CN110174480A - 一种茶叶中4-甲基咪唑的前处理方法及含量分析方法 - Google Patents

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陈达炜
陈荣冰
王飞权
张渤
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Abstract

本发明公开了一种茶叶中4‑甲基咪唑的前处理方法及含量分析方法，包括步骤：在茶叶粉末样品中加入氘代4‑甲基咪唑内标液混匀，加入水预浸泡，再加入乙腈超声萃取，萃取液离心得上清液；将上清液冷冻，室温解冻后取下层液，待分析进样。本方法利用乙腈水溶液冷冻后能分层的化特性，无需添加额外试剂，即可实现4‑甲基咪唑富集及茶叶基质同步净化。本发明样品前处理简单、成本低，基质效应弱，灵敏度高，具有检测限低、准确度高的优点，可应用于茶叶中4‑甲基咪唑的批量检测。

Description

一种茶叶中4-甲基咪唑的前处理方法及含量分析方法
技术领域
本发明属于食品安全检测领域，具体涉及一种茶叶中4-甲基咪唑的前处理方法及含量分析方法。
背景技术
烷基咪唑是一类含氮杂环化合物，水溶性良好，被国际癌症研究机构（IARC）和美国国家毒理学办公室（NTP）归入2B类致癌物名单，加利福尼亚州环境健康危害评估办公室(OEHHA)将其安全限量定为29µg/天，引起食品安全研究者的广泛关注。烷基咪唑目前认为是生产过程中美拉德反应的副产物，而美拉德反应是茶叶加工过程中重要的反应。
茶叶中4-甲基咪唑含量低（痕量级别），因此目前烷基咪唑的检测以色谱-质谱联用法为主，而茶叶基质复杂，含有大量的多酚、生物碱、氨基酸等成分，在进行质谱分析之前通常需要净化样品，消除或减小基质效应，以减少对4-甲基咪唑检测的干扰，富集4-甲基咪唑浓度以提高质谱的响应。目前报到较多的茶叶中4-甲基咪唑预处理方法有液液微萃取法（DLLME）、固相萃取法（SPE）、固相微萃取法(SPME)、QuEChERS等前处理技术取得较好的基质净化效果，但液液微萃取法较适合液态食品，固相萃取法等所需吸附材料的制备较为复杂，大批量检测时试剂消耗及耗材使用成本巨大。
发明内容
为了克服上述现有技术存在的不足，本发明的首要目的在于提供茶叶中4-甲基咪唑的前处理方法，该方法操作简单，成本低，基质干扰小，灵敏度高，检测限低，适合于茶叶批量检测4-甲基咪唑的含量分析方法。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种茶叶中4-甲基咪唑含量分析的前处理方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）在茶叶粉末样品中加入氘代4-甲基咪唑内标液混匀，加入水预浸泡，再加入乙腈超声萃取，萃取液离心得上清液；
（2）将上清液冷冻，解冻后取下层液，待分析进样。
本发明采用氘代4-甲基咪唑内标液与茶叶粉末样品混匀，优选的，所述茶叶粉末样品与氘代4-甲基咪唑内标液的质量体积比为1g：10-30ul。
本发明是利用乙腈水溶液冷冻后能分层的化特性，实现4-甲基咪唑富集及茶叶基质同步净化，为了利于样品溶液分层，增强富集效果，优选的，步骤（1）中，所述茶叶粉末样品、水与乙腈的质量体积比为1g：1-5ml：4-10ml。
优选的，步骤（1）中，所述预浸泡的时间为20-60min；所述超声萃取的时间为20-60min。
优选的，步骤（1）中，所述离心的转速为5000r/m-10000 r/m，时间为5-10min。
本发明采用冷冻法诱导乙腈分层，冷冻的设备可采用本领域常规冷冻装置，如冰箱等。冷冻的温度不宜过低，过低会导致下层溶液快速结冰，不利于成分在两相溶液中的分配，过高则无法实现两相分层。冷冻的时间半小时以上分层可达稳定状态。优选的，步骤（2）中，所述冷冻的温度为-10~-20℃，时间为0.5-3h。
作为本发明进一步优选的技术方案，步骤（2）中，取下层液加入乙腈稀释，过微孔滤膜，待分析进样。本发明将解冻后的下层液加入乙腈稀释，可以进一步降低基质效应。
本发明还提供了一种茶叶中4-甲基咪唑的含量分析方法，其特征在于，包括如下步骤：
a、 使用上述的前处理方法对茶叶样品进行前处理，得到待测样品；
b、采用液相色谱-高分辨质谱联用仪对待测样品进行检测。
优选的，步骤b中，所述检测条件为：
