加一组扩增附着在抗原上的核酸的正向和反向引物(AF和AR)(图1C)。在一些实施例中，AR引物另外包含条形码(BC5)和OE区，与编码免疫蛋白的一条链的核酸的引物(例如，抗体的LF引物)相匹配。进行扩增，产生编码免疫蛋白(例如，HC/LC分子)的核酸和编码免疫蛋白链的核酸和用于识别抗原(例如，HC/抗原分子)的核酸的混合物。在一些实施例中，利用高通量方法对这些分子进行测序，并且得到的信息用单独免疫结合蛋白(例如，抗体)识别抗原。

在一些实施例中，将第二重叠延伸区(OE)置于BR和免疫蛋白引物(例如，对于抗体，LF引物)上。在该实施例中，在扩增后获得编码免疫结合蛋白的链(例如，抗体的重链和轻链)的核酸以及抗原的条形码。在一些实施例中，对该多部分核酸进行测序以识别免疫结合蛋白和免疫结合蛋白所结合的抗原。

核酸

在一些实施例中，本发明涉及至少部分编码本发明的单独肽、多肽、蛋白质和RNA控制装置的核酸。在一些实施例中，核酸可能是天然的、合成的或其组合。本发明的核酸可能是RNA、mRNA、DNA或cDNA。

在一些实施例中，本发明的核酸还包括表达载体，例如质粒，或病毒载体，或线性载体，或整合到染色体DNA中的载体。表达载体可以包含核酸序列，其能够使载体在一个或多个选定的宿主细胞中复制。所述的序列对于各种细胞是公知的。来自质粒pBR322复制起点适用于大多数革兰氏阴性细菌。在真核宿主细胞例如哺乳动物细胞中，表达载体可被整合到宿主细胞染色体中，然后与宿主染色体一起复制。类似地，载体可被整合到原核细胞的染色体中。

表达载体一般还包含选择基因，也称为选择标记。对于原核和真核细胞，包括本发明的宿主细胞，选择标记在本领域中是公知的。一般，选择基因编码对于在选择性培养基中生长的转化的宿主细胞的存活或生长所必需的蛋白质。未用含有选择基因的载体转化的宿主细胞将不能在培养基中存活。典型的选择基因编码的蛋白质(a)赋予对抗生素或其他毒素的抗性，例如，氨苄青霉素、新霉素、甲氨蝶呤或四环素，(b)补体营养缺陷型，或(c)提供不能从复合培养基中获得的关键营养素，例如，编码芽孢杆菌的D-丙氨酸消旋酶的基因。在一些实施例中，示例性选择方案利用药物来抑制宿主细胞的生长。用异源基因成功转化的那些细胞产生赋予抗药性的蛋白质，从而在选择方案中存活。用于细菌或真核(包括哺乳动物)系统的其他选择标记在本领域中是公知的。

在一些实施例中，能够在哺乳动物宿主细胞中表达编码本发明的免疫结合蛋白的转基因的启动子的示例是EF1a启动子。天然EF1a启动子驱动延伸因子-1复合物的α亚基的表达，其负责将氨酰基tRNA酶促递送至核糖体。EF1a启动子已被广泛应用于哺乳动物表达质粒中，并已显示能有效驱动自克隆到慢病毒载体中的转基因的表达。参见，例如，Milone等人，Mol.Ther.17(8):1453-1464(2009)，该篇文献出于所有目的以其全文形式被援引加入本文。启动子的另一示例是立即早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。该启动子序列是强组成型启动子序列，能够驱动与之可操作地连接的任何多核苷酸序列的高水平表达。也可以使用其他组成型启动子序列，包括但不限于猿猴病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒启动子(MMTV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复序列(LTR)启动子、MoMuLV启动子、磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子、MND启动子(含有具有骨髓增殖肉瘤病毒增强子的修饰的MoMuLV LTR的U3区的合成型启动子)(参见，例如，Li等人，J.Neurosci.Methods vol.189，pp.56-64(2010)，该篇文献出于所有目的以其全文形式被援引加入本文)、禽白血病病毒启动子、Epstein-Barr病毒立即早期启动子、Rous肉瘤病毒启动子以及人类基因启动子，例如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、延伸因子-1a启动子、血红蛋白启动子和肌酸激酶启动子。此外，本发明并不限于使用组成性启动子。

诱导型启动子也被认为是本发明的一部分。诱导型启动子的示例包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子、四环素启动子、c-fos启动子、自四环素操纵子控制下的人巨细胞病毒立即-早期启动子表达的ThermoFisher的T-REx系统以及Intrexon的RheoSwitch启动子。Karzenowski,D.等人，BioTechiques 39:191-196(205)；Dai,X.等人，Protein Expr.Purif42:236-245(2005)；Palli,S.R.等人，Eur.J.Biochem.270:1308-1515(2003)；Dhadialla,T.S.等人，Annual Rev.Entomol.43:545-569(1998)；Kumar,M.B.等人,J.Biol.Chem.279:27211-27218(2004)；Verhaegent,M.等人，Annal.Chem.74:4378-4385(2002)；Katalam,A.K.,等人，Molecular Therapy 13:S103(2006)；和Karzenowski,D.等人，Molecular Therapy 13:S194(2006)，美国专利号8,895,306、8,822,754、8,748,125、8,536,354，上述文献和专利均出于所有目的以其全文形式被援引加入本文。

本发明的表达载体通常具有启动子元件，例如增强子，以调节转录起始的频率。通常，这些位于起始位点上游30-110bp的区域，尽管已经显示多个启动子也包含起始位点下游的功能元件。启动子元件之间的间隔通常是灵活的，因此当元件相对于彼此反转或移动时保留启动子功能。在胸苷激酶(tk)启动子中，启动子元件之间的间隔可以在活性开始下降之前增加到50bp。取决于启动子，似乎单独元件可以协同或独立地起作用以激活转录。

在一些实施例中，适合细菌宿主细胞的控制区用于表达载体。在一些实施例中，用于引导本发明核酸构建体转录的合适控制区包括从大肠杆菌乳糖操纵子、天蓝色链霉菌琼胶酶基因(dagA)、枯草芽孢杆菌蔗糖果聚糖酶基因(sacB)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、嗜热脂肪芽孢杆菌麦芽糖淀粉酶基因(amyM)、解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因以及原核β-内酰胺酶基因、tac启动子或T7启动子获得的控制区。

在一些实施例中，丝状真菌宿主细胞的控制区包括从米曲霉TAKA淀粉酶、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉耐酸α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、米黑根毛霉脂肪酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、构巢曲霉乙酰胺酶和尖孢镰刀菌胰酶样蛋白酶(WO96/00787)以及NA2-tpi启动子(来自黑曲霉中性α-淀粉酶和米曲霉丙糖磷酸异构酶的基因的启动子的杂交体)的基因获得的控制区及其突变、截短和杂交控制区。示例性酵母细胞控制区可以来自酿酒酵母烯醇化酶(ENO-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母乙醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)以及酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶的基因。

