CN105452286B - 方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种鉴定化合物的方法,所述化合物与编码一种或多种参与检测和感知脂肪酸的受体的一种或多种多肽结合或调节所述多肽活性。
Description
技术领域
本发明涉及一种鉴定化合物的方法,所述化合物与编码一种或多种参与检测和感知脂肪酸的受体的一种或多种多肽结合或调节所述多肽活性。
背景技术
众所周知许多猫伴侣动物和犬伴侣动物挑剔它们的食物。动物将经常拒吃它已经吃过一段时间的食料(foodstuff),或拒绝吃任何超过最低量的食料。部分这种现象可能受原料感官概况的微妙差异驱使。这些差异可能无法由人类消费者感知,但是归因于嗅觉系统和味觉系统的差异,猫伴侣动物和犬伴侣动物可以充分觉察这些差异。这些感官差异可以归因于所用原料的自然变异或当物料供应短缺并且不得不用替代品替换时。这可令主人非常沮丧并且可导致主人感觉动物不快乐并且不享受其食物。如果不消费动物可获得的足量食物,动物还可能无法摄入其需要量的必需营养素。因此,可以清楚地看到,需要一种方式以鼓励伴侣动物吃为其提供的食料。已经提出许多解决方案以克服这个问题。大部分市售宠物食物以一系列不同的风味和/或质地提供。但是,伴侣动物主人将知道,伴侣动物经常会由于不明原因突然拒绝主人觉得是动物最偏好的风味。通过向伴侣动物提供不同食料的选择,已经对伴侣动物的风味偏好性进行了大量研究。
哺乳动物中的味觉感知受动物舌头的味蕾上的味觉受体(taste receptor)控制并且通常认为涉及5种味觉感知;咸味、甜味、苦味、酸味和鲜味。食物的口味由哪种受体受到刺激决定。虽然一些味觉受体在物种之间有同源性,每种受体类型的普遍程度、频率和活性取决于物种,因为如所预计那样,食草动物将需要不同于食肉动物的口味刺激。猫和犬味觉受体与人味觉受体有一些同源性,尽管,如已知那样,猫科动物和犬科动物中的不同受体具有与人类中不同的激活和/或偏好性水平。
通常认为对食物中脂肪的感知已经归因于口感并且在一定程度归因于嗅觉。但是,在人类和啮齿类领域,最近已经鉴定脂肪酸味觉受体(卡尔托尼(Cartoni)等人,2010;加林多(Galindo)等人,2012;马丁(Martin)等人,2011),这表明味觉反应还参与脂肪感知和检测。
预测GPR120(也称作GPR129、03FAR1、PGR4、FFAR4)是G蛋白偶联的细胞表面受体,含有参与检测特定脂肪酸的7个跨膜结构域(transmembrane domain)(以及胞外部分)和参与信号转导的G蛋白结合的胞内部分。认为GPR120结合游离形式的中链至长链脂肪酸,如油酸和亚油酸。已经预测在人类中结肠内分泌细胞上存在GP120受体的两种同工型(isoform)(剪接变体)GPR120L和GPR120S。已经提出长同工型在感知口味方面没有功能性地发出信号。
GPR120在多种哺乳动物组织中表达,并且已经已知参与刺激胆囊收缩素(cholecystokinin,CCK)从STC-1(肠分泌细胞系)分泌,此外已经报道GPR120对分泌胰高血糖素样肽(glucogon-like peptide,GLP-1)具有刺激作用。GPR120还在脑下垂体(pituitary gland)中表达并且因此已经探索其参与应激调节的可能性。GPR120是不饱和长链脂肪酸的已知受体并参与GLP-1分泌、胰岛素敏化以及抗炎效应和抗肥胖效应。已经提出GPR120激动剂或拮抗剂可以用作治疗多种代谢性疾病如糖尿病的潜在疗法。但是,尚待探索GPR120的潜在适口性增强作用。
EP1688138A1(武田制药有限公司(Takeda Pharmaceutical Company Limited))是涉及调节人衍生性14273受体(GPR120受体)功能的特异性作用剂的欧洲专利申请。该文献描述了刺激GPR120的低分子量合成激动剂或拮抗剂。这些物质据称可用于治疗暴食、糖尿病或肥胖症。描述了能够抑制GPR120的替代性作用剂及其治疗厌食症的用途。该申请限于人类和小鼠GPR120受体并涉及在治疗性背景下化合物的鉴定和用途。
专利申请公开WO2007/134613(瑞欧-科学公司(Rheo-Science A/S))涉及多种哺乳动物组织中的GPR120受体表达。该申请提出化合物用于调节GPR120的表达以治疗、缓解、预防或诊断人类中糖尿病和/或肥胖症的用途,即治疗性应用。
欧洲专利申请EP1932920A1(卫材研究与开发管理有限公司(Eisai R&DManagement Co Ltd))公开了一种用于确定某物质是否改变人GPR120介导的细胞刺激活性以用于治疗性应用的方法。
专利申请公开WO2011/159297A1(麦他波勒克斯公司(Metabolex Inc))描述了人和大鼠的GPR120激动剂以及它们治疗代谢性疾病(包括糖尿病和与血糖控制不良相关的疾病)的用途。该申请描述了将GPR120激动剂施用至小鼠以确定对胰岛素、胰高血糖素样肽1和多种其他激素分泌的影响。显示GPR120激动剂可以在小鼠中响应于腹内葡萄糖负荷而降低血糖。