液相条件：色谱柱：HILIC柱；柱温：40℃；流速：0.2mL/min；进样量：2μL；流动相：A相为甲醇；B相为5mM乙酸铵水，A:B=9:1等度洗脱，进样量5uL；
质谱条件：离子源：电喷雾离子源；扫描模式：正离子模式；喷雾电压为3.5Kv；毛细管温度320℃；加热器温度为300℃；鞘气为40arb；辅助气10arb；检测方式：平行反应监测PRM；分辨率采用MS Full Scan 70000 FWHM；定量离子：m/z 83.0609；内标离子：m/z88.0908。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本方法利用乙腈水溶液冷冻后能分层的化特性，无需添加额外试剂，即可实现4-甲基咪唑富集及茶叶基质同步净化，减少了被二次污染的风险。本发明样品前处理简单、成本低，基质效应弱，灵敏度高，具有检测限低、准确度高的优点，可应用于茶叶中4-甲基咪唑的批量检测。
具体实施方式
下面给出实施例以对本发明进行具体的描述，但不限于此。
实施例1 ：
准确称取茶叶粉末样品1g，加入20μl氘代4-甲基咪唑同位素内标溶液混合，加入2ml水浸泡30分钟，再加入8ml乙腈超声萃取20分钟，7500 rpm离心10 min。取上清液1.5 ml转入离心管放入-10℃冰箱内冷冻1.5h，取出后在室温下解冻，完成相位的低温诱导分离。取下层溶液0.2ml，用乙腈定容至1ml，过0.22μm滤膜，供液相色谱和质谱分析进样。
液相条件：色谱柱：HILIC柱（100× 2.1mm, 1.7 μm）；柱温：40℃；流速：0.2mL/min；进样量：2μL；流动相：A相为甲醇；B相为5mM乙酸铵水，A:B=9:1等度洗脱，进样量5uL；
质谱条件：离子源：电喷雾离子源；扫描模式：正离子模式；喷雾电压为3.5Kv；毛细管温度320℃；加热器温度为300℃；鞘气为40arb;辅助气10arb；检测方式：平行反应监测（PRM）；分辨率采用MS Full Scan 70000 FWHM；定量离子：m/z 83.0609；同位素内标离子：m/z88.0908。
实施例2 ：
准确称取茶叶粉末样品1g，加入25μl 氘代4-甲基咪唑同位素内标溶液混合，加入3ml水浸泡40分钟，再加入7ml乙腈超声萃取40分钟后8000 rpm离心8 min。取上清液2 ml转入离心管放入-20℃冰箱内冷冻1h，取出后在室温下解冻，完成相位的低温诱导分离。取下层溶液0.2ml，用乙腈定容至1ml，过0.22μm滤膜，供液相色谱和质谱分析进样。
液相条件和质谱条件同实施例1。
实施例3：
准确称取茶叶粉末样品1g，加入30μl氘代 4-甲基咪唑同位素内标溶液混合，加入4ml水浸泡30分钟。加入6ml乙腈超声萃取30分钟后8500 rpm离心5 min。取上清液1.5 ml转入2ml离心管放入-20℃冰箱内冷冻2h，取出后在室温下解冻，完成相位的低温诱导分离。取下层溶液0.2ml，用乙腈定容至1ml，过0.22μm滤膜，进行LC-HRMS分析。供液相色谱和质谱分析进样。
液相条件和质谱条件同实施例1。
实施例4：
准确称取茶叶粉末样品1g，加入22μl 氘代4-甲基咪唑同位素内标溶液混合，加入5ml水浸泡35分钟。加入5ml乙腈超声萃取35分钟后9000 rpm离心5min。取上清液1.5 ml转入2ml离心管放入-16℃冰箱内冷冻2h，取出后在室温下解冻，完成相位的低温诱导分离。取下层溶液0.2ml，用乙腈定容至1ml，过0.22μm滤膜，进行LC-HRMS分析。供液相色谱和质谱分析进样。
液相条件和质谱条件同实施例1。
实施例5：
准确称取茶叶粉末样品1g，加入28μl 氘代4-甲基咪唑同位素内标溶液混合，加入3ml水浸泡25分钟。加入5ml乙腈超声萃取45分钟后8000 rpm离心8min。取上清液1.5 ml转入2ml离心管放入-16℃冰箱内冷冻1.5h，取出后在室温下解冻，完成相位的低温诱导分离。取下层溶液0.2ml，用乙腈定容至1ml，过0.22μm滤膜，进行LC-HRMS分析。供液相色谱和质谱分析进样。
液相条件和质谱条件同实施例1。
方法学验证：结果如表1所示。
表1：方法学验证
由表1结果可以看出，4-甲基咪唑在0.05-10μg/L范围内具有良好的线性关系，回收率为96.4%。表明本发明采用冷冻诱导的乙腈分层方法，无需添加额外试剂，即可实现4-甲基咪唑富集及茶叶基质同步净化。本发明样品前处理简单、成本低，基质效应弱，灵敏度高，具有检测限低、准确度高的优点，可适用于茶叶中4-甲基咪唑的批量检测。

