JP2016530487A - 方法 - Google Patents
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Abstract
Description
(i)ネコ科もしくはイヌ科のGPR120またはネコ科もしくはイヌ科のCD36受容体の配列;
(ii)配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7で示されるアミノ酸配列;
(iii)配列番号1または配列番号3に対して少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列;
(iv)配列番号5または配列番号7に対して少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列;
(v)配列番号3または配列番号7のアミノ酸127〜279を含むアミノ酸配列;あるいは
(vi)(i)(ii)(iii)、(iv)または(v)の機能性断片
を含み、試験化合物がポリペプチドに結合するか否かおよび/またはその活性を調節するか否かを特定するステップを含む方法を提供する。
−試験化合物の非存在下および存在下におけるポリペプチドの生物活性を測定するステップと、
−試験物質の非存在下と存在下との間で生物活性に差がある場合に、ポリペプチドに結合するかまたはその生物活性を調節するものとして物質を同定するステップと
を含み得る。
(i)ポリペプチドの(3次元)3D構造を予測するステップと、
(ii)試験化合物を用いて、ポリペプチドの予測された3D構造をin silicoでスクリーニングするステップと、
(iii)試験化合物がポリペプチドの結合部位と相互作用するか否かを予測するステップと、
(iv)化合物の3D構造がポリペプチドの3D構造の結合部位に適合する場合、ポリペプチドに結合しおよびその生物活性を調節するものとして化合物を同定するステップと
を含み得る。
ネコ科GPR120の適正な配列の決定
頬スワブを用いて、DNAを26匹のネコから採取した。各ネコから2つのスワブ(swabs)を採取した。Qiagen DNeasy Blood and Tissue Kitで抽出したDNAを配列決定に使用した。公的に入手可能なネコ科配列ゲノムに基づいて、エクソン領域に隣接するようにプライマーを設計した。エクソン領域はすべて、可能な場合は両方向から配列決定した。配列は、Sequencher v5.1(Gene Codes,USA)を用いて分析した。26匹のネコに由来するコンセンサス配列を公的に入手可能な配列と比較し、すべてのエクソンに対する最終コンセンサス配列を作成した。
ネコ科CD36の適正な配列の決定
頬スワブを用いて、DNAを26匹のネコから採取した。各ネコから2つのスワブを採取した。Qiagen DNeasy Blood and Tissue Kitで抽出したDNAを配列決定に使用した。公的に入手可能なネコ科配列ゲノムに基づいて、エクソン領域に隣接するようにプライマーを設計した。エクソン領域はすべて、可能な場合は両方向から配列決定した。配列は、Sequencher v5.1(Gene Codes,USA)を用いて分析した。26匹のネコに由来するコンセンサス配列を公的に入手可能な配列と比較し、すべてのエクソンに対する最終コンセンサス配列を作成した。
イヌ科GPR120の適正な配列の決定
84匹のイヌから少量の血液試料を用いてDNAを採取した。15倍の平均カバレッジを与えるすべての試料について、イルミナプラットフォームを用いる全ゲノム配列決定を行った。Bowtie2を用いて、データを参照ゲノムに対してマッピングした。目的の領域をインハウスのPerlスクリプトを用いて抽出した。エクソン領域を同定し、すべてのエクソンに対する最終コンセンサス配列を作成した。
イヌ科CD36の適正な配列の決定
84匹のイヌから少量の血液試料を用いてDNAを採取した。15倍の平均カバレッジを与えるすべての試料について、イルミナプラットフォームを用いる全ゲノム配列決定を行った。Bowtie2を用いて、データを参照ゲノムに対してマッピングした。目的の領域をインハウスのPerlスクリプトを用いて抽出した。エクソン領域を同定し、すべてのエクソンに対する最終コンセンサス配列を作成した。
