CN110168423A - 照明装置和用于在显微镜中照明的方法和显微镜 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于显微镜(1a)、尤其是光片显微镜或SPIM显微镜(1)或者倾斜平面显微镜、如OPM或SCAPE显微镜的照明装置(3)，其包括用于馈入照明光束(7)的照明输入端(13)和用于输出至少两个由照明光束(7)产生的子光束(17)的照明输出端(15)，以及本发明涉及一种包括这种照明装置(3)的显微镜(1a)和一种用于在显微镜(1a)中均匀照明试样(63)的方法。由现有技术已知的照明装置(3)和显微镜(1a)通常容易磨损并且在照明频率方面受到限制。为了消除这些缺点，所述照明装置(3)包括至少一个衍射光学构件(46)，用于将照明光束(7)分成沿着子光路(19)传播的所述至少两个子光束(17)并且用于相对改变所述至少两个子光束(17)相对彼此的传播方向(11)。

Description

照明装置和用于在显微镜中照明的方法和显微镜

技术领域

本发明涉及一种用于显微镜、尤其是光片显微镜或SPIM显微镜或者倾斜平面显微镜、如OPM或SCAPE显微镜的照明装置，该照明装置包括用于馈入照明光束的照明输入端和用于输出至少两个由照明光束产生的子光束的照明输出端。此外，本发明涉及一种显微镜、尤其是光片显微镜或SPIM显微镜或者倾斜平面显微镜、如OPM或SCAPE显微镜以及一种用于在这样的显微镜中均匀照明试样的方法。

背景技术

光片可理解成被照明的基本上沿着两个彼此垂直定向的空间方向——长度方向和宽度方向延伸的区域，其中，被照明的区域沿着垂直于这两个空间方向定向的厚度方向的延伸尺寸优选小于沿着光片宽度方向或长度方向的延伸尺寸多个数量级。通常，这样的光片通过使准直的光线沿着光线的仅仅一个横向延伸聚焦而实现。为此，例如可以使用圆柱透镜、消色差的圆柱透镜或非球面的圆柱透镜，如所谓的鲍威尔透镜。

在一个平面内照明试样的显微镜、例如光片显微镜或SPIM显微镜、倾斜平面显微镜(OPM)或SCAPE显微镜中，这样的光片用于照明试样中的照明平面，其中，避免了试样的隐去(光漂白)或损坏，因为在被照明的照明平面之外不将照射能量引入试样中。

光束可看作是传播的光的模型设想，其中光束沿着传播方向传播并且具有垂直于传播方向的空间延伸。通常，光束、尤其是由光源发出的光束具有旋转对称的高斯形的横向光线分布轮廓。可能的其他光线分布轮廓例如是贝塞尔光线形的或者帽顶形的。

在利用光片显微镜或SPIM显微镜检查异质试样时，照明光线的散射和干涉可极大恶化图像质量。在试样中激励荧光借助成形为光片的光实现。光片可理解成在垂直于光束传播方向定向的方向上聚焦的光束，该光束因此基本上仅构成在一个照明平面内并且照明该照明平面。照明平面优选位于借以探测散射光或荧光的探测物镜的焦点平面内。

在利用光片照明时，在试样的强烈散射元件或吸收元件后面可能形成明显可见的条形阴影。

在现有技术中通过如下方式抵抗这样的阴影形成，即，利用机械构件、例如可倾斜的镜子连续使光片倾斜。这些解决方案具有如下缺点，即，机械部件磨损，这强烈减小这种照明装置的使用寿命。

可达到的最大曝光频率在按照现有技术从不同方向连续照明试样时受到限制。尤其是当使用所谓的虚拟光片照明试样时，亦即照明光线(例如高斯光线、贝塞尔光线、马蒂厄光线和艾瑞光线)聚焦在试样中并且在照相机的曝光时间期间扫描经过图像区时，这是重要的。在这里，同样如当以在机械构件频率范围内的图像拍摄速度或者以比机械构件频率快的图像拍摄速度使用快速探测器时，不再能实现从不同方向连续照明的区域的平均化(Mittelung)，由此减小阴影减少的效果。在典型地用于快速偏转的谐振倾斜镜子中，将光不均匀地从所有方向射入试样中，因为镜子具有与角度相关的速度，例如服从正弦函数，并且在换向点处制动并换向。

发明内容

本发明的目的在于，创造一种用于显微镜、尤其是光片显微镜或SPIM显微镜或者倾斜平面显微镜、如OPM或SCAPE显微镜的照明装置，该照明装置在使用寿命高的同时能实现高的曝光频率。

开头所述类型的照明装置按照本发明通过如下方式实现所述目的，即，所述照明装置包括至少一个衍射光学构件，用于将照明光束分成沿着子光路传播的所述至少两个子光束并且用于相对改变所述至少两个子光束相对彼此的传播方向，使得由照明装置输出的所述至少两个子光束在输出端上非共线地相对彼此延伸。按照本发明的显微镜通过如下方式实现上述目的，即，在该显微镜中设有按照本发明的照明装置。

