CN110214273B - 使用嗅觉受体的筛选方法和使用这种方法鉴定的新化合物 - Google Patents

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Abstract

本公开的主题涉及筛选原料和宠物食品以制造适口的宠物食品的方法。本公开的主题还涉及鉴定调节嗅觉受体活性和/或表达的化合物的方法。

Description

使用嗅觉受体的筛选方法和使用这种方法鉴定的新化合物
相关申请的交叉引用
本申请要求于2016年9月30日提交的美国临时申请第62/402,823号的优先权，其内容通过引用整体并入，并且要求其优先权。
序列表
本申请包含序列表，该序列表已经以ASCII格式电子提交，并且其全部内容通过引用并入本文。所述ASCII拷贝在2017年9月7日创建，命名为069269_0225_SL.txt，大小为7,123,619字节。
技术领域
本公开的主题涉及嗅觉受体(olfactory receptor，OR)用于鉴定嗅觉调节剂的用途。本公开的主题还涉及嗅觉受体用于筛选制备宠物食品的原料的用途以及筛选存在嗅觉调节化合物的成品宠物食品的用途。
背景技术
可食用组合物的嗅觉谱(olfactory profile)可以通过一组心理物理叙述语来表征，诸如，例如，水果味、花香味、蜂蜜味、脂肪味、薄荷味和金属味中的一种或多种。在某些实施方案中，不同添味剂(odorant)的组合可以被感知为新的气味对象。引起这些气味感觉的化合物通常被称为添味剂(odorant)。不受理论的束缚，假设气味由鼻腔和咽喉中的嗅觉受体感知，所述嗅觉受体将信号传递到大脑，在大脑中记录了添味剂和所产生的嗅觉谱。嗅觉受体包含一大类G蛋白偶联受体(GPCR)，其检测与气味感官知觉相关的化合物。
宠物食品制造商长期以来一直希望提供具有高营养价值的宠物食品。此外，特别是猫和狗的食品，宠物食品制造商希望获得高度适口性，使得宠物可以从它们的食物中获得全营养益处。众所周知，家养动物(Domestic animal)在它们的食物偏好方面是挑剔的，并经常随着时间拒绝食用它已经接受的宠物食品或者拒绝食用任何多于最少量的宠物食品。这种现象可能部分地是由于原料的感官特征的细微差异，由于它们的味觉和嗅觉系统，这些微妙差异可以被家养动物所感知。因此，宠物主人经常更换宠物食品的类型和品牌，以便使他们的宠物保持健康和满意的状态。
虽然气味和风味技术近来有所进展，但是仍需要筛选用于制造宠物食品的原料的方法和用于筛选成品宠物食品的方法以确保最适口的产品，以及使用制造宠物食品的方法。还需要通过增强或改变宠物食品的气味谱(odor profile)、质地谱(texture profile)和/或风味谱(flavor profile)来增强或改变宠物食品的适口性的化合物。增强或改变可用于增加所需属性的强度，以替换宠物食品中不存在或以某种方式丢失的所需属性，或降低不想要的属性的强度。特别是，希望降低宠物食品中不想要的令人反感的气味的存在或强度。类似地，需要通过增强或改变药物的适口性来增加对宠物药物的接受度。
宠物保健品行业还涉及开发气味阻滞剂(odor deterrent)，该气味阻滞剂可以有效阻止宠物刮伤、咀嚼、舔舐或摄取危害动物健康或所有者财产的物体。虽然已知某些添味剂可以有效地制止宠物，但是宠物对这些气味阻滞剂的反应存在显著差异。因此，需要有效地赋予有害或有毒物体不良的气味的化合物。
因此，本领域仍需要筛选未加工的宠物食品材料(例如新蛋白质来源)以及成品宠物食品的方法，以提供芳香、适口和营养的宠物食品。还需要鉴定增强、降低或以其它方式调节宠物食品或物体的适口性和/或阻滞性(deterrence)的化合物，以及包含这些化合物的气味组合物。
发明内容
本公开的主题提供了鉴定增强、增加、降低和/或调节嗅觉受体活性和/或表达的化合物的方法。在某些实施方案中，所述方法需要筛选调节宠物食品或药物或用于制造宠物食品或药物的原料中的嗅觉受体活性和/或表达的化合物。本公开的主题还提供增强、增加、降低和/或调节由所述方法鉴定的嗅觉受体的活性和/或表达的化合物。在某些实施方案中，嗅觉受体是犬科动物或猫科动物的受体。
在某些实施方案中，鉴定增强、增加、降低和/或调节嗅觉受体活性和/或表达的化合物的方法包括在细胞中表达嗅觉受体，所述嗅觉受体具有SEQ ID NO：11至SEQ ID NO：30中任意一个或多个所示的核苷酸序列或SEQ ID NO：61至SEQ ID NO：3808中所示的任意一个或多个核苷酸序列或它们的片段或变体。该方法可以进一步包括使表达嗅觉受体的细胞与样品(例如，宠物食品原料、成品宠物食品或测试化合物)接触，并且与不存在样品时受体的活性和/或表达相比，测定在样品存在下嗅觉受体的活性和/或表达。在某些实施方案中，在样品和嗅觉受体激动剂的存在下测定嗅觉受体的活性和/或表达。
在某些实施方案中，鉴定增强、增加、降低和/或调节嗅觉受体活性和/或表达的化合物的方法包括在细胞中表达嗅觉受体，所述嗅觉受体具有SEQ ID NO：41至SEQ ID NO：60中任意一个或多个所示的氨基酸序列或SEQ ID NO：61至SEQ ID NO：3808中所示的任意一个或多个氨基酸序列或它们的片段或变体。该方法可以进一步包括使表达嗅觉受体的细胞与样品(例如，宠物食品原料、成品宠物食品或测试化合物)接触，并且与不存在样品时受体的活性和/或表达相比，测定在样品存在下嗅觉受体的活性和/或表达。在某些实施方案中，在样品和嗅觉受体激动剂的存在下测定嗅觉受体的活性和/或表达。
在某些实施方案中，本公开提供了鉴定调节嗅觉受体活性的组合物的方法，包括(a)使嗅觉受体激动剂与嗅觉受体接触，(b)测定嗅觉受体的活性，(c)使测试剂与嗅觉受体接触，(d)测定嗅觉受体的活性，和(e)当(d)的活性大于或小于(b)的活性时，选择该测试剂作为组合物。
在某些实施方案中，嗅觉受体激动剂选自由草青醛(trifernal)、异戊酸、3-甲基-2-己酸、α-紫罗兰酮、乙酸己酯、戊基硫醇、新洋茉莉醛、对茴香醛、4-乙氧基苯甲醛、薄荷醇、甲基丁香酚、水杨酸甲酯、苯乙醛、β-紫罗兰酮、乙酸戊酯、壬硫醇、苯乙酮、香豆素、铃兰醛、间茴香醛、4-甲基戊酸、戊醇、苯乙酸烯丙酯、己酸、α-紫罗兰酮、柠檬醛、乙酸异戊酯、辛硫醇、苯丙酮、7-甲氧基香豆素及它们的组合所组成的组中。
在某些非限制性实施方案中，本文所述的鉴定调节嗅觉受体活性的化合物的方法利用表达对细胞天然的嗅觉受体的细胞。这种表达天然嗅觉受体的细胞的实例包括，例如但不限于，人、狗和/或猫的嗅觉细胞(例如，嗅觉受体细胞)。在某些实施方案中，从人、狗和/或猫中分离表达嗅觉受体的人、狗和/或猫的嗅觉细胞并在体外培养。在某些实施方案中，嗅觉受体细胞可以是永生化的，例如，使得从人、狗和/或猫分离的细胞可以在培养物中增殖。
在某些实施方案中，细胞表达钙结合光蛋白、环核苷酸门控(CNG)通道、含cAMP反应元件(CRE)的荧光素酶报告基因、GloSensor荧光素酶或PKA-NanoBiT系统。在某些实施方案中，钙结合光蛋白(calcium-binding photoprotein)选自由clytin、水母发光蛋白(aequorin)、奥贝林(obelin)、它们的任意重组或分离形式、及它们的任意组合所组成的组中。在某些实施方案中，通过发光检测或荧光检测监测细胞内钙水平。在某些实施方案中，荧光检测包括钙敏感荧光染料，所述荧光染料选自由Fura-2 AM、Fura-2五钾盐(Fura-2pentapotassium)、Fura Red AM、Indo-1AM、Indo-1五钾盐(Indo-1 pentapotassium)、Fluo-3、Fluo-4，Fluo-8、钙绿-1(Calcium Green-1)、钙3(Calcium 3)、钙4(Calcium 4)、钙5(Calcium 5)、Rhod-2、它们的衍生物及它们的组合所组成的组中。
在某些实施方案中，测试剂的半数有效浓度值(EC 50 value)不大于约200μM。在某些实施方案中，测试剂的Emax值不小于约2.0。
本公开还提供了鉴定增强、增加、降低和/或调节嗅觉受体的活性和/或表达的化合物的方法，其中所述测定使用无细胞测定法(cell-free assay)进行，例如，其中所述嗅觉受体结合到基质或以其它方式附着于基质。
本公开还提供了鉴定增强、增加、降低和/或调节嗅觉受体的活性和/或表达的化合物的方法，其中所述测定使用嗅觉受体的计算机模拟(in silico)模型进行，例如，其中使用计算机程序对嗅觉受体进行建模，并通过对接算法(docking algorithm)预测化合物与受体的结合。
本公开的主题还提供了一种制造适口的宠物食品的方法，其中筛选用于生产宠物食品的原料以确定它们是否含有增强、增加、减少和/或调节嗅觉受体的活性和/或表达的化合物。在某些实施方案中，原料是新的蛋白质来源。在某些实施方案中，原料是通常不在人类食物链中消耗的蛋白质来源。在某些实施方案中，不选择包含增加嗅觉受体的活性和/或表达的化合物(例如，与未与原料接触的嗅觉受体相比)的原料宠物食品用于生产成品宠物食品。在某些实施方案中，选择包含增加嗅觉受体的活性和/或表达的化合物(例如，与未与原料接触的嗅觉受体相比)的原料宠物食品用于生产成品宠物食品。在其它实施方案中，选择不增加嗅觉受体的活性和/或表达的宠物食品原料(或者，例如在嗅觉受体激动剂存在下，其降低嗅觉受体的活性)来生产成品宠物食品。在其它实施方案中，不选择不增加嗅觉受体的活性和/或表达的宠物食品原料(或者，例如在嗅觉受体激动剂存在下，其降低嗅觉受体的活性)来生产成品宠物食品。
本公开的主题还提供了一种制造适口的宠物食品的方法，其中筛选成品宠物食品以确定其是否含有增强、增加、降低和/或调节嗅觉受体的活性和/或表达的化合物。在某些实施方案中，化合物在制造过程中形成。在一个实施方案中，包含增加嗅觉受体的活性和/或表达的化合物的成品宠物食品(例如，与未与成品宠物食品接触的嗅觉受体相比)补充有一种或多种降低嗅觉受体的活性和/或表达的化合物(例如拮抗剂化合物)。在一个实施方案中，包含降低嗅觉受体的活性和/或表达的化合物的成品宠物食品(例如，与未与成品宠物食品接触的嗅觉受体相比，或与已接触激动剂的嗅觉受体相比)补充有一种或多种增加嗅觉受体的活性和/或表达的化合物(例如，激动剂化合物)。
本公开的主题还提供了一种制造适口的宠物药品的方法，其中筛选成品宠物药品以确定其是否含有增强、增加、降低和/或调节嗅觉受体的活性和/或表达的化合物。在某些实施方案中，化合物在制造过程中形成。在一个实施方案中，包含增加嗅觉受体的活性和/或表达的化合物的成品宠物药品(例如，与未与成品宠物药品接触的嗅觉受体相比)补充有一种或多种降低嗅觉受体的活性和/或表达的化合物(例如拮抗剂化合物)。在一个实施方案中，包含降低嗅觉受体的活性和/或表达的化合物的成品宠物药品(例如，与未与成品宠物药品接触的嗅觉受体相比，或与已接触激动剂的嗅觉受体相比)补充有一种或多种增加嗅觉受体的活性和/或表达的化合物(例如，激动剂化合物)。
本发明公开的主题还提供了风味组合物，其包含根据本文所述方法鉴定的嗅觉受体调节剂，例如激动剂和/或拮抗剂和/或变构调节剂和/或反向激动剂。
在某些实施方案中，所述化合物可用于通过赋予令人反感的气味和/或降低物体或表面的适口性来维持动物健康的方法。在某些实施方案中，该方法包括将包含如本文所述的化合物的气味阻滞剂施用于物体或表面。在某些实施方案中，该物体对动物的健康有害或对动物有毒。
前面已经相当广泛地概述了本申请的特征和技术优点，以便可以更好地理解随后的详细描述。在下文中将描述本申请的附加特征和优点，其形成本申请权利要求的主题。本领域技术人员应该理解，所公开的概念和具体实施方案可以容易地用作修改或设计用于实现本申请的相同目的的其它结构的基础。本领域技术人员还应该认识到，这类等同的结构不脱离所附权利要求中阐述的本申请的精神和范围。从以下描述中将更好地理解被认为是申请的特征的新颖特征、关于其组织和操作方法，以及其它目的和优点。
附图说明
图1显示人、犬科动物和猫科动物嗅觉受体(OR)核苷酸序列(SEQ ID NO：1至SEQID NO：30)以及它们相应的氨基酸序列(SEQ ID NO：31至SEQ ID NO：60)。序列包括人嗅觉受体HsOR17.1.11(hOR3A1)、HsOR1.4.8(hOR6P1)、HsOR11.3.14(hOR51E1)、HsOR11.3.40(hOR51L1)、HsOR14.1.27(hOR11H6)、HsOR11.13.7(hOR4D6)、HsOR14.2.5(hOR4E2)、HsOR16.1.3(hOR2C1)、HsOR11.13.6(hOR5A1)和HsOR11.18.36(hOR8B8)；犬科动物嗅觉受体CafaOR9.2.9、CafaOR38.1.21、CafaOR21.2.15、CafaOR21.2.43、CafaOR15.2.20、CafaOR18.3.11、CafaOR15.3.1、CafaOR6.3.1、CafaOR18.3.12和CafaOR5.2.5；和猫科动物嗅觉受体E1：13347030-13347977、F1：65134904-65135858、D1：62955839-62956792、D1：63312327-63313289、B3：72908295-72909287、D1：105486528-105487493、B3：74116955-74117893、E3：40237904-40238842、D1：105462554-105463512和D1：21266824-21267768。
图2A至图2E。A)作为标记的犬科动物、猫科动物和人嗅觉受体序列的比对(分别为SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：51和SEQ ID NO：31，按照出现的顺序)。活性位点，定义为配体中任何重原子的以内的那些残基，在序列比对中用黑框突出显示。包括N-末端到7跨膜结构域的残基，以便于在蛋白质序列内通过数字鉴别残基。C-末端到7跨膜结构域的残基不包括在比对中。B)用于建模的配体(铃兰醛)的化学结构。C)与犬科动物受体CafaOR9.2.9结合的配体的近视图(near view)。该图示出了化合物在所选受体的7-螺旋跨膜结构域(7TM)内的结合位置。D)与受体结合的配体的近视图，该图示出了限定结合配体环境的残基。相对于A)中突出显示的那些残基，选择较少数量的残基以便于观察。E)配体与受体结合的相互作用图，该图示出了限定结合配体环境的残基。可以与配体接触的残基显示为圆。暗圆(dark circle)是主要通过范德华或疏水接触而相互作用的那些残基。较亮的圆(lighter circle)是通过其他相互作用类型例如氢键、环堆积、盐桥与配体相互作用的那些残基。当圆周围存在晕圈(halo)时表明在配体结合上该残基的水可及(water-accessible)表面积显著减少。当存在氢键时用虚线表示。可能与配体形成氢键的残基包括Gln103。可能与配体形成环堆积、盐桥、氢键、π相互作用、带电相互作用、范德华相互作用或疏水相互作用的其它残基包括Leu104、Lys275、Arg87、Val81、Met84、Val279、Tyr262、Met209、Gly258、Val111、Tyr255、Thr282、Phe107和Thr80。
图3A至图3E。A)作为标记的犬科动物、猫科动物和人嗅觉受体序列的比对(分别为SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：42，按照出现的顺序)。活性位点，定义为配体中任何重原子的以内的那些残基，在序列比对中用黑框突出显示。包括N-末端到7跨膜结构域的残基，以便于在蛋白质序列内通过数字鉴别残基。C-末端到7跨膜结构域的残基不包括在比对中。B)用于建模的配体(对茴香醛)的化学结构。C)与犬科动物受体CafaOR38.1.21结合的配体的近视图。该图示出了化合物在所选受体的7-螺旋跨膜结构域(7TM)内的结合位置。D)与受体结合的配体的近视图，该图示出了限定结合配体环境的残基。相对于A)中突出显示的那些，选择较少数量的残基以便于观察。E)配体与受体结合的相互作用图，该图示出了限定结合配体环境的残基。可以与配体接触的残基显示为圆。暗圆是主要通过范德华或疏水接触而相互作用的那些残基。较亮的圆是通过其他相互作用类型例如氢键、环堆积、盐桥与配体相互作用的那些残基。当圆周围存在晕圈时表明在配体结合上该残基的水可及表面积显著减少。当存在氢键时用虚线表示。可能与配体形成氢键的残基包括Lys273。可能与配体形成环堆积、盐桥、氢键、π相互作用、带电相互作用、范德华相互作用或疏水相互作用的其它残基包括Thr78、Leu82、Tyr260、Thr256、Tyr253和Phe105。
图4A至图4E。A)作为标记的犬科动物、猫科动物和人嗅觉受体序列的比对(分别为SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：53和SEQ ID NO：33，按照出现的顺序)。活性位点，定义为配体中任何重原子的以内的那些残基，在序列比对中用黑框突出显示。包括N-末端到7跨膜结构域的残基，以便于在蛋白质序列内通过数字鉴别残基。C-末端到7跨膜结构域的残基不包括在比对中。B)用于建模的配体((+)-薄荷醇)的化学结构。C)与犬科动物受体CafaOR21.2.15结合的配体的近视图。该图示出了化合物在所选受体的7-螺旋跨膜结构域(7TM)内的结合位置。D)与受体结合的配体的近视图，该图示出了限定结合配体环境的残基。相对于A)中突出显示的那些，选择较少数量的残基以便于观察。E)配体与受体结合的相互作用图，该图示出了限定结合配体环境的残基。可以与配体接触的残基显示为圆。暗圆是主要通过范德华或疏水接触而相互作用的那些残基。较亮的圆是通过其他相互作用类型例如氢键、环堆积、盐桥与配体相互作用的那些残基。当圆周围存在晕圈时表明在配体结合上该残基的水可及表面积显著减少。当氢键存在时用虚线表示。可能与配体形成环堆积、盐桥、氢键、π相互作用、带电相互作用、范德华相互作用或疏水相互作用的其它残基包括Met83、His107、Ile106、Leu182、Asn197、Gly201、Val204、Ser260、Phe256和Leu273。可能与配体形成范德华或疏水相互作用的其它残基包括Met103。
图5A至图5E。A)作为标记的犬科动物、猫科动物和人嗅觉受体序列的比对(分别为SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：44和SEQ ID NO：54，按照出现的顺序)。活性位点，定义为配体中任何重原子的以内的那些残基，在序列比对中用黑框突出显示。包括N-末端到7跨膜结构域的残基，以便于在蛋白质序列内通过数字鉴别残基。C-末端到7跨膜结构域的残基不包括在比对中。B)用于建模的配体(雄甾二烯酮(Androstadienone))的化学结构。C)与犬科动物受体CafaOR21.2.43结合的配体的近视图。该图示出了化合物在所选受体的7螺旋跨膜结构域(7TM)内的结合位置。D)与受体结合的配体的近视图，该图示出了限定结合配体环境的残基。相对于A)中突出显示的那些，选择较少数量的残基以便于观察。E)配体与受体结合的相互作用图，该图示出了限定结合配体环境的残基。可以与配体接触的残基显示为圆。暗圆是主要通过范德华或疏水接触而相互作用的那些残基。较亮的圆是通过其他相互作用类型例如氢键、环堆积、盐桥与配体相互作用的那些残基。当圆周围存在晕圈时表明在配体结合上该残基的水可及表面积显著减少。当存在氢键时用虚线表示。可能与配体形成环堆积、盐桥、氢键、π相互作用、带电相互作用、范德华相互作用或疏水相互作用的其它残基包括Met80、Met88、Leu108、Ile111、His112、Thr115、Val209、Val210、Thr213、Leu214、Val262、Ile263、Ser266、Ile281、Ala284和Leu288。可能与配体形成范德华或疏水相互作用的其它残基包括Asp285。