巴拉特·希姆普卡德(Bharat Shimpukade)等人(药物化学杂志(Journal ofMedicinal Chemistry),专利和选择的GPR120激动剂的发现(Discovery of a Patent andSelective GPR120Agonist),2012年5月10日;59(9):4511-4515)公开了一种用于治疗性用途的人GPR120激动剂。
孙启(Qi Sun)等人(分子药理学(Molecular Pharmacology),基于对接模拟的GPR120激动剂的结构-活性关系(Structure-Activity Relationships ofGPR120Agonists Based on a Docking Simulation),2010年11月;78(5):804-810)描述了用于治疗目的人GPR120激动剂。
原高史(Takafumi Hara)等人(纽宁-斯密特博格药理学文献(Naunyn-SchmiedArch Pharmacol),游离脂肪酸受体GPR120和GPR40的新型选择配体(Novel SelectiveLigands for Free Fatty Acid Receptors GPR120and GPR40),2009年9月;380(3):247-255)尝试鉴定人GPR120受体的新治疗性配体。但是,这些作者仅能够鉴定部分激动剂。
铃木孝义(Takayoshi Suzuki)等人(药物化学杂志(Journal of MedicinalChemistry),源自PPARy激动剂的G蛋白偶联受体120-选择性激动剂的鉴定(Identification of G Protein-Coupled Receptor 120-Selective Agonists Derivedfrom PPARy Agonists),2008年12月11日;51(23):7640-7644)描述了发现GPR120选择性激动剂的需求,原因是这些选择性激动剂可以作为治疗剂使用。
CD36(还称作FAT、GP3B、GP4、GPIV、SCARB3、血小板反应蛋白受体)不属于G蛋白偶联受体家族(它属于B类清除受体家族),参照人类中其他已知的脂肪酸味觉受体,这不同寻常。
已知家养猫科动物挑剔食物,并且许多主人觉察到猫将在特定的日子仅吃某些食料。因此,确保猫充分响应于特定食料的能力确保食料总是得到动物接受,并且还确保主人感觉到动物快乐和健康。
犬科动物也可能挑剔,或在某些动物的情况下,在食物选择方面不加区分。通过改善食料的味觉感知,可以鼓励犬科动物更可靠和更一致地吃特定食料。
目前,通过喂食试验鉴定猫和犬对口味刺激的偏好性,就成本、时间和结果而言,所述喂食试验可能无效率。另外,鉴定新口味刺激是困难的,因为许多化合物可能需要使用动物偏好性试验测试并处理,以确定哪种化合物可以可靠地吸引猫科动物和犬科动物。相对大量的每种测试化合物对这类方法是必需的。
因此,需要可靠、更高效的筛选方法以鉴定可以结合于并刺激(或其他调节)动物、尤其是犬科动物和猫科动物中某些味觉受体的口味化合物。
发明内容
因此,在一个方面,本发明提供一种用于鉴定与多肽结合和/或调节所述多肽活性的化合物的方法,所述多肽包含;
(i)猫或犬GPR120或者猫或犬CD36受体的序列;
(ii)如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7中所述的氨基酸序列;
(iii)与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3具有至少90%同一性的氨基酸序列;
(iv)与SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:7具有至少90%同一性的氨基酸序列;
(v)包含SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:7的氨基酸127至279的氨基酸序列;或
(vi)(i)、(ii)、(iii)、(iv)或(v)的功能性片段。
所述方法包括确定测试化合物是否与所述多肽结合和/或调节所述多肽活性。
发明人已经发现,包含SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:3的序列的多肽分别是人GPR120脂肪酸受体和CD36脂肪酸受体的猫同源物的氨基酸序列。SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:7分别是犬GPR120受体和CD36受体的氨基酸序列。人序列分别地在SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:11中显示。