开头所提到的方法按照本发明通过如下方式实现所述目的，即，该方法包括：产生照明光束，沿着照明光路传播照明光束，在衍射光学构件处使照明光束衍射和分成沿着子光路以不同的传播方向传播的至少两个子光束，减小所述至少两个子光束的光彼此间的相干性，并且将子光束从不同的方向射入一个共同的照明平面中。

由于所述至少两个子光束的非共线传播，所述至少两个子光束在试样中的传播方向也不同。这具有如下优点，即，可以从不同方向照明试样的强吸收区域或者说散射区域，从而可以减少或者完全避免在试样的强吸收区域或强散射区域后面的阴影形成。

此外，使用衍射光学构件是一种能简单实现的多方向照明试样的可能性，其中，可以完全放弃易受干扰的并且可能传递振动的机械运动的构件。放弃机械构件能在使用寿命长的情况下实现高的照明频率。

按照本发明的照明装置、按照本发明的显微镜和按照本发明的方法可以通过下面的分别各自有利的并且可任意相互组合的特征来进一步改进。

衍射光学构件尤其是可理解成一个单个的元件、亦即不是包括多个元件的组件。在衍射光学构件上出现光束的入射光的衍射，从而照明光束被分成至少两个子光束。衍射优选在具有基本上在空间上周期变化的光的衍射条件的光学元件上发生。

在这里，所述至少两个子光束可以在其一部分特性方面是彼此相同的或者具有不同的参数。尤其是，所述至少两个子光束的强度可以单独调节。它们例如也可以是彼此相同或类似的。

所述至少两个子光束可以在照明装置的输出端处彼此平行并且垂直于传播方向彼此错开地构成亦或彼此成角度地传播。

由各子光束确定的平面或者说两个子光束所在的平面在此在展开的光路中基本上相当于照明平面。

在照明装置下游可连接有光片发生器，使得离开照明输出端的子光束可馈入光片发生器中并且由该光片发生器变换成至少两个子光片。如上面描述的，子光片的变换优选借助适当的圆柱透镜实现。圆柱透镜可以已经位于照明装置上游，使得光片发生器将所述至少两个子光束的线形中间图像变换成相应的子光片。

光片发生器也可以构造成用于产生之前描述的虚拟光片。该虚拟光片通过个别子光束借助至少一个扫描装置、例如扫描镜子的扫描运动产生。在按照本发明的方法中，从不同方向射入试样中的子光束可以例如是对称的高斯射线或其他射线。其可以馈入光片发生器中并产生子光片。子光片也可以构成为虚拟的子光片，其方式为扫描元件扫描子光束的传播方向并且例如使每个子光束的焦点经过和/或通过试样扫描或运动。

因此，散射光或荧光可以借助垂直于照明平面定向的观测物镜捕获，在探测器上成像和优选提供给进一步的图像处理装置。

按照本发明的照明装置可以借助适当的扫描镜子集成到显微镜中。这一方面能实现显微镜光路的紧凑构造并且能防止用于试样的检查区域受到试样照明的限制。另一方面，这样的扫描镜子能实现构建虚拟光片和/或扫描到试样中和/或通过试样的光片。

照明装置可具有不同功能的光阑，例如场光阑或孔光阑，使得另外的参数、例如光片的厚度是可变的。这些光阑可以设置成分开的并且可变的构件或者通过照明装置的光学元件形成。此外，可以在包含照明装置的显微镜中设有扫描镜子，该扫描镜子使发射光路的所有光线在物镜的后面的、亦即与物镜或试样相对的焦点平面中共同倾斜相同的角度。

在照明装置的一种进一步有利的实施方案中，所述衍射光学构件具有至少一个光栅。光栅能以不同的参数获得。可能的设计参数例如是不同照明装置彼此间的强度比例或角度。

在按照本发明的照明装置的一种进一步有利的实施方案中，设有一个单个的脉冲式光源，在该脉冲式光源的输出端上输出脉冲式照明光束并且将该照明光束馈入照明输入端中。

所述衍射光学构件由脉冲式照明光束产生至少两个同步脉冲式子光束。

脉冲式光源具有如下优点：可以预防试样的隐退、尤其是由光源的光激励的并且发射荧光的荧光团。在照明平面中的激励、亦即照明仅仅在脉冲式光源的脉冲持续时间期间实现，其中，利用脉冲序列频率产生各个光脉冲并且利用该脉冲序列频率照明试样。

因此，除了隐去之外，也可以通过吸收照明光束的光来防止试样受热。这特别是对于在活体内用显微镜检验的试样是重要的，因为在这些试样中希望使由于用显微镜检验对试样的干扰尽可能小。

此外，可以利用脉冲激励和在短脉冲时出现的脉冲峰值功率有效地激励与强度有关的、大多非线性的过程。

作为脉冲式光源，尤其是可以使用激光光源，因为利用这些激光光源可以波长选择性地激励在试样中存在的或者说附加地引入试样中的荧光。激光光源可以在所谓的持续扫气运行(cw)中运行并且借助机械式调制器、例如斩波器来调制。