オレイン酸に対するネコ科応答を決定するための給餌試験
ネコのゲルパネルを用いて、単体の曝露における一連の濃度のオレイン酸の嗜好性を比較した。0.001%オレイン酸〜1%オレイン酸の範囲に及ぶ8濃度のオレイン酸について、用量応答を試験した。すべての製品(ブランク、0%オレイン酸、を含む)は、ベースラインのゲル摂取を増大させるために、食物摂取用/正の呈味物質として、25mM L−ヒスチジンを含有し、負の影響の可能性があるオレイン酸濃度の同定を可能にした。
リノール酸に対するネコ科応答を決定するための給餌試験
ネコのゲルパネルを用いて、単体の曝露における一連の濃度のリノール酸の嗜好性を比較した。0.001%リノール酸〜1%リノール酸の範囲に及ぶ8濃度のリノール酸について、用量応答を試験した。すべての製品(ブランク、0%リノール酸、を含む)は、ベースラインのゲル摂取を増大させるために、食物摂取用/正の呈味物質として、25mM L−ヒスチジンを含有し、負の影響の可能性があるリノール酸濃度の同定を可能にした。
ラウリン酸に対するネコ科応答を決定するための給餌試験
ネコのゲルパネルを用いて、単体の曝露における一連の濃度のラウリン酸の嗜好性を比較した。0.05%ラウリン酸〜1%ラウリン酸の範囲に及ぶ5濃度のラウリン酸について、用量応答を試験した。すべての製品(ブランク、0%ラウリン酸、を含む)は、ベースラインのゲル摂取を増大させるために、食物摂取用/正の呈味物質として、25mM L−ヒスチジンを含有し、負の影響の可能性があるラウリン酸濃度の同定を可能にした。
パルミチン酸に対するネコ科応答を決定するための給餌試験
ネコのゲルパネルを用いて、単体の曝露における一連の濃度のパルミチン酸の嗜好性を比較した。0.05%パルミチン酸〜1%パルミチン酸の範囲に及ぶ5濃度のパルミチン酸について、用量応答を試験した。すべての製品(ブランク、0%パルミチン酸、を含む)は、ベースラインのゲル摂取を増大させるために、食物摂取用/正の呈味物質として、25mM L−ヒスチジンを含有し、負の影響の可能性があるパルミチン酸濃度の同定を可能にした。
リノール酸に対するイヌ科応答を決定するための給餌試験
2つの異なるイヌパネルを用いて、複数濃度のリノール酸の嗜好性を比較した。各パネルは、単一品種のイヌから構成し;各パネルは異なる品種とした。
オレイン酸に対するイヌ科応答を決定するための給餌試験
2つの異なるイヌパネルを用いて、複数濃度のオレイン酸の嗜好性を比較した。各パネルは、単一品種のイヌから構成し;各パネルは異なる品種とした。
GP120およびGPR120+CD36受容体のin vitroアッセイの開発および使用のための方法
最初に、標的受容体GPR120およびCD36に対する遺伝子配列を、ネコおよびイヌの遺伝子を再配列決定することにより確認した。
CD36受容体のin vitroアッセイの開発および使用ための方法
最初に、標的受容体CD36に対する遺伝子配列を、ネコおよびイヌの遺伝子を再配列決定することにより確認した。
GPR120受容体のin silicoモデルの開発および使用のための方法
タンパク質構造データバンクから入手可能なA群のGPCRの結晶構造をホモロジーモデリングの鋳型として用いて、GPR120のモデルを構築した。Modelerソフトウェアパッケージを使用した。
Claims (15)
- (i)ネコ科もしくはイヌ科のGPR120またはネコ科もしくはイヌ科のCD36受容体の配列;
(ii)配列番号1、配列番号3、配列番号5または配列番号7で示されるアミノ酸配列;
(iii)配列番号1または配列番号3に対して少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列;
(iv)配列番号5または配列番号7に対して少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列;
(v)配列番号3または配列番号7のアミノ酸127〜279を含むアミノ酸配列;
(vi)(i)、(ii)、(iii)、(iv)または(v)の機能性断片
を含むポリペプチドに結合するおよび/またはその活性を調節する化合物を同定する方法において、