在一些实施例中，昆虫细胞的示例性控制区其中包括基于多面体、PCNA、OplE2、OplE1、果蝇金属硫蛋白和果蝇肌动蛋白5C的那些。在一些实施例中，昆虫细胞启动子可与杆状病毒载体一起使用。

在一些实施例中，植物细胞的示例性控制区其中包括基于花椰菜花叶病毒(CaMV)35S、多聚泛素基因(PvUbi1和Pvubi2)、水稻(Oryza sativa)肌动蛋白1(OsAct1)和肌动蛋白2(OsAct2)控制区、玉米泛素1(ZmUbi1)控制区和多个水稻泛素(RUBQ1、RUBQ1、rubi3)控制区。

在一些实施例中，表达载体包含一个或多个选择标记，其允许对转化的细胞进行选择。选择标记是其产物提供杀生物剂或病毒抗性、对重金属的抗性、营养缺陷型的原养型等的基因。细菌选择标记的示例是来自枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的dal基因，或赋予抗生素抗性的标记，例如氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素(示例1)或四环素抗性。酵母宿主细胞的合适标记是ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。用于丝状真菌宿主细胞的选择标记包括但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨基甲酰基转移酶)、bar(草丁膦乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸盐还原酶)、pyrG(乳清酸核苷-5'-磷酸脱羧酶)、sC(硫酸盐腺苷酸转移酶)和trpC(邻氨基苯甲酸合成酶)以及其等价物。用于曲霉属细胞的实施例包括构巢曲霉或米曲霉的amdS和pyrG基因以及吸水链霉菌的bar基因。

在一些实施例中，可能希望对本发明的多肽进行修饰。本领域技术人员将认识到在给定核酸构建体中产生改变以产生变体多肽的多种方式。这些公知的方法包括定点突变、利用简并寡核苷酸的PCR扩增、将含有核酸的细胞暴露于诱变剂或辐射、所需寡核苷酸的化学合成(例如，与连接和/或克隆结合以产生大的核酸)和其他公知的技术(参见，例如，Gillam和Smith，Gene 8:81-97，1979；Roberts等人，Nature 328:731-734，1987，上述文献出于所有目的以其全文形式被援引加入本文)。在一些实施例中，修饰编码本发明多肽的重组核酸以提供优选的密码子，其增强所选生物体中核酸的翻译。

本发明的多核苷酸还包括含有与本发明的多核苷酸基本等同的核苷酸序列的多核苷酸。根据本发明的多核苷酸可以与本发明的多核苷酸具有至少约80％，更通常至少约90％，甚至更通常至少约95％的序列同一性。本发明还提供了多核苷酸的互补序列，包括与编码上述多肽的多核苷酸具有至少约80％，更通常至少约90％，甚至更通常至少约95％的序列同一性的核苷酸序列。多核苷酸可以是DNA(基因组、cDNA、扩增的或合成的)或RNA。用于获得此类多核苷酸的方法和算法是本领域技术人员公知的，并且可包括例如确定杂交条件的方法，所述杂交条件可常规分离具有所需序列同一性的多核苷酸。

编码根据本发明的蛋白质类似物或变体的核酸(即，其中一个或多个氨基酸被设计成与野生型多肽不同)可以使用定点突变或PCR扩增产生，其中引物具有所需的点突变。关于合适的突变技术的详细描述，参见Sambrook等人，Molecular Cloning:A LaboratoryManual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989)和/或Current Protocols in Molecular Biology,Ausubel等人，eds，Green Publishers Inc.和Wileyand Sons,N.Y.(1994)，每篇文献均出于所有目的以其全文形式被援引加入本文。使用本领域公知的方法的化学合成，例如描述于Engels等人，Angew Chem Intl Ed.28:716-34,1989(该篇文献出于所有目的以其全文形式被援引加入本文)中，也可用于制备所述核酸。

在一些实施例中，用于产生变体的氨基酸“取代”优选是用具有相似结构和/或化学性质的另一氨基酸来取代一氨基酸的结果，即，保守性氨基酸替换。氨基酸取代可以基于所涉及残基的极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性和/或两亲性质的相似性来进行。例如，非极性(疏水)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、和甲硫氨酸；极性中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺；带正电荷的(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸；带负电荷的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。

本发明的核酸可与另一核酸连接，以便在合适的启动子的控制下表达。为了实现核酸的高效转录，本发明的核酸还可以连接到与启动子或转录起始位点配合的其他调节元件，例如，包含增强子序列、多聚A位点或终止子序列的核酸。除本发明的核酸外，可以掺入可作为确认核酸表达的标记的基因(例如，耐药基因、编码报告酶的基因、或编码荧光蛋白的基因)。

当将本发明的核酸离体导入细胞时，本发明的核酸可与促进核酸转移到细胞中的物质结合，例如，用于引入核酸的试剂，例如脂质体或阳离子脂质，除上述赋形剂外。可替换地，携带本发明核酸的载体也是有用的。特别是，适合于对含有由合适的载体携带的本发明核酸的生物体施用的形式的组合物适合于体内基因治疗。

宿主细胞

在一些实施例中，将编码本发明的免疫结合蛋白(例如，抗体)的核酸克隆到合适的表达载体，用于在宿主细胞中表达免疫结合蛋白。在一些实施例中，本发明的宿主细胞包括例如细菌、真菌或哺乳动物宿主细胞。在一些实施例中，宿主细胞是细菌，包括例如，芽孢杆菌，如地衣芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌；泛菌，如柠檬泛菌；假单胞菌，如产碱假单胞菌；链霉菌，如变铅青链霉菌或锈赤霉链霉菌；埃希氏菌，如大肠杆菌；肠杆菌属；链球菌；古细菌，如马氏甲烷八叠球菌；或棒状杆菌，如，谷氨酸棒状杆菌。

在一些实施例中，宿主细胞是真菌细胞，包括但不限于酵母属、克鲁维酵母菌属、假丝酵母属、毕赤酵母属、德巴利氏酵母属、汉逊酵母属、耶氏酵母属、接合酵母属或裂殖酵母属的真菌。在一些实施例中，宿主细胞是真菌，尤其包括酿酒酵母、粟酒裂殖酵母、乳酸克鲁维酵母、马克思克鲁维酵母、土曲霉、黑曲霉、毕赤酵母、根霉、米根霉、解脂耶氏酵母等。在一些实施例中，真核细胞是藻类，包括但不限于小球藻属、衣藻属、栅藻属、等鞭金藻属、杜氏藻属、四丝藻属、微绿球藻属或原囊藻属的藻类。在一些实施例中，藻类是绿藻、红藻、灰藻、chlorarachniophytes、眼虫藻(euglenids)、色藻界(chromista)或鞭毛藻。