优选可以使用脉冲式激光。脉冲式激光可以是质量开关的(Q开关)激光或者说模式耦合的激光。一个质量开关的激光的脉冲持续时间通常在纳秒范围内，而利用模式耦合的激光，直至到飞秒范围内的脉冲持续时间是可能的。所使用的脉冲激光光源可以具有适当的用于频率变换的元件、亦即例如是频率加倍或频率加多倍的。

使用一个单个的光源具有优点，即，仅须操控、运行和监控这个单个的光源、而不是多个光源。

在按照本发明的照明装置的一种进一步的实施方案中，所述至少两个子光束之中的每个子光束通过照明光束的光的不同的由衍射光学构件产生的衍射阶形成。因为光栅的不同的衍射阶在空间上彼此分开，因此可以按简单的方式将所述至少两个子光束彼此分开。

不同的衍射阶尤其是可以包括第零衍射阶、亦即照明光束的在其传播方向上不变的部分。

此外，在更高的衍射阶、亦即第一、第二、等等衍射阶中可以进行光源的光谱裂解。尤其是短脉冲激光具有与脉冲持续时间成反比的宽带。

光栅给宽带光源在更高的衍射阶中加载角分散、亦即个别频率或者说波长的与波长有关的传播方向，从而不是产生离散数量的光片，而是可以产生连续“扇区”类型的光片并且可以用于照明试样。在此，照明方向可以与相对于平均波长的光谱偏移成比例。

在按照本发明的照明装置的一种进一步的实施方案中，设有用于减小子光束的光彼此间的相干性的退相干装置。使用退相干装置具有如下优点：从不同方向射入的子光片或者说其光在照明平面内不相互干涉。因此可以在照明平面内避免干涉带、亦即局部的静态的并且在时间上稳定的照明最大值和照明最小值并且实现均匀地照明试样。

下面使用术语“相干”和“退相干”。这些术语不应理解成量子力学系统的相干或退相干，而是应理解成光学相干或退相干。

相同频率的两个彼此处于固定的相位关系的光波是相干的并且可干涉，其中，产生时间上恒定的干涉图案。而对于彼此不相干的光源，个别在时间上和空间上受限制的波列的建设性和破坏性的干涉彼此平均，从而不能观测到在时间上恒定的干涉图案。有空间相干和时间相干之分。如果在空间上延展的光源具有空间相干，则来自光源不同区域的光分量可相互干涉。通常，对于激光光源来说可认为，始终存在空间相干。

时间相干表明：一个光源的两个或多个光束副本可相对彼此在时间上以什么样的量偏移，直至不再出现可见的干涉。通常，借助相干长度说明时间相干。该相干长度可以从几微米(白光)直至对于稳定的激光光源的几千米。

按照本发明的照明装置的退相干装置构造成用于减小两个空间和/或时间相干的子光束彼此间的空间相干性和/或时间相干性。

退相干装置可构造成延迟机构，所述至少两个子光路为了传播各一个子光束而具有不同长度的光学行程长度。不同长度的光学行程长度具有如下优点，即，经由这些不同长度的光学行程长度可减小子光束彼此间的时间相干性。

子光束的不同长度的光学行程长度引起：一个子光路相对于至少一个另外的子光路在时间上和沿传播方向在空间上延迟。

不同长度的光学行程长度例如可通过如下方式实现，即，同样长的子光路具有不同的折射率或者相同折射率的光路具有不同的长度。借助折叠的光路也可以实现不同长度的光学行程长度。同样，上述工作方式的组合是可能的。

按照本发明的照明装置可包括至少一个光波导体。光波导体具有如下优点，即，与可容易调节的光路相反，耦合输入光波导体中的光可以在该光波导体中被引导直至光波导体的耦合输出面。

光波导体可构造成带状的光波导体。优选地可以使用以光导线缆或光导纤维形式的旋转对称的光波导体。光导线缆具有如下优点，即，这些光导线缆能以不同的光导特性可用并且通过其柔性能非常简单地实现大的光学行程长度。光导线缆例如能卷绕到轴上并且能确保多米的延迟路段在卷绕的光导线缆的由最大弯曲确定的最小直径的数量级内的空间上。

为了简化所述至少两个子光路彼此间的布置结构，每个所述子光路可包括一个光波导体，其中，所述至少两个子光路的光波导体可具有彼此不同的长度。因此，由于通过光波导体的不同飞行时间，在光波导体的输出端上得到子光束彼此间的时间延迟。

在按照本发明的照明装置的一种进一步的实施方案中，所述至少两个子光路的不同长度的光学行程长度构造成，使得它们具有长度差，该长度差大于或等于子光束的光的相干长度。这具有如下优点，即，子光束通过不同长度的光学行程长度这样相对彼此在时间上错开，使得这些子光束不再能相互干涉，亦即在照明平面内同时射入的子光束彼此间不再具有固定的相位关系。

光学行程长度彼此间的差别也可以成为光路差，其中，光路差可匹配于所使用的光源的相应相干长度。这可以有利地借助上述光波导体实现，因为其长度可以利用适当的连接段延长或减小另外的光波导体的长度。