序列从猫或犬再测序的(re-sequenced)基因组DNA获得并与人序列比较且与建议的预测的猫和犬序列比较。猫CD36基因序列中,在公开的序列和发明人分离的序列之间存在一些差异。在本发明中还包括功能变体(functional variant)和等位变体(allelicvariant)的用途,所述功能变体和等位变体可以在序列上有差异,但是仍能够接受脂肪酸刺激并导致动物及本身在筛选方法内部感知脂肪酸。
预测猫和犬序列是有活性的功能性受体,原因在于可获得的人、大鼠和鼠科动物GPR120和CD36序列的序列相似性(至少82%相似性)。没有理由不相信这类受体在体内没有功能,尤其从以下事实来看是这样:发明人已经示出猫科动物和犬科动物对已知与人等同受体结合的油酸和亚油酸作出明显反应,并且体外测定显示这些受体与已知的配体结合并作出反应。
因此,在本发明的一个方面中,该方法是体外方法。所述体外方法可以包括:
-在测试化合物不存在和存在下测量多肽的生物活性;并且
-当与测试剂存在下相比,在测试剂不存在下的生物活性之间存在差异时,鉴定作为一种与该多肽结合或调节其生物活性的作用剂(agent)。
体外方法还可以包括使多肽与测试化合物接触。
用于该方法中的检测方法可以包括使用标记的化合物/作用剂,和在洗涤后确定哪种测试化合物仍与受体结合。可以通过监测细胞内部因受体激活而增加的游离钙浓度(称作钙通量(calcium flux)),检测由化合物与受体结合所诱导的活性,这也是本领域技术人员已知的。可以通过荧光检测如钙敏感性荧光染料或使用发光蛋白的发光检测进行监测。备选方法涉及如技术人员还已知的cGMP活性监测。
在人类中,CD36的氨基酸残基127和279之间的区域已经牵涉长链脂肪酸结合,因此,包含SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5的这个部分的多肽可以用于本发明的方法中。包含SEQID NO:3或SEQ ID NO:5的氨基酸残基155至183的多肽可以用于本发明的筛选方法中。
该方法还可以涉及同时使用本发明的两种多肽,原因是CD36蛋白可以作为蛋白伴侣以允许某化合物或作用剂与GPR120的蛋白质相互作用或增加GPR120和脂肪酸或其他活化化合物之间的相互作用。因此,作为本发明的又一个方面,包括包含两种多肽的体外方法。因此,本发明包括一种方法,所述方法包括在测试化合物不存在和在其存在下,测量GPR120多肽(SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:5)或其片段在CD36多肽(分别是SEQ ID NO:3或SEQID NO:7)存在下的生物活性;并且鉴定与该作用剂不存在下的活性相比造成活性差异的作用剂。
筛选可以调节多肽的生物活性的作用剂的方法是本领域熟知的并且可以涉及使用本发明多肽在其上固定化的固相支持物。
通过这类筛选方法鉴定的作用剂可以抑制/拮抗或激活/激动本发明肽的生物活性。因此,这类作用剂可以用作受体激动剂或拮抗剂。
通过本发明体外方法鉴定的化合物可以在体内(例如,在喂食试验中)进一步测试。
本发明还涉及一种用于鉴定与GPR120受体和/或CD36受体结合和/或调节所述受体活性的口味化合物的方法,其中GPR120或CD36受体是猫的、犬的或人的(SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:11)或其中GPR120受体与SEQ ID NO:1至少87%相同,并且其中CD36受体与SEQ ID NO:3至少82%相同。
GPR120受体可以与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:9的任一者90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%相同。
CD36受体可以与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:11的任一者85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%相同。
这类口味化合物的鉴定可以产生用于猫、犬或人类消费的更适口食料添加物。
需要鉴定比已经已知与GPR120和/或CD36结合的化合物更有益的化合物;例子包括生产更容易/更经济的化合物;可以就相似的效果而言相对于已知化合物以更少的量使用的化合物;与其他化合物协同相互作用的化合物。
本发明还可以涉及称作FFAR1(GPR40)、FFAR2(GPR43)和/或FFAR3(GPR41)的受体。以往已经将这些多肽描述为与脂肪酸结合,但是没有在口味化合物的背景下,也没有在猫科动物和犬科动物的背景下描述。
因此本发明的范围内还包括如本文所述的用于鉴定与FFAR1受体、FFAR2受体或FFAR3受体结合和/或调节它们的生物活性的化合物的方法。
每个方面的全部特征适用于彼此方面,加以必要变通。
本文中使用标准单字母代码描述氨基酸序列。序列以N端至C端的方向从左至右描述。可以并入肽中的氨基酸包括任何已知的天然存在氨基酸。