在一些实施例中，真核细胞是哺乳动物细胞，例如，小鼠、大鼠、兔子、仓鼠、猪、牛、猫或犬。在一些实施例中，哺乳动物细胞是灵长类动物的细胞，包括但不限于猴子、黑猩猩、大猩猩和人类。在一些实施例中，哺乳动物细胞是小鼠细胞，因为小鼠通常用作其他哺乳动物的模型，尤其是用作人类的模型(参见，例如，Hanna,J.等人，Science 318:1920-23,2007；Holtzman,D.M.等人，J Clin Invest.103(6):R15-R21,1999；Warren,R.S.等人，JClin Invest.95:1789-1797,1995；每篇文献均出于所有目的以其全文形式被援引加入本文)。在一些实施例中，动物细胞包括例如成纤维细胞、上皮细胞(例如，肾、乳腺、前列腺、肺)、角质形成细胞、肝细胞、脂肪细胞、内皮细胞和造血细胞。在一些实施例中，动物细胞是成体细胞(例如，终末分化的、分裂的或非分裂的)或胚胎细胞(例如，囊胚细胞等)或干细胞。在一些实施例中，动物细胞是来源于动物或其他来源的细胞系。

在一些实施例中，哺乳动物细胞是在包括人类的哺乳动物循环系统中发现的细胞。示例性的循环系统细胞尤其包括红细胞、血小板、浆细胞、T细胞、自然杀伤细胞、B细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞等，以及它们的前体细胞。作为一组，这些细胞被定义为本发明的循环真核细胞。在一些实施例中，哺乳动物细胞来源于任何这些循环真核细胞。本发明可以与这些循环细胞或来源于循环细胞的细胞中的任何一种一起使用。在一些实施例中，哺乳动物细胞是T细胞或T细胞前体或祖细胞。在一些实施例中，哺乳动物细胞是辅助T细胞、细胞毒性T细胞、记忆T细胞、调节性T细胞、自然杀伤T细胞、黏膜相关不变T细胞、γδT细胞，或上述的前体或祖细胞。在一些实施例中，哺乳动物细胞是自然杀伤细胞，或自然杀伤细胞的前体或祖细胞。在一些实施例中，哺乳动物细胞是B细胞，或浆细胞，或B细胞前体或祖细胞。在一些实施例中，哺乳动物细胞是嗜中性粒细胞或嗜中性粒细胞前体或祖细胞。在一些实施例中，哺乳动物细胞是巨核细胞或巨核细胞的前体或祖细胞。在一些实施例中，哺乳动物细胞是巨噬细胞或巨噬细胞的前体或祖细胞。

在一些实施例中，从受试者获得细胞的来源。受试者可以是任何生物体。受试者的示例包括人类、狗、猫、小鼠及其转基因物种。在一些实施例中，T细胞可以从许多来源获得，包括外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾脏组织和肿瘤。在一些实施例中，可以使用本领域可获得的任何数量的T细胞系。在一些实施例中，可以使用本领域技术人员已知的任何数量的技术，例如Ficoll分离，从受试者采集的血液单位中获得T细胞。在一些实施例中，通过血液分离术获得来自个体的循环血液的细胞。血液分离产物通常含有淋巴细胞，包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其他有核白细胞、红细胞和血小板。在一些实施例中，可以洗涤通过血液分离术采集的细胞以除去血浆部分并将细胞置于合适的缓冲液或培养基中用于后续处理步骤。在一些实施例中，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤细胞。在可替换的方面，洗涤液缺乏钙并且可能缺乏镁，或者可能缺乏许多(如果不是全部)二价阳离子。在缺乏钙的情况下，初始激活步骤可导致放大的激活。

在一些实施例中，植物细胞是单子叶或双子叶植物的细胞，包括但不限于苜蓿、杏仁、芦笋、鳄梨、香蕉、大麦、豆类、黑莓、芸苔、西兰花、卷心菜、油菜、胡萝卜、花椰菜/菜花、芹菜、樱桃、菊苣、柑橘、咖啡、棉花、黄瓜、桉树、大麻、莴苣、小扁豆、玉米、芒果、甜瓜、燕麦、木瓜、豌豆、花生、菠萝、李子、土豆(包括红薯)、南瓜、萝卜、油菜籽、覆盆子、大米、黑麦、高粱、大豆、菠菜、草莓、甜菜、甘蔗、向日葵、烟草、番茄、白萝卜、小麦、西葫芦、以及其他结果蔬菜(例如，西红柿、胡椒、辣椒、茄子、黄瓜、南瓜等)、其他鳞茎类蔬菜(例如，大蒜、洋葱、韭菜等)、其他梨果类水果(例如苹果、梨等)、其他核果类水果(例如，桃、油桃、杏、梨、梅子等)、拟南芥、木本植物如针叶树和落叶树、观赏植物、多年生牧草、饲料作物、花卉、其他蔬菜、其它水果、其他农作物、草本植物、草、或多年生植物部分(例如，鳞茎；块茎；根；冠；茎；匍匐茎、分蘖；芽；插枝，包括无根插枝、生根插枝和愈伤组织插枝或愈伤组织产生的苗木；顶端分生组织等)。术语“植物”是指植物的所有物理部分，包括种子、幼苗、树苗、根、块茎、茎、梗、叶和果实。

应用

在一些实施例中，本发明的免疫结合蛋白用于治疗感染性疾病、癌症、过敏症和自身免疫性疾病。在一些实施例中，本发明的方法用于制备来自已经被感染因子攻击/感染的受试者的免疫结合蛋白的组库。在一些实施例中，本发明的免疫结合蛋白用于治疗感染了感染因子的受试者的疗法。在一些实施例中，本发明的免疫结合蛋白用于治疗患有癌症或过敏症的受试者。在一些实施例中，本发明的免疫结合蛋白用于治疗对免疫疗法有响应的黑色素瘤、淋巴瘤、白血病和其他癌症。在一些实施例中，本发明的免疫结合蛋白用于治疗对免疫检查点抑制剂疗法有响应的癌症。在一些实施例中，添加外源免疫结合蛋白(例如，抗体)有助于受试者的身体加速其对病原体的自身免疫应答，实际上将免疫从一个个体“移植”到另一个个体。在一些实施例中，本发明的免疫结合蛋白预防性使用。在一些实施例中，本发明的免疫结合蛋白用于诊断应用。在一些实施例中，本发明的免疫结合蛋白提供受试者对治疗的反应的信息。在一些实施例中，本发明的免疫结合蛋白提供受试者对抗体疗法、小分子药物疗法、生物疗法或细胞免疫疗法的反应的信息。