通常，照明光束的相关长度等于子光束的相干长度，只要不进行预防措施、如几何或光谱过滤子光束。

如果为了照明光束馈入照明装置中而设有脉冲式光源，则在照明装置的一种进一步有利的实施方案中，所述至少两个子光路的光学行程长度具有长度差，该长度差大于或等于光在真空中在脉冲式产生的照明光束的脉冲持续时间期间走过的路程。这具有如下优点，即，与照明光束脉冲副本相应的子光束的脉冲这样相对彼此延迟，使得子光束的脉冲在照明平面内不是同时地、而是在时间上相继地构成所述至少两个子光片。

通过子光片彼此间这样在时间上分开，这些子光片不再会相互干涉并且由于在照明平面内的干涉而造成的条纹形成可得以避免。

优选地，在所述至少两个子光束之间的光路差可选择成比光在真空中在脉冲持续时间期间走过的路程大、例如以两倍的因子大于该路程。

尤其是当照明光束的脉冲形状不是具有矩形形状、而是对应于具有上升边沿和下降边沿的脉冲形状时，这样的较大的光路差便是有利的。

因为具有时间上的高斯分布轮廓、洛伦兹分布轮廓或sech²分布轮廓的脉冲的脉冲持续时间通常被作为半峰全宽(FWHM)测量和给出，所以在两个子光路之间的光路差不足时脉冲时间分布轮廓的下降边沿可与第二子光束的第二脉冲时间分布轮廓的上升边沿干涉。

按照本发明的照明装置的一种进一步有利的实现方式将所述至少一个光栅构成为在结晶介质或玻璃中的密度光栅。密度光栅可以理解成作为在结晶介质或玻璃中传播的声波序列的压缩区域的周期性布置结构。

密度光栅也构成衍射光学构件，因为在这样的密度光栅上出现的布拉格反射以及在光栅上的衍射基于惠更斯原理。

声波或声学振动优选通过声学振荡器产生，例如通过超声变换器。该振荡器可借助连接层与结晶介质或玻璃连接并且因此将由其产生的声波耦合输入到结晶介质或玻璃中。

沿纵向在结晶介质或玻璃中延伸的声波在其波峰处产生在结晶介质或玻璃中的密实部，该密实部随波长周期性重复。

密度光栅因此可理解成纯相位光栅，亦即入射到密度光栅上的光波仅仅获得相位改变。

不过，之前描述的衍射光栅同样可以是具有固定的周期结构的相位光栅。

密度光栅优选可以在声光元件(AOE)、例如声光调制器(AOM)或声光偏转器(AOD)中产生，其中，AOE可在不同的运行模式中运行。如果该AOE例如在布拉格配置中运行，则除了第零阶之外仅附加地形成第一衍射阶。在本申请的范围内，AOM可理解成在频率和/或传播方向和/或强度方面根据在其中产生的声波而影响(调制)入射光的AOE。AOD是AOM的一种特殊的专注于影响传播方向的实施方式。

通过选择行进通过结晶介质或玻璃的声波的方向及其频率，可相对于照明光束的原始传播方向改变第一衍射阶的方向。

在按照本发明的照明装置的一种进一步有利的实施方案中，所述至少两个密度光栅构成在结晶介质中或在玻璃中。这具有如下优点，即，构成在AOE中的所述至少两个密度光栅可以在结晶介质中或在玻璃中具有不同的周期和/或传播方向，从而所述至少两个密度光栅之中的每个密度光栅产生照明光束的第一衍射阶，其中，由所述至少两个密度光栅产生的衍射阶可沿不同的方向衍射。

此外可通过如下方式进一步改进按照本发明的照明装置，即，至少一个密度光栅相对于结晶介质或玻璃运动并且照明光束的由密度光栅产生的衍射阶相对彼此是频率偏移的。

这具有如下优点，即，已运动的密度光栅因此同时构成退相干装置。因为在相同频率的光时出现，所以这样的频率偏移不导致在照明平面中的静态局部强度最小值或强度最大值，而是仅导致以声波的频率、亦即在几十至数百MHz范围内的频率出现的颤动。

因此，利用每秒10000或多个图像的极快相机拍摄图像不受该颤动影响，因为其由相机的与颤动相比更慢的拍摄速率平均得出。

因此，利用由谐振扫描镜子(例如16kHz的扫描频率)产生的虚拟光片照明试样是可能的。

照明光束的光的频率偏移以在结晶介质或玻璃中传播的声波的频率实现，其中，声波的频率视照明光束的入射方向而叠加于照明光束的光的频率或从照明光束的频率减去。

如果声波的传播方向与照明光束的传播方向形成小于90°的角度，则照明光束的光的频率在第一衍射阶中减小了声波的频率，而当在声波传播方向和照明光束传播方向之间的角度大于90°时，照明光束的光的频率在第一衍射阶中提高了声波的频率。

