CN110161252B - 用于评估心血管病症进展风险的新标志物 - Google Patents

用于评估心血管病症进展风险的新标志物 Download PDF

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Abstract

本发明涉及心血管病症进展风险的评估和用于评估心血管病症进展风险的新标志物。其公开了在心血管病症的进展风险的评估中使用生化标志物。本发明还涉及生化标志物或标志物组用于评估心血管病症进展风险的用途以及用于实施本发明方法的试剂盒。

Description

用于评估心血管病症进展风险的新标志物
本申请是申请日为2015年3月20日、中国申请号为201580027006.0、发明名称为“用于评估心血管病症进展风险的新标志物”的发明申请的分案申请。
发明领域
本发明涉及用于评估受试者中心血管病症进展风险的方法。其公开了在评估受试者的心血管病症进展风险中使用选自下组的至少一种标志物：T三叶因子3(T TrefoilFactor 3)、α-2-巨球蛋白(alpha-2-Macroglobulin)、血管内皮生长因子D(VascularEndothelial Growth Factor D)、Tamm-Horsfall尿糖蛋白(Tamm-Horsfall UrineGlycoprotein)、肾-损伤-分子-1(Kidney-Injury-Molecule-1)、肝细胞生长因子受体(Hepatocyte Growth Factor Receptor)、神经纤毛蛋白-1(Neuropilin-1)、胰岛素样生长因子结合蛋白4(Insulin-like Growth Factor Binding Protein 4)、和α-谷胱甘肽-S-转移酶(alpha-Glutathione-S-Transferase)。
背景技术
心血管(CV)疾病是世界范围内的主要死亡原因。对处于患上心血管疾病的风险的患者的心血管疾病早期评估对于治疗策略和患者生活方式的进行或修改是重要的。
一个组群的处于心血管疾病进展风险的患者由罹患糖尿病的患者组成。在这种患者组群中，患上心血管疾病例如心肌梗塞的风险占所有死亡的约50％。对于患有2型糖尿病的患者，心血管疾病的发病率是增加的，使得3个患者中约2个死于心血管疾病。特别是对于2型糖尿病患者，现有的风险预测方法(如生化标志物)是不显著的。
一些心血管疾病进展的风险标志物是已知的：
B型利钠肽(BNP)(也称为脑利钠肽)是具有32个氨基酸的蛋白质。其响应于心肌细胞的过度拉伸而由心脏的心室分泌。BNP作为前肽连同长度为76个氨基酸的无生物活性的N-末端片段(NT-pro BNP；Swiss Prot号P16860)一起分泌。NT-pro BNP的生物半衰期高于BNP的生物半衰期，这使得NT-pro BNP成为有吸引力的诊断靶标。已经发现增加NT-pro BNP血浆水平(连同MCP-1和半乳凝素-3一起)与较大的CV事件的发生率相关(Tunon J,Am JCardiol,2013)。此外，NT-pro BNP被鉴定为老年人的总死亡率和CV死亡率的预测因子(Muscari A，Int J Clin Pract，2013)。还发现NT-pro BNP(和hs-cTnT)提高了在患有2型糖尿病的患者中可估计CV事件或死亡的风险的准确性(Hillis等2013,Diabetes Care 37(1):295-303)。进一步发现NT-pro BNP(+hsTNT)预测稳定性冠状动脉疾病中的死亡率(Giannitsis E,Clin Chem Lab Med,2013)。NT-proBNP的纳入显著改善了心力衰竭(HF)风险预测的Framingham、健康ABC和ARIC风险评分，其改善为18％、12％和13％。(Agarwal SK,Circ Heart Fail,2012)。