在一些实施例中，免疫结合蛋白(例如，抗体)可以从受试者获得，其中和感染因子，或可以被制成变得中和。在一些实施例中，感染因子是葡萄球菌、链球菌、大肠杆菌、假单胞菌或沙门氏菌的细菌菌株。在一些实施例中，感染因子是金黄色葡萄球菌、淋病奈瑟氏球菌、化脓性链球菌、A群链球菌、B群链球菌(无乳链球菌)、肺炎链球菌和破伤风梭菌。在一些实施例中，感染因子是可能感染宿主细胞的细菌病原体，包括例如幽门螺杆菌，嗜肺军团菌、分枝杆菌属(例如，结核分枝杆菌、非结核分枝杆菌、胞内分枝杆菌、M.kansaii或M.gordonea)的细菌菌株、脑膜炎奈瑟氏球菌、单核细胞增生性李斯特菌、立克次氏体、沙门氏菌属、布鲁氏菌属、志贺氏菌属，或某些大肠杆菌菌株，或已经获得具有侵入因子的基因的其他细菌。在一些实施例中，感染因子是抗生素抗性的细菌病原体。在一些实施例中，感染因子是病毒病原体，包括例如Ebola、Zika、RSV、逆转录病毒科(例如，人类免疫缺陷病毒，如HIV-1和HIV-LP)、微小核糖核酸病毒科(例如，脊髓灰质炎病毒、甲型肝炎病毒、肠病毒、人类柯萨奇病毒、鼻病毒和埃可病毒)、风疹病毒、冠状病毒、水疱性口炎病毒、狂犬病病毒、埃博拉病毒、副流感病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、呼吸道合胞病毒、流感病毒、乙型肝炎病毒、细小病毒、腺病毒科、疱疹病毒科(例如，1型和2型单纯疱疹病毒(HSV)、水痘-带状疱疹病毒、巨细胞病毒(CMV)和疱疹病毒)、痘病毒科(例如，天花病毒、牛痘病毒和痘病毒)或丙型肝炎病毒。

在一些实施例中，本发明的免疫结合蛋白用于增强受试者抵抗传染病的免疫力。例如，在流感中，身体会在7-10天内对攻击作出反应；不过，在诸如老年人等免疫功能低下的患者中，免疫应答的时间或程度可能不足以抵抗感染，导致严重的并发症并可能导致死亡。通过用针对相关流感病毒株设计的抗体增强免疫系统，可以治疗受试者中的感染。在一些实施例中，本发明的方法用于快速开发针对新出现的大流行性流感株的菌株特异性抗体。在一些实施例中，本发明的免疫结合蛋白用于治疗感染的患者和/或被动免疫面临暴发的弱势群体。在一些实施例中，预防性施用免疫结合蛋白。在一些实施例中，免疫结合蛋白的预防性施用保护处于风险中的受试者群体免于疾病。

在一些实施例中，感染因子是单纯疱疹病毒1(HSV-1)、单纯疱疹病毒2(HSV-2)、水痘带状疱疹病毒、EB(Epstein-Barr)病毒、巨细胞病毒(CMV)或卡波西肉瘤病毒。HSV-1主要引起口腔疱疹、眼疱疹和疱疹脑炎，偶尔会引起生殖器疱疹；HSV-2主要引起生殖器疱疹，但也可引起口腔疱疹；水痘带状疱疹引起水痘和带状疱疹；EB病毒引起单核细胞增多症，并与包括伯基特氏淋巴瘤在内的若干癌症有关；CMV引起单核细胞增多症样综合征和先天性/新生儿发病率和死亡率。一些疱疹病毒科，尤其是HSV-1，已经与阿尔茨海默病相关，并被提出为阿尔茨海默病的病原体。在一些实施例中，本发明的免疫结合蛋白可用于治疗和/或被动免疫抵抗这些疱疹病毒科。在一些实施例中，可以采用针对HSV-1或HSV-2的抗体的注射或局部应用来降低疱疹爆发影响的发生率或严重程度。

在一些实施例中，本发明的免疫结合蛋白可用于治疗癌症。在一些实施例中，癌症是肉瘤、上皮癌、黑色素瘤、脊索瘤、恶性组织细胞瘤、间皮瘤、胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤、成神经管细胞瘤、恶性脑膜瘤、恶性神经鞘瘤、白血病、淋巴瘤、骨髓瘤、骨髓增生异常综合征、骨髓增生性疾病。在一些实施例中，癌症是白血病、淋巴瘤、骨髓瘤、骨髓增生异常综合征和/或骨髓增生性疾病。在一些实施例中，癌症是对免疫疗法有响应的癌症。在一些实施例中，癌症是对免疫检查点抑制剂疗法有响应的癌症。

在一些实施例中，本发明的免疫结合蛋白对肿瘤特异性或富集的抗原具有特异性。在一些实施例中，肿瘤特异性或富集的抗原的示例包括，例如，4-1BB、5T4、腺癌抗原、甲胎蛋白、BAFF、B淋巴瘤细胞、C242抗原、CA-125、碳酸酐酶9(CA-IX)、C-MET、CCR4、CD152、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23(IgE受体)、CD28、CD30(TNFRSF8)、CD33、CD4、CD40、CD44v6、CD51、CD52、CD56、CD74、CD80、CEA、CNTO888、CTLA-4、DR5、EGFR、EpCAM、EphA3、CD3、FAP、纤连蛋白额外结构域-B、叶酸受体1、GD2、GD3神经节苷脂、糖蛋白75、GPNMB、HER2/neu、HGF、人散射因子受体激酶、IGF-1受体、IGF-I、IgG1、L1-CAM、IL-13、IL-6、胰岛素样生长因子I受体、α5β1-整合素、整合素αvβ3、MORAb-009、MS4A1、MUC1、粘蛋白CanAg、N-羟乙酰神经氨酸、NPC-1C、PDGF-Rα、PDL192、磷脂酰丝氨酸、前列腺癌细胞、RANKL、RON、ROR1、SCH900105、SDC1、SLAMF7、TAG-72、肌腱蛋白C、TGFβ2、TGF-β.、TRAIL-R1、TRAIL-R2、肿瘤抗原CTAA16.88、VEGF-A、VEGFR-1、VEGFR2、707-AP、ART-4、B7H4、BAGE、β-连环蛋白/m、Bcr-abl、MN/C IX抗体、CAMEL、CAP-1、CASP-8、CD25、CDC27/m、CDK4/m、CT、Cyp-B、DAM、ErbB3、ELF2M、EMMPRIN、ETV6-AML1、G250、GAGE、GnT-V、Gp100、HAGE、HLA-A*0201-R170I、HPV-E7、HSP70-2M、HST-2、hTERT(或hTRT)、iCE、IL-2R、IL-5、KIAA0205、LAGE、LDLR/FUT、MAGE、MART-1/黑素-A、MART-2/Ski、MC1R、肌球蛋白/m、MUM-1、MUM2、MUM-3、NA88-A、PAP、蛋白酶-3、p190次要bcr-abl、Pml/RARα、PRAME、PSA、PSM、PSMA、RAGE、RU1或RU2、SAGE、SART-1或SART-3、生存素、TPI/m、TRP-1、TRP-2、TRP-2/INT2、WT1、NY-Eso-1或NY-Eso-B或波形蛋白。