照明光束的第一衍射阶、亦即第一子光束因此相对于照明光束的光双倍偏移。

在按照本发明的照明装置的一种进一步有利的实施方案中，结晶介质是各向异性的结晶介质。该结晶介质使子光束的光的极性相对于照明光束的光的极性转动。各向异性的介质尤其是可以设置在AOE中。

这具有如下优点，即，不同极性的子光束由于不同的极性而具有进一步减小的干涉能力。这还有助于减少或防止在照明平面内形成局部照明最小值或照明最大值。

各向异性的结晶介质、亦即各向异性的晶体具有根据光在晶体中的传播方向而不同的折射率。因此，对于照明光束和第一衍射阶的子光束的折射率可以不同，因为它们沿不同的方向传播通过晶体。

各向异性的结晶介质可以这样定向，即，第零阶、亦即照明光束的光的在不改变传播方向的情况下传播通过晶体的部分对于照明光束的光的每个极性获得相同的折射率，而第一衍射阶的子光束沿着如下的传播方向传播通过晶体，折射率在该传播方向上与光的极性相关。

折射率与极性的该相关性、亦即双重折射可导致第一衍射阶的光极性转动。尤其是，第一衍射阶的光的极性可相对于第一衍射阶的极性转动了90°。

第一衍射阶的光的极性的转动尤其是可以在各向异性的晶体、例如AOE中实现，所述晶体在所谓的剪切模式中运行。在该模式中，光栅振动垂直于声波的传播方向出现，亦即声波作为横波运动穿过结晶介质。该模式的缺点是横波在结晶介质中的速度与纵波相比以最大十倍的因子减小。

按照本发明的照明装置的每个上述实施方案可安装在显微镜、尤其是光片或SPIM显微镜或倾斜平面显微镜如OPM或SCAPE显微镜中。在此，不仅所述至少两个子光束在空间上的分开而且这两个子光束的光彼此间相干的减小确保了：在照明平面内均匀地照明要用显微镜检查的试样并且试样的强吸收区域或散射区域具有减小的或者受抑制的阴影形成。

附图说明

下面依据特定实施方式的附图更详细地阐述本发明。在此，相同的技术特征或具有相同技术效果或相同功能的技术特征设有相同的附图标记。在下面示出的实施方案的技术特征可任意相互组合或省去，只要其不取决于利用该技术特征实现的技术效果。

图中：

图1示出具有按照本发明的照明装置的SPIM显微镜的透视图；

图2示出按照本发明的照明装置的第一实施方案；

图3示出按照本发明的照明装置的第二实施方案；

图4示出按照本发明的照明装置的第三实施方案；和

图5示出具有按照本发明的照明装置的具有倾斜虚拟光片的SPIM显微镜的示意图。

具体实施方式

图1示出显微镜1a的、尤其是光片显微镜或SPIM显微镜1的示意图，该显微镜包括按照本发明的照明装置3。

示例性地依据SPIM显微镜1描述本发明，不过本发明可以按照所描述的实施方案也应用在倾斜平面显微镜、如OPM或SCAPE显微镜中。在图中未示出倾斜平面显微镜、OPM或SCAPE显微镜。

此外，SPIM显微镜1包括光源5，该光源沿着照明光路9发射照明光束7。

照明光束7沿着传播方向11传播，该传播方向对于照明光束7来说平行于x轴定向。

照明光束7经由一个照明输入端13馈入照明装置3中。照明装置3还包括一个照明输出端15，经由该照明输出端在SPIM显微镜1的在图1中所示的实施方案输出两个子光束17，其中，子光束17沿着两个不同的子光路19、子光路19a和19b延伸。子光束17为了更好的区分而被划分成一个第一子光束17a和一个第二子光束17b。

这两个子光束17a、17b之中的每个子光束沿着各自的传播方向11a或11b传播。两个传播方向11a、11b以及照明光束7的传播方向11位于一个由x轴和y轴确定的平面内。

由照明装置3经由照明输出端输出的子光束17a、17b经由一个输入端23馈入光片发生器21中。

光片发生器21将经由输入端23馈入的子光束17a和17b这样变换，使得在该光片发生器的输出端25上子光束17a和17b垂直于相应输出侧的传播方向27a和27b具有比在该光片发生器的输入端23上更大的宽度b，其中该宽度b在x-y平面中测量。

为了在光片发生器21的输出侧25a上更好地区分子光束17a和17b，用虚线绘出子光路17b。

两个子光路17a和17b延伸在光片发生器21的输出侧25a上会聚并且分别具有一个基本上位于x-y平面内的焦点区域29。沿着z轴，由相应的焦点区域29定义的子光片31a、31b具有光片厚度d，该光片厚度明显小于子光片31a、31b在x-y平面内的延伸尺寸。

子光片31a、31b定义一个照明平面33，两个光片31a、31b位于这个照明平面内并且该照明平面平行于x-y平面定向。同时，照明平面33是观测光学镜片37的焦点平面35。