图6A至图6E。A)作为标记的犬科动物、猫科动物和人嗅觉受体序列的比对(分别为SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：45和SEQ ID NO：55，按照出现的顺序)。活性位点，定义为配体中任何重原子的以内的那些残基，在序列比对中用黑框突出显示。包括N-末端到7跨膜结构域的残基，以便于在蛋白质序列内通过数字鉴别残基。C-末端到7跨膜结构域的残基不包括在比对中。B)用于建模的配体(异丁酸(isobuteric acid))的化学结构。C)与猫科动物受体catGr5(B3：72908295-72909287)结合的配体的近视图。该图示出了化合物在所选受体的7-螺旋跨膜结构域(7TM)内的结合位置。D)与受体结合的配体的近视图，该图示出了限定结合配体环境的残基。相对于A)中突出显示的那些，选择较少数量的残基以便于观察。E)配体与受体结合的相互作用图，该图示出了限定结合配体环境的残基。可以与配体接触的残基显示为圆。暗圆是主要通过范德华或疏水接触而相互作用的那些残基。较亮的圆是通过其他相互作用类型例如氢键、环堆积、盐桥与配体相互作用的那些残基。当圆周围存在晕圈时表明在配体结合上该残基的水可及表面积显著减少。当氢键存在时用虚线表示。可能与配体形成氢键的残基包括Tyr277。可能与配体形成环堆积、盐桥、氢键、π相互作用、带电相互作用、范德华相互作用或疏水相互作用的其它残基包括Phe119、Pro177、Leu180、Ile181、Pro199、Cys217和Phe220。可能与配体形成范德华或疏水相互作用的其它残基包括Tyr277和Lys290。
图7A至图7E。A)作为标记的犬科动物、猫科动物和人嗅觉受体序列的比对(分别为SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：56和SEQ ID NO：46，按照出现的顺序)。活性位点，定义为配体中任何重原子的以内的那些残基，在序列比对中用黑框突出显示。包括N-末端到7跨膜结构域的残基，以便于在蛋白质序列内通过数字鉴别残基。C-末端到7跨膜结构域的残基不包括在比对中。B)用于建模的配体(β-紫罗兰酮)的化学结构。C)与猫科动物受体catGr6(D1：105486528-105487493)结合的配体的近视图。该图示出了化合物在所选受体的7-螺旋跨膜结构域(7TM)内的结合位置。D)与受体结合的配体的近视图，该图示出了限定结合配体环境的残基。相对于A)中突出显示的那些，选择较少数量的残基以便于观察。E)配体与受体结合的相互作用图，该图示出了限定结合配体环境的残基。可以与配体接触的残基显示为圆。暗圆是主要通过范德华或疏水接触而相互作用的那些残基。较亮的圆是通过其他相互作用类型例如氢键、环堆积、盐桥与配体相互作用的那些残基。当圆周围存在晕圈时表明在配体结合上该残基的水可及表面积显著减少。当氢键存在时用虚线表示。可能与配体形成氢键的残基包括Tyr265。可能与配体形成环堆积、盐桥、氢键、π相互作用、带电相互作用、范德华相互作用或疏水相互作用的其它残基包括Phe88、Phe111、Met170、Met206、Cys261、Ile264、Ser279、Ile280和Thr283。可能与配体形成范德华或疏水相互作用的其它残基包括His112、Asn209和Tyr265。
图8A至图8E。A)作为标记的犬科动物、猫科动物和人嗅觉受体序列的比对(分别为SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：37和SEQ ID NO：57，按照出现的顺序)。活性位点，定义为配体中任何重原子的以内的那些残基，在序列比对中用黑框突出显示。包括N-末端到7跨膜结构域的残基，以便于在蛋白质序列内通过数字鉴别残基。C-末端到7跨膜结构域的残基不包括在比对中。B)用于建模的配体(乙酸戊酯)的化学结构。C)与猫科动物受体catG7(B3：74116955-74117893)结合的配体的近视图。该图示出了化合物在所选受体的7-螺旋跨膜结构域(7TM)内的结合位置。D)与受体结合的配体的近视图，该图示出了限定结合配体环境的残基。相对于A)中突出显示的那些，选择较少数量的残基以便于观察。E)配体与受体结合的相互作用图，该图示出了限定结合配体环境的残基。可以与配体接触的残基显示为圆。暗圆是主要通过范德华或疏水接触而相互作用的那些残基。较亮的圆是通过其他相互作用类型例如氢键、环堆积、盐桥与配体相互作用的那些残基。当圆周围存在晕圈时表明在配体结合上该残基的水可及表面积显著减少。当存在氢键时用虚线表示。可能与配体形成氢键的残基包括Met81、Tyr258和Gln100。可能与配体形成环堆积、盐桥、氢键、π相互作用、带电相互作用、范德华相互作用或疏水相互作用的其它残基包括Thr77、Lys269、Leu104、Thr276、Val277、His73、Val273和Val78。
图9A至图9E。A)作为标记的犬科动物、猫科动物和人嗅觉受体序列的比对(分别为SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：58和SEQ ID NO：48，按照出现的顺序)。活性位点，定义为配体中任何重原子的以内的那些残基，在序列比对中用黑框突出显示。包括N-末端到7跨膜结构域的残基，以便于在蛋白质序列内通过数字鉴别残基。C-末端到7跨膜结构域的残基不包括在比对中。B)用于建模的配体(1-壬硫醇)的化学结构。C)与猫科动物受体catG8(E3：40237904-40238842)结合的配体的近视图。该图示出了化合物在所选受体的7-螺旋跨膜结构域(7TM)内的结合位置。D)与受体结合的配体的近视图，该图示出了限定结合配体环境的残基。相对于A)中突出显示的那些，选择较少数量的残基以便于观察。E)配体与受体结合的相互作用图，该图示出了限定结合配体环境的残基。可以与配体接触的残基显示为圆。暗圆是主要通过范德华或疏水接触而相互作用的那些残基。较亮的圆是通过其他相互作用类型例如氢键、环堆积、盐桥与配体相互作用的那些残基。当圆周围存在晕圈时表明在配体结合上该残基的水可及表面积显著减少。当氢键存在时用虚线表示。可能与配体形成环堆积、盐桥、氢键、π相互作用或带电相互作用的其它残基包括Leu101、Phe104、Leu105、Gly108、Glu180、Val202、Phe206、Tyr259和Lys272。可能与配体形成范德华或疏水相互作用的其它残基包括Met81。
图10A至图10E。A)作为标记的犬科动物、猫科动物和人嗅觉受体序列的比对(分别为SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：59和SEQ ID NO：39，按照出现的顺序)。活性位点，定义为配体中任何重原子的以内的那些残基，在序列比对中用黑框突出显示。包括N-末端到7跨膜结构域的残基，以便于在蛋白质序列内通过数字鉴别残基。C-末端到7跨膜结构域的残基不包括在比对中。B)用于建模的配体(β-紫罗兰酮)的化学结构。C)与猫科动物受体catG9(D1：105462554-105463512)结合的配体的近视图。该图示出了化合物在所选受体的7-螺旋跨膜结构域(7TM)内的结合位置。D)与受体结合的配体的近视图，该图示出了限定结合配体环境的残基。相对于A)中突出显示的那些，选择较少数量的残基以便于观察。E)配体与受体结合的相互作用图，该图示出了限定结合配体环境的残基。可以与配体接触的残基显示为圆。暗圆是主要通过范德华或疏水接触而相互作用的那些残基。较亮的圆是通过其他相互作用类型例如氢键、环堆积、盐桥与配体相互作用的那些残基。当圆周围存在晕圈时表明在配体结合上该残基的水可及表面积显著减少。当存在氢键时用虚线表示。可能与配体形成氢键的残基包括Lys278。可能与配体形成环堆积、盐桥、氢键、π相互作用或带电相互作用的其它残基包括Phe110、Val111、Gly114、Val208、Ile212、Phe258、Ala261、Leu262、Tyr265，Val282和Ser285。可能与配体形成范德华或疏水相互作用的其它残基包括Tyr79和Lys278。
图11A至图11E。A)作为标记的犬科动物、鼠科动物(murine)、猫科动物和人的嗅觉受体序列的比对(分别为SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：3809、SEQ ID NO：50和SEQ ID NO：40，按照出现的顺序)。活性位点，定义为配体中任何重原子的以内的那些残基，在序列比对中用黑框突出显示。包括N-末端到7跨膜结构域的残基，以便于在蛋白质序列内通过数字鉴别残基。C-末端到7跨膜结构域的残基不包括在比对中。B)用于建模的配体(香豆素)的化学结构。C)与犬科动物受体CafaOR5.2.5.结合的配体的近视图。该图示出了化合物在所选受体的7螺旋跨膜结构域(7TM)内的结合位置。D)与受体结合的配体的近视图，该图示出了限定结合配体环境的残基。相对于A)中突出显示的那些，选择较少数量的残基以便于观察。E)配体与受体结合的相互作用图，该图示出了限定结合配体环境的残基。可以与配体接触的残基显示为圆。暗圆是主要通过范德华或疏水接触而相互作用的那些残基。较亮的圆是通过其他相互作用类型例如氢键、环堆积、盐桥与配体相互作用的那些残基。当圆周围存在晕圈时表明在配体结合上该残基的水可及表面积显著减少。当存在氢键时用虚线表示。可能与配体形成环堆积、盐桥、氢键、π相互作用或带电相互作用的其它残基包括Tyr77、Phe108、Val112、Ser116、Val206、Asp210、Phe256和Thr283。可能与配体形成范德华或疏水相互作用的残基包括Tyr263。
图12显示天然嗅觉受体信号传导途径和可能的功能测定。
图13显示覆盖嗅觉遗传空间(genetic space)的多物种(人/犬科动物/猫科动物)的进化树。进化树显示所有嗅觉受体并突出显示了30种选择的嗅觉受体(10种人受体、10种犬科动物受体、10种猫科动物受体)。
图14显示实施例4中OR_1至OR_5的第2阶段测试的总结结果。
图15显示实施例4中OR_6至OR_10的第2阶段测试的总结结果。
图16显示实施例4中狗OR的第3阶段测试的总结结果。
图17显示实施例4中猫OR的第3阶段测试的总结结果。
图18显示使用OR_1(OR3A1)的CRE-NanoLuc荧光素酶测定的结果。
图19显示使用OR_1(OR3A1)的chAMPion测定的结果。
图20显示使用OR_2(OR6P1)的CRE-NanoLuc荧光素酶测定的结果。
图21显示使用OR_2(OR6P1)的chAMPion测定的结果。
图22显示使用OR_3(OR51E1)的CRE-NanoLuc荧光素酶测定的结果。
图23显示使用OR_3(OR51E1)的chAMPion测定的结果。
图24显示使用OR_4(OR51L1)的CRE-NanoLuc荧光素酶测定的结果。
图25显示使用OR_4(OR51L1)的chAMPion测定的结果。
图26显示使用OR_5(OR11H6)的CRE-NanoLuc荧光素酶测定的结果。
图27显示使用OR_5(OR11H6)的chAMPion测定的结果。
图28显示使用OR_6(OR4D6)的CRE-NanoLuc荧光素酶测定的结果。
图29显示使用OR_6(OR4D6)的chAMPion测定的结果。
图30显示使用OR_7(OR4E2)的CRE-NanoLuc荧光素酶测定的结果。
图31显示使用OR_7(OR4E2)的chAMPion测定的结果。
图32显示了使用OR_8(OR2C1)的CRE-NanoLuc荧光素酶测定的结果。
图33显示使用OR_8(OR2C1)的chAMPion测定的结果。
图34显示使用OR_9(OR5A1)的CRE-NanoLuc荧光素酶测定的结果。
图35显示使用OR_9(OR5A1)的chAMPion测定的结果。
图36显示使用OR_10(OR8B8)的CRE-NanoLuc荧光素酶测定的结果。
图37显示使用OR_10(OR8B8)的chAMPion测定的结果。
图38A至图38B显示OR_2(OR6P1)的阳性配体的剂量-反应曲线。A)使用空白(mock)、猫科动物和犬科动物的受体的对茴香醛的剂量-反应曲线。B)使用空白、猫科动物和犬科动物的受体的4-乙氧基苯甲醛的剂量-反应曲线。
图39A至图39D显示OR_3(OR51E1)的阳性配体的剂量-反应曲线。A)使用空白、猫科动物和犬科动物的受体的异戊酸的剂量-反应曲线。B)使用空白、猫科动物和犬科动物的受体的4-甲基戊酸的剂量-反应曲线。C)使用空白、猫科动物和犬科动物的受体的己酸的剂量-反应曲线。D)使用空白、猫科动物和犬科动物的受体的3-甲基-2-己酸的剂量-反应曲线。
图40A至图40B显示OR_4(OR51L1)的阳性配体的剂量-反应曲线。A)使用空白、猫科动物和犬科动物的受体的己酸的剂量-反应曲线。B)使用空白、猫和犬的受体的苯乙酸烯丙酯的剂量-反应曲线。
图41A至图41B显示OR_8(OR2C1)的阳性配体的剂量-反应曲线。A)使用空白、猫科动物和犬科动物受体并使用CRE-NanoLuc荧光素酶测定的壬硫醇的剂量-反应曲线。B)使用空白、猫科动物和犬科动物受体并使用CNG测定的壬硫醇的剂量-反应曲线。
图42A至图42H显示OR_9(OR5A1)的阳性配体的剂量-反应曲线。A)使用空白、猫科动物和犬科动物的受体并使用CRE-NanoLuc荧光素酶测定的异戊酸的剂量-反应曲线。B)使用空白、猫科动物和犬科动物的受体并使用CRE-NanoLuc荧光素酶测定的柠檬醛的剂量-反应曲线。C)使用空白、猫科动物和犬科动物的受体并使用CRE-NanoLuc荧光素酶测定的乙酸戊酯的剂量-反应曲线。D)使用空白、猫科动物和犬科动物的受体并使用CRE-NanoLuc荧光素酶测定的β-紫罗兰酮的剂量-反应曲线。E)使用空白、猫科动物和犬科动物的受体并使用CNG测定的异戊酸的剂量-反应曲线。F)使用空白、猫科动物和犬科动物的受体并使用CNG测定的柠檬醛的剂量-反应曲线。G)使用空白、猫科动物和犬科动物的受体并使用CNG测定的乙酸戊酯的剂量-反应曲线。H)使用空白、猫科动物和犬科动物的受体并使用CNG测定的β-紫罗兰酮的剂量-反应曲线。人OR5A1仅在CRE-Nanoluc测定中有反应，其仅对β-紫罗兰酮有反应。狗OR5A1在两种测定中的反应特征略有不同：在CRE-NanoLuc测定中，受体以相似的EC50和Emax对所有四种化合物有反应；在CNG测定中，受体对所有四种化合物都有反应，但对β-紫罗兰酮的反应具有最低的EC50和最高的Emax。猫OR5A1在两种测定中具有不同的反应特征：在CRE-NanoLuc测定中，受体以相似的EC50和Emax对所有四种化合物有反应；在CNG测定中，受体仅对β-紫罗兰酮具有强烈反应，但对异戊酸和乙酸戊酯的反应较弱，对柠檬醛没有反应。两种测定中的反应曲线的差异可能是由于不同的测定方案和CRE-NanoLuc测定中更长的孵育时间。
图43A至图43C显示OR_10(OR8B8)的阳性配体的剂量-反应曲线。A)使用空白、猫科动物和犬科动物的受体的乙酰苯的剂量-反应曲线。B)使用空白、猫科动物和犬科动物的受体的苯丙酮(propriophenone)的剂量-反应曲线。C)使用空白、猫科动物和犬科动物的受体的香豆素的剂量-反应曲线。
具体实施方式
本公开的主题涉及筛选和鉴定调节嗅觉受体的活性和/或表达的化合物的方法。本公开的主题还涉及制备芳香、适口且营养全面的宠物食品、药品，以及非营养全面的宠物食品(例如，点心(snack)、保健品(care)和零食(treats))，其中筛选宠物食品和/或最终宠物食品或药品的原料以确定其是否含有调节嗅觉受体的化合物。此外，这种筛选方法可用于选择不包含令人反感的化合物的原料和/或最终宠物食品。通过所述方法鉴定的化合物可用于通过增强或减少吸引人的或令人反感的的气味调节宠物食品和药品的香味和/或适口性。所述化合物还可用于增加物体的令人反感的气味，从而减少猫或狗的接触、适口性和摄食。
1.定义
本说明书中使用的术语在本发明的背景中和在使用每个术语的特定背景中通常具有它们在本领域中的普通含义。某些术语在下面或说明书中的其它地方讨论，以向从业者提供对描述本发明的方法和组合物以及如何制备和使用它们的额外指导。
如本文所用，当与权利要求和/或说明书中的“包括”一起使用时，词语“一个(a)”或“一个(an)”的使用可以表示“一个”，但是它也与“一个或多个”、“至少一个”和“一个或多于一个”一致。此外，术语“具有”、“包括”、“含有”和“包含”是可互换的，并且本领域技术人员认识到这些术语是开放式术语。
术语“约”或“大约”意指在本领域普通技术人员确定的特定值的可接受误差范围内，其将部分取决于如何测量或确定该值，即，测量系统的限制。例如，根据本领域的实践，“约”可以表示在3个或多于3个标准偏差内。或者，“约”可以表示给定值的至多20％、优选至多10％、更优选至多5％、更优选至多1％的范围。或者，特别是对于生物系统或过程，该术语可以表示值的数量级内，优选地在5倍内，更优选地在2倍内。
如本文中可互换使用的“气味(odor)”、“味(smell)”和“芳香”是指受试者的嗅觉系统中受体细胞活化引起的感觉。在某些实施方案中，气味可以通过一组心理物理叙述语来表征，诸如，例如水果味、花香味、蜂蜜味、脂肪味、薄荷味和金属味中的一种或多种。参见，例如，Dravnieks，气味特征图谱(Atlas of Odor Character Profiles)，美国测试与材料协会(American Society for Testing and Materials)，1985；Castro等人，公共科学图书馆-综合(PLOS ONE)，0073289，2014，其内容通过引用并入本文。在某些实施方案中，通过“添味剂”在受试者中引发嗅觉。在某些实施方案中，可以感知不同添味剂的组合，作为新的气味对象。在某些实施方案中，添味剂可以是合成添味剂。在某些实施方案中，添味剂是从天然来源获得或制备的。
如本文所用，“嗅觉谱”是指气味感觉的组合，其中每一种都可以通过一组心理物理叙述语来表征，诸如，例如水果味、花香味、蜂蜜味、脂肪味、薄荷味和金属味中的一种或多种。在某些实施方案中，不同添味剂的组合可以被感知为新的气味感官体验。在某些实施方案中，嗅觉谱由一种或多种添味剂产生，所述添味剂以相同或不同的浓度存在于组合物中。在某些实施方案中，嗅觉谱是指气味的强度或者气味的组合，例如，由受试者或本领域已知的任何测定法检测的水果味、花香味、蜂蜜味、脂肪味、薄荷味和金属味。在某些实施方案中，更改、改变或变换嗅觉谱中的添味剂的组合可以改变受试者的感官体验。
如本文所用，“风味”是指一种或多种感官刺激，诸如，例如味道(味觉)、气味(嗅觉)、触感(触觉)和温度(热)刺激中的一种或多种。在某些非限制性实施方案中，暴露于风味的受试者的感官体验可以被分为特定风味的特征体验。例如，风味可以由受试者识别为但不限于花香、柑橘、浆果、坚果、焦糖、巧克力、胡椒、烟熏、奶酪、肉味等风味。如本文所用，风味组合物可选自液体、溶液、干粉、喷雾、糊剂、悬浮剂及它们的任意组合。风味剂可以是天然组合物、人工组合物、性质等同物或它们的任意组合。
如本文所用，“风味谱”是指感官刺激的组合，例如味道、嗅觉、触觉和/或热刺激。在某些实施方案中，风味谱包含一种或多种有助于受试者感官体验的风味。在某些实施方案中，更改、改变或变换风味谱中的刺激的组合可以改变受试者的感官体验。