在一些实施例中，肿瘤抗原结合免疫结合蛋白(例如，抗体)可用于制备对肿瘤抗原特异性的嵌合抗原受体，并将该CAR构建体置于T细胞和/或自然杀伤细胞中。在一些实施例中，具有肿瘤特异性CAR的T细胞和/或自然杀伤细胞用于治疗患有携带肿瘤抗原的癌症的受试者。

在一些实施例中，本发明的免疫结合蛋白可用于治疗患有过敏症的受试者。常见的过敏原包括贝类、坚果、牛奶、花粉(ollen)、某些药物、乳胶、昆虫叮咬和一些植物化合物(例如，漆酚)。在一些实施例中，本发明的免疫结合蛋白结合感兴趣的过敏原而不引发过敏反应。例如，免疫结合蛋白可以是没有Fc区的抗体，也可以是IgG形式的抗体或不是IgE形式的其他形式的抗体。在这些实施例中，本发明的免疫结合蛋白与过敏原结合而不引发过敏反应，并且该结合可以防止受试者中的IgE抗体与过敏原结合并引起过敏反应(这是竞争性抑制反应)。在一些实施例中，结合过敏原的免疫结合蛋白从具有过敏症的受试者获得。

在一些实施例中，本发明的免疫结合蛋白可用于治疗患有自身免疫性疾病的受试者。在一些实施例中，自身免疫性疾病是类风湿性关节炎、狼疮、乳糜泻、Sjorgren综合症、风湿性多肌痛、多发性硬化、强直性脊柱炎、1型糖尿病等。在一些实施例中，本发明的免疫结合蛋白结合自身免疫性疾病的抗原靶标而不引发自身免疫反应。例如，免疫结合蛋白可以是没有Fc区的抗体，或者可以是不与与自身免疫性疾病相关的效应细胞相互作用的形式的抗体。在这些实施例中，本发明的免疫结合蛋白与自身免疫抗原结合而不引发自身免疫反应，并且这种结合可以防止受试者的免疫系统与减少自身免疫性疾病的自身免疫抗原反应(这可以是竞争性抑制反应)。

本说明书中引用的所有出版物和专利均在此被援引加入本文，如同每篇单独的出版物或专利被明确地和单独地指出被援引加入本文，并且被援引加入本文以公开和描述与所引用的出版物相关的方法和/或材料。

实例

实例1.原代细胞的多重抗原染色

在一些实施例中，通过将抗原与NHS DBCO异双官能交联剂一起温育来制备条形码化的肽抗原。其次，将具有5'引物位点、DNA条形码、3'引物位点、3'多聚dt、含有3'生物素和5'叠氮化物的DNA寡核苷酸与肽-DBCO抗原混合以制备条形码标记的抗原。

在一些实施例中，使用磁分离法分离具有膜结合受体的人B细胞。将细胞与标记抗原的混合物一起温育，使得标记的抗原与膜结合的免疫球蛋白受体结合。洗涤细胞并且可选地在将细胞与链霉亲和素-PE荧光团一起温育后对细胞进行FACS分选。在一些实施例中，随后将细胞单细胞分选到含有基于Triton的裂解混合物和具有5'扩增标签的多聚dt引物的平板中。在一些实施例中，用模板转换逆转录酶、模板转换引物和合适的缓冲液和dNTP混合物进行逆转录反应。用KAPA Hifi和对扩增标签和模板转换序列特异性的引物扩增具有条形码化的抗原的cDNA文库。在一些实施例中，通过PCR用含有针对感兴趣区域的孔特异性的条形码和3'引物的引物来扩增感兴趣的特定区域，例如重链和轻链CDR区和抗原条形码。在一些实施例中，这些片段用于产生用于高通量测序的测序文库。测序后，通过孔特异性条形码的识别、重链和轻链读段的序列组装以及识别具有抗原条形码的读段来对数据进行解卷积。

实例2.使用珠子的多重抗原文库测序

如实例1中所述制备与抗原结合的B细胞池。在一些实施例中，在抗原染色和洗涤后，用单分散液滴发生器分离细胞。在一些实施例中，液滴包括裂解/结合混合物，所述裂解/结合混合物在高盐/去污剂缓冲液和1-10个细胞中含有一个或多个条形码化的多聚dt捕获珠子(用包含5'扩增标签和3'多聚dT序列的DNA引物包被的珠子)。在一些实施例中，油相用于制备乳剂，其中油相是含有两亲氟/含水表面活性剂的全氟化碳。当细胞裂解时，它们的RNA被捕获在条形码化的多聚dt珠子上，条形码化的抗原DNA也是如此。在一些实施例中，乳剂在严格的结合条件下被破坏，例如用二氯甲烷和6X SSC缓冲液。将珠子混合物洗涤两次并重悬于逆转录酶反应中并温育。在一些实施例中，珠子(“模板珠子”)在用单分散液滴发生器产生的另一种水/油乳剂中分离，使得每个液滴在PCR混合物中具有约一个“模板珠子”。PCR混合物还包含一个或多个含有珠子的“预备”珠子，所述珠子用含有5'扩增标签和珠子特异性条形码的引物包被。在一些实施例中，引物具有3'多聚dA，一些具有3'抗原引物，一些具有3'重链反向引物，并且一些具有3'轻链反向引物。在一些实施例中，水相具有5'重链引物、5'轻链引物、5'抗原引物和来自多聚dT捕获珠子的5'扩增标签。Kapa Hifi是这种扩增的适合聚合酶。在一些实施例中，PCR之后破坏乳剂并产生高通量测序文库。测序后，与最后一轮PCR条形码相关的所有读段被分成池。然后，通过与多聚A/5'扩增标签相关的读段来识别细胞特异性的条形码。在一些实施例中，与含有相同细胞特异性条形码的珠子相关的所有读段被分组在一起。在一些实施例中，这些组用于提供序列或结合在一起的重链、轻链和抗原的识别。

