CN110215541A - 一种管状细菌纳米纤维素/鱼源明胶复合材料及其制备方法和人工血管应用 - Google Patents

一种管状细菌纳米纤维素/鱼源明胶复合材料及其制备方法和人工血管应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种管状细菌纳米纤维素/鱼源明胶复合材料及其制备方法和人工血管应用，将鱼源明胶均匀扩散进细菌纳米纤维素内部网络并交联而得，有望更好地应用于人工血管中。本发明具备优异的血液相容性和细胞相容性，鱼源明胶富含的‑NH、‑OH、‑COOH等多种官能团有利于通过EDC/NHS反应接枝肝素，进一步提高复合材料的抗凝血性。

Description

一种管状细菌纳米纤维素/鱼源明胶复合材料及其制备方法 和人工血管应用
技术领域
本发明属于生物复合材料领域，特别涉及一种管状细菌纳米纤维素/鱼源明胶复合材料及其制备方法和人工血管应用。
背景技术
心血管疾病的发病率、致残率和死亡率均逐年升高，对人类身体健康造成很大影响。数据显示，仅美国心血管患病总人数就多达3.1亿，仅2012年心血管疾病就导致欧洲430多万人死亡。心血管病已超过肿瘤成为致死率最高的疾病。治疗该疾病的有效手段是血管移植，但由于自体血管的短缺、副作用明显等原因，人工血管需求巨大。目前，膨体聚四氟乙烯和涤纶聚酯已成功用于替换大口径血管。但对于小口径血管(直径<6mm)来说，这些材料由于顺应性差，易形成血栓和引起内膜增生，往往导致移植物闭塞，远期通畅率低。此外，由于异物反应这些材料的移植可能还会出现晚期并发症。目前国内临床使用的大口径人工血管被进口产品垄断，而小口径人工血管尤其是<6mm的小径血管在全球市场仍处于空白。随着心脏搭桥年手术量的日益增长，人工血管产品的市场容量巨大。据报道，2014年在中国仅冠脉搭桥术的数量约为4.2万例，病人平均需使用3根小口径血管，市场需求约为12.6万根。因此，近几年来研究者越来越关注小口径人工血管的研究。
细菌纳米纤维素(bacterial nanocellulose，BNC)也称作细菌纤维素(bacterialcellulose，BC)，是由细菌经过培育产生的天然纤维素高聚物，它具有纳米纤维结构(10-100nm)、高持水性、高纯度、生物可降解性以及良好的生物相容性。在医用材料中BNC已被成功用于人造皮肤的临时替代品和伤口敷料，该材料在小口径人工血管上的应用潜力已得到广泛关注。但纯的BNC管直接作为小径人工血管时，不能快速内皮化，在血液长期畅通性方面尚存在不足，需对其进一步改性以满足临床要求。
明胶(gelatin，Gel)通常是由动物皮肤、肌膜、肌腱、骨头等组织中所含的胶原经部分降解而来，其本质是一种变性的胶原，通常由多种分子量在几万到几十万之间蛋白质组成。从分子结构上来看，构成明胶的氨基酸多达18种，这些氨基酸侧链的-NH、-OH、-COOH等多种官能团在维持其理化活性方面具有重要作用。成品明胶中，蛋白成分含量超过82％，水和无机盐等其它组分约占16％。因此，作为一种天然的高分子材料，明胶具有优良的可修饰性和生物相容性。对于一些宗教来说，如伊斯兰教、清真教和犹太教，普通的猪源明胶以及不遵照教规屠宰的牛源明胶无法得到他们的认可与使用，更无法在其国家进行推广销售。由于出现越来越多的关于牛、猪等禽类的发生疫病的消息，导致生产明胶的原料越来越少。鱼源明胶主要是以深层冷水鱼如绿鳍、蟾鱼、黑线鳍等的皮骨为原料提取，不仅在很大程度上避免了资源的浪费和环境污染，且无宗教的限制。
由于细菌纳米纤维素在小径人工血管的生物相容性上还有所欠缺，所以通常对其表面进行复合改性研究，这也是提高人工血管材料的生物相容性，减少血栓，防止血管闭塞的有效方法。常见的改性材料包括胶原、肝素和白蛋白等，但它们相对价格高昂，提高了生产成本。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种管状细菌纳米纤维素/鱼源明胶复合材料及其制备方法和人工血管应用，该复合材料具备优异的血液相容性和细胞相容性，鱼源明胶富含的-NH、-OH、-COOH等多种官能团有利于通过EDC/NHS反应接枝肝素，进一步提高复合材料的抗凝血性。