試験化合物が、前記ポリペプチドに結合するか否かおよび/またはその活性を調節するか否かを特定するステップを含む方法。 - (a)GPR120受容体および/またはCD36受容体に結合するおよび/またはその活性を調節する呈味化合物を同定する方法において、
a)前記GPR120受容体が、
i)ネコ科、イヌ科もしくはヒトのものであるか;
ii)配列番号1、配列番号5もしくは配列番号9のアミノ酸配列を有するか;または
iii)配列番号1、配列番号5もしくは配列番号9に対して少なくとも87%同一であり;および、
b)CD36受容体が、
i)ネコ科、イヌ科もしくはヒトのものであり;
ii)配列番号3、7もしくは11のアミノ酸配列を有し;
iii)配列番号3、7もしくは11に対して少なくとも83%同一である、方法。 - in vitro法である、請求項1または2記載の方法。
- in silico法である、請求項1または2記載の方法。
- (i)化合物の非存在下および存在下における前記ポリペプチドの生物活性を測定するステップ、および
(ii)化合物の非存在下と存在下との間で生物活性に差がある場合に、前記ポリペプチドに結合するまたはその生物活性を調節するものとして前記化合物を同定するステップ、
を含む、請求項3記載のin vitro法。 - 前記ポリペプチドを化合物と接触させるステップをさらに含む、請求項5記載のin vitro法。
- (a)前記ポリペプチドの3次元(3D)構造を予測するステップ、
(b)試験化合物の3D構造を用いて、前記ポリペプチドの予測された3D構造をin silicoでスクリーニングするステップ、
(c)前記試験化合物が前記ポリペプチドの結合部位に適合するか否かを特定するステップ、および
(d)化合物の3D構造が前記ポリペプチドの3D構造の結合部位に適合する場合、前記ポリペプチドに結合しおよびその生物活性を調節するものとして前記化合物を同定するステップ、
を含む、請求項4記載のin silico法。 - 請求項1〜7いずれか1項記載の方法により同定された物質または化合物を含む食料。
- 化合物または物質が、
(i)ネコ科もしくはイヌ科のGPR120またはネコ科もしくはイヌ科のCD36受容体の配列;
(ii)配列番号1、配列番号3、配列番号5または配列番号7で示されるアミノ酸配列;
(iii)配列番号1または配列番号3に対して少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列;
(iv)配列番号5または配列番号7に対して少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列;
(v)配列番号3または配列番号7のアミノ酸127〜279を含むアミノ酸配列;
(vi)(i)、(ii)、(iii)、(iv)または(v)の機能性断片
を含むポリペプチドを活性化するか否かを特定するためのキットにおいて、
前記(i)〜(vi)の1つまたは複数のポリペプチド、および1つまたは複数の試験化合物を含むキット。 - 配列番号3で示されるアミノ酸配列を含む、単離ポリペプチド。
- 請求項10記載のポリペプチドをコードする単離核酸。
- 配列番号4のヌクレオチド配列を含む、請求項11記載の核酸。
- 請求項11または12記載の核酸を含むベクター。
- 請求項10記載のポリペプチド、請求項11または12記載の核酸、あるいは請求項13記載のベクターを含む、宿主細胞。
- (i)ネコ科もしくはイヌ科のGPR120またはネコ科もしくはイヌ科のCD36受容体の配列;
(ii)配列番号1、配列番号3、配列番号5または配列番号7で示されるアミノ酸配列;
(iii)配列番号1、配列番号3に対して少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列;
(iv)配列番号5または配列番号7に対して少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列;
(v)配列番号3または配列番号7のアミノ酸127〜279を含むアミノ酸配列;
(vi)(i)、(ii)、(iii)、(iv)または(v)の機能性断片
を含むポリペプチドを含む、融合タンパク質。
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