实例3.使用5'5'引物的多重抗原文库测序

通过混合5'DBCO寡核苷酸和5'叠氮寡核苷酸来制备5'5'引物。在一些实施例中，DBCO和叠氮化物不需要位于组分寡核苷酸的精确5'末端，而是可能以仍允许3'末端进行PCR反应的方式放置。将结合的产物与未反应的组分寡核苷酸分离。在一些实施例中，使用这些5'5'引物而非珠子将读段连接至细胞特异性的条形码可能产量更高。在一些实施例中，反应使用含有5'5'连接的引物，其中3'末端之一含有多聚A，而另一个含有3'轻链、3'重链或3'抗原标签。在一些实施例中，反应混合物还含有5'重链、5'轻链和5'抗原以及具有5'磷酸基团的5'扩增标签引物。在一些实施例中，用单分散乳剂发生器产生乳剂，使得在具有dNTP等的合适缓冲液中每个液滴包含约1个“模板珠子”和5'5'引物混合物和KAPA hifi。乳剂PCR后，用二氯甲烷破坏乳剂，萃取水相并清洁。用具有连接酶的连接缓冲液重悬获得的DNA。在一些实施例中，用核酸外切酶处理连接后获得的DNA。在一些实施例中，将核酸外切酶处理后获得的混合物置于具有KAPA hifi的PCR中，用3'多聚A引物、3'重链引物和3'轻链引物进行20个循环。在一些实施例中，PCR产物用作模板以产生测序文库，该测序文库在高通量测序仪上测序。测序后，根据读段的细胞特异性条形码对读段进行分组，然后识别重链、轻链和抗原的读段。

实例4.通过PCR的多重基因特异性珠子文库

在一些实施例中，制备珠子文库，其中每个珠子具有含有珠子特异性条形码、分子特异性条形码和多个基因特异性引物的引物。在一些实施例中，首先用5'扩增引物序列包被MyOne羧酸盐磁珠(dynabead)。将珠子与在3'末端含有反向互补扩增序列的有限稀释度的DNA引物、包括12个N残基的独特分子条形码和12个碱基的适配子序列(例如M13测序引物序列)一起温育。在用该混合物温育珠子后，将珠子沉淀并洗涤，然后置于Klenow外聚合酶反应中。然后将珠子沉淀并洗涤。

在一些实施例中，将珠子重悬于含有聚合酶和可溶形式的反向互补适配子序列的PCR混合物中，并使用单分散液滴发生器置于油/水乳剂中。在液滴产生之后，将乳剂循环30x然后破坏。然后珠子与T7核酸外切酶反应。然后将珠子置于反应混合物中，所述反应混合物含有寡核苷酸，具有3'反向互补适配子序列，10碱基随机DNA序列和5'适配子2序列和klenow外聚合酶混合物。在一些实施例中，在该反应后，用T7核酸外切酶处理珠子。在可替换的实施例中，使用热而不是核酸酶来除去第二链。在一些实施例中，然后将珠子置于混合物中，所述混合物含有捕获引物，具有3'反向互补的适配子2，并且3'重链、3'轻链和3'抗原标签的5'反向互补物添加有klenow外聚合酶混合物。在一些实施例中，在该反应后，用T7外切核酸酶处理珠子。

实例5.利用连接的多重基因特异性珠子文库

在一些实施例中，制备珠子文库，其中每个珠子具有含有珠子特异性条形码、分子特异性条形码和多个基因特异性引物的引物。在一些实施例中，首先用具有5'氨基部分的5'扩增引物序列包被MyOne羧酸盐磁珠。然后将珠子与在3'末端含有反向互补扩增序列的有限稀释度的DNA引物、包含12个N残基的独特分子条形码和12个碱基的适配子序列(例如M13测序引物序列)一起温育。在用该混合物温育珠子后，用Klenow外切酶处理珠子。在一些实施例中，然后将珠子与可溶形式的反向互补适配子序列混合，并使用单分散液滴发生器置于油/水乳剂中。在液滴产生之后，将乳剂循环30x然后破坏。将珠子置于混合物中，所述混合物具有双链DNA序列，其中正向链含有5'磷酸、10碱基随机DNA序列和位于3'末端的3'重链引物、3'轻链引物或3'抗原标签引物。混合物还包含T4DNA连接酶。在该反应后，用T7外切核酸酶处理珠子。

实例6.用膜结合受体制备B细胞

在一些实施例中，增加细胞上的受体密度可能是有益的。在一些实施例中，通过与IL21、IL4和CD40L一起温育将原代B细胞转化为分泌抗体的浆细胞。用NHS-叠氮化物异双官能交联剂处理这些细胞。通过将蛋白质G与NHS-DBCO异双官能交联剂混合来制备蛋白质-GDBCO。用蛋白质-G DBCO和另外的蛋白质-G处理细胞，然后在微孔阵列中与缓冲液中的可溶性或固相蛋白质-G在空间上分离。将细胞离心或重力沉降到每个孔的底部。通过离心或重力将细胞从微孔中移出，并置于具有代谢抑制剂的溶液中，例如存在于许多常用的染色缓冲液中。在该处理后，细胞与抗原反应。

实例7.用水凝胶结合受体制备B细胞

在一些实施例中，进一步增加抗原结合细胞上的受体密度可能是有益的。在一些实施例中，通过与IL21、IL4和CD40L一起温育将原代B细胞转化为分泌抗体的浆细胞。用NHS-叠氮化物异双官能交联剂处理细胞，然后在微孔阵列中进行空间分离。用DBCO 4x树枝状聚合物PEG处理微孔中的细胞，然后用叠氮化物-叠氮化物同双官能的1kd PEG处理。在一些实施例中，将DBCO 4x树枝状聚合物PEG处理和同双官能叠氮化物-叠氮化物1kda PEG处理重复所需数量的轮次。DBCO/叠氮化物钉的这些额外循环产生额外的官能化位点和更大的水凝胶体积以获得更好的信号，直到产生所需量的官能化和/或水凝胶。在一些实施例中，通过将蛋白质G与NHS-DBCO异双官能交联剂混合来制备蛋白质-G DBCO。用带额外蛋白质-G的蛋白质-G DBCO处理嵌入水凝胶中的细胞。将细胞从微孔中取出并置于含有代谢抑制剂的溶液中，例如存在于许多常用的染色缓冲液中。细胞准备好与抗原反应。可替换地，将细胞/水凝胶混合物留在孔阵列中并用抗原原位染色。

实例8.用磁珠结合受体制备B细胞

在一些实施例中，通过与IL21、IL4和CD40L一起温育将原代B细胞转化为分泌抗体的浆细胞。用NHS-叠氮化物异双官能交联剂处理细胞并洗涤。

在一些实施例中，通过用EDC/磺基NHS活化磁性羧化珠并与蛋白质G反应来制备蛋白质-G珠。通过将蛋白质G珠与NHS-DBCO异双官能交联剂混合来制备蛋白质-G DBCO珠。细胞在微孔阵列中在空间上分开。将蛋白质G DBCO珠添加到每个孔中。在一些实施例中，还将可溶性叠氮化物PEG和可溶性蛋白质G加入孔中。在一些实施例中，通过磁分离、离心或重力从微孔中除去具有抗体的珠子，并将其置于具有代谢抑制剂的溶液中，所述代谢抑制剂例如存在于许多常用的染色缓冲液中。然后使抗体珠与抗原反应。可替换地，将细胞/珠子混合物留在孔阵列中并用抗原原位染色。