如本文所用，“混合”，例如，“将本申请的风味组合物或其组合与食品混合”是指在产品形成期间或在这些步骤的某些组合中，将风味组合物或风味组合物的各个组分与成品混合或添加至成品中或者与产品的一些或所有组分混合的方法。当在混合的上下文中使用时，术语“产品”是指产品或它的任意组分。该混合步骤可包括选自以下步骤的方法：将风味组合物添加到产品中，将风味组合物喷洒在产品上，将风味组合物涂覆在产品上，将产品悬浮于风味组合物中，将风味组合物涂在产品上，将风味组合物粘附在产品上，用风味组合物包封产品，将风味组合物与产品混合及它们的任意组合。风味组合物可以是溶液、液体、干粉、喷雾、糊剂、悬浮液及它们的任意组合。
如本文所用，“适口性”可以指人或非人动物(例如伴侣动物)食用某种食品的总体意愿。增加食品的“适口性”可以导致人或非人动物对食物的享受和接受的增加，以确保人或非人动物食用“健康量”的食物。降低食品的“适口性”可导致人或非人动物对食物的享受和接受的减少。如本文所用的术语“健康量”的食物是指使人或非人动物能够维持或实现有助于其在微量营养素、大量营养素和热量方面的总体健康的摄入的量，例如“玛氏宠物护理必需营养标准(Mars Petcare Essential Nutrient Standards)””中所述。在某些实施方案中，“适口性”可以表示人或非人动物对一种食品相对于另一种食品的相对偏好。例如，当人或非人动物表现出对两种或更多种食物中的一种的偏好时，优选的食品更“适口”，并且具有“增强的适口性”。在某些实施方案中，一种食品相对于一种或多种其它食品的相对适口性可以例如在并排的自由选择比较中确定，例如通过食品的相对消耗，或指示适口性的其它适当的偏好测定。适口性可以通过标准测试方案来确定，其中动物可以同等地获得两种食品，如所谓的“双碗测试(two-bowl test)”或“对比测试(versus test)”的测试。这种偏好可以来自任何动物的感觉，但是可以尤其涉及味道、余味、气味、口感和/或质地。
术语“宠物食物”或“宠物食品”或“最终宠物食品”是指供伴侣动物如猫、狗、豚鼠、兔、鸟和马食用的产品或组合物。例如但不作为限制，伴侣动物可以是“家养”的狗，例如，家犬(Canis lupus familiaris)。在某些实施方案中，伴侣动物可以是“家养”的猫，例如家猫(Felis domesticus)。“宠物食物”或“宠物食品”包括任何食物、饲料、点心、食品补充剂、液体、饮料、零食、玩具(可咀嚼和/或可食用的玩具)、膳食替代品或膳食替代物。
术语“人类食物”或“人类食品”或“最终人类食品”是指旨在供人类食用的产品或组合物。“人类食物”或“人类食品”包括任何食物、饲料、点心、食物补充剂、液体、饮料、零食、膳食替代品或膳食替代物。
在某些实施方案中，“食品”包括人类食品和/或宠物食品。
如本文所用，“营养全面的”是指基于例如伴侣动物营养领域中的公认或主管当局的建议以适当的量和比例包含宠物食品的预期接受者的所有已知所需营养物的宠物食品。因此，这些食物能够作为饮食摄入的唯一来源以维持生命，而无需添加补充营养源。
术语“原料”是指在被加工或制成最终宠物食品之前的植物和/或动物材料。在某些实施方案中，“原料”未被明显地(significantly)加工以在分析之前将其分离成单独的元素(例如，通过萃取、纯化、分馏和/或浓缩)。“原料”包括宠物食品的蛋白质来源。在某些实施方案中，原料是新的蛋白质来源，其不与人类食物来源(即，通常不被人类食用的蛋白质来源)竞争。在某些实施方案中，原料是人类食物链的副产物。在某些非限制性实施方案中，加工“原料”，例如，以在分析之前将其分离成单独的元素(例如，通过提取、纯化、分馏和/或浓缩)，然后根据本文描述的方法进行分析。
如本文所用，“风味组合物”是指在动物或人类中调节(包括增强、增加、加强、减少、抑制或诱导)天然或合成促味剂、风味剂、味觉谱、风味谱和/或质地谱的味道、气味、风味和/或质地的至少一种化合物或其生物学上可接受的盐。在某些实施方案中，风味组合物包含化合物或其生物学上可接受的盐的组合。在某些实施方案中，风味组合物包含一种或多种赋形剂。
如本文所用，“气味阻滞剂”、“气味阻滞剂产品”或“气味阻滞剂组合物”是指含有为物体提供令人反感的气味的至少一种化合物或其生物学上可接受的盐的产品或组合物。在某些实施方案中，气味阻滞剂阻止动物接触、接近、咀嚼、舔舐或食用物体，例如食物或液体产品。在某些实施方案中，所述物体是，例如但不限于，衣服、鞋、地毯、家具、家居品、农药、除草剂或有毒化合物。在某些实施方案中，该物体是另一种动物或动物本身。在其它实施方案中，该物体对动物有毒，或者在接触或摄取时对动物的健康有害。
如本文所用，术语“调节”或“修改”是指受体的量、质量或特定活性的效果的增加或减少和/或受体的表达、活性或功能的增加或减少。如本文所用，“调节剂”是指使用例如激动剂、拮抗剂、变构调节剂及它们的同源物包括片段、变体和模拟物的计算机模拟、体外和/或体内测定鉴定的任何抑制性或活化性化合物。
如本文所用，“抑制剂”或“拮抗剂”是指减少、降低、阻断、阻止、延迟激活、失活、脱敏或下调目标受体或途径的生物活性和/或表达的调节化合物。术语“拮抗剂”包括全部、部分和中性拮抗剂以及反向激动剂。如本文所用，“诱导物”、“激活剂”或“激动剂”是指增加、诱导、刺激、打开、激活、促进、增强激活、敏化或上调目标受体或途径的调节化合物。术语“激动剂”包括完全和部分激动剂。如本文所用的“变构调节剂”是指“正变构调节剂”和“负变构调节剂”。“正变构调节剂”是指由不同化合物与受体的结合引起的增加、诱导、刺激、打开、激活、促进、增强活化、敏化或上调目标受体或途径的调节化合物。“负变构调节剂”是指由不同化合物与受体的结合引起的减少、降低、阻断、阻止、延迟激活、失活、脱敏或下调目标受体或途径的生物活性和/或表达的调节化合物。
如本文所用，术语“载体”和“表达载体”是指线性或环状的DNA分子，其中可以整合适当大小的另一DNA序列片段。这样的一个或多个DNA片段可以包括提供由DNA序列片段编码的基因的转录的额外区段。额外的区段可包括但不限于：启动子、转录终止子、增强子、内部核糖进入位点、非翻译区、多聚腺苷酸化信号、选择标记物、复制起点等。表达载体通常衍生自质粒、粘粒、病毒载体和酵母人工染色体。载体通常是含有来自几种来源的DNA序列的重组分子。
术语“可操作地连接”当应用于例如表达载体中的DNA序列时，指示序列被排列为使得它们协同作用以实现它们的预期目的，即启动子序列允许启动转录，转录通过连接的编码序列继续直到终止信号。
如本文所用，术语“核酸分子”和“核苷酸序列”是指单链或双链共价连接的核苷酸序列，其中每个核苷酸上的3′和5′末端通过磷酸二酯键连接。核酸分子可以包括脱氧核糖核苷酸碱基或核糖核苷酸碱基，并且可以在体外合成制备或从天然来源分离。
本文可互换使用的术语“多肽”、“肽”、“氨基酸序列”和“蛋白质”是指由至少两个氨基酸的连接形成的分子。一个氨基酸残基与下一个氨基酸残基之间的连接是酰胺键，有时称为肽键。多肽可通过本领域已知的合适方法获得，包括从天然来源分离，在重组表达系统中表达，化学合成或酶促合成。该术语可适用于氨基酸聚合物，其中一个或多个氨基酸残基是相应天然存在的氨基酸的人工化学模拟物，以及适用于天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。
如本文所用，术语“氨基酸”是指天然存在的和合成的氨基酸，以及以与天然存在的氨基酸类似的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的那些氨基酸，以及后来进行修饰的那些氨基酸，例如羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物和衍生物可以指具有与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构的化合物，即与氢、羧基、氨基和R基团键合的碳，所述R基团例如，高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜和甲硫氨酸甲基锍。此类类似物可具有经修饰的R基团(例如正亮氨酸)或修饰的肽主链，但保留与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物是指具有不同于氨基酸的一般化学结构，但以与天然存在的氨基酸类似的方式起作用的结构的化合物。
本文可互换使用的术语“分离的”或“纯化的”是指从与其天然相关的组分中除去的核酸、多肽或其它生物学部分。术语“分离的”可以指与整个生物体分离和分开的多肽，其中该分子天然存在或在基本上不存在相同类型的其它生物大分子的情况下存在。关于多核苷酸的术语“分离的”可以指完全或部分缺乏通常天然与其相关的序列的核酸分子；或天然存在的但具有与其相关的异源序列的序列；或从染色体分离的分子。如本文所用，术语“重组”可用于描述核酸分子，并且是指基因组、RNA、DNA、cDNA、病毒、半合成或合成来源的多核苷酸，其由于其来源或操作而与其天然相关的全部或部分多核苷酸不相关。
如本文所用，术语“融合”是指通过遗传或化学方法连接不同的肽或蛋白质区段，其中肽或蛋白质区段的连接端可以彼此直接相邻或可以通过接头或间隔区部分如氨基酸残基或其它连接基团分离。
2.嗅觉受体
本公开的主题提供了用于所公开方法的嗅觉受体。本公开的嗅觉受体可包括哺乳动物嗅觉受体，例如但不限于人、犬科动物和猫科动物嗅觉受体。
在某些非限制性实施方案中，嗅觉受体是人嗅觉受体，例如人嗅觉受体HsOR17.1.11(hOR3A1)、HsOR1.4.8(hOR6P1)、HsOR11.3.14(hOR51E1)、HsOR11.3.40(hOR51L1)、HsOR14.1.27(hOR11H6)、HsOR11.13.7(hOR4D6)、HsOR14.2.5(hOR4E2)、HsOR16.1.3(hOR2C1)、HsOR11.13.6(hOR5A1)、HsOR11.18.36(hOR8B8)或它们的组合。
在某些非限制性实施方案中，嗅觉受体是犬科动物嗅觉受体，例如，犬科动物嗅觉受体CafaOR9.2.9、CafaOR38.1.21、CafaOR21.2.15、CafaOR21.2.43、CafaOR15.2.20、CafaOR18.3.11、CafaOR15.3.1、CafaOR6.3.1、CafaOR18.3.12、CafaOR5.2.5或它们的组合。在某些非限制性实施方案中，嗅觉受体是犬科动物嗅觉受体，其具有SEQ ID NO：61至SEQID NO：2260所示的核苷酸序列或氨基酸序列。
在某些非限制性实施方案中，嗅觉受体是猫科动物嗅觉受体，例如，猫科动物嗅觉受体E1：13347030-13347977、F1：65134904-65135858、D1：62955839-62956792、D1：63312327-63313289、B3：72908295-72909287、D1：105486528-105487493、B3：74116955-74117893、E3：40237904-40238842、D1：105462554-105463512、D1：21266824-21267768或它们的组合。在某些非限制性实施方案中，嗅觉受体是猫科动物嗅觉受体，其具有SEQ ID NO：2261至SEQ ID NO：3808中所示的核苷酸序列或氨基酸序列。
在工作实施例中测试的嗅觉受体及它们别名和组名称列于表1中。
表1
在某些实施方案中，用于本公开的方法的嗅觉受体包括犬科动物嗅觉受体，所述犬科动物嗅觉受体包含SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：20中所示的核苷酸序列，SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44、SEQ IDNO：45、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49或SEQ ID NO：50中所示的氨基酸序列，和/或SEQ ID NO：61至SEQ ID NO：2260中所示的核苷酸序列或氨基酸序列，包括它们的片段(例如，它们的功能片段)及它们的变体。
在某些实施方案中，用于本公开的方法的嗅觉受体包括猫科动物嗅觉受体，所述猫科动物嗅觉受体包含SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29或SEQ ID NO：30中所示的核苷酸序列，SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：54、SEQ IDNO：55、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：59或SEQ ID NO：60中所示的氨基酸序列，和/或SEQ ID NO：2261至SEQ ID NO：3808中所示的核苷酸序列或氨基酸序列，包括它们的片段(例如，它们的功能片段)及它们的变体。
在某些实施方案中，用于本公开主题的嗅觉受体可包括由以下核苷酸序列编码的受体：所述核苷酸序列是与SEQ ID NO：11至SEQ ID NO：30中的任一个至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同源的核苷酸序列和/或由SEQ ID NO：61至SEQ ID NO：3808所示的核苷酸序列(同源性，如本文使用的该术语，可以使用标准软件如BLAST或FASTA测量)，包括它们的片段(例如，它们的功能片段)。
在某些实施方案中，用于本公开的方法的嗅觉受体可包括包含以下氨基酸序列的受体：所述氨基酸序列是与SEQ ID NO：41至SEQ ID NO：60中任一个约33％至99％、约34％至99％、约35％至99％、约40％至约99％、约45％至99％、约50％至99％、约55％至99％、约60％至99％、约61％至99％、约65％至99％、约70％至99％、约72％至99％、约75％至99％、约79％至99％、约80％至99％、约84％至99％、约85％至99％、约87％至99％、约89％至99％、约90％至99％、约95％至99％或约97％至99％同源的氨基酸序列和/或SEQ ID NO：61至SEQ ID NO：3808所示的氨基酸序列(同源性，如本文所用的该术语，可使用标准软件如BLAST或FASTA测量)，包括它们的片段(例如，它们的功能片段)。
在某些实施方案中，用于本公开的方法的嗅觉受体可包括包含以下氨基酸序列的受体：所述氨基酸序列是与SEQ ID NO：41至SEQ ID NO：60中的任一个至少约33％、34％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、61％、65％、70％、72％、75％、79％、80％、84％、85％、87％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同源的氨基酸序列和/或SEQ ID NO：61至SEQ ID NO：3808中所示的氨基酸序列(同源性，如本文所用的该术语，可以使用标准软件如BLAST或FASTA测量)，包括它们的片段(例如，它们的功能片段)。
在某些实施方案中，嗅觉受体是犬科动物CafaOR9.2.9，所述犬科动物CafaOR9.2.9包含SEQ ID NO：41所示的氨基酸序列或与其至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同源的序列(同源性，如本文所用的该术语，可使用标准软件如BLAST或FASTA测量)，并且例如通过包含SEQ ID NO：11所示序列或与其至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同源的序列(同源性，如本文所用的该术语，可使用标准软件如BLAST或FASTA测量)包括它们的片段(例如，它们的功能片段)的核酸编码。
在某些实施方案中，嗅觉受体是犬科动物CafaOR38.1.21，所述犬科动物CafaOR38.1.21包含SEQ ID NO：42所示的氨基酸序列或与其至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同源的序列(同源性，如本文所用的该术语，可使用标准软件如BLAST或FASTA测量)，并且例如通过包含SEQ ID NO：12所示序列或与其至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同源的序列(同源性，如本文所用的该术语，可使用标准软件如BLAST或FASTA测量)包括它们的片段(例如，它们的功能片段)的核酸编码。
在某些实施方案中，嗅觉受体是犬科动物CafaOR21.2.15，所述犬科动物CafaOR21.2.15包含SEQ ID NO：43所示的氨基酸序列或与其至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同源的序列(同源性，如本文所用的该术语，可使用标准软件如BLAST或FASTA测量)，并且例如通过包含SEQ ID NO：13所示序列或与其至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同源的序列(同源性，如本文所用的该术语，可使用标准软件如BLAST或FASTA测量)包括它们的片段(例如，它们的功能片段)的核酸编码。
在某些实施方案中，嗅觉受体是犬科动物CafaOR21.2.43，所述犬科动物CafaOR21.2.43包含SEQ ID NO：44所示的氨基酸序列或与其至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同源的序列(同源性，如本文所用的该术语，可使用标准软件如BLAST或FASTA测量)，并且例如通过包含SEQ ID NO：14所示序列或与其至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同源的序列(同源性，如本文所用的该术语，可使用标准软件如BLAST或FASTA测量)包括它们的片段(例如，它们的功能片段)的核酸编码。
在某些实施方案中，嗅觉受体是犬科动物CafaOR15.2.20，所述犬科动物CafaOR15.2.20包含SEQ ID NO：45所示的氨基酸序列或与其至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同源的序列(同源性，如本文所用的该术语，可使用标准软件如BLAST或FASTA测量)，并且例如通过包含SEQ ID NO：15所示序列或与其至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同源的序列(同源性，如本文所用的该术语，可使用标准软件如BLAST或FASTA测量)包括它们的片段(例如，它们的功能片段)的核酸编码。
在某些实施方案中，嗅觉受体是犬科动物CafaOR18.3.11，所述犬科动物CafaOR18.3.11包含SEQ ID NO：46所示的氨基酸序列或与其至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同源的序列(同源性，如本文所用的该术语，可使用标准软件如BLAST或FASTA测量)，并且例如通过包含SEQ ID NO：16所示序列或与其至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同源的序列(同源性，如本文所用的该术语，可使用标准软件如BLAST或FASTA测量)包括它们的片段(例如，它们的功能片段)的核酸编码。