本发明提供了一种管状细菌纳米纤维素/鱼源明胶复合材料，使鱼源明胶均匀进入细菌纳米纤维素内部网络并交联而得。
所述复合材料中的纳米纤维直径为10-100nm。
所述复合材料管壁上接枝肝素，得到肝素化的复合材料。即通过EDC/NHS反应体系，在BNC/Gel复合管壁上接枝肝素，得到肝素化的BNC/Gel/Hep复合管。
本发明还提供了一种管状细菌纳米纤维素/鱼源明胶复合材料的制备方法，包括：
(1)通过发酵培养得到管状细菌纳米纤维素材料，纯化后得到纯BNC管；
(2)利用振荡浸渍或者压力注射的方法将鱼源明胶溶液均匀扩散进入纯BNC管的内部网络，交联制得BNC/Gel复合管。
所述步骤(2)中的振荡浸渍的工艺参数为：温度20-35℃，转速100-200rpm，时间24-48h。
所述步骤(2)中的压力注射的工艺参数为：以0.01-0.1MPa的压力缓慢均匀地向管腔内注入明胶溶液，保持1-5min。
所述步骤(2)中的鱼源明胶溶液的浓度0.1％-20％。
所述步骤(2)中的交联采用戊二醛或者京尼平溶液作为交联剂；戊二醛溶液的浓度为0.5％-5.0％。
所述步骤(2)中的交联的工艺参数为：在4-35℃的条件下静置2-8h。
本发明还提供了一种管状细菌纳米纤维素/鱼源明胶复合材料的应用，所述复合材料应用于人工血管。
本发明采用的鱼源明胶不仅具备优异的生物相容性，而且价格便宜，性能稳定，且使用范围无限制，与BNC管复合后达到了良好的血液相容性及细胞相容性的效果。此外，鱼源明胶富含的-NH、-OH、-COOH等多种官能团有利于接枝肝素，进一步提高复合材料的抗凝血性。
有益效果
(1)本发明制备的BNC/明胶复合管具备优异的细胞相容性，鱼源明胶的复合有利于内皮细胞的增殖和铺展，可实现人工血管快速内皮化，提高长期畅通性。
(2)本发明制备的BNC/明胶复合管，明胶在BNC基质中分布均匀，具有很好的血液相容性，所复合的鱼源明胶富含的-NH、-OH、-COOH等多种官能团有利于通过EDC/NHS反应接枝肝素，进一步提高复合材料的抗凝血性。
附图说明
图1是发酵培育出来的BNC管(A)及BNC/Gel复合管(B)(鱼源明胶溶液浓度为2.0％w/v)的宏观图；
图2是经考马斯亮蓝G250染色后的BNC管(a)及BNC/Gel(鱼源明胶溶液浓度分别为0.25％w/v(b)、0.5％w/v(c)、1.0％w/v(d)和2.0％w/v(e))复合管的宏观图；
图3是BNC管及BNC/Gel复合管的内表面SEM微观图(鱼源明胶溶液浓度为2.0％w/v)；
图4是BNC管及BNC/Gel复合管内表面的血浆复钙时间对比图；
图5是HUVECs在BNC管、BNC/Gel复合管及BNC/壳聚糖复合管内壁的SEM图。
图6是纯BNC管与复合管的甲苯胺蓝染色后的宏观形貌；其中，a：BNC管，b：BNC/Gel，c：BNC/Hep，d：BNC/Gel/Hep。
图7是BNC管及其复合管的血小板黏附SEM图；其中，a：BNC管，b：BNC/Gel，c：BNC/Hep，d：BNC/Gel/Hep。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
(1)配制100mL的液体培养基(100g/L果糖，5g/L蛋白胨，3g/L酵母粉)，置于250mL的三角瓶中，115℃高温高压灭菌30min后，冷却至室温，接种Komagataeibacter xylinusATCC23770、DHU-ATCC-1菌种，30℃，100rpm振荡培养24h，得到菌种活力旺盛的发酵液。