实例9.使用5'5'引物的多重ScFv产生

在一些实施例中，如上文所述由个体细胞制备的cDNA在微孔阵列或乳剂中从含有连接的5'5'引物文库的混合物中分离，其中一侧对重链可变序列的5'编码框是特异性的，并且一侧对轻链可变序列的3'编码框是特异性的。另外，PCR混合物包含Kapa Hifi聚合酶以及轻链5'可变区和重链3'可变区的引物文库。将从反应中获得的DNA与T4连接酶连接，然后用核酸外切酶处理。将该混合物置于具有KAPAhifi的PCR中，用3'重链引物文库和5'轻链引物文库进行20个循环。PCR后，将该物质克隆到合适的表达载体中，用于产生含有ScFv片段的蛋白质。可替换地或另外，组合的ScFv DNA文库用于制备用于高通量测序的测序文库。

实例10.用于捕获单个珠子或细胞的微图案化表面

在一些实施例中，在用AZ4620正性抗蚀剂旋涂之前清洁玻璃表面。在一些实施例中，表面用铬掩模以暴露1μm斑点50μm中心到中心的方式进行图案化。在一些实施例中，对抗蚀剂进行显影并用APTES将表面硅烷化，然后用NHS-PEG-叠氮化物处理。在一些实施例中，用丙酮和DMSO剥离抗蚀剂，然后用与氟代辛基三乙氧基硅烷混合的10kd PEG-硅烷对表面进行处理以钝化表面。改变PEG-硅烷与氟代辛基硅烷的比例将产生具有不同质量的钝化表面。在一些实施例中，比例为1：1000PEG-硅烷：氟代辛基硅烷，以使表面在非细胞捕获位置处略微疏水，而不会促成细胞蛋白质与钝化表面的非特异性相互作用。在一些实施例中，用NHS DBCO对细胞或珠子进行官能化，洗涤并通过移液管或注射泵在含有2％BSA、1mMEDTA和25mM HEPES的结合缓冲液中引入到阵列表面，并在温和搅拌或流体流动下温育。然后洗涤阵列。

实例11.特定细胞类型的微图案化表面捕获

在一些实施例中，来自实例10的微图案化阵列用于捕获展示特异性表面标志物的细胞，例如人类B细胞。在一些实施例中，将含有DBCO部分的抗CD19抗体(用DBCO-NHS功能化的抗体)加入到合适的染色缓冲液(例如PBS-BSA)中的外周血单核细胞的混合物中，洗涤并引入到合适的结合缓冲液中的阵列表面，并允许在温和搅拌或流体流动下温育。然后洗涤阵列并将捕获的B细胞包含在阵列中。

实例12.将细胞从微图案化表面转移到微孔以进行后续反应

可以对实例10-11进行修饰以在空间上分离细胞或珠子周围的缓冲液以进行另外的反应。在一些实施例中，由PDMS制备的微孔阵列(孔的尺寸30μmx30μmx100μm 50μm中心至中心深度)被预先填充有含有多聚dT珠和弱裂解/结合混合物的混合物(例如，含有LiCl和去污剂如1％Triton或0.5％Tween-20的混合物)。将该微孔阵列置抵来自实例10-12的微图案化细胞阵列，以便将1个细胞登记到阵列中的1个孔。裂解发生在微孔中，并且mRNA被捕获在多聚dT珠上。

实例13.将珠子从微图案化表面转移到微孔以进行后续反应

在本实施例中，如实例12中那样，将含有来自单个细胞的cDNA文库和条形码化的抗原标签的珠子转移到微孔阵列中。在一些实施例中，预先填充由PDMS制成的微孔阵列，其具有的孔尺寸30μmx30μmx100μm 50μm中心至中心深度，含有PCR混合物，所述PCR混合物包含用于扩增例如实例2和3中的特定目标分子的引物。PCR反应在微孔阵列中发生。

实例14.用于捕获细胞表面上的抗体的单个细胞的空间限制

在一些实施例中，结合单个细胞(展示抗体的细胞)用于其表面上的后续捕获。在本实施例中，细胞被捕获在类似于实例10-12的微图案化表面上。在一些实施例中，用NHS-PEG-脱硫生物素衍生化微图案化表面的斑点，并且在用PEG-硅烷处理后，在细胞结合缓冲液中用含有链霉亲和素的溶液处理表面。在引入到阵列之前，用NHS-PEG-脱硫生物素和NHS-PEG-叠氮化物使细胞功能化。因此，细胞和表面之间的连接通过脱硫生物素-链霉亲和素-脱硫生物素相互作用进行。在一些实施例中，登记含有蛋白质G-DBCO的混合物的微孔阵列并将其置抵细胞阵列以在空间上隔开每个细胞以捕获从细胞分泌到其表面的抗体。温育后，除去微孔阵列，用含有游离蛋白质G和代谢抑制剂的溶液洗涤细胞。可以用抗原对细胞进行原位染色并通过引入生物素释放，或通过引入生物素释放并然后如先前实例中所述随后用抗原染色。

实例15.将细胞或珠子从微图案化表面转移到微孔阵列

在一些实施例中，修饰实例14以将细胞以配准方式转移至微孔阵列用于后续反应。在本实例中，将细胞转移至微孔阵列。微孔阵列装载含有生物素的溶液。在将微孔阵列配准/放置到微图案化表面后，由于生物素对脱硫生物素的置换，细胞从表面释放。可以通过离心或其他方式将细胞移动到孔阵列的底部。可以重复本步骤以类似方式加载额外的细胞或珠子，以便将精确数量的细胞或珠子添加到微孔阵列中的每个位置。

实例16.一步精确配准单个珠子和单个细胞

在一些实施例中，具有约400nM特征的微图案化表面用于捕获尺寸为lμm的珠子。这类似于实例10，在表面上使用PEG-叠氮化物以在珠子上捕获PEG-DBCO。在一些实施例中，添加已经用PEG-叠氮化物功能化的细胞。由于珠子尺寸远小于细胞直径，因此每个珠子捕获大约一个细胞，所述珠子被微图案化表面捕获。以这种方式，在配准的网格上精确的一个珠子对一个细胞的比率是可能的，其可以用于随后的检查/处理。在本实例中，珠子也用条形码化的多聚dT捕获探针功能化，用于在受限空间中裂解单个细胞后的mRNA捕获，例如在实例13中。如实例2中那样，珠子/细胞组合也可被释放以置于乳剂中。

本说明书中引用的所有出版物和专利均在此被援引加入本文，如同每篇单独的出版物或专利被具体地和单独地指出被援引加入本文，并且通过被援引加入本文以公开和描述与所引用的出版物相关的方法和/或材料。

本领域技术人员将认识到或能够确定使用不超过常规的实验，许多等同于本文所述的本发明的具体实施例。所述等同情况旨在由所附权利要求书涵盖。

Claims (29)