在某些实施方案中，嗅觉受体是犬科动物CafaOR15.3.1，所述犬科动物CafaOR15.3.1包含SEQ ID NO：47所示的氨基酸序列或与其至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同源的序列(同源性，如本文所用的该术语，可使用标准软件如BLAST或FASTA测量)，并且例如通过包含SEQ ID NO：17所示序列或与其至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同源的序列(同源性，如本文所用的该术语，可使用标准软件如BLAST或FASTA测量)包括它们的片段(例如，它们的功能片段)的核酸编码。
在某些实施方案中，嗅觉受体是犬科动物CafaOR6.3.1，所述犬科动物CafaOR6.3.1包含SEQ ID NO：48所示的氨基酸序列或与其至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同源的序列(同源性，如本文所用的该术语，可使用标准软件如BLAST或FASTA测量)，并且例如通过包含SEQ ID NO：18所示序列或与其至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同源的序列(同源性，如本文所用的该术语，可使用标准软件如BLAST或FASTA测量)包括它们的片段(例如，它们的功能片段)的核酸编码。
在某些实施方案中，嗅觉受体是犬科动物CafaOR18.3.12，所述犬科动物CafaOR18.3.12包含SEQ ID NO：49所示的氨基酸序列或与其至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同源的序列(同源性，如本文所用的该术语，可使用标准软件如BLAST或FASTA测量)，并且例如通过包含SEQ ID NO：19所示序列或与其至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同源的序列(同源性，如本文所用的该术语，可使用标准软件如BLAST或FASTA测量)包括它们的片段(例如，它们的功能片段)的核酸编码。
在某些实施方案中，嗅觉受体是犬科动物CafaOR5.2.5，所述犬科动物CafaOR5.2.5包含SEQ ID NO：50所示的氨基酸序列或与其至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同源的序列(同源性，如本文所用的该术语，可使用标准软件如BLAST或FASTA测量)，并且例如通过包含SEQ ID NO：20所示序列或与其至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同源的序列(同源性，如本文所用的该术语，可使用标准软件如BLAST或FASTA测量)包括它们的片段(例如，它们的功能片段)的核酸编码。
在某些实施方案中，嗅觉受体是猫科动物E1：13347030-13347977，所述猫科动物E1：13347030-13347977包含SEQ ID NO：51所示的氨基酸序列或与其至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同源的序列(同源性，如本文所用的该术语，可使用标准软件如BLAST或FASTA测量)，并且例如通过包含SEQ ID NO：21所示序列或与其至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同源的序列(同源性，如本文所用的该术语，可使用标准软件如BLAST或FASTA测量)包括它们的片段(例如，它们的功能片段)的核酸编码。
在某些实施方案中，嗅觉受体是猫科动物F1：65134904-65135858，所述猫科动物F1：65134904-65135858包含SEQ ID NO：52所示的氨基酸序列或与其至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同源的序列(同源性，如本文所用的该术语，可使用标准软件如BLAST或FASTA测量)，并且例如通过包含SEQ ID NO：22所示序列或与其至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同源的序列(同源性，如本文所用的该术语，可使用标准软件如BLAST或FASTA测量)包括它们的片段(例如，它们的功能片段)的核酸编码。
在某些实施方案中，嗅觉受体是猫科动物D1：62955839-62956792，所述猫科动物D1：62955839-62956792包含SEQ ID NO：53所示的氨基酸序列或与其至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同源的序列(同源性，如本文所用的该术语，可使用标准软件如BLAST或FASTA测量)，并且例如通过包含SEQ ID NO：23所示序列或与其至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同源的序列(同源性，如本文所用的该术语，可使用标准软件如BLAST或FASTA测量)包括它们的片段(例如，它们的功能片段)的核酸编码。
在某些实施方案中，嗅觉受体是猫科动物D1：63312327-63313289，所述猫科动物D1：63312327-63313289包含SEQ ID NO：54所示的氨基酸序列或与其至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同源的序列(同源性，如本文所用的该术语，可使用标准软件如BLAST或FASTA测量)，并且例如通过包含SEQ ID NO：24所示序列或与其至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同源的序列(同源性，如本文所用的该术语，可使用标准软件如BLAST或FASTA测量)包括它们的片段(例如，它们的功能片段)的核酸编码。
在某些实施方案中，嗅觉受体是猫科动物B3：72908295-72909287，所述猫科动物B3：72908295-72909287包含SEQ ID NO：55所示的氨基酸序列或与其至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同源的序列(同源性，如本文所用的该术语，可使用标准软件如BLAST或FASTA测量)，并且例如通过包含SEQ ID NO：25所示序列或与其至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同源的序列(同源性，如本文所用的该术语，可使用标准软件如BLAST或FASTA测量)包括它们的片段(例如，它们的功能片段)的核酸编码。
在某些实施方案中，嗅觉受体是猫科动物D1：105486528-105487493，所述猫科动物D1：105486528-105487493包含SEQ ID NO：56所示的氨基酸序列或与其至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同源的序列(同源性，如本文所用的该术语，可使用标准软件如BLAST或FASTA测量)，并且例如通过包含SEQ ID NO：26所示序列或与其至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同源的序列(同源性，如本文所用的该术语，可使用标准软件如BLAST或FASTA测量)包括它们的片段(例如，它们的功能片段)的核酸编码。
在某些实施方案中，嗅觉受体是猫科动物B3：74116955-74117893，所述猫科动物B3：74116955-74117893包含SEQ ID NO：57所示的氨基酸序列或与其至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同源的序列(同源性，如本文所用的该术语，可使用标准软件如BLAST或FASTA测量)，并且例如通过包含SEQ ID NO：27所示序列或与其至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同源的序列(同源性，如本文所用的该术语，可使用标准软件如BLAST或FASTA测量)包括它们的片段(例如，它们的功能片段)的核酸编码。
在某些实施方案中，嗅觉受体是猫科动物E3：40237904-40238842，所述猫科动物E3：40237904-40238842包含SEQ ID NO：58所示的氨基酸序列或与其至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同源的序列(同源性，如本文所用的该术语，可使用标准软件如BLAST或FASTA测量)，并且例如通过包含SEQ ID NO：28所示序列或与其至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同源的序列(同源性，如本文所用的该术语，可使用标准软件如BLAST或FASTA测量)包括它们的片段(例如，它们的功能片段)的核酸编码。
在某些实施方案中，嗅觉受体是猫科动物D1：105462554-105463512，所述猫科动物D1：105462554-105463512包含SEQ ID NO：59所示的氨基酸序列或与其至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同源的序列(同源性，如本文所用的该术语，可使用标准软件如BLAST或FASTA测量)，并且例如通过包含SEQ ID NO：29所示序列或与其至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同源的序列(同源性，如本文所用的该术语，可使用标准软件如BLAST或FASTA测量)包括它们的片段(例如，它们的功能片段)的核酸编码。
在某些实施方案中，嗅觉受体是猫科动物D1：21266824-21267768，所述猫科动物D1：21266824-21267768包含SEQ ID NO：60所示的氨基酸序列或与其至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同源的序列(同源性，如本文所用的该术语，可使用标准软件如BLAST或FASTA测量)，并且例如通过包含SEQ ID NO：30所示序列或与其至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同源的序列(同源性，如本文所用的该术语，可使用标准软件如BLAST或FASTA测量)包括它们的片段(例如，它们的功能片段)的核酸编码。
在某些实施方案中，同源性被描述为两个序列之间的同一性百分比。两个氨基酸序列或两个核苷酸序列的同一性百分比可通过为了最佳比较目的比对序列来确定(例如，可在第一序列中引入缺口以与序列最佳比对)并比较在相应的位置的氨基酸残基或核苷酸。同一性百分比可以通过所比较序列中相同的氨基酸残基或核苷酸的数量来确定(例如，同一性％＝相同位置的数目/位置的总数×100)。在某些实施方案中，嗅觉受体的片段(例如，它们的功能片段)包含至少约5、约10、约15、约20、约25、约30、约40、约50、约60、约70、约80、约90、约100、约125、约150、约175、约200、约250、约300或更多个氨基酸残基或它们的任何中间值或范围。在某些实施方案中，片段包含约5至约10、约5至约20、约5至约30、约5至约40、约5至约50、约10至约50、约10至约60、约10至约70、约10至约80、约10至约90、约10至约100、约20至约100、约50至约100、约50至约150、约50至约200、约50至约250、约100至约250或约100至约300个氨基酸残基或它们的任何中间范围。
两个序列之间百分比同一性的测定可以使用本领域技术人员已知的数学算法来确定。用于比较两个序列的数学算法的非限制性实例是Karlin与Altschul(1990)美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)87：2264-2268的算法，其修改为Karlin与Altschul(1993)美国国家科学院院刊90：5873-5877，其公开内容通过引用整体并入本文。Altschul等人(1990)分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)215：403-410的NBLAST和XBLAST程序已经并入了这样的算法。BLAST核苷酸搜索可以用NBLAST程序进行，例如得分＝100，字长＝12，以获得与本发明的核苷酸序列同源的核苷酸序列。BLAST蛋白质搜索可以用XBLAST程序进行，例如得分＝50，字长＝3，以获得与本发明的氨基酸序列同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的间隙比对(gapped alignment)，可以按Altschul等人(1997)核酸研究(NucleicAcids Res.)25：3389-3402中所述使用Gapped BLAST，其公开内容通过引用整体并入本文。或者，PSI-Blast可用于执行迭代搜索，其检测分子之间的距离关系。当使用BLAST、GappedBLAST和PSI-Blast程序时，可以使用相应程序(例如，XBLAST和NBLAST)的默认参数。参见http：//www.ncbi.nlm.nih.gov。用于比较序列的数学算法的另外的非限制性实例是Myers和Miller，CABIOS(1989)的算法，其公开内容通过引用整体并入本文。作为CGC序列比对软件包的一部分的ALIGN程序(版本2.0)已经并入了这样的算法。本领域已知的用于序列分析的算法的其它非限制性实例包括ADVANCE和ADAM，如Torellis和Robotti(1994)(生物科学的计算机应用)(Comput.Appl.Biosci.)，10：3-5；和Pearson和Lipman(1988)国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.)85：2444-8中所描述，其公开内容通过引用整体并入本文。在FASTA中，ktup是设置搜索的灵敏度和速度的控制选项。在某些实施方案中，所公开的主题提供分离的或纯化的嗅觉受体和/或其变体和片段的用途。所公开的主题还包括序列变体的用途。在某些实施方案中，变异可以发生在嗅觉受体的核苷酸序列的编码区和非编码区之一或两者中。变体可包括在生物体中由相同遗传基因座编码的基本上同源的蛋白质，即等位基因变体。变体还包括来自生物体例如人、犬科动物和猫科动物中其它遗传基因座的蛋白质，但与嗅觉受体具有基本同源性，即同源物(homolog)。变体还可以包括与嗅觉受体基本同源但来源于另一种生物体的蛋白质，即直系同源物(ortholog)。变体还包括通过化学合成产生的与嗅觉受体基本同源的蛋白质。变体还包括通过重组方法产生的与嗅觉受体基本同源的蛋白质。可以使用本领域熟知的方法鉴定直系同源物、同源物和等位基因变体。这些变体可包括编码受体的核苷酸序列，其与SEQ ID NO：11至SEQ ID NO：30中任一个所示的核苷酸序列、或在SEQ ID NO：61至SEQ ID NO：3808的核苷酸序列中的任一个或它们的片段具有至少约60-65％、约65-70％、约70-75％、约80-85％、约90-95％、约95-99％或更高的同源性。这样的核酸分子可以容易地鉴定为能够在严格条件下与SEQ ID NO：11至SEQ IDNO：30中任一个所示的核苷酸序列、或在SEQ ID NO：61至SEQ ID NO：3808的核苷酸序列中的任一个或它们的片段杂交。在某些实施方案中，当氨基酸序列与SEQ ID NO：41至SEQ IDNO：60中任一个所示的氨基酸序列、或在SEQ ID NO：61至SEQ ID NO：3808的氨基酸序列中的任一个或它们的片段具有至少约60-65％、约65-70％、约70-75％、约80-85％、约90-95％、约95-99％或更高的同源性时，两个多肽(或它们的区域)基本上是同源的。根据所公开的主题，基本上同源的氨基酸序列将由与SEQ ID NO：41至SEQ ID NO：60中任一个所示的核苷酸序列的核苷酸序列或其部分、或在SEQ ID NO：61至SEQ ID NO：3808的氨基酸序列中的任一个杂交的核酸序列在严格条件下编码。
用于所公开的主题的方法中的嗅觉受体包括具有添加添加、缺失或取代的氨基酸残基(变体)的嗅觉受体，其基本上不改变受体的生物活性。例如，可以改变而不影响生物活性的嗅觉受体的那些单个位点或区域可以通过例如检查嗅觉受体细胞外结构域的结构来确定。或者和/或另外，可以凭经验通过丙氨酸扫描诱变确定容许氨基酸取代的那些受体区域(Cunningham等人，科学(Science)244，1081-1085(1989)，其公开内容通过引用整体并入本文)。在丙氨酸扫描诱变方法中，所选择的氨基酸残基分别被中性氨基酸(例如丙氨酸)替换，以确定对生物活性的影响。通常认为保守氨基酸变化最不可能扰乱多肽的结构和/或功能。因此，所公开的主题包括嗅觉受体内的一个或多个保守氨基酸变化。保守氨基酸变化通常涉及用结构和/或功能相似的一种氨基酸取代另一种氨基酸(例如，具有大小、电荷和形状类似的侧链的氨基酸)。本领域已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括具有碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电的极性侧链(如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β-分支侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。在某些实施方案中，嗅觉受体内的一个或多个氨基酸残基可以被来自相同侧链家族的其它氨基酸残基替换，并且可以使用本文所述的功能测定法来测定改变的蛋白质的所保留功能。可以通过本领域已知的标准技术，例如定点诱变和PCR介导的诱变，将修饰引入本公开的嗅觉受体中。如果这种替换导致生物活性的保留，则可以引入更多实质性变化和/或可以进行其它的添加/缺失并筛选所得产物。在某些实施方案中，缺失或添加可以是5-10个残基、或者2-5个氨基酸残基或1-2个残基以及它们之间的值。
本发明公开的主题还提供了编码嗅觉受体的分离的核酸，包括它们的片段(例如，它们的功能片段)。本公开的嗅觉受体可包括哺乳动物嗅觉受体，例如但不限于人、犬科动物和猫科动物的嗅觉受体。分离的核酸可以是基因组DNA、cDNA和RNA(例如，mRNA)。
在某些非限制性实施方案中，嗅觉受体是犬科动物嗅觉受体，例如，犬科动物嗅觉受体CafaOR9.2.9、CafaOR38.1.21、CafaOR21.2.15、CafaOR21.2.43、CafaOR15.2.20、CafaOR18.3.11、CafaOR15.3.1、CafaOR6.3.1、CafaOR18.3.12、CafaOR5.2.5，包括它们的片段(例如，它们的功能片段)，或它们的组合。在某些实施方案中，嗅觉受体包含SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ IDNO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：20所示的核苷酸序列，包括它们的片段(例如，它们的功能片段)。在某些实施方案中，嗅觉受体包含SEQ ID NO：61至SEQ ID NO：2260所示的核苷酸序列，包括它们的片段(例如，它们的功能片段)。