观测光学镜片37的光轴39平行于z轴定向并且垂直于照明平面33或焦点平面35。

在图1中还示出三个俯视图A，这三个俯视图示出在照明装置3和光片发生器21之间的区域。

所有三个俯视图A示出光从照明装置3输出和光沿逆着z轴观察的方向输入到光片发生器21中。

俯视图A₁示出子光束17a和17b输出的可能的实施方案，其中，两个子光束17a、17b相互间成一个角度41延伸。

俯视图A₂示出两个子光束17a和17b，这两个子光束平行地并且在侧向沿y轴错开地从照明装置3在照明输出端15上输出。

俯视图A₃示出光从照明装置3传输至光片发生器21的另一种可能性。在俯视图A₃中示出的可能性包括光纤耦合器43，光能经由这些光纤耦合器耦合输入到光波导体45中或从光波导体45耦合输出至光片发生器21。

在俯视图A₃中示出的用于传输光的可能性因此构成一种根据光片发生器21的要求调节沿y轴的侧向偏移或导入光波导体45中的子光束17a、17b之间的角度41的可能性。

在图2中示出按照本发明的照明装置3的第一实施方案。在所示的实施方式中，该照明装置包括仅一个构造成光栅47的衍射光学构件46，该光学构件在图2中构造成透射光栅49。在其他实施方案中可以使用反射光栅。

周期性的光栅结构51仅在图2中示出。

图2还示出光源5，该光源可以构造成脉冲光源6并且该光源在输出端25输出照明光束7并且经由望远镜53扩宽该照明光束。扩宽的照明光束7因此入射到多个周期性设置的光栅结构51上，从而沿传播方向11在光栅47后面产生多个衍射阶55。在图2中示出第零衍射阶O₀，第正一衍射阶O₊₁和第负一衍射阶O_-1。

衍射阶55被馈入光片发生器21中、被望远镜53变换并且在相应的焦点区域29内构成为光片31。光片31由部分光片31a-31c组成。

在图2所示的SPIM显微镜1的部件的实施方式中，简化示出了光片发生器21。此外，设置在光源5下游的望远镜53具有圆柱透镜57，该圆柱透镜使由光源5发出的照明射束7沿着y轴、但不沿着z轴准直。在望远镜53产生的中间图像59因此是透镜焦点61，该透镜焦点沿着z轴延伸。

在部分光片31a-31c重叠的焦点区域29中存在试样63，该试样被部分光片31a-31c在照明平面33内照明。

试样63具有强烈吸收作用的或者说散射的区域65，该区域在下文称为干扰部位65。

干扰部位65的区域在放大部67中放大示出，其中，照明试样63的所述三个光片31a、31b、31c示意性地作为条带示出。如图2所示，相应的光片31延伸经过在放大部67中示出的整个区域，使得没有该示意图就不可能区分各个光片31a、31b和31c。

光片31a通过第负一衍射阶O_-1构成，第二光片31b通过第零阶O₀构成，并且第三光片31c通过第正一阶O₊₁构成。

光片31a-31c入射到干扰部位65上并且构成相应的阴影69，该阴影条带形地沿相应的传播方向11a-11c延伸。

从不同的传播方向11a-11c照明试样63允许使核心阴影71最小或者完全避免核心阴影。核心阴影71基本上沿着传播方向11a-11c在干扰部位65后面构成并且在放大部67中平面填满地标出。

在图2中示出的光源5可以是激光光源5a，其中，该光源优选是宽带的激光光源5b。

图2的激光光源5b产生照明光束7的光，其具有取决于带宽的相干长度L，该相干长度能导致在焦点区域29内构成干涉(未示出)，只要未设有退相干装置73。

退相干装置73在图2中仅示意性示出。利用退相干装置73避免在照明平面33中构成干涉，使得在照明平面33中可以均匀地照明试样63。

在图3中示出按照本发明的照明装置3的第二实施方式，其中，照明装置3在该实施方式中不仅包括光栅47、而且包括耦合输入透镜75和延迟机构77。

光片发生器21包括示意性示出的另外的光学构件79，这些另外的光学构件例如包括之前提到的圆柱透镜57并且产生线形的中间图像59。此外，光片发生器21包括照明透镜81，利用该照明透镜在试样63中产生部分光片31a-31c。

在照明平面33中原理性照明试样63如之前在图2中描述。

照明装置3的在图3中示出的实施方案的延迟机构77构成退相干装置73并且包括三个光波导体45，各一个子光束17a-17c在这三个光波导体中传播。

在图3示出的实施方式中，包括所述负一衍射阶O_-1的第一子光束17a耦合输入到第一光波导体45a中。相应地，第二子光束17a和第三子光束17c分别耦合输入到第二光波导体45b和第三光波导体45c中。相应的光纤耦合器43(见图1)在图3的示意图中未示出。

经由光波导体45a-45c引导的子光束17a-17c馈入光片发生器21中。

图3还示出，光波导体45具有不同的长度l，这在图3中以光波导体45a-45c的拉伸的状态83示出。

照明装置3的在图3中示出的实施方式的光波导体45a-45c具有光波导体45的所用材料的相同的折射率n。不过，光波导体45a-45c在其长度l_a-l_c方面彼此不同，从而为所述三个光波导体45a-45c得到长度差ΔΙ和不同的光学行程长度85a、85b和85c。对于在图3中所示的光波导体45a-45c，通过相应的长度l_a-l_c乘以相应的在所示情况下相同的折射率n得到相应的光学行程长度85a-85c。