此外,本发明的肽还可以包含修饰氨基酸,即,在自然界中并不天然存在的氨基酸。例如,本发明的肽可以包含正亮氨酸或本领域已知的其他修饰氨基酸。
本发明的肽可以仅由本文公开的氨基酸序列组成,或可以包含除这些序列之外的其他氨基酸。本文所述的多肽序列可以在序列的N端(氨基端)末端和/或在C端(羧基端)末端含有额外的氨基酸,尤其在本发明的筛选方法中使用时。这类种额外的氨基酸可以有助于固定用于筛选目的多肽,或允许多肽成为融合蛋白的部分,以易于检测生物活性。
本发明的多肽包含上述序列的保留中链至长链脂肪酸结合能力的同源物或衍生物。可以在不造成任何明显结构或功能性改变的情况下,将众多保守性氨基酸置换引入肽中。因此,可以将一种氨基酸替换为相似“类型”的另一种氨基酸,例如,将一种疏水性氨基酸更换为另一种疏水性氨基酸。合适的保守性氨基酸置换是本领域已知的。在这类同源物和衍生物的情况下,与同源物或衍生物应当保留结合脂肪酸及向下游传输信号的能力相比,与本文所鉴定的特定序列的同一性程度较不重要。然而,适当地,提供与本文所提供的序列具有至少90%同一性的同源物或衍生物。最优选地,提供具有至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的同源物或衍生物。
通过以下方式确定两个氨基酸序列或两个核酸序列的同一性百分数(percentidentity):出于最佳比较目的而比对序列(例如,可以在第一个序列中引入多个空位(gap)以便与该序列最佳比对)并且比较在相应位置处的氨基酸残基或核苷酸。“最佳比对”是两个序列的产生最高同一性百分数的比对。同一性百分数由被比较的序列中的相同氨基酸残基或核苷酸数目决定(即,同一性%=相同位置数/位置总数×100)。
使用本领域技术人员已知的数学算法,可以完成两个序列之间同一性百分数的确定。用于比较两个序列的数学算法的例子是卡林(Karlin)和阿特舒尔(Altschul)(1990)美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)87:2264-2268的算法,该算法如在卡林和阿特舒尔(1993)美国国家科学院院刊90:5873-5877中那样修改。阿特舒尔等人(1990)分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)215:403-410的NBLAST程序和BLASTP程序已经并入这种算法。BLAST核苷酸搜索可以用NBLAST程序,评分=100、字长度=12执行,以获得与本发明核酸分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白质搜索可以用XBLAST程序、评分=50、字长度=3执行,以获得与本发明蛋白质分子同源的氨基酸序列。为了用于比较目的获得带空位的比对,可以如阿特舒尔等人(1997)核酸研究(Nucleic Acids Res.)25:3389-3402中所述那样使用Gapped BLAST。可选地,PSI-Blast可以用来执行检测分子之间远缘关系(distantrelationship)(Id.)的迭代搜索。当使用BLAST、Gapped BLAST和PSI-Blast程序时,可以使用相应程序(例如XBLAST和NBLAST)的默认参数。参见http://www.ncbi.nlm.nih.gov。用来比较序列的数学算法的另一个例子是迈尔斯(Myers)和米勒(Miller)的算法CABIOS(1989)。作为CGC序列比对软件包组成部分的ALIGN程序(2.0版)已经并入这种算法。本领域已知用于序列分析的其他算法包括如托瑞里斯(Torellis)和罗博蒂(Robotti)(1994)计算机应用生物科学(Comput.Appl.Biosci.),10:3-5中所述的ADVANCE和ADAM以及在皮尔森(Pearson)和李普曼(Lipman)(1988)科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.)85:2444-8描述的FASTA。在FASTA内部,ktup是设置搜索灵敏度和速度的控制选项。
已经用亚油酸和油酸实施对人类和啮齿类GPR120和CD36蛋白的实验,这些实验中许多用敲除啮齿类模型进行。尽管这些实验显示缺少该受体的效应,它们并未特异性显示该分子激活此受体。在加林多(Galindo)等人2011化学(Chem.Sen)中描述了显示油酸和亚油酸对人GPR120体外反应的实验例子。相对于亚油酸,在库达(Kuda)等人,2013生物化学杂志(J.Biol.Chem)中描述了人CD36实验。卡尔托尼(Cartoni)等人,2010神经科学学报(J.Neurosci.)显示GPR120敲除小鼠对亚油酸和油酸具有改变的反应。盖拉德(Gaillard)等人(2008,FASEB)显示小鼠CD36+味觉受体细胞对亚油酸敏感,而CD36-味觉细胞不敏感。本文所述多肽的人类和啮齿类同源物已经显示与这些特定的长链脂肪酸结合。针对浓度渐增的脂肪酸的体内反应而言,猫和犬等同序列出现与这类分子结合,如本文中所示。另外,本文所述的猫受体体外测定显示受亚油酸和油酸阳性激活(positive activation)。