过氧化物氧还蛋白-4(Peroxiredoxin-4)(Uniprot号Q13162)是由6个成员组成的过氧化物氧还蛋白(Prx)家族的抗氧化过氧化物酶的可分泌和稳定的同种型。由于其抗氧化活性，其是抵抗氧化应激的保护剂。过氧化物氧还蛋白-4参与转录因子NF-κB的激活。已经表明，在没有心血管疾病史的患者中，升高的血清水平与显著更高的事件性心血管事件风险和心血管死亡率及全因死亡率相关(Abbasi A，JAHA，2012)。此外，在患有2型糖尿病和外周动脉粥样硬化疾病(PAD)的患者中观察到了高水平的过氧化物氧还蛋白-4(Eter EI,Cell Stress Chaperones,2013)。
骨保护素(Osteoprotegerin)(OPG；Swiss Prot号O00300)由TNFRSF11B基因编码。OPG是一种细胞因子受体和肿瘤坏死因子(TNF)受体超家族的一个成员。OPG主要结合2种配体，即RANKL(核因子κB配体的受体激活剂)和TRAIL(肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体)。在结合后一种配体时，OPG抑制破骨细胞的活性并促进其凋亡。OPG和RANKL是骨骼和血管组织中的矿物质代谢调节物，也是动脉粥样硬化的标志物。OPG可以视为是一种“血管钙化”标志物。OPG与TRAIL的结合防止肿瘤细胞的凋亡。已显示，OPG改进传统的心血管风险因素的风险预测(Mogelvang R,Heart,2012)。进一步显示，其是1型糖尿病中的心血管并发症的独立预测因子(Gordin D,Diab Care,2013)。此外，高水平的OPG(+8个其他标志物)显示出与较低的踝-臂指数(ABI)相关(Ye Z,Am J Hypertension,2013)。在年龄较长的患者中观察到了OPG水平的升高(Fontes JD,Atherosclerosis,2013)。发现颈动脉狭窄的患者中OPG(和Lp-PLA2)是升高的(Musialek P,J Clin Neurol,2013)。发现OPG基因多态性与2型糖尿病中增加的心血管疾病风险相关(Guo C,Genet.Mol Biol,2013)。最终，发现OPG(和OPN)水平与动脉僵硬度是正相关的，并伴随CAD的程度(Tousoulis,int J Cardiol,2013)。
载脂蛋白B(Apolipoprotein B)(ApoB；Swiss Prot号P04114)是乳糜微粒和低密度脂蛋白(LDL)的主要载脂蛋白。LDL颗粒上的ApoB充当全身多种细胞中的LDL受体的配体。通过一个尚未透彻理解的机制，高水平的ApoB可导致斑块并引起血管疾病(动脉粥样硬化)，导致心脏疾病。有大量证据证明ApoB的水平是比总胆固醇或LDL更好的心脏疾病风险指标。据显示，ApoB是比非HDL-C更精确的心血管风险标志物(Sniderman AD,Atherosclerosis,2012)。据显示，Apo B(和载脂蛋白B/载脂蛋白(a)-I比率)与颈动脉内-中膜厚度相关(Huang F,PLOSONE,2013)。此外，据显示，升高的ApoB血清水平强烈预测早期心血管事件(Gigante B,Heart,212)。据显示，ApoB与增加的MetS发生的风险相关(Koskinen J,Eur J Prev Cardiol.2012)。最后，ApoB/ApoA1比率比用于评估急性心肌梗死风险的任何胆固醇比率都要优越(McQueen MJ,Lancet,2008)。
血管生成素-2(Angiopoietin-2)(Ang-2；SwissProt号O15123)是由人中的ANGPT2基因编码的蛋白。ANG-2属于血管生成素家族，其包含4个在血管生成中起作用的血管生长因子。血管生成素细胞因子参与控制微血管的穿透性并允许平滑肌细胞覆盖血管，使得血管舒张和血管收缩成为可能。血管生成素-2促进细胞死亡并破坏血管形成。已确定循环的Ang-2(及其受体sTie-2)具有遗传特性并与心血管疾病风险因素(包括代谢综合征)相关(Lieb W,Circ CV Genet,2010)。发现高水平的ANG-2与较大的全因死亡和心血管死亡风险相关(Lorbeer R,Eur J Heart Fail,2013)。