1.一种用于制备核酸的方法，包括步骤：

提供多个宿主细胞，其中宿主细胞包括编码多聚免疫结合蛋白的多条多肽链的核酸，并且其中宿主细胞表达可结合抗原的免疫结合蛋白；

将多个宿主细胞暴露于多个抗原，其中每个抗原具有识别抗原的独特条形码，并且其中每个抗原单独暴露于宿主细胞；

识别与宿主细胞结合的抗原；

向结合了抗原的宿主细胞添加第一引物组、第二引物组、第三引物组、多个dNTP和聚合酶；

其中第一引物组包括正向引物和反向引物，其中第一引物组的引物之一具有编码免疫结合蛋白的第二多肽链的核酸的重叠延伸区，另一引物具有编码条形码的核酸的重叠延伸区，其中第一引物组扩增编码多聚免疫结合蛋白的第一多肽链的核酸；

其中第二引物组包括正向引物和反向引物，其中第二引物组的引物之一具有编码第一多肽链的核酸的重叠延伸区，其中第二引物组扩增编码免疫结合蛋白的第二多肽链的核酸；

其中第三引物组包括正向引物和反向引物，其中第三引物组的引物之一具有编码第一多肽链的核酸的重叠延伸区，其中第三引物组扩增编码条形码的核酸；

使第一引物组、第二引物组、第三引物组、dNTP、聚合酶、条形码、编码多聚免疫结合蛋白的核酸和抗原与条形码反应，从而获得编码第一免疫多肽链、第二免疫多肽链和条形码的单个核酸。

2.根据权利要求1所述的方法，其中多聚免疫结合蛋白是抗体。

3.根据权利要求1所述的方法，其中多聚免疫结合蛋白是T细胞受体。

4.根据权利要求1所述的方法，其中细胞在乳剂中。

5.一种用于制备一组核酸的方法，包括步骤：

提供多个宿主细胞，其中宿主细胞包括编码多聚免疫结合蛋白的多条多肽链的核酸，并且其中宿主细胞表达可以结合抗原的免疫结合蛋白；

将多个宿主细胞暴露于多个抗原，其中每个抗原具有识别抗原的独特条形码，并且其中每个抗原暴露于宿主细胞；

识别与宿主细胞结合的抗原；

向结合了抗原的宿主细胞添加第一引物组、第二引物组、第三引物组、多个dNTP和聚合酶；

其中第一引物组包括正向引物和反向引物，其中第一引物组的引物之一具有独特的核酸条形码，并且其中所述引物组扩增编码多聚免疫结合蛋白的第一多肽链的核酸；

其中第二引物组包括正向引物和反向引物，其中第二引物组的引物之一具有相同的核酸条形码，并且其中所述引物组扩增编码多聚免疫结合蛋白的第二多肽链的核酸；

其中第三引物组包括正向引物和反向引物，其中第三引物组的引物之一具有相同的核酸条形码，并且其中所述引物组扩增编码抗原条形码的核酸；

使第一引物组、第二引物组、第三引物组、dNTP、聚合酶、编码多聚免疫结合蛋白的核酸和抗原与抗原条形码反应，从而获得一组核酸，所述核酸编码核酸条形码与第一免疫多肽链、第二免疫多肽链和抗原条形码的每一个。

6.根据权利要求5所述的方法，其中包含核酸条形码的引物被附着在珠上。

7.根据权利要求5所述的方法，其中细胞在孔中。

8.根据权利要求5所述的方法，其中细胞在乳剂中。

9.根据权利要求5所述的方法，其中多个细胞在由表面张力保持到表面的多个液滴的阵列中。

10.根据权利要求5所述的方法，其中多个细胞通过水凝胶的方式在空间上分离。

11.根据权利要求5所述的方法，其中多聚免疫结合蛋白是抗体。

12.根据权利要求5所述的方法，其中多聚免疫结合蛋白是T细胞受体。

13.一种用于制备连接的核酸对的方法，包括步骤：

提供多个宿主细胞，其中宿主细胞包括编码多聚免疫结合蛋白的多条多肽链的核酸；

向宿主细胞添加连接的引物对、第二引物、第三引物、多个dNTP和聚合酶；

其中连接的引物对包括结合编码多聚免疫结合蛋白的第一多肽链的核酸的一个引物和结合编码多聚免疫结合蛋白的第二多肽链的核酸的第二引物，其中第二引物当与连接的引物对中的第一引物偶联时扩增多聚免疫结合蛋白的第一多肽链；

其中第三引物当与连接的引物对中的第一引物偶联时扩增多聚体免疫结合蛋白的第二多肽链；

使连接的引物对、第二引物、第三引物、dNTP和聚合酶反应，从而获得编码第一免疫多肽链和第二免疫多肽链的连接的核酸对。

14.根据权利要求13所述的方法，其中连接的引物对是化学键合的。

15.根据权利要求14所述的方法，其中连接通过表面发生。

16.根据权利要求13所述的方法，其中连接的引物对是物理键合的。

17.根据权利要求16所述的方法，其中连接通过表面发生。

18.根据权利要求13所述的方法，其中细胞在孔中。

19.根据权利要求13所述的方法，其中细胞在乳剂中。

20.根据权利要求13所述的方法，其中多个细胞在由表面张力保持到表面的多个液滴的阵列中。

21.根据权利要求13所述的方法，其中多个细胞通过水凝胶的方式在空间上分离。

22.一种核酸，所述核酸包括编码多聚免疫结合蛋白的第一链的多核苷酸、编码多聚免疫结合蛋白的第二链的多核苷酸和编码条形码的多核苷酸，其中多聚免疫结合蛋白的第一链与多聚免疫结合蛋白的第二链配对以形成在宿主细胞中发现的免疫结合蛋白，其中多聚免疫结合蛋白从宿主细胞中衍生出，并且其中条形码识别免疫结合蛋白所结合的抗原。

23.根据权利要求22所述的核酸，其中第一链编码抗体重链，而第二链编码抗体轻链。

24.根据权利要求22所述的核酸，其中第一链编码T细胞受体的第一链，并且第二链编码T细胞受体的第二链。

25.一种连接的核酸引物对，包括多核苷酸引物，其中两个引物在聚合酶反应中在不同的结合位点反应。

26.根据权利要求25所述的连接的核酸引物对，其中第一引物结合抗体重链核酸序列，而第二引物结合轻链核酸序列。

27.根据权利要求25所述的连接的核酸引物对，其中第一引物结合T细胞受体重链核酸序列，而第二引物结合T细胞受体轻链核酸序列。

28.根据权利要求25所述的连接的核酸引物对，其中第一引物结合抗体重链核酸序列，而第二引物结合包含核酸条形码的多核苷酸序列。

29.根据权利要求25所述的连接的核酸引物对，其中第一和第二引物通过化学键结合。