(2)准备长12mm，直径3mm的玻璃棒，长12mm，内径8mm，壁厚0.5mm的硅胶管，和2个大小头的圆柱形空心硅胶塞子，大头的直径为10mm，小头的直径为5mm，空心直径为3mm。洗净，烘干，将玻璃棒和硅胶管同轴套于硅胶管管腔内，玻璃棒和硅胶管之间形成中空圆柱形空腔，硅胶管的开口处通过圆柱形空心硅胶塞子和玻璃棒密封，装置在121℃高温高压灭菌20min，在烘箱内烘干，置于超净工作台内冷却备用。
(3)在超净工作台将步骤(1)中发酵液接种到步骤(2)中装置的中空圆柱形空腔中，调整装置，使玻璃棒位于硅胶管的正中央并保持同轴平行，将其置于充满空气或者氧气的环境中，30℃静置培养7天，培养过程中，菌体聚集在靠近外硅胶管的一侧，不断生成BNC，最后充满整个管腔。将BNC管从装置中取出并用1％的NaOH溶液80℃碱煮4小时，然后用超纯水反复清洗，直至中性，最后得到纯化后的BNC管，如图1A所示。
(4)将纯化好的长约50mm(内径×外径：3×8mm)BNC管加入到不同浓度的鱼源明胶溶液中，然后在160rpm，30℃的恒温摇床里振荡24h，之后，取出样品放于1.0％的戊二醛溶液中充分浸泡6h，最后用蒸馏水冲洗直至洗掉残留的戊二醛，得到BNC/Gel复合管，如图1B所示。
实施例2
(1)配制100mL的液体培养基(100g/L果糖，5g/L蛋白胨，3g/L酵母粉)，置于250mL的三角瓶中，115℃高温高压灭菌30min后，冷却至室温，接种DHU-ATCC-1菌种，30℃，100rpm震荡培养24h，得到菌种活力旺盛的发酵液。
(2)准备长12mm，外径3mm，壁厚0.5mm的内硅胶管，长12mm，内径8mm，壁厚0.5mm的外硅胶管，和2个大小头的圆柱形空心硅胶塞子，大头的直径为10mm，小头的直径为5mm，空心直径为3mm。洗净，烘干，将内硅胶管和外硅胶管同轴套于外硅胶管管腔内，内硅胶管和外硅胶管之间形成中空圆柱形空腔，外硅胶管的开口处通过圆柱形空心硅胶塞子和玻璃棒密封，装置在121℃高温高压灭菌20min，在烘箱内烘干，置于超净工作台内冷却备用。
(3)在超净工作台将步骤(1)中发酵液接种到步骤(2)中装置的中空圆柱形空腔中，调整装置，使内硅胶管位于外硅胶管的正中央并保持同轴平行，将其置于充满空气或者氧气的环境中，30℃静置培养7天，培养过程中，菌体聚集，不断生成BNC，最后充满整个管腔。将BNC管从装置中取出并用1％的NaOH溶液80℃碱煮4小时，然后用超纯水反复清洗，直至中性，最后得到纯化后的BNC管。
(4)将纯化好的长约50mm(内径×外径：3×8mm)BNC管加入到不同浓度的鱼源明胶溶液中，然后在160rpm，30℃的恒温摇床里振荡24h，之后，取出样品放于1.0％的戊二醛溶液中充分浸泡6h，最后用蒸馏水冲洗直至洗掉残留的戊二醛，得到BNC/Gel复合管。
(5)为了测定细菌纳米纤维素/明胶(BNC/Gel)管中鱼源明胶的分布情况，分别截取了30mm纯BNC管和4种浓度的BNC/Gel复合管放入考马斯亮蓝(Coomassie BrilliantBlue)G 250溶液，并将其放入160r/min，30℃的恒温摇床中振荡24h；用去离子水反复冲洗所有样品，直至纯BNC管上附着的蓝色完全褪去(所有样品相同处理条件)，得到如图2所示的染色图。进一步通过扫描电子显微镜观察BNC管与BNC/Gel复合管的纤维微观结构，结果如图3所示，从结果可以看出，复合管的纤维网络明显比BNC管的纤维致密，有明胶的沉积。
实施例3
(1)配制100mL的液体培养基(100g/L果糖，5g/L蛋白胨，3g/L酵母粉)，置于250mL的三角瓶中，115℃高温高压灭菌30min后，冷却至室温，接种DHU-ATCC-1菌种，30℃，100rpm震荡培养24h，得到菌种活力旺盛的发酵液。