生长-因子-分化-因子-15(Growth-Factor-Differentiation-Factor-15)(GDF-15；Swiss Prot号Q99988)属于PGFβ超家族且在炎症和凋亡通路中起作用。血清GDF-15与一些肿瘤类型的进展呈正相关，所述肿瘤类型包括一些结肠直肠癌、胰腺癌和前列腺癌。GDF-15还由引发氧化应激的心血管事件(包括动脉粥样硬化)上调。增加的循环GDF-15浓度与增大的未来不良心血管事件风险相关。
嗜铬粒蛋白A(Chromogranin)(CgA；Swiss Prot号P10645)是神经元和神经内分泌细胞中与儿茶酚胺类共同储存和共同释放的主要的可溶蛋白，并且能通过产生一些生物活性肽而作为促/前激素起作用，所述生物活性肽包括血管抑素(vaso他汀类药物)、胰腺抑素(pancrea他汀类药物)、儿茶酚抑素(cate他汀类药物)、旁腺抑素(para他汀类药物)、铬抑素(chromo他汀类药物)、WE-14和GE-25。其同样储存在心肌中的心房颗粒中。CgA及其片段通过影响内分泌、心血管、及免疫系统及通过影像葡萄糖或钙内稳态来发挥广谱的调控活性。CgA血浆浓度与全因死亡率相关；在根据已知的死亡风险因子调整后，该关联丧失(Rosjo H,Eur J Heart Fail,2010)。CgA在整个ACS谱中是长期死亡和心脏衰竭住院的独立预测因子，并对常规心血管风险标志物提供渐增的预后信息(Jansson AM,Eur Heart J,2009)。CgA能鉴定具有增加的短期或长期死亡风险的受试者(Goetze JP,EndocrineConnections,2014)。急诊室中的受试者中增加的CgA(和CT-proET-1)水平与急性非稳定心脏衰竭增加了除NT-proBNP测量外的独立预后信息(Dieplinger B.,Clin Chim Acta,2009)。
半乳凝素-3(Galectin-3)(Swiss Prot号P17931)是可溶的β半乳糖苷酶结合凝集素，其由活化的巨噬细胞、肥大细胞和嗜酸性粒细胞分泌，但也由GI和呼吸道的上皮细胞分泌。其参与细胞粘附，趋化作用，细胞生长/分化，细胞周期和细胞凋亡。心肌纤维化的标志物。半乳凝素-3与心发作的心脏衰竭(HF)的关联在高风险组群中较强(Browers FP,CircHeart Fail,2014)。高浓度的Gal-3与增加事件性HF和死亡的风险相关(Ho JE,JACC,2012)。半乳凝素-3与年龄和CV风险因素相关，并预测普通人群的全因死亡(de Boer RA,JIntern Med,2011)。升高的血浆半乳凝素-3水平与增加的快速GFR下降风险及社区中的易发(incident)CKD风险相关(O’Seaghdha,J Soc.Nephrol,2013)。高水平的半乳凝素-3与社区住所年长成人中的全因死亡率及CVD死亡率独立相关，其中基线处的CVD是未知的(Daniels LB,Am Heart J,2014)。
金属蛋白酶组织抑制剂-1(TIMP-1；Swiss Prot号P01033)是结合基质金属蛋白酶(MMP)的特异性抑制剂。后者(n＝23)水解细胞外基质。有4种TIMP(1-4)，其表达在发育和组织重建过程中受到调节。TIMP(和MMP)在许多生物过程(如胚胎发生，正常组织重建，伤口愈合，和血管生成)中发挥核心作用。AMI后较高的血浆TIMP-1(和TIMP-2、TIMP-4)水平与MACE相关，并对单独获取自GRACE临床风险评分的那些提供额外的预后信息(Kelly D,Am JCardiol,2010)。较低水平的循环TIMP1(和前MMP1)和流行的CVD的风险之间的强关联，其独立于常见的心血管和炎症风险因素(Panayiotou AG,Int Angiol,2013)。TIMP-1(和MMP-9)与AMI之后的LV功能障碍和重建的超声心动图参数相关，并可鉴定处于随后的LV重建和不良预后(Kelly D,Eur Heart J,2008)风险的患者。TIMP-1(和MMP-1)的循环浓度与长期的高血压疾病相关，所述疾病伴随较多的靶器官损伤(Morillas P,J Hypertens,2013)。