用于本发明筛选方法中的肽可以通过本领域熟知的化学合成方法产生。例如,可以使用固相肽合成法,化学合成肽。这些方法采用固相或溶液相合成方法(关于固相合成技术,参见例如,J·M·斯图尔特(J.M.Stewart)和J·D·杨(J.D.Young),固相肽合成(SolidPhase Peptide Synthesize),第2版,皮尔斯化工有限公司,罗克福德III(PierceChemical Co.,Rockford III.)(1984)以及G·巴拉尼(G.Barany)和R·B·梅里菲尔德(R.B.Merrifield),肽:分析合成(The Peptides:Analysis Synthesize),生物学(Biology),编者E·格罗斯(E.Gross)和J·梅恩豪福尔(J.Meienhofer)第2卷,学术出版社(Academic Press),纽约,1980,第3-254页;并且关于经典溶液合成(classical solutionsynthesiz),参见例如M·波丹斯基(M Bodansky),肽合成的原理(Principles of PeptideSynthesize),施普林格(Springer-Verlag),柏林(Berlin),1984以及E·格罗斯和J·梅恩豪福尔编著,肽:分析合成,生物学,(The Peptides:Analysis,Synthesieze,Biology),如上文,第1卷)。其他肽合成方法是本领域已知的。
可选地,可以通过表达编码肽的前体的核酸分子产生肽。在另一个方面,本发明提供编码本发明肽的前体的核酸序列。这类核酸可以通过本领域熟知的方法合成(例如,参见分子克隆:实验室手册(Molecular Cloning:A Laboratory Manual):第3版,萨姆布鲁克(Sambrook)和拉塞尔(Russell),2001,冷泉港实验室出版社(Cold Spring HarborLaboratory Press))。
此外,编码肽的核酸可以并入合适的核酸载体。在又一个方面,本发明提供包含本发明核酸的载体。载体可以具有与编码肽的核酸序列可操作地连接的(operably linked)启动子元件。合适的载体和产生这类载体的方法是本领域已知的。
可以将本发明的核酸或本发明的载体引入宿主细胞中。因此,在额外的方面,本发明提供包含本发明核酸或载体的细胞。细胞可以是分离的细胞,如CHO K1细胞,或其他适当已知的稳定细胞系。
在又一个方面,本发明提供了包含本文所述多肽的融合蛋白。这类融合蛋白可以含有可检测标记,官能团如载体、标签、稳定化序列或可以借以检测脂肪酸结合作用的机理。合适的标签包括FLAG标签、His标签、MYC标签、麦芽糖结合蛋白和本领域已知的其他标签。本发明也提供编码这类融合蛋白的核酸、含有编码融合蛋白的核酸的载体和包含这类核酸或载体的宿主细胞。
合成这类融合蛋白的方法是本领域熟知的。
本发明的方法可以是计算机模拟方法。这种方法可以包括:
(i)预测多肽的(三维)3D结构;
(ii)以计算机模拟方式(in silico)用测试化合物筛选多肽的预测3D结构;
(iii)预测测试化合物是否与多肽的结合位点相互作用;并且
(iv)当化合物的3D结构匹配(fit)多肽3D结构的结合位点时,鉴定所述化合物为一种与所述多肽结合或调节所述多肽生物活性的化合物。
这类技术和方法是本领域技术人员已知的。如本领域技术人员将通常进行那样,使用从蛋白质数据库可获得的A组其他GPCR的晶体结构作为同源性建模的模板,建立GPR120的模型。使用Modeler软件包。如本领域技术人员将通常进行那样,进行针对单种游离脂肪酸(例如亚油酸)的模拟和最小化。可以使用任何合适的建模软件包,也可以使用合适的模拟软件程序。
通过本发明计算机模拟方式筛选法鉴定为与GPR120或CD36结合的化合物可以通过本发明的体外方法进一步测试。额外或备选地,可以在体内(例如,在喂食试验中)测试这种化合物。
根据本发明第一方面,本发明的又一个方面提供调节GPR120受体或CD36受体的生物活性的化合物。
本发明这个方面的方法因此是一种鉴定口味化合物的合适筛选方法,所述口味化合物可以在猫科动物或犬科动物食料中使用以确保这种食料的长期接受度和一致摄入。
因此,在额外的方面,本发明提供包含由本发明方法鉴定的作用剂或化合物的食料。