(2)准备长12mm，直径3mm的玻璃棒，长12mm，内径8mm，壁厚0.5mm的硅胶管，和2个大小头的圆柱形空心硅胶塞子，大头的直径为10mm，小头的直径为5mm，空心直径为3mm。洗净，烘干，将玻璃棒和硅胶管同轴套于硅胶管管腔内，玻璃棒和硅胶管之间形成中空圆柱形空腔，硅胶管的开口处通过圆柱形空心硅胶塞子和玻璃棒密封，装置在121℃高温高压灭菌20min，在烘箱内烘干，置于超净工作台内冷却备用。
(3)在超净工作台将步骤(1)中发酵液接种到步骤(2)中装置的中空圆柱形空腔中，调整装置，使玻璃棒位于硅胶管的正中央并保持同轴平行，将其置于充满空气或者氧气的环境中，30℃静置培养7天，培养过程中，菌体聚集在靠近外硅胶管的一侧，不断生成BNC，最后充满整个管腔。将BNC管从装置中取出并用1％的NaOH溶液80℃碱煮4小时，然后用超纯水反复清洗，直至中性，最后得到纯化后的BNC管。
(4)将纯化好的长约50mm(内径×外径：3×8mm)BNC管加入到不同浓度的鱼源明胶溶液中，然后在160rpm，30℃的恒温摇床里振荡24h，之后，取出样品放于1.0％的戊二醛溶液中充分浸泡6h，最后用蒸馏水冲洗直至洗掉残留的戊二醛，得到BNC/Gel复合管。
图4是BNC管与复合了0.25％、0.5％、1％和2％鱼源明胶BNC管，结果表明了复合管的血浆复钙时间明显高于BNC管的血浆复钙时间，说明BNC/Gel复合管的血液相容性优于BNC管。
将BNC/Gel复合管(1％的明胶溶液复合得到的复合管)、BNC管及BNC/壳聚糖复合管剪成1cm×1cm的形状，平铺在24孔板的底部，每孔种入1万人脐静脉内皮细胞(HUVECs)，培养24小时后，经过固定，冻干后，扫描电镜观察细胞形貌，结果如图5所示，BNC/Gel复合管上粘附的内皮细胞(HUVECs)数量比纯BNC管的明显要多，细胞形态也更为铺展，说明BNC/Gel复合管的细胞相容性优于BNC管，而BNC/壳聚糖表面的细胞数量比纯BNC明显更少，说明壳聚糖有一定细胞抑制性。该结果也说明复合明胶，比复合壳聚糖更有利于HUVECs的增殖，从而有利于人工血管的内皮化。
实施例4
(1)配制100mL的液体培养基(100g/L果糖，5g/L蛋白胨，3g/L酵母粉)，置于250mL的三角瓶中，115℃高温高压灭菌30min后，冷却至室温，接种DHU-ATCC-1菌种，30℃，100rpm震荡培养24h，得到菌种活力旺盛的发酵液。
(2)准备长12mm，外径3mm，壁厚0.5mm的内硅胶管，长12mm，内径8mm，壁厚0.5mm的外硅胶管，和2个大小头的圆柱形空心硅胶塞子，大头的直径为10mm，小头的直径为5mm，空心直径为3mm。洗净，烘干，将内硅胶管和外硅胶管同轴套于外硅胶管管腔内，内硅胶管和外硅胶管之间形成中空圆柱形空腔，外硅胶管的开口处通过圆柱形空心硅胶塞子和玻璃棒密封，装置在121℃高压灭菌20min，在烘箱内烘干，置于超净工作台内冷却备用。
(3)在超净工作台将步骤(1)中发酵液接种到步骤(2)中装置的中空圆柱形空腔中，调整装置，使内硅胶管位于外硅胶管的正中央并保持同轴平行，将其置于充满空气或者氧气的环境中，30℃静置培养7天，培养过程中，菌体聚集，不断生成BNC，最后充满整个管腔。将BNC管从装置中取出并用1％的NaOH溶液80℃碱煮4小时，然后用超纯水反复清洗，直至中性，最后得到纯化后的BNC管。
(4)将纯化好的长约50mm(内径×外径：3×8mm)BNC管加入到不同浓度的鱼源明胶溶液中，然后在160rpm，30℃的恒温摇床里振荡24h，之后，取出样品放于1.0％的戊二醛溶液中充分浸泡6h，最后用蒸馏水冲洗直至洗掉残留的戊二醛，得到BNC/Gel复合管。
(5)通过EDC/NHS体系在BNC/Gel复合管上接枝肝素(Hep)，得到BNC/Gel/Hep复合管。
甲苯胺蓝染色结果如图6所示，c和d管被均匀染上蓝色，表明在纯BNC管与BNC/Gel复合管上成功接枝了肝素，且肝素在管中分布均匀。