在某些非限制性实施方案中，嗅觉受体是猫科动物嗅觉受体，例如，猫科动物嗅觉受体E1：13347030-13347977、F1：65134904-65135858、D1：62955839-62956792、D1：63312327-63313289、B3：72908295-72909287、D1：105486528-105487493、B3：74116955-74117893、E3：40237904-40238842、D1：105462554-105463512、D1：21266824-21267768，包括它们的片段(例如，它们的功能片段)，或它们的组合。在某些实施方案中，嗅觉受体包含SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29或SEQ ID NO：30中所示的核苷酸序列，包括它们的片段(例如，它们的功能片段)。在某些实施方案中，嗅觉受体包含在SEQ ID NO：2261至SEQ ID NO：3808中所示的核苷酸序列，包括它们的片段(例如，它们的功能片段)。
所公开的主题还提供了包含嗅觉受体或其片段的融合蛋白。在某些实施方案中，所公开的主题提供了嗅觉受体或其功能片段和免疫球蛋白重链恒定区的融合蛋白。在某些实施方案中，本公开的融合蛋白可包括可检测标记物、官能团如载体、标记、稳定序列或可检测嗅觉受体激动剂结合的机制。标记的非限制性实施方案包括FLAG标签、His标签、MYC标签、麦芽糖结合蛋白和本领域已知的其它标签。本公开的主题还提供了编码这种融合蛋白的核酸，含有编码融合蛋白的核酸的载体和含有这样的核酸或载体的宿主细胞。在某些实施方案中，可以在嗅觉受体的氨基末端(N末端)或嗅觉受体的羧基末端(C末端)进行融合。在某些实施方案中，本文公开的嗅觉受体可以在序列的N末端和/或C末端含有额外的氨基酸，例如，当用于所公开的主题的方法时。在某些实施方案中，额外的氨基酸可以帮助固定多肽用于筛选目的，或者允许多肽成为融合蛋白的一部分，如上所述，以便于检测生物活性。
3.鉴定嗅觉受体调节化合物的方法
本公开还提供了用于鉴定调节嗅觉受体的活性和/或表达的化合物的方法。例如但不作为限制，调节剂可以是激动剂(例如，完全或部分激动剂)或拮抗剂或反向激动剂或变构调节剂。本公开的主题提供了用于鉴定调节上文公开的嗅觉受体的活性和/或表达的化合物的计算机模拟和体外方法。3.1计算机模拟方法
本公开的主题还提供了用于鉴定能够与嗅觉受体有潜在相互作用的化合物和/或调节嗅觉受体的活性和/或表达的化合物的计算机模拟方法。
在某些实施方案中，该方法可包括预测嗅觉受体的三维结构(3D)并用推定的嗅觉受体调节化合物(即测试化合物)筛选预测的3D结构。该方法可以进一步包括通过分析与推定的化合物和受体的氨基酸的潜在相互作用来预测推定的化合物是否会与受体的结合位点相互作用。该方法可以进一步包括通过确定化合物的3D结构是否适合在受体的3D结构的结合位点内来鉴定可以结合和/或调节嗅觉受体的生物活性的测试化合物。在某些实施方案中，用于所公开方法的嗅觉受体可以是犬科动物受体CafaOR9.2.9、CafaOR38.1.21、CafaOR21.2.15、CafaOR21.2.43、CafaOR15.2.20、CafaOR18.3.11、CafaOR15.3.1、CafaOR6.3.1、CafaOR18.3.12、CafaOR5.2.5或它们的组合。在某些非限制性实施方案中，嗅觉受体是SEQ ID NO：61至SEQ ID NO：2260中描述的犬科动物嗅觉受体。
在某些实施方案中，用于所公开方法的嗅觉受体可以是猫科动物受体E1：13347030-13347977、F1：65134904-65135858、D1：62955839-62956792、D1：63312327-63313289、B3：72908295-72909287、D1：105486528-105487493、B3：74116955-74117893、E3：40237904-40238842、D1：105462554-105463512和D1：21266824-21267768或它们的组合。在某些非限制性实施方案中，嗅觉受体是SEQ ID NO：2261至SEQ ID NO：3808中描述的猫科动物嗅觉受体。
在其它实施方案中，用于所公开方法的嗅觉受体可具有SEQ ID NO：41至SEQ IDNO：60中任一个的氨基酸序列或SEQ ID NO：61至SEQ ID NO：3808中的任一个的氨基酸序列或其片段或变体。在某些实施方案中，用于本公开主题的嗅觉受体可包括这样的受体，所述受体包含与SEQ ID NO：41至SEQ ID NO：60中的任一个或SEQ ID NO：61-至SEQ ID NO：3808中的任一个氨基酸序列或其片段或变体具有至少约33％、34％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、61％、65％、70％、72％、75％、79％、80％、84％、85％、87％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，用于所公开方法的嗅觉受体可以由SEQ ID NO：11至SEQ ID NO：30中任一个的核苷酸序列或SEQ ID NO：61至SEQ ID NO：3808中的任一核苷酸序列或其片段或变体编码。在某些实施方案中，用于本公开的主题的嗅觉受体可以包括这样的受体，所述受体由与SEQ ID NO：11至SEQ ID NO：30中的任一个或在SEQ ID NO：61至SEQ ID NO：3808中的任一个核苷酸序列或其片段或变体具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的核苷酸序列编码。
可以使用所公开的方法测试的化合物(例如，潜在的嗅觉受体调节剂)的非限制性实例包括任何小的化学化合物或任何生物实体，例如本领域已知的肽、盐、氨基酸和气味化合物，例如雄甾烯酮(androstenone)。在某些实施方案中，测试化合物可以是小化学分子。
在某些实施方案中，可以使用其它GPCR的晶体结构作为用于同源建模的模板来构建嗅觉受体的结构模型。例如，但不作为限制，可以使用GPCR的晶体结构产生结构模型。在某些实施方案中，嗅觉受体的结构模型可以基于已知的GPCR的晶体结构或者已知的GPCR的晶体结构的组合。(参见，例如Lee等人，欧洲药理学杂志(Eur J Pharmacol)，2015年5月14日，pii：S0014-2999(15)30012-1，其通过引用整体并入本文)。在某些实施方案中，嗅觉受体的结构模型可以基于来自蛋白质数据库(PDB)的β2肾上腺素能受体3SN6的晶体结构产生。(参见，例如，Rasmussen等人，自然(Nature)，2011 Jul 19；477(7366)：549-55，其通过引用整体并入本文)。在某些实施方案中，可以基于来自PDB的现有GPCR晶体结构3SN6的晶体结构产生嗅觉受体的7跨膜结构域(7TM)的结构模型。在某些实施方案中，嗅觉受体的结构模型可以使用I-TASSER程序套件(Yang等人，自然方法(Nat Methods)，12：7-8(2015)，其通过引用整体并入本文)和Modeller(Eswar等人，现代生物信息学方法(Curr ProtocBioinformatics)，15：5.6.1-5.6.30(2006)，其通过引用整体并入本文)构建，Modeller是来自Accelrys的DiscoveryStudio(DS)程序套件的一部分(DiscoveryStudio(DS)是来自Accelrys公司的交互式建模和模拟程序的套件)。可以使用本领域已知的任何合适的建模软件。在某些实施方案中，Modeller软件包可用于产生三维蛋白质结构。
在某些实施方案中，鉴定结合嗅觉受体的化合物的计算机模拟方法包括确定测试化合物是否与嗅觉受体结合袋中的一个或多个氨基酸相互作用，如本文所述。
可以使用本文公开的体外和体内方法进一步测试通过所公开的计算机模拟方法鉴定的化合物。
3.2嗅觉受体跨膜化合物结合位点
本申请提供了筛选调节嗅觉受体例如犬科动物或猫科动物的嗅觉受体的活性的化合物的方法，其中所述化合物与嗅觉受体的一个或多个氨基酸相互作用。在某些实施方案中，嗅觉受体的结合位点包含受体的7TM结构域内的氨基酸，并且可以通过使用计算机模拟建模产生受体的相互作用图来鉴定，如本文所述。在一个非限制性实例中，7TM相互作用图中氨基酸的存在意味着残基位于配体结合环境附近，与配体相互作用。
在某些实施方案中，化合物与本文所述的嗅觉受体的一个或多个氨基酸之间的相互作用可包括一个或多个氢键、共价键、非共价键、盐桥、物理相互作用及它们的组合。相互作用还可以是本领域已知的配体受体相互作用的任何相互作用特征。这种相互作用可以通过例如定点诱变、X射线晶体学、X射线或其它光谱方法、核磁共振(NMR)、交联评估(coss-linking assessment)、质谱或电泳、低温显微镜(cryo-microscopy)、基于已知激动剂的置换测定法、结构测定和它们的组合来测定。在某些实施方案中，相互作用是计算机模拟测定的，例如通过理论手段，例如使用分子对接、分子建模、分子模拟或本领域普通技术人员已知的其它手段将化合物对接到如本文所述的猫科动物或犬科动物的嗅觉受体结合袋中。在某些实施方案中，7TM相互作用图中的氨基酸与配体之间的相互作用是π-π相互作用。
在某些实施方案中，7TM相互作用图中的氨基酸与配体之间的相互作用是氢键相互作用。
在某些实施方案中，7TM相互作用图中的氨基酸与配体之间的相互作用是疏水相互作用。
在某些实施方案中，7TM相互作用图中的氨基酸与配体之间的相互作用是范德华相互作用。
在某些实施方案中，7TM相互作用图中的氨基酸是极性氨基酸，其中氨基酸与作为氢键供体和/或受体的配体相互作用。
在某些实施方案中，化合物与本文所述的嗅觉受体的一个或多个氨基酸之间的相互作用可包括一个或多个氢键、共价键、非共价键、盐桥、物理相互作用及它们的组合。相互作用还可以是本领域已知的配体受体相互作用的任何相互作用特征。这种相互作用可以通过例如定点诱变、X射线晶体学、X射线或其它光谱方法、核磁共振(NMR)、交联评估、质谱或电泳、低温显微镜、基于已知激动剂的置换测定法、结构测定和它们的组合来确定。在某些实施方案中，相互作用是在计算机模拟中测定的，例如通过理论手段，例如使用分子对接、分子建模、分子模拟或本领域普通技术人员已知的其它手段将化合物对接到嗅觉受体结合袋中。
在某些实施方案中，嗅觉受体是犬科动物嗅觉受体，例如但不限于CafaOR9.2.9、CafaOR38.1.21、CafaOR21.2.15、CafaOR21.2.43、CafaOR15.2.20、CafaOR18.3.11、CafaOR15.3.1、CafaOR6.3.1、CafaOR18.3.12或CafaOR5.2.5。在某些非限制性实施方案中，嗅觉受体是SEQ ID NO：61至SEQ ID NO：2260中描述的犬科动物嗅觉受体。
在某些实施方案中，嗅觉受体是猫科动物嗅觉受体，例如但不限于E1：13347030-13347977、F1：65134904-65135858、D1：62955839-62956792、D1：63312327-63313289、B3：72908295-72909287、D1：105486528-105487493、B3：74116955-74117893、E3：40237904-40238842、D1：105462554-105463512或D1：21266824-21267768。在某些非限制性实施方案中，嗅觉受体是SEQ ID NO：2261至SEQ ID NO：3808中描述的猫科动物嗅觉受体。
在某些实施方案中，根据本文所述的相互作用的任何组合，例如一种、两种、三种或更多种相互作用，所述化合物与本文所述的一种或多种嗅觉受体相互作用。
在某些实施方案中，化合物与至少一种本文所述的受体结合。在某些实施方案中，化合物选择性地结合至本文所述的受体中的仅一种。
在一个实施方案中，嗅觉受体是犬科动物CafaOR9.2.9。在某些实施方案中，与化合物相互作用的氨基酸残基包括CafaOR9.2.9残基Gln103，例如通过氢键或盐桥相互作用，如CafaOR9.2.9中铃兰醛(Lilial)的计算机模拟建模所示例的(图2)。或者或另外，在某些实施方案中，与化合物相互作用的氨基酸包括CafaOR9.2.9残基Leu104、Lys275、Arg87、Val81、Met84、Val279、Tyr262、Met209、Gly258、Val111、Tyr255、Thr282、Phe107和/或Thr80，其单独存在或者结合上面列出的与Gln103的相互作用，例如通过极性、环堆积、盐桥、氢键、π相互作用、带电相互作用、范德华相互作用或疏水相互作用，如在CafaOR9.2.9中铃兰醛的计算机模拟建模所示例的(图2)。或者或另外，在某些实施方案中，与化合物相互作用的氨基酸包括CafaOR9.2.9残基Gln103、Leu104、Lys275、Arg87、Val81、Met84、Val279、Tyr262、Met209、Gly258、Val111、Tyr255、Thr282、Phe107和Thr80中的任意一个、两个、三个或更多个，例如通过极性、环堆积、盐桥、氢键、π相互作用或带电相互作用、范德华相互作用、疏水相互作用或其它相互作用，如CafaOR9.2.9中铃兰醛的计算机模拟建模所示例的(图2)。
在一个实施方案中，嗅觉受体是犬科动物CafaOR38.1.21。在某些实施方案中，与化合物相互作用的氨基酸残基包括CafaOR38.1.21残基Lys273，例如通过氢键或盐桥相互作用，如CafaOR38.1.21中对茴香醛的计算机模拟建模所示例的(图3)。或者或另外，在某些实施方案中，与化合物相互作用的氨基酸包括CafaOR38.1.21残基Thr78、Leu82、Tyr260、Thr256、Tyr253和/或Phe105，其单独存在或者结合上面列出的与Lys273的相互作用，例如通过极性、环堆积、盐桥、氢键、π相互作用、带电相互作用、范德华相互作用或疏水相互作用，如在CafaOR38.1.21中对茴香醛的计算机模拟建模所示例的(图3)。或者或另外，在某些实施方案中，与化合物相互作用的氨基酸包括CafaOR38.1.21残基Lys273、Thr78、Leu82、Tyr260、Thr256、Tyr253和Phe105中的任意一个、两个、三个或更多个，例如通过极性、环堆积、盐桥、氢键、π相互作用或带电相互作用、范德华相互作用、疏水相互作用或其它相互作用，如CafaOR38.1.21中对茴香醛的计算机模拟建模所示例的(图3)。
在一个实施方案中，嗅觉受体是犬科动物CafaOR21.2.15。在某些实施方案中，与化合物相互作用的氨基酸包括CafaOR21.2.15残基Met83、His107、Ile106、Leu182、Asn197、Gly201、Val204、Ser260、Phe256和/或Leu273，例如通过极性、环堆积、盐桥、氢键、π相互作用、带电相互作用、范德华相互作用或疏水相互作用，如CafaOR21.2.15中(+)-薄荷醇的计算机模拟建模所示例的(图4)。或者或另外，某些实施方案中，与化合物相互作用的氨基酸包括CafaOR21.2.15残基Met103、Met83、His107、Ile106、Leu182、Asn197、Gly201、Val204、Ser260、Phe256和Leu273中的任意一个、两个、三个或更多个，例如通过极性、环堆积、盐桥、氢键、π相互作用或带电相互作用、范德华相互作用、疏水相互作用或其它相互作用，如CafaOR21.2.15中(+)-薄荷醇的计算机模拟建模所示例的(图4)。
在一个实施方案中，嗅觉受体是犬科动物CafaOR21.2.43。在某些实施方案中，与化合物相互作用的氨基酸包括CafaOR21.2.43残基Met80、Met88、Leu108、Ile111、His112、Thr115、Val209、Val210、Thr213、Leu214、Val262、Ile263、Ser266、Ile281、Ala284和/或Leu288，例如通过极性、环堆积、盐桥、氢键、π相互作用、带电相互作用、范德华相互作用或疏水相互作用，如CafaOR21.2.43中雄甾二烯酮的计算机模拟建模所示例的(图5)。或者或另外，某些实施方案中，与化合物相互作用的氨基酸包括CafaOR21.2.43残基Asp285、Met80、Met88、Leu108、Ile111、His112、Thr115、Val209、Val210、Thr213、Leu214，Val262、Ile263、Ser266、Ile281、Ala284和Leu288中的任意一个、两个、三个或更多个，例如通过极性、环堆积、盐桥、氢键、π相互作用或带电相互作用、范德华相互作用、疏水相互作用或其它相互作用，如CafaOR21.2.43中雄甾二烯酮的计算机模拟建模所示例的(图5)。
在一个实施方案中，嗅觉受体是猫科动物catGr5(B3：72908295-72909287)。在某些实施方案中，与化合物相互作用的氨基酸残基包括catGr5(B3：72908295-72909287)残基Tyr277，例如通过氢键或盐桥相互作用，如catGr5(B3：72908295-72909287)中异丁酸的计算机模拟建模所示例的(图6)。或者或另外，在某些实施方案中，与化合物相互作用的氨基酸包括catGr5(B3：72908295-72909287)残基Phe119、Pro177、Leu180、Ile181、Pro199、Cys217和/或Phe220，其单独存在或者结合上面列出的相互作用，例如通过极性、环堆积、盐桥、氢键、π相互作用、带电相互作用、范德华相互作用或疏水相互作用，如在catGr5(B3：72908295-72909287)中异丁酸的计算机模拟建模所示例的(图6)。或者或另外，在某些实施方案中，与化合物相互作用的氨基酸包括CafaOR9.2.9残基Tyr277、Lys290、Phe119、Pro177、Leu180、Ile181、Pro199、Cys217和Phe220中的任意一个、两个、三个或更多个，例如通过极性、环堆积、盐桥、氢键、π相互作用或带电相互作用、范德华相互作用、疏水相互作用或其它相互作用，如catGr5(B3：72908295-72909287)中异丁酸的计算机模拟建模所示例的(图6)。
在一个实施方案中，嗅觉受体是猫科动物catGr6(D1：105486528-105487493)。在某些实施方案中，与化合物相互作用的氨基酸残基包括catGr6(D1：105486528-105487493)残基Tyr265，例如通过氢键或盐桥相互作用，如catGr6(D1：105486528-105487493)中β-紫罗兰酮的计算机模拟建模所示例的(图7)。或者或另外，在某些实施方案中，与化合物相互作用的氨基酸包括catGr6(D1：105486528-105487493)残基Phe88、Phe111、Met170、Met206、Cys261、Ile264、Ser279、Ile280和/或Thr283，其单独存在或者结合上面列出的相互作用，例如通过极性、环堆积、盐桥、氢键、π相互作用、带电相互作用、范德华相互作用或疏水相互作用，如在catGr6(D1：105486528-105487493)中β-紫罗兰酮的计算机模拟建模所示例的(图7)。或者或另外，在某些实施方案中，与化合物相互作用的氨基酸包括catGr6(D1：105486528-105487493)残基His112、Asn209、Tyr265、Phe88、Phe111、Met170、Met206、Cys261、Ile264、Ser279、Ile280和Thr283中的任意一个、两个、三个或更多个，例如通过极性、环堆积、盐桥、氢键、π相互作用或带电相互作用、范德华相互作用、疏水相互作用或其它相互作用，如catGr6(D1：105486528-105487493)中β-紫罗兰酮的计算机模拟建模所示例的(图7)。