食料可以是本领域已知的任一种。由本发明方法鉴定的化合物可以掺入猫或犬可以在其膳食中消费的任何产品中。因此,本发明涵盖标准食品、补充剂、宠物食物、饮料、点心和零食。食品优选地是已烹饪的产品。它可以掺入肉或动物衍生材料(如牛肉、鸡肉、火鸡肉、羔羊肉、血浆、骨髓等或它们的两种或更多种)。备选地,食品可以不含肉(优选地包含肉替代品如大豆、玉米谷蛋白或大豆产品)以提供蛋白质源。产品可以含有额外的蛋白质源,如大豆蛋白浓缩物、乳蛋白、谷蛋白等。产品还可以含有淀粉源,如糊化淀粉,如一种或多种谷粒(例如小麦、玉米、稻、燕麦、大麦等)或可以无淀粉。常见的干商品猫食含有约10%至70%粗蛋白、约10%至60%脂肪以及剩余部分为碳水化合物,包含膳食纤维和灰分。常见的湿或微湿产品含有(基于干物质)约40%脂肪、50%蛋白质以及为纤维和灰分的剩余部分。本发明特别地与如本文所述的宠物食料相关,所述宠物食料作为猫或犬的膳食、食料或补充剂出售。在本发明文中,术语“家养”猫意指猫类,尤其家猫(Felis domesticus)(家猫(Felis catus))并且术语“家养”犬意指犬类,尤其家犬(Canis lupus familiaris)。优选地,宠物食料将满足动物的常量营养素(macronutrient)需求。
本发明每个方面的优选特征适用于每种其他方面,加以必要变通。
参考的全部文献按照法律允许的最充分程度在此公开。
附图说明
现在将参考以下非限制性实施例描述本发明。参考以下附图,其中:
图1显示猫GPR120的氨基酸序列。
图2显示猫GPR120的核苷酸序列。
图3显示猫CD36的氨基酸序列。
图4显示猫CD36的核苷酸序列。
图5显示犬GPR120的氨基酸序列。
图6显示犬GPR120的核苷酸序列。
图7显示犬CD36的氨基酸序列。
图8显示犬CD36的核苷酸序列。
图9显示人GPR120的氨基酸序列。
图10显示人GPR120的核苷酸序列。
图11显示人CD36的氨基酸序列。
图12显示人CD36的核苷酸序列。
图13显示在SEQ ID NO:3和公开的猫CD36序列之间的序列差异。
图14显示猫对油酸的剂量反应曲线。
图15显示猫对亚油酸的剂量反应曲线。
图16显示猫对月桂酸的剂量反应曲线。
图17显示猫对棕榈酸的剂量反应曲线。
图18显示犬对亚油酸的反应曲线。
图19显示犬对油酸的反应曲线。
图20显示猫GPR120的预测结构。
图21显示人CD36的预测结构。
图22显示稳定细胞系中的猫GPR120瞬时转染。
图23显示CHOK1细胞中的猫GPR120瞬时转染。
图24显示使用体外测定对猫GRP120获得的游离脂肪酸剂量反应曲线和EC50值。
图25显示使用体外测定对单独的猫GPR120及与CD36共转染的猫GPR120获得的游离脂肪酸剂量反应曲线和相应EC50值。
图26显示猫CD36仅在SSO(CD36拮抗剂)存在下的荧光响应。
图27显示使用计算机模拟方法时GPR120结合位点中亚油酸的示意图。
图28显示使用计算机模拟方法时GPR120结合位点中油酸的示意图。
具体实施方式
实施例
实施例1
测定猫GPR120的正确序列
使用颊拭子从26只猫采集DNA。从每只猫采集两根拭子。用凯杰DNeasy血液和组织试剂盒(Qiagen DNeasy Blood and Tissue Kit)提取的DNA用于测序。基于可公开获得的猫基因组序列,将引物设计成分布于外显子区侧翼。在可能情况下,全部外显子区均以两个方向测序。使用Sequencher v5.1(基因编码(Gene Codes),美国)分析序列。来自26只猫的共有序列与可公开获得的序列比较并且生成全部外显子的最终共有序列。
这些序列基于再测序的WCPN猫数据,参照RNA-Seq数据和可公开获得的猫和人序列。
证实的fGPR120编码序列匹配在Ensembl上的序列。这是正确的同工型,因为人类中鉴定的另一个长同工型没有功能地发出信号。
实施例2
测定猫CD36的正确序列
使用颊拭子从26只猫采集DNA。从每只猫采集两根拭子。用凯杰DNeasy血液和组织试剂盒提取的DNA用于测序。基于可公开获得的猫基因组序列,将引物设计成分布于外显子区侧翼。在可能情况下,全部外显子区均以两个方向测序。使用Sequencher v5.1(基因编码,美国)分析序列。来自26只猫的共有序列与可公开获得的序列比较并且生成全部外显子的最终共有序列。
这些序列基于再测序的WCPN猫数据,参照RNA-Seq数据、来自猫味蕾的cDNA测序数据和可公开获得的猫和人序列。
Ensembl上可获得的人和猫转录物序列在第一终止密码子后均含有节段(section)。可能在猫中,如同人类那样,直至第一终止密码子的转录物序列第一部分是初级(primary)编码序列。
在位置300处,存在一连串8个腺嘌呤残基。这不同于Ensembl上的预测转录物,而是产生一种具有472个氨基酸的蛋白质,所述蛋白质匹配猫中另一个同工型的长度并匹配人蛋白质的长度。因此Ensembl上预测的转录物均没有完全匹配这个序列,但是来自猫味觉乳头的cDNA的测序显示这种转录物是正确的转录物构型。
实施例3
测定犬GPR120的正确序列
从84只犬通过小体积血液样品采集DNA。使用lllumina平台,对全部的样品进行全基因组测序,产生平均覆盖率15x。使用Bowtie2,将数据定位至参考基因组。使用自有Perl脚本,提取目的区域。鉴定外显子区生成全部外显子的最终共有序列。
这些序列基于犬基因组测序数据,参照RNA-Seq数据和可公开获得的犬和人序列。
证实的犬GPR120编码序列匹配在Ensembl上的序列。