载脂蛋白(a)(APOA_HUMAN；Swiss Prot号P08519)是脂蛋白(a)(Lp(a))的一部分。脂蛋白(a)是这样的脂蛋白，其具有由载脂蛋白(a)和载脂蛋白B-100组成的蛋白组分。冠心病中的载脂蛋白(a)水平是增加的(Koch等1997Journal of the American Society ofNephrology:1890-1897；Ezhov等,2014,Atherosclerosis 235:477-482)。
发明内容
为了具有临床实用性，作为单一标志物的新的诊断标志物应当与本领域已知的其他标志物相当或更好。本发明的目标在于研究：是否能鉴定出生化标志物，其能用于评估心血管疾病进展的风险。
令人惊奇地发现，生化标志物三叶因子3、α-2-巨球蛋白、血管内皮生长因子D(VEGF-D；Swiss Prot号O43915)、Tamm-Horsfall尿糖蛋白/Uromoduline(Swiss Prot号P07911)、肾-损伤-分子-1(KIM-1；Swiss Prot号Q96D42)、α-谷胱甘肽-S-转移酶(SwissProt号P08263)、肝细胞生长因子受体(Swiss Prot号P08581)、神经纤毛蛋白-1(SwissProt号O14786)和胰岛素样生长因子结合蛋白4(IGFBP4；Swiss Prot号P22692)单独、互相组合或与已知的生化标志物组合是用于评估约7年内心血管疾病进展风险的显著预测因子。
具体而言，发明人使用了来自ORIGIN试验的随机化的患者库并鉴定了总计8种生化标志物，即三叶因子3、α-2-巨球蛋白、α-谷胱甘肽-S-转移酶、Nt-pro BNP、过氧化物氧还蛋白-4、骨保护素、载脂蛋白B和血管生成素-2，其单独或互相组合与ORIGIN研究的临床第一共同主要终点(即心血管死亡、非致死性心肌梗塞或非致死性中风)相关。当额外的因子(如ACE/ARB或ASA)被纳入基础临床模型中时，证实了这些生物标志物。
在作为选择的实施方案中，为了探索基础临床模型对上述鉴定的临床第一共同主要终点的生物标志物的鉴定的效果，纳入了额外因子如HbA1c，他汀类(他汀类药物)或ACE/ARB，ASA和他汀类至基础临床模型中，发明人证实了三叶因子3、α-2-巨球蛋白和α-谷胱甘肽-S-转移酶单独地或与Nt-pro BNP、过氧化物氧还蛋白-4、载脂蛋白B,血管生成素-2、和生长-因子-分化-因子-15组合地与临床第一共同主要终点显著相关。
在作为选择的实施方案中，为了为了探索基础临床模型对上述鉴定的临床第一共同主要终点的生物标志物的鉴定的效果，纳入了额外因子如肌酐至基础临床模型中，发明人证实了三叶因子3和α-谷胱甘肽-S-转移酶单独地或与Nt-pro BNP、骨保护素、血管生成素-2、生长-因子-分化-因子-15、嗜铬粒蛋白A和半乳凝素-3组合地与临床第一共同主要终点显著相关。
在作为选择的实施方案中，为了为了探索基础临床模型对上述鉴定的临床第一共同主要终点的生物标志物的鉴定的效果，纳入了额外因子如肌酐和HbA1c至基础临床模型中，发明人证实了三叶因子3和α-谷胱甘肽-S-转移酶单独地或与Nt-pro BNP、骨保护素、血管生成素-2、生长-因子-分化-因子-15和嗜铬粒蛋白A组合地与临床第一共同主要终点显著相关。
在进一步的作为选择的实施方案中，为了得到最终验证，用全部8401名参与者重复了前向选择(forward selection)过程用于第一共同主要结局。发明人证实了三叶因子3、α-2-巨球蛋白和α-谷胱甘肽-S-转移酶及额外鉴定的肝细胞生长因子受体单独地或与Nt-pro-BNP、血管生成素-2、载脂蛋白B、骨保护素、生长-因子-分化-因子-15、和嗜铬粒蛋白A组合地与临床第一共同主要终点显著相关。
在进一步的作为选择的实施方案中，其中向所有参与者的基础临床模型添加了年龄及年龄和肌酐二者，发明人证实了三叶因子3、α-2-巨球蛋白和α-谷胱甘肽-S-转移酶单独地或与Nt-pro-BNP、血管生成素-2、载脂蛋白B、生长-因子-分化-因子-15、过氧化物氧还蛋白-4、嗜铬粒蛋白A和半乳凝素-3组合地与临床第一共同主要终点显著相关。