Claims (9)

1.一种茶叶中4-甲基咪唑的前处理方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）在茶叶粉末样品中加入氘代4-甲基咪唑内标液混匀，加入水预浸泡，再加入乙腈超声萃取，萃取液离心得上清液；
（2）将上清液冷冻，室温解冻后取下层液，待分析进样。
2.根据权利要求1所述的一种茶叶中4-甲基咪唑的前处理方法，其特征在于，步骤（1）中，所述茶叶粉末样品与氘代4-甲基咪唑内标液的质量体积比为1g：10-30ul。
3.根据权利要求1所述的一种茶叶中4-甲基咪唑的前处理方法，其特征在于，步骤（1）中，所述茶叶粉末样品、水与乙腈的质量体积比为1g：1-5ml：4-10ml。
4.根据权利要求1所述的一种茶叶中4-甲基咪唑的前处理方法，其特征在于，步骤（1）中，所述预浸泡的时间为20-60min；所述超声萃取的时间为20-60min。
5.根据权利要求1所述的一种茶叶中4-甲基咪唑的前处理方法，其特征在于，步骤（1）中，所述离心的转速为5000r/m-10000 r/m，时间为5-10min。
6.根据权利要求1所述的一种茶叶中4-甲基咪唑的前处理方法，其特征在于，步骤（2）中，所述冷冻的温度为-10～-20℃，时间为0.5～3h。
7.根据权利要求1所述的一种茶叶中4-甲基咪唑的前处理方法，其特征在于，步骤（2）中，取下层液加入乙腈稀释，过微孔滤膜，待分析进样。
8.一种茶叶中4-甲基咪唑的含量分析方法，其特征在于，包括如下步骤：
a、使用权利要求1-7任一项所述的前处理方法对茶叶样品进行前处理，得到待测样品；
b、采用液相色谱-高分辨质谱联用仪对待测样品进行检测。
9.根据权利要求8所述的一种茶叶中4-甲基咪唑的含量分析方法，其特征在于，步骤b中，所述检测条件为：
液相条件：色谱柱：HILIC柱；柱温：40℃；流速：0.2mL/min；进样量：2μL；流动相：A相为甲醇；B相为5mM乙酸铵水，A:B=9:1等度洗脱，进样量5uL；
质谱条件：离子源：电喷雾离子源；扫描模式：正离子模式；喷雾电压为3.5Kv；毛细管温度320℃；加热器温度为300℃；鞘气为40arb；辅助气10arb；检测方式：平行反应监测PRM；分辨率采用MS Full Scan 70000 FWHM；定量离子：m/z 83.0609；内标离子：m/z88.0908。
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