图3的延迟机构77引起：不同的衍射阶O_-1、O₀、O₊₁相对彼此延迟并且在不同的时刻馈入光片发生器21中。在此，光波导体45a-45c之间的延迟这样选择，使得在延迟段77中产生的时间延迟与光在真空中的一路程相当，该路程大于或等于由光源5b发出的照明光束7的相干长度L。该路程接近于长度差Δl。因此，防止在照明平面33中光片31a-31c干涉。

延迟机构77的光波导体45a-45c可以按简单的方式用更大或更小长度l的光波导体45更换。如以光波导体45a为例所阐明的，光波导体45可以节省空间地卷绕起来。因此，可以借助延迟机构77实现匹配于激光光源5a的不同的相干长度L。

图4示出按照本发明的照明装置3的第三实施方式。

在该实施方式中，光源5或者激光光源5a也产生照明光束7，该照明光束借助位于望远镜53中的圆柱透镜57产生中间图像59并且加宽照明光束7。

扩宽的照明光束7馈入声光元件(AOE)86中。AOE86例如可以是声光调制器(AOM)87(尤其是声光偏转器(AOD))，如在图3中所示。

AOM87包括结晶介质或玻璃89、声变换器91、操控电子装置93和吸收区域95。

声变换器91借助未示出的频率发生器操控并且在结晶介质或玻璃89中产生光波97，该光波沿着射出方向99在结晶介质或玻璃89中传播。该纵向声波97构成密度光栅101，该密度光栅的特征在于，该密度光栅具有结晶介质或玻璃89的压缩区域102的周期区段。

在照明装置3的在图4中所示的实施方式中，声变换器91产生第一密度光栅101a和第二密度光栅101b。仅仅出于可视性的原因，这些密度光栅相对彼此错开地在结晶介质或玻璃89中标出。

不同的密度光栅101a和101b基本上区别在于产生这些密度光栅的频率F，声变换器91以该频率运行。

第一密度光栅101a以频率F_a运行，该频率小于借以产生第二密度光栅101b的频率F_b。这表现为压缩区域的不同空间频率103。

在图4中入射到AOM87中的照明光束7按照布拉格条件衍射，其中与在图2和图3中所使用的光栅49相反，为每个密度光栅101产生一个单独的衍射阶55。

此外，图4示出对于两个密度光栅101a、101b相同的第零衍射阶O₀。

利用较低的频率F_a产生的密度光栅101a比密度光栅101b具有更小的空间频率103a，该密度光栅101b利用较高的频率F_b由声变换器91产生并且同样具有较高的空间频率103b。

衍射阶55a由密度光栅101a产生并且与第零阶O₀相比在比密度光栅101b的衍射阶55b更小的角度41衍射。

密度光栅101关于结晶介质或玻璃89沿着射出方向99运动，从而衍射光束7的光频率105在第零阶O₀中得以保留、然而在衍射阶55a和55b中移动了相应的频率F_a或F_b，其中，作为光频率105和相应频率F_a与F_b之和分别得到光频率105a和光频率105b。

因为照明光束7的传播方向11至少部分地相反于在结晶介质或玻璃89中延伸的声波97的射出方向99延伸，所以衍射阶55a和55b的光频率105a和105b提高。在其他实施方式中，光波97的射出方向99可以相反于在图4中示出的射出方向99定向，其中，在这样的布置结构中光频率105a和105b以及相应的频率F_a和F_b减小。

由光片发生器21产生的部分光片31a-31c同时照明试样63的照明平面33。然而因为光频率105、105a和105b不同，所以在照明平面33中不产生静态干涉图案。

然而，由于频率差，在照明平面33中不产生具有在频率F_a或F_b的数量级内的颤动频率的干涉式的颤动。

这与摄像机的用于拍摄照明平面33的通常拍摄率相比是很高的，从而摄像机始终平均(mittelt)颤动频率并且因而不探测该颤动频率。

此外可能的是，结晶介质89是各向异性的结晶介质89a，该结晶介质使衍射阶55a或55b的极性相对于第零阶O₀的极性转动。

然而为了利用通过各向异性的结晶介质89a的极性转动，相对于图4所示的布置结构不同的、照明光束7的AOM87的定向或传播方向11是必需的。这在图4中未示出。

在图5中示意性示出光片或SPIM显微镜1。可以是激光光源5a或宽带激光光源5b的光源5发射照明光束7，该照明光束穿过透镜107并且被该透镜聚焦。透镜107可以是球面透镜107a或非球面透镜107b。

照明光束7聚焦到衍射光学构件46上，其中，衍射光学构件46在图5中是AOE86、尤其是AOM87，在其结晶介质或玻璃89中产生密度光栅101。

AOE86产生第零衍射阶O₀、第一密度光栅101a的第正一衍射阶O₊₁和第二密度光栅101b的第正一衍射阶O₊₁。第一和第二密度光栅101a、101b在图5中仅图解示出，为此参见图4。类似于图4的AOE86，其构成退相干装置73。