在一个实施方案中，嗅觉受体是猫科动物catG7(B3：74116955-74117893)。在某些实施方案中，与化合物相互作用的氨基酸残基包括catG7(B3：74116955-74117893)残基Met81、Tyr258和Gln100，例如通过氢键或盐桥相互作用，如catG7(B3：74116955-74117893)中乙酸戊酯的计算机模拟建模所示例的(图8)。或者或另外，在某些实施方案中，与化合物相互作用的氨基酸包括catG7(B3：74116955-74117893)残基Thr77、Lys269、Leu104、Thr276、Val277、His73、Val273和/或Val78，其单独存在或者结合上面列出的相互作用，例如通过极性、环堆积、盐桥、氢键、π相互作用、带电相互作用、范德华相互作用或疏水相互作用，如在catG7(B3：74116955-74117893)中乙酸戊酯的计算机模拟建模所示例的(图8)。或者或另外，在某些实施方案中，与化合物相互作用的氨基酸包括catG7(B3：74116955-74117893)残基Met81、Tyr258、Gln100、Thr77、Lys269、Leu104、Thr276、Val277、His73，Val273和Val78中的任意一个、两个、三个或更多个，例如通过极性、环堆积、盐桥、氢键、π相互作用或带电相互作用、范德华相互作用、疏水相互作用或其它相互作用，如catG7(B3：74116955-74117893)中乙酸戊酯的计算机模拟建模所示例的(图8)。
在一个实施方案中，嗅觉受体是猫科动物catG8(E3：40237904-40238842)。在某些实施方案中，与化合物相互作用的氨基酸包括catG8(E3：40237904-40238842)残基Leu101、Phe104、Leu105、Gly108、Glu180、Val202、Phe206、Tyr259和/或Lys272，例如通过极性、环堆积、盐桥、氢键、π相互作用、带电相互作用、范德华相互作用或疏水相互作用，如catG8(E3：40237904-40238842)中1-壬硫醇的计算机模拟建模所示例的(图9)。或者或另外，某些实施方案中，与化合物相互作用的氨基酸包括catG8(E3：40237904-40238842)残基Met81、Leu101、Phe104、Leu105、Gly108、Glu180、Val202、Phe206、Tyr259和Lys272中的任意一个、两个、三个或更多个，例如通过极性、环堆积、盐桥、氢键、π相互作用或带电相互作用、范德华相互作用、疏水相互作用或其它相互作用，如catG8(E3：40237904-40238842)中1-壬硫醇的计算机模拟建模所示例的(图9)。
在一个实施方案中，嗅觉受体是猫科动物catG9(D1：105462554-105463512)。在某些实施方案中，与化合物相互作用的氨基酸残基包括catG9(D1：105462554-105463512)残基Lys278，例如通过氢键或盐桥相互作用，如catG9(D1：105462554-105463512)中β-紫罗兰酮的计算机模拟建模所示例的(图10)。或者或另外，在某些实施方案中，与化合物相互作用的氨基酸包括catG9(D1：105462554-105463512)残基Phel10、Val111、G1y114、Val208、Ile212、Phe258、Ala261、Leu262、Tyr265、Val282和/或Ser285，其单独存在或者结合上面列出的相互作用，例如通过极性、环堆积、盐桥、氢键、π相互作用、带电相互作用、范德华相互作用或疏水相互作用，如在catG9(D1：105462554-105463512)中β-紫罗兰酮的计算机模拟建模所示例的(图10)。或者或另外，在某些实施方案中，与化合物相互作用的氨基酸包括catG9(D1：105462554-105463512)残基Tyr79、Lys278、Phe110、Val111、Gly114、Val208、Ile212、Phe258、Ala261、Leu262、Tyr265、Val282和Ser285中的任意一个、两个、三个或更多个，例如通过极性、环堆积、盐桥、氢键、π相互作用或带电相互作用、范德华相互作用、疏水相互作用或其它相互作用，如catG9(D1：105462554-105463512)中β-紫罗兰酮的计算机模拟建模所示例的(图10)。
在一个实施方案中，嗅觉受体是犬科动物CafaOR5.2.5。在某些实施方案中，与化合物相互作用的氨基酸包括CafaOR5.2.5残基Tyr77、Phe108、Val112、Serl16、Val206、Asp210、Phe256和/或Thr283，例如通过极性、环堆积、盐桥、氢键、π相互作用、带电相互作用、范德华相互作用或疏水相互作用，如CafaOR5.2.5中香豆素的计算机模拟建模所示例的(图11)。或者或另外，某些实施方案中，与化合物相互作用的氨基酸包括CafaOR5.2.5残基Tyr263、Tyr77、Phe108、Val112、Ser116、Val206、Asp210、Phe256和Thr283中的任意一个、两个、三个或更多个，例如通过极性、环堆积、盐桥、氢键、π相互作用或带电相互作用、范德华相互作用、疏水相互作用或其它相互作用，如CafaOR5.2.5中香豆素的计算机模拟建模所示例的(图11)。
在某些实施方案中，化合物与本文所述的任意一种或多种人、犬科动物或猫科动物嗅觉受体相互作用，其中所述化合物与所述受体的7TM结构域中存在的一个或多个氨基酸残基相互作用。所述受体的EC2环位于受体活性位点袋的入口处。在某些实施方案中，存在于嗅觉受体的EC2环中的氨基酸残基与本文所述的化合物相互作用。
3.3体外方法
本公开的主题还提供了用于鉴定产生可调节嗅觉受体的活性和/或表达的宠物食物、食品或化合物的原料的体外方法。
用于本公开的方法的嗅觉受体可包括本文公开的分离的或重组的嗅觉受体或表达嗅觉受体的细胞。在某些实施方案中，用于所公开方法的嗅觉受体可包含SEQ ID NO：41至SEQ ID NO：60中任一个的氨基酸序列或SEQ ID NO：61至SEQ ID NO：3808中的任一个氨基酸序列或其片段或变体。在某些实施方案中，用于所公开方法的嗅觉受体可以与SEQ IDNO：41至SEQ ID NO：60中任一个的氨基酸序列或SEQ ID NO：61至SEQ ID NO：3808中的任一个氨基酸序列或其片段或变体具有至少约33％、34％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、61％、65％、70％、72％、75％、79％、80％、84％、85％、87％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。在某些实施方案中，用于所公开方法的嗅觉受体可以由包含SEQ ID NO：11至SEQ ID NO：30中任一个或SEQ ID NO：61至SEQ ID NO：3808中的任一个核苷酸序列或其片段或变体的核苷酸序列编码。在某些实施方案中，用于本公开主题的嗅觉受体可包括受体，所述受体由与SEQ ID NO：11至SEQ ID NO：30中任一个或SEQ ID NO：61至SEQ ID NO：3808中的任一个核苷酸序列或其片段或变体具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的核苷酸序列编码。
在某些实施方案中，用于鉴定调节嗅觉受体的活性和/或表达的化合物的方法包括在不存在和/或存在测试化合物的情况下，测量嗅觉受体的生物活性。在某些实施方案中，该方法可包括在不同浓度的测试化合物的存在下测量嗅觉受体的生物活性。该方法还可以包括鉴定与不存在测试化合物时嗅觉受体的活性和/或表达相比，导致嗅觉受体的活性和/或表达的调节的测试化合物。
在某些实施方案中，该方法可以进一步包括组合分析两种或更多种、三种或更多种或者四种或更多种测试化合物。在某些实施方案中，两种或更多种、三种或更多种或者四种或更多种测试化合物可以来自不同类别的化合物，例如氨基酸和小的化合物。例如但不作为限制，该方法可包括在一种或多种氨基酸测试化合物存在下分析一种或多种小化学测试化合物对嗅觉受体的生物活性和/或表达的影响。在某些实施方案中，鉴定化合物对嗅觉受体的活性和/或表达的影响的方法包括在嗅觉受体配体(例如添味剂或嗅觉受体激动剂/拮抗剂)的存在下分析测试化合物对嗅觉受体的生物活性和/或表达的影响。
在某些实施方案中，鉴定可调节嗅觉受体的活性和/或表达的化合物的方法包括在细胞系中表达嗅觉受体并在存在和/或不存在测试化合物的情况下测量受体的生物活性。该方法可以进一步包括通过确定与不存在测试化合物时受体活性相比测试化合物存在下受体活化是否不同来鉴定调节受体活性的测试化合物。在某些实施方案中，该方法可包括在不同浓度的试验化合物的存在下测量嗅觉受体的生物活性。在某些实施方案中，推定的嗅觉受体调节剂的选择性可以通过比较其对其它GPCR或嗅觉受体的作用来评估。
在某些实施方案中，根据本文所述的方法鉴定的化合物与不存在化合物时嗅觉受体的生物活性相比，以至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％或更多增加或降低嗅觉受体的生物活性。
在某些实施方案中，鉴定调节嗅觉受体的活性和/或表达的化合物的方法包括确定化合物是否作为例如激动剂或拮抗剂直接调节受体。在某些实施方案中，该方法包括确定化合物是否间接调节受体活性(例如，作为变构调节剂)，例如通过增强或降低其它化合物对激活或抑制受体活性的作用。
在某些实施方案中，可以调节嗅觉受体的活性和/或表达的测试剂具有不大于约200μM的EC50值。在某些实施方案中，测试剂的EC50值不大于约1μM、2μM、3μM、4μM、5μM、6μM、7μM、8μM、9μM、10μM、20μM、30μM、40μM、50μM、60μM、70μM、80μM、90μM、100μM、110μM、120μM、130μM、140μM、150μM、160μM、170μM、180μM、190μM或200μM。在某些实施方案中，测试剂的EC50值不大于约250μM、300μM、400μM、500μM、600μM、700μM、800μM、900μM或1M。在某些实施方案中，测试剂的EC50值至少为1pM、10pM、100pM、1nM、10nM或100nM，但不超过约1μM、2μM、3μM、4μM、5μM、6μM、7μM、8μM、9μM、10μM、20μM、30μM、40μM、50μM、60μM、70μM、80μM、90μM、100μM、110μM、120μM、130μM、140μM、150μM、160μM、170μM、180μM、190μM或200μM。
在某些实施方案中，可以调节嗅觉受体的活性和/或表达的测试剂具有不小于约2.0的Emax值。在某些实施方案中，测试剂的Emax值不小于约1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150或200。在某些实施方案中，测试剂的Emax值大于约200。
可以通过使用标记化合物和/或试剂来检测本公开的方法中受体的活化。在某些实施方案中，嗅觉受体的活性可以通过检测第二信使来确定，所述第二信使例如但不限于cAMP、cGMP、IP3、DAG或钙。在某些实施方案中，嗅觉受体的活性可以通过检测细胞内钙水平来确定。监测可以通过但不限于发光或荧光检测，如通过钙敏感荧光染料或发光光蛋白。在某些实施方案中，监测可以通过发光进行。在某些实施方案中，细胞内钙水平可以使用细胞染料，例如荧光钙指示剂如钙4来确定。在某些实施方案中，细胞内钙水平可以通过测量钙结合钙结合蛋白例如钙调蛋白的水平来确定。或者和/或另外，嗅觉受体的活性可以通过检测嗅觉受体的一个或多个下游蛋白靶的磷酸化、转录物水平和/或蛋白质水平来确定。在某些实施方案中，使用GloSensorTM和/或蛋白激酶A(PKA)-NanoBiTTM技术确定嗅觉受体的活性。在某些实施方案中，使用chAMPion测定系统测定嗅觉受体的活性，其通过经由环核苷酸门控(CNG)通道的钙流入间接测量cAMP水平。在某些实施方案中，GloSensor测定包括OR质粒和GloSensor质粒的瞬时共转染和由GloSensor(预突变(permutated)荧光素酶，发光活性取决于cAMP的结合)检测cAMP和发光读数。在某些实施方案中，PKA-NanoBiT测定包括OR质粒与PKA-NanoBiT质粒的瞬时共转染和检测荧光和/或发光读数(OFF信号)的降低，其由破坏分裂荧光素酶互补的PKA亚基的cAMP依赖性解离引起。在某些实施方案中，chAMPion测定法包括OR质粒的瞬时转染和通过光蛋白或荧光染料检测钙，这是由于cAMP水平增加导致CNG通道开放和钙流入而引起的。
本公开的方法中使用的细胞系可包括表达嗅觉受体的任何细胞类型(例如，稳定或瞬时表达)。可用于所公开方法的细胞的非限制性实例包括HeLa细胞、中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)、非洲绿猴肾细胞(COS细胞)、非洲爪蟾卵母细胞(Xenopus oocytes)、HEK-293细胞和鼠3T3成纤维细胞。在某些实施方案中，该方法可包括在HEK-293细胞中表达嗅觉受体。在某些实施方案中，该方法可包括在COS细胞中表达嗅觉受体。在某些实施方案中，细胞组成型表达嗅觉受体。在某些实施方案中，细胞瞬时表达嗅觉受体。在另一个实施方案中，细胞表达嗅觉受体是可诱导的。
在某些实施方案中，细胞表达钙结合光蛋白、环核苷酸门控(CNG)通道、含cAMP反应元件(CRE)的荧光素酶报告基因、GloSensor荧光素酶或PKA-NanoBiT系统。在某些实施方案中，细胞表达钙结合光蛋白，其中光蛋白在结合钙时发光。在某些实施方案中，钙结合光蛋白包含化合物，所述化合物选自由clytin、水母发光蛋白、奥贝林、它们的任何重组或分离形式及它们的组合。在某些实施方案中，钙结合光蛋白包含蛋白质clytin。在某些实施方案中，clytin是重组clytin。在某些实施方案中，clytin包含分离的clytin，例如，从Clytiagregarium分离的clytin。在某些实施方案中，钙结合光蛋白包含蛋白质水母发光蛋白，例如重组水母发光蛋白或分离的水母发光蛋白，如从维多利亚水母(Aequorea victoria)分离的水母发光蛋白。在某些实施方案中，钙结合光蛋白包含蛋白质奥贝林，例如重组奥贝林或分离的奥贝林，如从薮枝螅(Obelia longissima)分离的奥贝林。
在某些实施方案中，通过发光检测或荧光检测监测细胞内钙水平。在某些实施方案中，荧光检测包括钙敏感荧光染料，所述钙敏感荧光染料选自由所述荧光染料选自由Fura-2 AM、Fura-2五钾盐(Fura-2 pentapotassium)、Fura Red AM、Indo-1AM、Indo-1五钾盐(Indo-1 pentapotassium)、Fluo-3、Fluo-4，Fluo-8、钙绿-1(Calcium Green-1)、钙3(Calcium 3)、钙4(Calcium 4)、钙5(Calcium 5)、Rhod-2、它们的衍生物及它们的组合所组成的组中。
在某些实施方案中，可以通过将编码嗅觉受体的核酸引入细胞中来进行细胞中嗅觉受体的表达。例如但不作为限制，可将具有SEQ ID NO：11至SEQ ID NO：30中任一个或SEQID NO：61至SEQ ID NO：3808中任一核苷酸序列或其片段的核苷酸序列的核苷酸引入到细胞中。在某些实施方案中，核酸向细胞中的引入可以通过本领域已知的任何方法进行，包括但不限于转染、电穿孔、显微注射，用含有核酸序列的病毒或噬菌体载体感染、细胞融合、染色体介导的基因转移、微细胞介导的基因转移、原生质球融合等。本领域已知许多技术用于引入外源基因进入细胞(参见，例如Loeffler和Behr，酶学方法(Meth.Enzymol.)217：599-618(1993)；Cohen等人，酶学方法217：618-644(1993)；Cline，药学与治疗学(Pharmac.Ther.)29：69-92(1985)，其全部公开内容通过引用并入本文)，并且可以根据所公开的主题使用。在某些实施方案中，该技术可以提供核酸向细胞的稳定转移，使得核酸可由细胞表达、可遗传并且可由其后代表达。在某些实施方案中，该技术可以提供核酸向细胞的瞬时转移，使得核酸可由细胞表达，其中核酸的浓度和表达在细胞后代的后续世代中降低。
在某些实施方案中，该方法可包括鉴定与嗅觉受体结合的化合物。该方法可包括使嗅觉受体与测试化合物接触并测量化合物与嗅觉受体之间的结合。例如，但不作为限制，该方法可包括在无细胞系统中提供分离的或纯化的嗅觉受体，并在无细胞系统中使受体与测试化合物接触以确定测试化合物是否结合嗅觉受体。在某些实施方案中，该方法可包括使在细胞表面上表达的嗅觉受体接触候选化合物，并检测候选化合物与嗅觉受体的结合。结合可以直接测量，例如通过使用标记的测试化合物，或者可以间接测量。在某些实施方案中，检测包括检测由化合物与嗅觉受体的结合引起的细胞中的生理学事件，例如细胞内钙水平的增加。例如但不作为限制，可以通过荧光检测如钙敏感荧光染料、通过检测发光或本领域已知的任何其它检测方法进行检测。
在其它非限制性实施方案中，体外测定包括表达对细胞天然的嗅觉受体的细胞。表达天然嗅觉受体的此类细胞的实例包括，例如但不限于人、狗和/或猫嗅觉细胞(例如，嗅觉受体细胞)。在某些实施方案中，从人、狗和/或猫分离表达嗅觉受体的人、狗和/或猫嗅觉细胞，并在体外培养。在某些实施方案中，嗅觉受体细胞可以是永生化的，例如，使得从人、狗和/或猫分离的细胞可以在培养物中增殖。
在某些实施方案中，可以通过基因编辑诱导细胞中嗅觉受体的表达，例如，通过使用CRISPR基因编辑系统将嗅觉受体基因并入细胞的基因组中，或编辑或修饰对细胞天然的嗅觉受体基因。
在某些实施方案中，鉴定结合嗅觉受体的化合物的体外方法包括确定测试化合物是否与嗅觉受体结合袋的一个或多个氨基酸相互作用，如本文所述。
在某些实施方案中，鉴定为嗅觉受体调节剂的化合物可以在其它分析方法中进一步测试，包括但不限于体内测定，以确认或定量它们的调节活性。
在某些实施方案中，鉴定嗅觉受体调节剂的方法可包括比较测试化合物对嗅觉受体激动剂或拮抗剂的作用。例如，当与单独与嗅觉受体激动剂接触时受体的活性相比，在激动剂存在下增加或降低受体活性的测试化合物可以被选择作为嗅觉受体调节化合物。
可根据所述方法使用的嗅觉受体激动剂可包含表1中所述的一种或多种化合物。
表2.人(H)或小鼠(M)嗅觉受体的化合物
在某些实施方案中，嗅觉受体激动剂选自由草青醛(trifemal)、异戊酸、3-甲基-2-己酸、α-紫罗兰酮、乙酸己酯、戊基硫醇、新洋茉莉醛、对茴香醛、4-乙氧基苯甲醛、薄荷醇、甲基丁香酚、水杨酸甲酯、苯乙醛、β-紫罗兰酮、乙酸戊酯、壬硫醇(nonanethiol)、苯乙酮、香豆素、铃兰醛(lilial)、间茴香醛(meta-anisaldehyde)、4-甲基戊酸、戊醇、苯乙酸烯丙酯(allyl-phenylacetate)、己酸、α-紫罗兰酮、柠檬醛、乙酸异戊酯、辛硫醇(octanethiol)、苯丙酮、7-甲氧基香豆素及它们的组合。