在进一步的作为选择的实施方案中，向所有参与者的基础临床模型添加了肌酐，并且发明人再次鉴定了三叶因子3、α-2-巨球蛋白、α-谷胱甘肽-S-转移酶以及神经纤毛蛋白1单独地或与Nt-pro-BNP、血管生成素-2、载脂蛋白B、生长-因子-分化-因子-15、骨保护素、过氧化物氧还蛋白-4、嗜铬粒蛋白A和半乳凝素-3组合地与临床第一共同主要终点显著相关。
发明人还在来自ORIGIN试验的随机化患者库中鉴定了总计7种生化标志物，即血管内皮生长因子D、Tamm-Horsfall尿糖蛋白、肾-损伤-分子-1、α-谷胱甘肽-S-转移酶、生长-因子-分化-因子-15(GDF-15；Swiss Prot号Q99988)、Nt-pro BNP、和血管生成素-2，其单独地或相互组合地与ORIGIN研究的临床第二共同主要终点(即心血管死亡、非致死性心肌梗塞、非致死性中风、血运重建程序或心脏衰竭的住院治疗)显著相关。
在作为选择的实施方案中，为了得到最终验证，用全部8401名参与者重复了前向选择过程用于第二共同主要终点。发明人证实了α-谷胱甘肽-S-转移酶和额外鉴定的肝细胞生长因子受体及胰岛素样生长因子结合蛋白4单独地或与Nt-pro BNP、血管生成素-2、生长-因子-分化-因子-15、载脂蛋白B、骨保护素和嗜铬粒蛋白A组合地与第二共同主要终点显著相关。
在作为选择的实施方案中，其中向所有参与者的基础临床模型添加了肌酐，发明人证实了α-谷胱甘肽-S-转移酶和肝细胞生长因子受体单独地或与Nt-pro BNP、血管生成素-2、生长-因子-分化-因子-15、载脂蛋白B、骨保护素和嗜铬粒蛋白A组合地与第二共同主要终点显著相关。
在进一步作为选择的实施方案中，向所有参与者的基础临床模型添加了年龄，并且发明人证实了Tamm-Horsfall尿糖蛋白单独地或与Nt-pro BNP、生长-因子-分化-因子-15、载脂蛋白B、嗜铬粒蛋白A、金属蛋白酶组织抑制剂1和载脂蛋白(a)组合地与第二共同主要终点显著相关。
在进一步作为选择的实施方案中，向所有参与者的基础临床模型添加了年龄和肌酐二者，并且发明人证实了α-谷胱甘肽-S-转移酶单独地或与Nt-pro BNP、血管生成素-2、生长-因子-分化-因子-15、载脂蛋白B、嗜铬粒蛋白A和金属蛋白酶-1组织抑制剂组合地与第二共同主要终点显著相关。
三叶因子3(TFF3；Swiss Prot号Q07654)是一种在人体中由TFF3基因(第21号染色体)编码的蛋白。三叶家族的成员特征为由具有至少一个拷贝的三叶草基序，一个含有三个保守SS-键的40-AA域。三叶因子是产生粘蛋白的细胞的分泌产物。它们在维持口腔粘膜的表面完整性及增强胃肠粘膜的愈合方面发挥关键作用。TFF包括胃肽(TFF1)，解痉肽(TFF2)和肠三叶因子(TFF3)。尚未有TTF3参与心血管事件的报道。
Α-2-巨球蛋白(Swiss Prot号P01023)是一种大血浆蛋白，其发现于血液中并由肝脏产生。其充当抗蛋白酶，并且能够使大量不同的蛋白酶失活。它是一种急性相蛋白(acute-phase protein)。因而其用作细胞因子、生长因子和激素的载体。在肾病综合征中，血清中的Α-2-巨球蛋白上升10倍或更多。α-2-巨球蛋白损失至尿液中被其的大尺寸所防止。尚未有关于α-2-巨球蛋白参与心血管事件的报道。
人α类谷胱甘肽-S-转移酶(GST)由第6号染色体上的5个基因、hGSTA1-hGSTA5、和7个假基因组成。谷胱甘肽-S-转移酶(GST)包含真核和原核II期代谢同工酶的家族，其以其催化还原形式的谷胱甘肽(GSH)与异型生物质底物的偶联(目的在于解毒)而闻名。药物代谢中活性的哺乳动物GST现在分类于α、μ和π类。尚未有α-谷胱甘肽-S-转移酶(Swiss Prot号P08263)参与心血管事件的报道。