实施例4
测定犬CD36的正确序列
从84只犬通过小体积血液样品采集DNA。使用lllumina平台,对全部样品进行全基因组测序,产生平均覆盖率15x。使用Bowtie2,将数据定位至参考基因组。使用自有Perl脚本,提取目的区域。鉴定外显子区生成全部外显子的最终共有序列。
这些序列基于犬基因组测序数据,参照RNA-Seq数据和可公开获得的犬和人序列。
证实的犬CD36编码序列匹配在Ensembl上的序列。
实施例5
确定猫对油酸反应的喂食试验
一个猫用凝胶板用来在单次暴露(monadic exposure)中比较一系列油酸浓度的适口性。剂量反应测试8种浓度的油酸,范围从0.001%油酸至1%油酸。全部产品(包括空白,0%油酸)均含有25mM L-组氨酸作为可摄入/阳性促味剂(tastant)以增加基准线凝胶摄入量,这使得鉴定油酸浓度的潜在不利影响成为可能。
与空白(0%油酸)相比,油酸浓度0.1%、0.2%、0.3%和0.6%(w/v)产生显著更高的摄入量,显示猫能够尝出亚油酸。
实施例6
确定猫对亚油酸反应的喂食试验
一个猫用凝胶板用来在单次暴露中比较一系列亚油酸浓度的适口性。剂量反应测试8种浓度的亚油酸,范围从0.001%亚油酸至1%亚油酸。全部产品(包括空白,0%亚油酸)均含有25mM L-组氨酸作为可摄入/阳性促味剂以增加基准线凝胶摄入量,这使得鉴定亚油酸浓度的潜在不利影响成为可能。
与空白(0%亚油酸)相比,亚油酸浓度0.1%(w/v)产生显著更高的摄入量。存在更高浓度变得遭厌恶/不利的趋势,与空白(0%亚油酸)相比摄入量减少,显示猫能够尝出亚油酸。
实施例7
确定猫对月桂酸反应的喂食试验
一个猫用凝胶板用来在单次暴露中比较一系列月桂酸浓度的适口性。剂量反应测试5种浓度的月桂酸,范围从0.05%月桂酸至1%月桂酸。全部产品(包括空白,0%月桂酸)均含有25mM L-组氨酸作为可摄入/阳性促味剂以增加基准线凝胶摄入量,这使得鉴定月桂酸浓度的潜在不利影响成为可能。
总体与空白(0%月桂酸)相比,月桂酸浓度0.1%产生最高的摄入量。但是,与空白(0%月桂酸)相比,测试的最高浓度0.6%和1%月桂酸显著地遭厌恶/不利,这也显示猫能够尝出月桂酸。
实施例8
确定猫对棕榈酸的反应的喂食试验
一个猫用凝胶板用来在单次暴露中比较一系列棕榈酸浓度的适口性。剂量反应测试5种浓度的棕榈酸,范围从0.05%棕榈酸至1%棕榈酸。全部产品(包括空白,0%棕榈酸)均含有25mM L-组氨酸作为可摄入/阳性促味剂以增加基准线凝胶摄入量,这使得鉴定棕榈酸浓度的潜在不利影响成为可能。
对于任何测试的棕榈酸浓度,不存在摄入量的显著差异,这归因于棕榈酸在室温为固态(熔化温度是大约63℃)的事实。因此,棕榈酸不能够与脂肪酸受体相互作用及结合以由猫产生口味反应。
实施例9
确定犬对亚油酸反应的喂食试验
使用两个不同的犬小组来比较亚油酸浓度的适口性。每个小组由单个品种的犬组成;各个小组是不同品种。
一个犬用板用来在单次暴露中比较一系列亚油酸浓度的适口性。剂量反应测试3种浓度的亚油酸,范围从0.01%亚油酸至1%亚油酸。全部产品(包括空白,0%亚油酸)均含有100mM L-组氨酸作为可摄入/阳性促味剂以增加基准线凝胶摄入量,这使得鉴定亚油酸浓度的潜在不利影响成为可能。
不同品种对亚油酸展示不同的反应。与空白(0%亚油酸)相比,品种1对测试的最高浓度1%的亚油酸具有显著的积极/摄取反应,而品种2在测试的亚油酸浓度之间具有更细微的差异。
实施例10
确定犬对油酸反应的喂食试验
使用两个不同的犬小组来比较油酸浓度的适口性。每个小组由单个品种的犬组成;各个小组是不同品种。
一个犬用板用来在单次暴露中比较一系列油酸浓度的适口性。剂量反应测试3种浓度的油酸,范围从0.01%油酸至1%油酸。全部产品(包括空白,0%油酸)均含有100mM L-组氨酸作为可摄入/阳性促味剂以增加基准线凝胶摄入量,这使得鉴定油酸浓度的潜在不利影响成为可能。
不同的品种均对油酸展示反应。与空白(0%油酸)相比,品种1对测试的最高浓度1%的油酸具有显著的积极/摄取反应,而品种2对0.1%的油酸具有显著的积极/摄取反应。该数据显示犬能够尝出油酸。
实施例11
用于GP120和GPR120+CD36受体体外测定法开发的方法和用途。
最初,通过猫和犬基因再测序证实靶受体GPR120和CD36的基因序列。
就GPR120(FFAR4、03FAR1)来说,将获得的序列与目前可获得的猫或犬参考序列和人参考序列比较。使用短同工型的序列。
就CD36来说,将获得的序列与目前可获得的猫或犬参考序列和人参考序列比较。
一旦确立靶序列,则将它们合成并克隆到表达载体pcDNA3.1Hygro和pcDNA3.1G418中。随后使用脂质体2000(Lipofectamine 2000),将这些构建体瞬时转染入CHO K1永生化细胞系及其他常用的细胞系,并且进行测试以确立靶蛋白的成功表达。使用钙敏感荧光染料(Fluo8)实施测试。将转染的细胞接种在384孔分析平板中。通过向细胞加载染料并且随后用受体的激动剂激发细胞,可以通过测量与胞内钙释放相关的荧光增加,在FLIPRTETRA仪上记录细胞的反应,因此证实受体的功能性表达。合适实验对照消除了细胞反应为非特异性或荧光增加归因于除胞内钙由细胞释放之外的因素的任何可能性。