上述的衍射阶构成子光束17、17a和17b，这些子光束沿着子光路19、19a和19b延伸并且被倾斜镜子109基本上偏转了90度，该倾斜镜子能沿着倾斜方向111倾斜。

借助望远镜53，子光束17、17a和17b聚焦到试样63中的照明平面33中，其中，子光束17、17a和17b沿着倾斜方向111倾斜导致子光束17、17a和17b的焦点区域29沿着扫描方向113在试样63中被扫描、亦即运动。

因为在试样63中的扫描相对于未示出的探测器的积分时间(Integrationszeit)快，所以通过焦点区域的运动为每个子光束17、17a和17b产生所谓的虚拟光片115，该虚拟光片对于子光束17导致所示出的第一虚拟光片115a。

因为子光束17、17a和17b沿着不同的传播方向11、11a、11b聚焦到试样63中，所构成的虚拟光片115从不同方向照明试样63。

Claims (15)

1.用于显微镜(1a)、尤其是光片显微镜或SPIM显微镜(1)或者倾斜平面显微镜、如OPM或SCAPE显微镜的照明装置(3)，其包括用于馈入照明光束(7)的照明输入端(13)和用于输出至少两个由照明光束(7)产生的子光束(17)的照明输出端(15)，其特征在于，所述照明装置(3)包括至少一个衍射光学构件(46)，用于将照明光束(7)分成沿着子光路(19)传播的所述至少两个子光束(17)并且用于相对改变所述至少两个子光束(17)相对彼此的传播方向(11)，使得由照明装置(3)输出的所述至少两个子光束(17)在照明输出端(15)上非共线地相对彼此延伸。

2.根据权利要求1所述的照明装置(3)，其特征在于，所述衍射光学构件(46)具有至少一个光栅(47)。

3.根据权利要求1或2所述的照明装置(3)，其特征在于，设有一个单个的脉冲式光源(6)，在该脉冲式光源的输出端(25)上输出脉冲式照明光束(7)并且将该照明光束馈入照明输入端(13)中。

4.根据权利要求1至3之一所述的照明装置(3)，其特征在于，所述至少两个子光束(17)之中的每个子光束(17)通过照明光束(7)的光的由衍射光学构件(46)产生的不同衍射阶(55)形成。

5.根据权利要求1至4之一所述的照明装置(3)，其特征在于，设有用于减小子光束(17)的光彼此间的相干性的退相干装置(73)。

6.根据权利要求5所述的照明装置(3)，其特征在于，所述退相干装置(73)构造成延迟机构(77)并且所述至少两个子光路(17)为了传播相应的子光束(17)而具有不同长度的光学行程长度(85)。

7.根据权利要求6所述的照明装置(3)，其特征在于，所述延迟机构(77)包括至少一个光波导体(45)。

8.根据权利要求6或7所述的照明装置(3)，其特征在于，所述至少两个子光路(17)的光学行程长度(85)具有长度差(Δl)，该长度差大于或等于子光束(17)的光的相干长度(L)。

9.根据权利要求6至8之一所述的照明装置(3)，其特征在于，所述至少两个子光路(17)的光学行程长度(85)具有长度差(Δl)，该长度差大于或等于光在真空中在脉冲式产生的照明光束(7)的脉冲持续时间期间走过的路程。

10.根据权利要求2至5之一所述的照明装置(3)，其特征在于，所述至少一个光栅(47)构成为在结晶介质或玻璃(89)中的密度光栅(101)。

11.根据权利要求10所述的照明装置(3)，其特征在于，所述至少两个密度光栅(101a、101b)构成在结晶介质或玻璃(89)中。

12.根据权利要求10或11所述的照明装置(3)，其特征在于，所述至少一个密度光栅(101)相对于结晶介质或玻璃(89)运动并且照明光束(7)的由密度光栅(101)产生的衍射阶(55)相对彼此是频率偏移的。

13.根据权利要求10至12之一所述的照明装置(3)，其特征在于，所述结晶介质(89)是各向异性的结晶介质(89a)，该各向异性的结晶介质使子光束(17)的光的极性相对于照明光束(7)的光的极性转动。

14.显微镜(1a)、尤其是光片显微镜或SPIM显微镜(1)或倾斜平面显微镜、如OPM或SCAPE显微镜，其包括根据权利要求1至13之一所述的照明装置(3)。

15.用于在显微镜(1a)、尤其是光片显微镜或SPIM显微镜(1)或倾斜平面显微镜、如OPM或SCAPE显微镜中均匀照明试样(63)的方法，包括：产生照明光束(7)，沿着照明光路(9)传播照明光束(7)，在衍射光学构件(46)处使照明光束(7)衍射和分成沿着子光路(19)以不同的传播方向(11a、11b)传播的至少两个子光束(17)，减小所述至少两个子光束(17)的光彼此间的相干，并且将子光束(17)从不同的方向射入一个共同的照明平面(33)中。