由图7可以看出BNC/Hep和BNC/Gel/Hep复合管上的血小板数量更少，说明了接枝肝素的BNC管能够抑制血小板黏附，提高了材料的抗凝血性。
实施例5
(1)按照实施例1中的步骤(1)(2)(3)得到纯化后的内径为3mm，长度大约为120mm的BNC管。
(2)将步骤(1)得到的纯化后的BNC管剪短，套于外径为3mm，长50mm的聚四氟乙烯管上，进行水分蒸发干燥，鼓风干燥至恒重，取下聚四氟乙烯管，得到管壁极薄的干的BNC管。
(3)将(1)中的湿BNC管或者步骤(2)获得的干的BNC管的一端连接在压力表上，另一端连接在注射器上，注射器内有1％(w/v)的明胶溶液，以0.01-0.1MPa的压力缓慢均匀地向管腔内注入1％的明胶溶液，1min后，干BNC管吸收明胶溶液膨胀，管壁厚度增加，取下复合管即得BNC/明胶半互穿双网络复合管。
在该半互穿复合管的内腔插入聚四氟乙烯管，置于1％(v/v)的戊二醛或者京尼平水溶液中静置交联12h，然后用超纯水反复冲洗，去除多余的交联剂溶液和游离的明胶，得到BNC/明胶互穿网络复合管(BNC/Gel复合管)。
本实施例得到的BNC/Gel两种复合管(半互穿和互穿网络复合管)，明胶均匀地分布在纤维网络内部，有利于蛋白质的吸附及细胞的吸附及生长，具有显著优异的细胞相容性。这种BNC/明胶复合管制备方法，明胶快速高效地进入到纤维网络内部后，分布均匀，具有高的制备效率。
实施例6
(1)按照实施例5种的(1)(2)(3)得到BNC/Gel复合管。
(2)通过EDC/NHS体系在BNC/Gel复合管上接枝肝素(Hep)，得到BNC/Gel/Hep复合管。
本实施例得到的BNC/Gel/Hep复合管，大量的肝素接枝在复合管上，其接枝的肝素量明显多于BNC/Hep复合管上的肝素，具有更优的抗凝血效果。

Claims (10)

1.一种管状细菌纳米纤维素/鱼源明胶复合材料，其特征在于：使鱼源明胶均匀进入细菌纳米纤维素内部网络并交联而得。
2.根据权利要求1所述的一种管状细菌纳米纤维素/鱼源明胶复合材料，其特征在于：所述复合材料中的纳米纤维直径为10-100nm。
3.根据权利要求1所述的一种管状细菌纳米纤维素/鱼源明胶复合材料，其特征在于：所述复合材料管壁上接枝肝素，得到肝素化的复合材料。
4.一种管状细菌纳米纤维素/鱼源明胶复合材料的制备方法，包括：
(1)通过发酵培养得到管状细菌纳米纤维素材料，纯化后得到纯BNC管；
(2)利用振荡浸渍或者压力注射的方法将鱼源明胶溶液均匀扩散进入纯BNC管的内部网络，交联制得BNC/Gel复合管。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中的振荡浸渍的工艺参数为：温度20-35℃，转速100-200rpm，时间24-48h。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中的压力注射的工艺参数为：以0.01-0.1MPa的压力缓慢均匀地向管腔内注入明胶溶液，保持1-5min。
7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中的鱼源明胶溶液的浓度0.1％-20％。
8.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中的交联采用戊二醛或者京尼平溶液作为交联剂；戊二醛溶液的浓度为0.5％-5.0％。
9.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中的交联的工艺参数为：在4-35℃的条件下静置2-8h。
10.一种如权利要求1或3所述的管状细菌纳米纤维素/鱼源明胶复合材料的应用，其特征在于：所述复合材料应用于人工血管。
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