肝细胞生长因子受体(HGFR；Swiss Prot号P08581)是一种间充质细胞来源的异二聚体膜受体。在刺激时其具有促有丝分裂、抗凋亡和血管生成的特性，其对多种细胞类型有效果。其在胚胎发育和伤口愈合中起作用。肝细胞生长因子(HGF)是HGFR的唯一已知的配体。具有高水平的配体HGF的受试者具有更多的CV疾病和更高的死亡率(
Figure BDA0001992808990000081
N,ExpGerontol,2013)。配体HGF的血清水平与CHF严重程度相关，且与CV死亡率有联系(LamblinN,Circulation,2005)。具有缺血性心肌病的搭桥手术(bypass surgery)患者的血清中的配体HGF高，并且所述HGF是心脏干细胞迁移的介导因子(D’Amario,D,Circulation,2014)。高水平的HGFR(及其配体HGF)可能反映了修复器官系统衰竭的尝试。
神经纤毛蛋白-1(NRP-1；Swiss Prot号O14786)是内皮细胞和平滑肌细胞(除其他细胞类型外)表达的两种人神经纤毛蛋白之一。其是针对血管内皮生长因子(VEGF)和信号素(semaphorin)二者的酪氨酸激酶受体的一种新的膜结合共同受体/辅受体(coreceptor)。NRP1在血管生成、轴突导向、细胞存活、迁移和侵袭中起多种作用。其对于脊椎动物中的血管发育是必不可少的。与乳内动脉移植不同的是，自体隐静脉移植具有较低的NRP1表达和丰富的外膜NRP1分布(于其管壁内)；这可能与较高的内膜增生(IH)发育易感性相关。IH是针对缺血性心脏病的冠状动脉旁路移植手术后引起移植失败主要的病理学因素(Alattar M,Eur J Cardiothorac Surg,2014)。尚未有神经纤毛蛋白-1参与心血管事件的报道。
胰岛素样生长因子结合蛋白4(IGFBP-4,Swiss Prot号P22692)是胰岛素样生长因子结合蛋白(IGFBP)家族(IGFBP-1至7)的成员，其相互之间具有50％同源性。IGFBP-4结合胰岛素样生长因子(IGF)I和II二者，其延长IGF的半衰期并改变其与细胞表面受体的结合。IGFBP-4片段可以用作疑患心肌缺血的患者中的MACE预测的间接生物标志物(PostnikovAB,Clin Biochem,2012)。尚未报道有全长IGFBP-4作为心血管疾病的生物标志物的直接检测。
本发明涉及用于评估受试者中心血管病症进展风险的方法，其包括：
(a)在来自所述受试者的样品中确定
(i)至少一种选自下组的第一标志物的量：三叶因子3、α-2-巨球蛋白、血管内皮生长因子D、Tamm-Horsfall尿糖蛋白、肾-损伤-分子-1、肝细胞生长因子受体、神经纤毛蛋白-1、胰岛素样生长因子结合蛋白4、和α-谷胱甘肽-S-转移酶；和
(ii)任选的至少一种进一步标志物的量；及
(b)当所述量与所述至少一种第一标志物的参考量相比是变化的时，关联(correlating)所述受试者处于心血管病症进展风险。
本发明所述的“进一步标志物”是任何这样的标志物，所述标志物在与第一标志物组合时增加对心血管疾病进展的评估中的相关信息。如果所述进一步标志物的相对风险与第一标志物的相对风险相似(如例如通过危险比所定义的那样)，则所述信息视为是相关的。
在本发明的优选实施方案中，本文所述方法中的进一步标志物选自下组：Nt-proBNP、过氧化物氧还蛋白-4、骨保护素、载脂蛋白B、载脂蛋白(a)、生长-因子-分化-因子-15、嗜铬粒蛋白A、半乳凝素-3、金属蛋白酶组织抑制剂1和血管生成素-2。
本发明还涉及一种方法，例如用于评估受试者中的心血管病症进展风险(例如升高的风险)的体外方法，其包括：
(a)在来自所述受试者的样品中确定
(i)至少一种选自下组的第一标志物的量：三叶因子3、α-2-巨球蛋白、和α-谷胱甘肽-S-转移酶；和
(ii)任选的至少一种进一步标志物的量；及
(b)当所述量与所述至少一种第一标志物的参考量相比是变化的时，关联所述受试者处于心血管病症进展风险。
在本发明的优选实施方案中，本文所述方法中的进一步标志物选自下组：Nt-proBNP、过氧化物氧还蛋白-4、骨保护素、载脂蛋白B、和血管生成素-2。