在某些实施方案中，本公开的嗅觉受体调节剂包含嗅觉受体调节剂的盐，例如但不限于乙酸盐或甲酸盐。在某些实施方案中，嗅觉受体调节剂的盐包含阴离子(-)(例如但不限于Cl-、O2-、CO3 2-、HCO3 -、OH-、NO3 -、PO4 3-、SO4 2-、CH3COO-、HCOO-和C2O4 2-)，其通过离子键与阳离子(+)(例如但不限于Al3+、Ca2+、Na+、K+、Cu2+、H+、Fe3+、Mg2+、NH4 +和H3O+)键合。在其它实施方案中，嗅觉受体激动剂的盐包含通过离子键与阴离子(-)键合的阳离子(+)。
在某些实施方案中，本申请的嗅觉受体调节剂通过嗅觉受体(例如犬科动物和/或猫科动物的嗅觉受体)的计算机模拟建模来鉴定，其中本申请的嗅觉受体调节剂包括适合在嗅觉受体的结合位点内的结构。在某些实施方案中，计算机模拟方法包括上文和本申请的实施例部分中描述的计算机模拟方法。
在某些实施方案中，本申请的嗅觉受体调节剂通过体外方法鉴定，其中嗅觉受体调节剂化合物调节本文公开的在体外由细胞表达的嗅觉受体。在实施方案中，体外方法包括上文和本申请的实施例部分中描述的体外方法。
4.宠物食品
本申请提供了可用于鉴定合适的原料以生产适口和营养的宠物食品的筛选方法。本发明公开的筛选方法还可用于确定成品宠物食品是否对于宠物(例如狗或猫)适口。例如，本文所述的体外方法可用于筛选原料和成品宠物食品以鉴定原料或成品宠物食品是否包含增加、降低或调节嗅觉受体活性和/或表达的化合物。在某些实施方案中，可以选择不增加嗅觉受体的活性和/或表达的原料和成品宠物食品用在用于食用的宠物食品中或作为用于食用的宠物食品。在某些实施方案中，可以选择确实增加嗅觉受体的活性和/或表达的原料和成品宠物食品用在用于食用的宠物食品中或作为用于食用的宠物食品。
合适的宠物食品的非限制性实例包括湿食品、干食品、潮湿食品、宠物食品补充剂(例如维生素)、宠物饮料产品、点心和零食以及本文所述的宠物食品类别。
宠物护理行业的目标之一是为宠物确定不与人类食物链竞争的可持续的蛋白质来源。因此，正在不断寻找符合这些标准的新型蛋白质来源。本公开的筛选方法可用于鉴定哪种新蛋白质来源被认为是对宠物适口的或至少对宠物食品的其它成分的适口性没有影响。在某些实施方案中，新蛋白质来源(即原料)是肉、鱼、奶酪、豆类、酵母、酵母提取物、细菌、藻类、真菌、坚果、种子或其它植物材料或它们的组合。在某些实施方案中，原料是肉。
在某些实施方案中，蛋白质来源可以衍生自多种植物来源。植物来源的非限制性实例包括玉米、玉蜀黍、大米、大豆、小麦等。例如但不作为限制，植物来源的蛋白质可包括羽扇豆蛋白质、小麦蛋白、大豆蛋白质及它们的组合。或者或另外，蛋白质来源可衍生自多种动物来源，例如来自动物界的多细胞真核生物。动物蛋白质的非限制性实例包括牛肉、猪肉、家禽、羊肉或鱼类，包括例如肌肉、肉类副产品、肉粉或鱼粉。动物来源的其它非限制性实例包括昆虫或来自节肢动物门的其它生物。
在某些实施方案中，蛋白质来源可以源自酵母或任何其它单细胞真核生物、霉菌、蘑菇或真菌。
在某些实施方案中，蛋白质来源可以源自细菌、古生菌或任何其它古细菌、真细菌或原核生物。
在某些实施方案中，蛋白质来源可以源自藻类、巨藻、海藻或任何其它单细胞或多细胞光合生物或原生生物。
在某些实施方案中，本公开的主题包括基于原料增强、增加、降低和/或调节嗅觉受体的活性和/或表达的能力来接受或拒绝用于生产宠物食品的原料。
在某些实施方案中，如果原料导致至少一种嗅觉受体的活性和/或表达的增强或增加，则拒绝该原料。在某些实施方案中，如果原料导致至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种、至少十种、至少十一种、至少十二种、至少十三种、至少十四种、至少十五种和/或至少十六种嗅觉受体的活性和/或表达的增强或增加，则拒绝该原料。
在某些实施方案中，如果原料导致至少一种嗅觉受体的活性和/或表达的增强或增加，则接受该原料。在某些实施方案中，如果原料导致至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种、至少十种、至少十一种、至少十二种、至少十三种、至少十四种、至少十五种和/或至少十六种嗅觉受体的活性和/或表达的增强或增加，则接受该原料。
在某些实施方案中，如果原料不调节至少一种嗅觉受体的活性，则接受该原料。在某些实施方案中，如果原料抑制或阻断至少一种嗅觉受体的活性和/或表达，则选择该原料。
在某些实施方案中，如果原料不调节至少一种嗅觉受体的活性，则拒绝该原料。在某些实施方案中，如果原料抑制或阻断至少一种嗅觉受体的活性和/或表达，则拒绝该原料。
在某些实施方案中，嗅觉受体选自犬科动物受体CafaOR9.2.9、CafaOR38.1.21、CafaOR21.2.15、CafaOR21.2.43、CafaOR15.2.20、CafaOR18.3.11、CafaOR15.3.1、CafaOR6.3.1、CafaOR18.3.12和/或CafaOR5.2.5中的任何一种或多种。在某些非限制性实施方案中，嗅觉受体选自SEQ ID NO：61至SEQ ID NO：2260中描述的一种或多种犬科动物嗅觉受体。
在某些实施方案中，嗅觉受体选自猫科动物受体E1：13347030-13347977、F1：65134904-65135858、D1：62955839-62956792、D1：63312327-63313289、B3：72908295-72909287、D1：105486528-105487493、B3：74116955-74117893、E3：40237904-40238842、D1：105462554-105463512和/或D1：21266824-21267768中的任何一种或多种。在某些非限制性实施方案中，嗅觉受体选自SEQ ID NO：2261至SEQ ID NO：3808中描述的一种或多种猫科动物嗅觉受体。
在某些非限制性实施方案中，可以将导致至少一种嗅觉受体的活性和/或表达增强或增加的原料与抑制或降低至少一种嗅觉受体的活性和/或表达的化合物混合，其中所述混合物被接受用于生产宠物食品。
在宠物食品的生产过程中，一些材料可能由于机械力、热力或化学反应而改变形式。本公开的筛选方法可用于鉴定形成对动物例如犬科动物或猫科动物而言不适口的化合物的宠物食品，所述化合物例如增强或增加嗅觉受体的活性和/或表达的化合物。
在某些实施方案中，本公开的主题包括基于产品增强、增加、降低和/或调节嗅觉受体的活性和/或表达的能力来接受或拒绝宠物食品。
在某些实施方案中，如果产品导致至少一种嗅觉受体的活性和/或表达的增强或增加，则拒绝该宠物食品。在某些实施方案中，如果产品导致至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种、至少十种、至少十一种、至少十二种、至少十三种、至少十四种、至少十五种和/或至少十六种嗅觉受体的活性和/或表达的增强或增加，则拒绝该宠物食品。在某些实施方案中，如果宠物食品不调节至少一种嗅觉受体的活性，则接受该宠物食品。在某些实施方案中，如果宠物食品抑制或阻断至少一种嗅觉受体的活性和/或表达，则选择该宠物食品。
在某些实施方案中，如果产品导致至少一种嗅觉受体的活性和/或表达增强或增加，则接受该宠物食品。在某些实施方案中，如果产品导致至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种、至少十种、至少十一种、至少十二种、至少十三种、至少十四种、至少十五种和/或至少十六种嗅觉受体的活性和/或表达的增强或增加，则接受该宠物食品。在某些实施方案中，如果宠物食品不调节至少一种嗅觉受体的活性，则拒绝该宠物食品。在某些实施方案中，如果宠物食品抑制或阻断至少一种嗅觉受体的活性和/或表达，则拒绝该宠物食品。
本公开主题的风味组合物还可以用于多种宠物食品中。需要时，本公开主题的一种或多种风味组合物与宠物食品和任选成分的组合提供了具有意想不到的气味并赋予例如所需嗅觉感官体验的风味剂。本文公开的风味组合物可以在宠物食品的配制加工或包装之前、期间或之后加入，并且风味组合物的组分可以顺序或同时加入。
在某些实施方案中，宠物食品是营养全面干、湿或半潮湿的食品。干或含低水分的营养全面的宠物食品可包含低于约15％的水分。湿或含高水分的营养全面的宠物食品可包含大于约50％的水分。此类食品可包含基于能量百分比的约10％至约90％的脂肪、约10％至约70％的蛋白质和约5％至约80％的碳水化合物，例如膳食纤维和灰分。
在某些实施方案中，宠物食品是营养全面的干、湿或半潮湿的食品。在某些实施方案中，宠物食品包含基于能量百分比的约60％的脂肪、约30％的蛋白质和约10％的碳水化合物，例如膳食纤维和灰分。
在某些实施方案中，宠物食品是营养全面的潮湿食品。潮湿(例如半潮湿或半干或软干或软潮湿或中等或含中等水分)的营养全面的宠物食品含有约15％至约50％的水分。
在某些实施方案中，宠物食品是非营养全面的宠物食品(例如，点心、保健品和零食)。在某些实施方案中，宠物食品是宠物食品点心产品。宠物食品点心产品的非限制性实例包括点心棒、宠物咀嚼物、松脆零食、谷物棒、点心、饼干和甜食产品。
在本公开的某些实施方案中，根据本文所述方法制备的宠物食品或药物的气味和/或适口性属性可以通过使用一组气味测试员的体内鼻闻(smelling)方法来测量。例如，但不作为限制，该小组可以包含犬科动物和/或猫科动物的组成员。在某些实施方案中，含有例如筛选的原料的宠物食品或筛选的宠物食品的适口性可以通过单独食用宠物食品来确定(例如，单碗试验，一元排名(monadic ranking))。在某些实施方案中，筛选的原料或筛选的宠物食品的适口性可以通过相对于已知对动物适口的宠物食品优先食用宠物食品或原料来确定(例如，用于测试偏好、差异和/或选择的双碗试验)。
在某些实施方案中，根据本文所述方法鉴定的化合物的适口性和/或令人反感的阻止气味可通过与不含化合物或含有不同风味组合物例如嗅觉受体激动剂的水溶液相比优先消耗含有所述化合物的水溶液来确定(例如，双瓶试验)。每种宠物食品或水溶液的摄入比率可以通过测量一种消耗配给量除以总消耗量来确定。然后可以计算消耗比(CR)以比较一种配给相对另一种配给的消耗，从而确定一种食品或水溶液相对其它的优先消耗。或者或另外，摄入量(g)的差异可用于评估双瓶试验中两种溶液之间或双碗试验中两种宠物食品之间在选定显著性水平例如在5％显著性水平下的平均摄入差异，以确定95％置信区间的摄入量平均差异。在某些实施方案中，置信区间可以是约90％。然而，可以使用任何显著性水平，例如，1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％或50％显著性水平。
在某些实施方案中，也可以计算偏好百分比分数，例如动物对一种溶液或食品的偏好百分比，该百分比是在试验期间该溶液或食品占摄入的总液体或食品的百分比。
5.气味阻滞剂
本公开提供了通过赋予令人反感的气味和/或降低物体或表面的适口性来维持动物健康的方法。在某些实施方案中，该方法包括将包含根据本文所述方法鉴定的化合物的气味阻滞剂产品施用、涂覆或接触到物体或表面，从而阻止动物接触和/或摄取所述物体或表面。因此，避免了可能由于接触和/或摄取所述物体或表面而对动物健康产生的有害影响。在某些实施方案中，物体或表面对动物的健康有害或对动物有毒。
实施例
通过参考以下实施例将更好地理解本公开的主题，这些实施例作为本发明的示例提供，而不作为限制。
实施例1-嗅觉受体和推定的结合化合物之间相互作用的计算机模拟模型
本实施例描述了犬科动物/猫科动物的嗅觉受体(OR)的计算机建模，以鉴定推定的嗅觉受体调节剂。
犬科动物/猫科动物的嗅觉受体的同源模型基于来自蛋白质数据库(PDB)的3SN6的晶体结构。3SN6是来自具有结合激动剂的A组GPCR的β2肾上腺素能受体的晶体结构(来自勃林格殷格翰(Boehringer Ingelheim)的BI-167107)。(Rasmussen等人，自然(Nature)，477：549-555(2011))。使用I-TASSER程序套件(Yang等人，自然方法(Nat Methods)，12：7-8(2015))和Modeller(Eswar等人，现代生物信息学方法(Curr Protoc Bioinformatics)，15：5.6.1-5.6.30(2006))建立模型，Modeller是来自Accelrys的DiscoveryStudio(DS)程序套件的一部分(DiscoveryStudio(DS)是来自Accelrys公司的交互式建模和模拟程序的套件)。
气味化合物对接在犬科动物/猫科动物的嗅觉受体的活性位点内。使用来自BioPredict公司的对接程序BioDock，但是其它最先端的对接程序也可用于此目的。
计算机模拟建模的结果在图2至图11给出。图13显示了覆盖嗅觉遗传空间的多物种(人/犬科动物/猫科动物)的进化树。进化树显示所有嗅觉受体，以及30个选择的嗅觉受体(10个人受体、10个犬科动物受体、10个猫科动物受体，突出显示，SEQ ID NO：1至SEQ IDNO：60)均匀地分布在嗅觉遗传空间周围。图13进一步显示选择10对犬科动物/猫科动物嗅觉受体(SEQ ID NO：11至SEQ ID NO：30和SEQ ID NO：41至SEQ ID NO：60)，因为它们覆盖了潜在OR受体的最佳宽度和范围。
实施例2-犬科动物和猫科动物嗅觉受体的鉴定
犬嗅觉受体序列和检测方法先前由Niimura&Nei(2007)描述，从中获得了1100个犬嗅觉受体序列。使用先前注释和相似性搜索的组合鉴定774个推定的猫嗅觉受体序列。从ensembl猫基因组(家猫6.2(Felis_catus_6.2)(GCA_000181335.2))中提取含有“嗅觉受体”的基因注释的序列。此外，狗、人、小鼠、大象、牛、马、兔和豚鼠核苷酸序列(Niimura等人，2015)用于相对猫基因组进行搜索。提取猫参考序列用于具有≥65％同一性和≥650bp长度的所有独特比对(unique alignments)。使用仅保留代表的最长的第一序列聚类(Fu等人，2012)除去冗余序列(≥95％同一性)。使用来自emboss程序包(package)的sixpack(Rice等人，2000)鉴定这些代表的氨基酸翻译，选择开放阅读框内的最长氨基酸序列。
1100个犬嗅觉受体和774个推定的猫嗅觉受体的核酸和氨基酸序列如SEQ ID NO：61至SEQ ID NO：3808所示。
实施例3-使用体外试验鉴定犬科动物和科动物猫嗅觉受体调节剂。
该实施例涉及不同猫科动物和犬科动物嗅觉受体(OR)的功能性表达。选择20个OR序列，其中10个序列具有猫科动物起源，其余10个具有犬科动物起源。将这些OR亚克隆到适合于OR的瞬时功能性表达的修饰的表达载体中。然后用各种浓度的不同添味剂刺激瞬时表达的受体，目的是使猫和犬OR被破解(deorphanize)。如图12所示，在以下细胞系和测定的任一种或两种中检测到OR反应性：1)HEK293 PEAKrapid/RTP1s endo(报告细胞系A)和CRE-NanoLuc荧光素酶报告基因测定；和2)HEK293/NatClytin/CNG/RTP1s(报告细胞系B)endo和CNG chAMPion测定。不同OR组的功能性表达在报告细胞系A或B中是瞬时的。瞬时转染的OR用3种浓度(n＝4)的不同添味剂(至少3种)刺激。
材料和方法
细胞系。以下细胞系用于此项目：
*报告细胞系A(用于CRE-荧光素酶、GloSensor和PKA-NanoBiT测定)：HEK293PEAKrapid/RTP1s endo
*报告细胞系B(用于chAMPion测定)：HEK293/CNG/nat-Clytin/RTP1s endo
细胞培养基。将细胞保持在补充有胎牛血清(希格玛(Sigma)目录号F7524；终浓度10％)、青霉素-链霉素(百威泰克(BioWhittaker)目录号DE17-602E；5mL的100X溶液)和以下选择抗生素的DMEM高葡萄糖(龙沙(Lonza)百威泰克(BioWhittaker)目录号BE12-604F/U1；500mL)中：
·HEK293 PEAKrapid/RTP1s endo：0.1毫克/毫升(mg/mL G418、0.2mg/mL潮霉素、0.1mg/mL博来霉素(zeocin)。
·HEK293/CNG/nat-Clytin/RTP1s endo：0.8mg/mL G418，50μg/mL博来霉素、0.6μg/mL嘌呤霉素。
细胞培养条件。在37℃、5％CO2和90％湿度下将细胞系保持在它们各自的完全培养基中。细胞每周分瓶两次。在标准增殖条件下，将约4×106个细胞接种在T225培养瓶中，回收约30×106个细胞/培养瓶。为了分瓶，用PBS轻轻洗涤细胞，然后在室温或37℃下用胰蛋白酶孵育5分钟。加入培养基并重悬细胞。
缓冲液。含0mM钙的台氏缓冲液(Tyrode buffer)：内部溶液(130mM NaCl、5mMKCl、1mM MgCl2、5mM NaHCO3、20mM HEPES，在水中，pH 7.4；无菌过滤并高压灭菌)。台氏缓冲液：内部溶液(130mM NaCl、5mM KCl、1mM MgCl2、5mM NaHCO3、2mM CaCl2、20mM HEPES，在水中，pH 7.4；无菌过滤并高压灭菌)。含10mM钙的台氏缓冲液：含0mM钙的台氏缓冲液加10mMCaCl2氯化钙(二水合物)：希格玛，223506，1M储备溶液，其在水中制备并在室温下储存。腔肠素(Coelenterazine)：储备溶液：5mg/mL，在含有30μM谷胱甘肽的DMSO(11.8mM)中；等分试样并储存在-20℃；在台氏缓冲液中以1∶1000稀释用于实验(终浓度：11.8μM)。
OR序列。使用犬科动物OR序列SEQ ID NO：11至SEQ ID NO：20和猫科动物OR序列SEQ ID NO：21至SEQ ID NO：30。合成这些序列并克隆到具有N末端SSTR3转运标签的pcDNA5表达载体中。
OR配体。表3中提供了第2阶段中的OR和添味剂组合测试。
表3
OR_3的四种化合物(以灰色突出显示)未在受体上单独测试，但包括在混合物中。所有化合物均购自希格玛奥德里奇(Sigma-Aldrich)。除了单个化合物之外，在项目的第2阶段对一些OR进行了混合物测试。表4中提供了在第2阶段中的一些OR测试的混合物组成。
表4
在第3阶段中，在完全剂量-反应曲线中测试OR的所有阳性组合(总是包括人、狗和猫的OR)和添味剂。表5中提供了在第3阶段中测试的OR和添味剂组合。
表5
测试试剂盒。根据制造商的指导使用以下试剂盒：
用于CRE-NanoLuc荧光素酶测定的荧光素酶测定系统(普洛麦格(Promega))。
分析方案
CRE-NanoLuc荧光素酶测定。HEK293 PEAKrapid/RTP1s endo细胞用编码各自OR的质粒与CRE-NanoLuc荧光素酶质粒(普洛麦格)以1∶1比例瞬时转染，并以20000细胞/孔接种于聚-D-赖氨酸包被的黑色透明底384孔测定板(MTP)的25μL/孔完全生长培养基中。
二十四小时后，手动除去细胞培养基，并用20μL/孔台氏缓冲液孵育细胞。将在具有0mM钙的台氏缓冲液中制备的化合物加入到细胞中(10μL/孔，3X溶液)。然后将细胞在37℃下孵育3-4小时。在发光板读数器(FLIPRTETRA，分子仪器公司(Molecular Devices))中读板。在加入20μL/孔的NanoGlo试剂后记录发光90s(相机设置：曝光时间：0.99s；最大增益)。
用软件(分子仪器公司，版本4.0.0.30)分析数据。发光值(以相对光单位(RLU)计)以20s-75s的平均值输出。除了使用原始值之外，还将数据标准化为背景信号(仅含有缓冲液的孔)并表示为“倍数变化”(平均值(n＝2)/缓冲液孔的平均值(n＝2))。使用Excel(微软(Microsoft))和GraphPad Prism(GraphPad软件公司(GraphPadSoftware，Inc.))进行图的数据分析和绘制。