在稳定细胞系A或CHOK1细胞系中瞬时表达时,人GPR120和猫GPR120均在微摩尔范围内对脂肪酸显示特异性反应(分别是图22和图23)。在稳定细胞系A中,人受体不需要外源G-蛋白的存在,但是猫受体的确需要这种蛋白质存在。生成测试的全部化合物的剂量反应曲线(图24)并计算EC50值。在图25中显示GPR120和CD36共转染的效果。
实施例12
用于CD36受体体外测定开发的方法和用途。
最初,通过猫和犬基因再测序证实靶受体CD36的基因序列。
将获得的CD36序列与目前可获得的猫或犬参考序列和人参考序列比较。
一旦确立靶序列,则将它合成并克隆到表达载体pcDNA3.1Hygro中。随后使用脂质体2000,将该构建体瞬时转染入CHO K1永生化细胞系及其他常用的细胞系,并且进行测试以确立靶蛋白的成功表达。使用钙敏感荧光染料(Fluo8)实施测试。将转染的细胞接种在384孔分析平板中。通过向细胞加载染料并且随后用受体的激动剂激发细胞,可以通过测量与胞内钙释放相关的荧光增加,在FLIPRTETRA仪上记录细胞的反应,因此证实受体的功能性表达。合适实验对照消除了细胞反应为非特异性或荧光增加归因于除胞内钙由细胞释放之外的因素的任何可能性。
采用CD36进行其他实验以确立用毒胡萝卜素(Thapsigargin)预处理后,推定性CD36拮抗剂磺基-N-琥珀酰亚胺基油酸酯(Sulfo-N-succinimidyl Oleate,SSO)是否将抑制CD36介导的钙内流。图26中显示用CD36或模拟对照转染的细胞的反应。
实施例13
用于GPR120受体计算机模拟模型开发的方法和用途。
使用从蛋白质数据库可获得的A组GPCR的晶体结构作为同源性建模的模板,建立GPR120的模型。使用Modeler软件包。
进行针对单种游离脂肪酸(例如亚油酸)的模拟和最小化。使用Discovery Studio中的程序Charmm。
Claims (3)
1.一种用于鉴定激活/激动多肽活性的化合物的体外方法,其中所述化合物在猫科动物食料中使用以确保这种食料的长期接受度和一致摄入,所述多肽包含:
(i)猫GPR120受体的序列;或者
(ii)如SEQ ID NO: 1中所述的氨基酸序列;
所述方法包括确定测试化合物在Gα 15或Gα 16存在下是否激活/激动所述多肽活性,其中:
(i)在化合物不存在和存在下测量所述多肽的生物活性;并且
(ii)当与化合物不存在下相比,在化合物存在下的生物活性增加时,鉴定所述化合物为一种激活/激动所述多肽生物活性的化合物;
并且其中所述方法还包括使所述多肽与化合物接触;并且其中使所述多肽与一系列浓度的所述化合物接触,生成所述化合物的剂量反应曲线。
2.一种用于体外鉴定激活/激动GPR120受体活性的口味化合物的方法,其中所述口味化合物在猫科动物食料中使用以确保这种食料的长期接受度和一致摄入,并且其中:
GPR120受体是:
i)猫的;或者
ii)具有SEQ ID NO: 1的氨基酸序列;并且
所述方法包括确定测试化合物在Gα 15或Gα 16存在下是否激活/激动所述GPR120受体活性,其中:
(i)在化合物不存在和存在下测量所述GPR120受体的生物活性;并且
(ii)当与化合物不存在下相比,在化合物存在下的生物活性增加时,鉴定所述化合物为一种激活/激动所述GPR120受体生物活性的化合物;
并且其中所述方法还包括使所述GPR120受体与化合物接触;
并且其中使所述GPR120受体与一系列浓度的所述化合物接触,生成所述化合物的剂量反应曲线。
3.一种用于体外鉴定激活/激动(a)GPR120受体和(b)CD36受体活性的口味化合物的体外方法,其中所述口味化合物在猫科动物食料中使用以确保这种食料的长期接受度和一致摄入,并且其中:
a)GPR120受体是:
i)猫的;或者
ii)具有SEQ ID NO: 1的氨基酸序列;并且
b)CD36受体是:
i)猫的;或者
ii)具有SEQ ID NO: 3的氨基酸序列;
所述方法包括确定测试化合物在Gα 15或Gα 16存在下是否激活/激动所述(a)GPR120受体和(b)CD36受体活性,其中:
(i)在化合物不存在和存在下测量所述(a)GPR120受体和(b)CD36受体的生物活性;并且
(ii)当与化合物不存在下相比,在化合物存在下的生物活性增加时,鉴定所述化合物为一种激活/激动所述(a)GPR120受体和(b)CD36受体生物活性的化合物;
并且其中所述方法还包括使所述(a)GPR120受体和(b)CD36受体与化合物接触;并且其中使所述(a)GPR120受体和(b)CD36受体与一系列浓度的所述化合物接触,生成所述化合物的剂量反应曲线。
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