chAMPion(CNG通道)测定。用编码各自OR的质粒瞬时转染HEK293/CNG/nat-Clytin/RTP1s endo细胞，并以20000细胞/孔接种于聚-D-赖氨酸包被的黑色透明底384MTP的25μL/孔完全生长培养基中。
二十四小时后，手动除去细胞培养基，并在37℃下将细胞在具有0mM钙的台氏缓冲液中于20μL/孔腔肠素(11μM)中孵育3.5小时。然后在发光板读数器(FLIPRTETRA，分子仪器公司)中用以下相机设置读取板：曝光时间：0.533s，最大增益。加入10μL/孔化合物(在具有0mM钙的台氏缓冲液中制备的3X溶液)后记录发光1分钟，然后在37℃下孵育30分钟。在加入具有10mM CaCl2的20μL/孔台氏缓冲液后，再次记录发光1分钟。加入化合物后的第一个读数监测受体-Gαq信号通路，正如所预期的，这里没有观察到信号。加入钙后的第二个读数监视OR-Gαs信号转导；对这些数据进行分析。
用软件(分子仪器公司，版本4.0.0.30)分析数据。将发光值(以RLU计)输出为10s至40s之间的最大RLU。除了使用原始值之外，还将数据标准化为背景信号(仅含有缓冲液的孔)并表示为“倍数变化”(平均值(n＝2)/缓冲液孔的平均值(n＝2))。使用Excel(微软)和GraphPad Prism(GraphPad软件公司)进行图的数据分析和绘制。
结果
在该项目的第1阶段中，玛氏宠物护理(Mars Petcare)提交了在该项目中待分析的二十个OR序列、十个犬科动物序列和十个猫科动物序列。合成OR序列并亚克隆到表达载体中，向OR蛋白的N-末端添加转运表位标签以促进它们的表达和质膜定位。
在第2阶段中进行犬科动物和猫科动物的OR的第一次功能测试。用根据公布的人直系同源物活性或预测的潜在活性预先选择的三种浓度的至少三种添味剂测试各组OR，每组OR由人、猫和狗的直系同源物(以及在OR_10、OR8B8的情况下，也有小鼠的直系同源物)组成。大多数OR组还进行两种混合物的激发，每种混合物由12种添味剂组成。在两个基于细胞的测定(CRE-NanoLuc荧光素酶测定和CNG chAMPion测定)中，平行测试所有OR组。发现这两种测定是对10种人OR的两种最佳测定，其在先前的研究中进行了测试。
在第2阶段中测试的十组OR中，七组显示至少一种受体直系同源物对至少一种化合物的反应(图14和图15)。几个OR对多于一种化合物有反应。对于四组OR，狗和猫的OR都表现出活性；这些包括OR_2组(OR6P1)，其中人直系同源物不会像狗和猫的受体一样对同一组配体有反应。对于另外三组OR，仅狗直系同源物或猫直系同源物分别有反应。
在该项目的第3阶段中，用八种浓度的阳性配体重新测试了六个阳性OR组，包括所有可用的直系同源物，并计算了剂量-反应曲线。第3阶段的结果总结在图16和图17中。简言之，六个狗OR显示为具有活性(配体数)：OR6P1(2)；OR51E1(3-4)；OR51L1(1)；OR2C1(1)；OR5A1(4)；OR8B8(3)。另外，六个猫OR表现出活性：OR6P1(2)；OR51E1(3-4)；OR51L1(2)；OR4E2(1)；OR2C1(1)；OR5A1(4)；OR8B8(1)。
所有数据都在图18至图43中详细列出。图18至图37示出在第2阶段的测定中获得的结果。图38至图43示出在第3阶段的测定中阳性配体的剂量-反应曲线。输出的数据如下：CRE-荧光素酶：平均15s至60s；chAMPion测定：最大10s至30s。将数据标准化为“倍数变化”(与缓冲液值的平均值比较)。所有对数的底数是10。
实施例4-使用体外测定鉴定犬科动物和猫科动物嗅觉受体调节剂。
本实施例描述了鉴定调节通过嗅觉受体配体对犬科动物或猫科动物的嗅觉受体的活化的化合物的体外试验。
通过用嗅觉受体的计算机模拟建模鉴定的化合物(如上文实施例1中详述)作为推定的嗅觉受体调节剂被选择用于体外进一步测试。所选调节剂的体外功能表征用于评价推定的调节剂化合物在调节通过嗅觉受体配体对嗅觉受体的活化中的有效性。
稳定或瞬时表达犬科动物或猫科动物的嗅觉受体(例如，犬科动物CafaOR9.2.9、CafaOR38.1.21、CafaOR21.2.15、CafaOR21.2.43、CafaOR15.2.20、CafaOR18.3.11、CafaOR15.3.1、CafaOR6.3.1、CafaOR18.3.12、CafaOR5.2.5，或猫科动物E1：13347030-13347977、F1：65134904-65135858、D1：62955839-62956792、D1：63312327-63313289、B3：72908295-72909287、D1：105486528-105487493、B3：74116955-74117893、E3：40237904-40238842、D1：105462554-105463512、D1：21266824-21267768，或具有SEQ ID NO：61至SEQID NO：3808中所示的核苷酸序列或氨基酸序列的任何一种受体)的HEK293细胞(或其它合适的表达系统)被暴露于推定的调节剂化合物和嗅觉受体配体(例如激动剂)以调节嗅觉受体的活性和/或表达。
体外测定的示例性方法如下。根据制造商的方案，用例如Lipofectamine2000(英杰公司(Invitrogen))进行所有瞬时转染。将10μl Lipofectamine2000稀释于500μl DMEM(生命技术公司(Life Technologies))中并在室温下孵育5分钟。将3μg质粒DNA(1μg/μl)稀释于500μl DMEM中并加入Lipofectamine2000混合物中以获得1000μl的终体积。在室温下另外孵育30分钟后，将DNA-Lipofectamine复合物加入到1000μl含有1,400,000个细胞/ml的细胞悬浮液中。随后，将25μl完全混合物(complete mixture)接种到黑色384孔聚苯乙烯测定板的每个孔中。转染3小时后，从细胞中除去转染混合物，并加入含有10％FBS和1％P/S的新鲜DMEM。在27至30小时转染后，从细胞除去培养基，在37℃下加入包含钙敏感性荧光染料或发光底物的20μl加样缓冲液(台氏缓冲液+2μM Fluo4-AM(英杰)+2.5mM用于荧光的丙磺舒(英杰)或腔肠素(Biosynth)+用于发光的台氏缓冲液)持续1小时(荧光)或3小时(发光)。然后使用自动洗板机(柏楉Asys洗板机(Biochrom Asys Plate Washer))用台氏缓冲液每20分钟洗涤细胞2次，以进行荧光方案。发光方案不需要洗涤步骤。
然后检测嗅觉受体的活化，例如，通过使用钙敏感性荧光染料、钙敏感性发光光蛋白或通过本领域已知的任何检测系统检测细胞内钙水平的变化。不表达嗅觉受体的细胞(空白对照(MOCK control))被用作对照。这样的数据捕获系统的实例包括Tetra或3系统。然而，可以使用其他成像技术和系统，例如，处理过的细胞的显微成像。
对于每个推定的嗅觉受体调节剂，以至少8个浓度一式三份产生剂量反应曲线，并确定推定的嗅觉受体调节剂的EC50值。例如，在SigmaPlot V12(Systat软件)中绘图，其中误差条表示标准误差。
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***
尽管已经详细描述了本公开的主题及其优点，但应该理解，在不脱离由所附权利要求限定的本发明的精神和范围的情况下，可以进行各种改变、替换和变更。此外，本申请的范围不旨在限于说明书中描述的过程、机器、制造、物质组成、装置、方法和步骤的特定实施方案。本领域普通技术人员将从所公开主题的公开内容中容易地理解，根据本公开的主题，可以使用执行与本文所述的相应实施方案基本相同的功能或实现基本相同的结果的现有或将会发展的过程、机器、制造、物质组成、装置、方法或步骤。因此，所附权利要求旨在在其范围内包括这样的过程、机器、制造、物质组成、装置、方法或步骤。
在本申请中引用了专利、专利申请、出版物、产品描述和方案，其公开内容出于所有目的通过引用整体并入本文。

Claims (32)

1.一种鉴定能够改变宠物食品的适口性的化合物的方法，所述方法包括：
(a)测量嗅觉受体的第一活性，
(b)使测试剂与所述嗅觉受体接触，
(c)在接触所述测试剂后测量所述嗅觉受体的第二活性，和
(d)当所述嗅觉受体的所述第二活性相对于所述嗅觉受体的所述第一活性增加或降低时，确定所述测试剂是能够改变宠物食品的适口性的化合物，
其中所述嗅觉受体是犬科动物或猫科动物的嗅觉受体，所述犬科动物或猫科动物的嗅觉受体包含选自由SEQ ID NO:41至SEQ ID NO:60所组成的组中的氨基酸序列，或者所述犬科动物或猫科动物的嗅觉受体的氨基酸酸序列由选自由SEQ ID NO:11至SEQ ID NO:30所组成的组中的核苷酸序列编码；并且
其中，所述第一活性和所述第二活性通过检测第二信使来确定。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述嗅觉受体是犬科动物或猫科动物的嗅觉受体，所述犬科动物或猫科动物的嗅觉受体包含选自由SEQ ID NO:51至SEQ ID NO:60所组成的组中的氨基酸序列。
3.一种鉴定能够改变宠物食品的适口性的化合物的方法，所述方法包括：
(a)使测试剂与嗅觉受体接触，
(b)检测所述测试剂与所述嗅觉受体的一个或多个氨基酸之间的相互作用，和
(c)当所述测试剂与所述氨基酸的一个或多个相互作用时，确定所述测试剂是能够调节改变宠物食品的适口性的化合物，
其中所述嗅觉受体是犬科动物或猫科动物的嗅觉受体，所述犬科动物或猫科动物的嗅觉受体包含选自由SEQ ID NO:41至SEQ ID NO:60所组成的组中的氨基酸序列，或者所述犬科动物或猫科动物的嗅觉受体的氨基酸酸序列由选自由SEQ ID NO:11至SEQ ID NO:30所组成的组中的核苷酸序列编码，
并且其中，所述方法还包括在接触所述测试剂之前测量所述嗅觉受体的第一活性，和在接触所述测试剂之后测量所述嗅觉受体的第二活性，其中所述第一活性和所述第二活性通过检测第二信使来确定。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述方法包括检测所述测试剂与所述嗅觉受体的7跨膜结构域(7TM)结构域中的一个或多个氨基酸之间的相互作用。
5.如权利要求3-4中任一项所述的方法，所述方法还包括使嗅觉受体配体与所述嗅觉受体接触。
6.如权利要求3-5中任一项所述的方法，所述方法还包括当所述嗅觉受体的所述第二活性相比所述嗅觉受体的所述第一活性降低时，确定所述测试剂是能够降低宠物食品的适口性的化合物。
7.如权利要求3-5中任一项所述的方法，所述方法还包括当所述嗅觉受体的所述第二活性相比所述嗅觉受体的所述第一活性增加时，确定所述测试剂是能够增加宠物食品的适口性的化合物。
8.如权利要求3-7中任一项所述的方法，其中所述嗅觉受体是犬科动物或猫科动物的嗅觉受体，所述犬科动物或猫科动物的嗅觉受体包含选自由SEQ ID NO:51至SEQ ID NO:60所组成的组中的氨基酸序列。
9.如权利要求3-8中任一项所述的方法，其中所述嗅觉受体是犬科动物CafaOR9.2.9嗅觉受体，所述犬科动物CafaOR9.2.9嗅觉受体包含由SEQ ID NO:41所描述的氨基酸序列，并且其中所述嗅觉受体的所述一个或多个氨基酸选自由Gln103、Leu104、Lys275、Arg87、Val81、Met84、Val279、Tyr262、Met209、Gly258、Val111、Tyr255、Thr282、Phe107和Thr80所组成的组中。
10.如权利要求3-8中任一项所述的方法，其中所述嗅觉受体是犬科动物CafaOR38.1.21嗅觉受体，所述犬科动物CafaOR38.1.21嗅觉受体包含SEQ ID NO:42所描述的氨基酸序列，并且其中所述嗅觉受体的所述一个或多个氨基酸选自由Lys273、Thr78、Leu82、Tyr260、Thr256、Tyr253和Phe105所组成的组中。
11.如权利要求3-8中任一项所述的方法，其中所述嗅觉受体是犬科动物CafaOR21.2.15嗅觉受体，所述犬科动物CafaOR21.2.15嗅觉受体包含由SEQ ID NO:43所描述的氨基酸序列，并且其中所述嗅觉受体的所述一个或多个氨基酸选自由Met103、Met83、His107、Ile106、Leu182、Asn197、Gly201、Val204、Ser260、Phe256和Leu273所组成的组中。
12.如权利要求3-8中任一项所述的方法，其中所述嗅觉受体是犬科动物CafaOR21.2.43嗅觉受体，所述犬科动物CafaOR21.2.43嗅觉受体包含SEQ ID NO:44所描述的氨基酸序列，并且其中所述嗅觉受体的所述一个或多个氨基酸选自由Asp285、Met80、Met88、Leu108、Ile111、His112、Thr115、Val209、Val210、Thr213、Leu214、Val262、Ile263、Ser266、Ile281、Ala284和Leu288所组成的组中。
13.如权利要求3-8中任一项所述的方法，其中所述嗅觉受体是猫科动物catGr5嗅觉受体，所述猫科动物catGr5嗅觉受体包含SEQ ID NO:55所描述的氨基酸序列，并且所述嗅觉受体的所述一个或多个氨基酸选自由Tyr277、Lys290、Phe119、Pro177、Leu180、Ile181、Pro199、Cys217和Phe220所组成的组中。
14.如权利要求13所述的方法，其中，所述猫科动物catGr5是B3：72908295-72909287。
15.如权利要求3-8中任一项所述的方法，其中所述嗅觉受体是猫科动物catGr6嗅觉受体，所述猫科动物catGr6嗅觉受体包含SEQ ID NO:56所描述的氨基酸序列，并且其中所述嗅觉受体的所述一个或多个氨基酸选自由His112、Asn209、Tyr265、Phe88、Phe111、Met170、Met206、Cys261、Ile264、Ser279、Ile280和Thr283所组成的组中。
16.如权利要求15所述的方法，其中，其中，所述猫科动物catGr6是D1：105486528-105487493。
17.如权利要求3-8中任一项所述的方法，其中所述嗅觉受体是猫科动物catG7嗅觉受体，所述猫科动物catG7嗅觉受体包含SEQ ID NO:57所描述的氨基酸序列，并且其中所述嗅觉受体的所述一个或多个氨基酸选自由Met81、Tyr258、Gln100、Thr77、Lys269、Leu104、Thr276、Val277、His73、Val273和Val78所组成的组中。
18.如权利要求17所述的方法，其中，所述猫科动物catG7是B3：74116955-74117893。
19.如权利要求3-8中任一项所述的方法，其中所述嗅觉受体是猫科动物catG8嗅觉受体，猫科动物catG8嗅觉受体包含SEQ ID NO:58所描述的氨基酸序列，并且其中所述嗅觉受体的所述一个或多个氨基酸选自由Met81、Leu101、Phe104、Leu105、Gly108、Glu180、Val202、Phe206、Tyr259和Lys272所组成的组中。
20.如权利要求19所述的方法，其中，所述猫科动物catG8是E3：40237904-40238842。
21.如权利要求3-8中任一项所述的方法，其中所述嗅觉受体是猫科动物catG9嗅觉受体，所述猫科动物catG9嗅觉受体包含SEQ ID NO:59所描述的氨基酸序列，并且其中所述嗅觉受体的所述一个或多个氨基酸选自由Tyr79、Lys278、Phe110、Val111、Gly114、Val208、Ile212、Phe258、Ala261、Leu262、Tyr265、Val282和Ser285所组成的组中。
22.如权利要求21所述的方法，其中，所述猫科动物catG9是D1：105462554-105463512。
23.如权利要求3-8中任一项所述的方法，其中所述嗅觉受体是犬科动物CafaOR5.2.5嗅觉受体，所述犬科动物CafaOR5.2.5嗅觉受体包含SEQ ID NO:50所述的氨基酸序列，并且其中所述嗅觉受体的所述一个或多个氨基酸选自由Tyr263、Tyr77、Phe108、Val112、Ser116、Val206、Asp210、Phe256和Thr283所组成的组中。
24.如权利要求3-23中任一项所述的方法，其中所述相互作用通过定点诱变、x射线晶体学、x射线光谱学、核磁共振(NMR)、交联评估、质谱、电泳、置换测定法及它们的组合来确定。
25.一种鉴定能够改变宠物食品的适口性的化合物的方法，所述方法包括：
(a)使嗅觉受体激动剂与嗅觉受体接触，
(b)测量所述嗅觉受体的第一活性，
(c)使测试剂与所述嗅觉受体接触，
(d)测量所述嗅觉受体的第二活性，和
(e)当所述第一活性大于或小于所述第二活性时，确定所述测试剂是能够改变宠物食品的适口性的化合物，
其中所述嗅觉受体是犬科动物或猫科动物的嗅觉受体，所述犬科动物或猫科动物的嗅觉受体包含选自由SEQ ID NO:41至SEQ ID NO:60所组成的组中的氨基酸序列，或者所述犬科动物或猫科动物的嗅觉受体的氨基酸酸序列由选自由SEQ ID NO:11至SEQ ID NO:30所组成的组中的核苷酸序列编码；
并且其中，所述第一活性和所述第二活性通过检测第二信使来确定。
26.一种选择宠物食品或其组分的方法，所述方法包括：
(a)测量嗅觉受体的第一活性，
(b)使测试剂与所述嗅觉受体接触，
(c)在接触所述测试剂之后测量所述嗅觉受体的第二活性，和
(d)当所述嗅觉受体的所述第二活性相对于所述嗅觉受体的所述第一活性增加或降低时，选择所述测试剂作为宠物食品或其组分，
其中所述嗅觉受体是犬科动物或猫科动物的嗅觉受体，所述犬科动物或猫科动物的嗅觉受体包含选自由SEQ ID NO:41至SEQ ID NO:60所组成的组中的氨基酸序列，或者所述犬科动物或猫科动物的嗅觉受体的氨基酸酸序列由选自由SEQ ID NO:11至SEQ ID NO:30所组成的组中的核苷酸序列编码；
并且其中，所述第一活性和所述第二活性通过检测第二信使来确定。
27.如权利要求25或26所述的方法，其中所述嗅觉受体是犬科动物或猫科动物的嗅觉受体，所述犬科动物或猫科动物的嗅觉受体包含选自由SEQ ID NO:51至SEQ ID NO:60所组成的组中的氨基酸序列。
28.如权利要求25的方法，其中嗅觉受体激动剂选自由草青醛、异戊酸、3-甲基-2-己酸、α-紫罗兰酮、乙酸己酯、戊基硫醇、新洋茉莉醛、对茴香醛、4-乙氧基苯甲醛、薄荷醇、甲基丁香酚、水杨酸甲酯、苯乙醛、β-紫罗兰酮、乙酸戊酯、壬硫醇、苯乙酮、香豆素、铃兰醛、间茴香醛、4-甲基戊酸、戊醇、苯乙酸烯丙酯、己酸、柠檬醛、乙酸异戊酯、辛硫醇、苯丙酮、7-甲氧基香豆素及它们的组合所组成的组中。
29.如权利要求1-3和25-27中任一项所述的方法，其中所述测试剂的EC50值不大于200μM。
30.如权利要求1-3和25-27中任一项所述的方法，其中所述测试剂的Emax值不小于2.0。
31.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中步骤(c)包括当接触所述测试剂后所述嗅觉受体的活性降低时，确定所述测试剂是能够改变宠物食品的适口性的化合物。
32.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中步骤(c)包括当接触所述测试剂后所述嗅觉受体的活性增加时，确定所述测试剂是能够改变宠物食品的适口性的化合物。
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