在本发明的另一个优选实施方案中，本文所述方法中的进一步标志物选自下组：Nt-pro BNP、过氧化物氧还蛋白-4、载脂蛋白B、血管生成素-2、和生长-因子-分化-因子-15。
在本发明的另一个优选实施方案中，本文所述方法中的进一步标志物选自下组：Nt-pro BNP、血管生成素-2、载脂蛋白B、生长-因子-分化-因子-15、过氧化物氧还蛋白-4、嗜铬粒蛋白A和半乳凝素-3。
本发明还涉及一种方法，例如用于评估受试者中的心血管病症进展风险(例如升高的风险)的体外方法，其包括：
(a)在来自所述受试者的样品中确定
(i)至少一种选自下组的第一标志物的量：三叶因子3、和α-谷胱甘肽-S-转移酶；和
(ii)任选的至少一种进一步标志物的量；及
(b)当所述量与所述至少一种第一标志物的参考量相比是变化的时，关联所述受试者处于心血管病症进展风险。
在本发明的优选实施方案中，本文所述方法中的进一步标志物选自下组：Nt-proBNP、骨保护素、血管生成素-2、生长-因子-分化-因子-15、嗜铬粒蛋白A和半乳凝素-3。
在本发明的另一个优选实施方案中，本文所述方法中的进一步标志物选自下组：Nt-pro BNP、骨保护素、血管生成素-2、生长-因子-分化-因子-15和嗜铬粒蛋白A。
本发明还涉及一种方法，例如用于评估受试者中的心血管病症进展风险(例如升高的风险)的体外方法，其包括：
(a)在来自所述受试者的样品中确定
(i)至少一种选自下组的第一标志物的量：三叶因子3、α-2-巨球蛋白、α-谷胱甘肽-S-转移酶和肝细胞生长因子受体；和
(ii)任选的至少一种进一步标志物的量；及
(b)当所述量与所述至少第一标志物的参考量相比是变化的时，关联所述受试者处于心血管病症进展风险。
在本发明的优选实施方案中，本文所述方法中的进一步标志物选自下组：Nt-proBNP、血管生成素-2、载脂蛋白B、骨保护素、生长-因子-分化-因子-15和嗜铬粒蛋白A。
本发明还涉及一种方法，例如用于评估受试者中的心血管病症进展风险(例如升高的风险)的体外方法，其包括：
(a)在来自所述受试者的样品中确定
(i)至少一种选自下组的第一标志物的量：三叶因子3、α-2-巨球蛋白、α-谷胱甘肽-S-转移酶和神经纤毛蛋白-1；和
(ii)任选的至少一种进一步标志物的量；及
(b)当所述量与所述至少第一标志物的参考量相比是变化的时，关联所述受试者处于心血管病症进展风险。
在本发明的优选实施方案中，本文所述方法中的进一步标志物选自下组：Nt-proBNP、血管生成素-2、载脂蛋白B、生长-因子-分化-因子-15、骨保护素、过氧化物氧还蛋白-4、嗜铬粒蛋白A和半乳凝素-3。
本发明还涉及一种方法，例如用于评估受试者中的心血管病症进展风险(例如升高的风险)的体外方法，其包括：
(a)在来自所述受试者的样品中确定
(i)至少一种选自下组的第一标志物的量：α-谷胱甘肽-S-转移酶、胰岛素样生长因子结合蛋白-4和肝细胞生长因子受体；和
(ii)任选的至少一种进一步标志物的量；及
(b)当所述量与所述至少第一标志物的参考量相比是变化的时，关联所述受试者处于心血管病症进展风险。
在本发明的优选实施方案中，本文所述方法中的进一步标志物选自下组：Nt-proBNP、血管生成素-2、生长-因子-分化-因子-15、载脂蛋白B、骨保护素和嗜铬粒蛋白A。
本发明还涉及一种方法，例如用于评估受试者中的心血管病症进展风险(例如升高的风险)的体外方法，其包括：
(a)在来自所述受试者的样品中确定
(i)至少一种选自下组的第一标志物的量：α-谷胱甘肽-S-转移酶和肝细胞生长因子受体；和
(ii)任选的至少一种进一步标志物的量；及
(b)当所述量与所述至少第一标志物的参考量相比是变化的时，关联所述受试者处于心血管病症进展风险。
在本发明的优选实施方案中，本文所述方法中的进一步标志物选自下组：Nt-proBNP、血管生成素-2、生长-因子-分化-因子-15、载脂蛋白B、骨保护素和嗜铬粒蛋白A。
本发明还涉及一种方法，例如用于评估受试者中的心血管病症进展风险(例如升高的风险)的体外方法，其包括：
(a)在来自所述受试者的样品中确定
(i)至少一种第一标志物的量，所述第一标志物是α-谷胱甘肽-S-转移酶；和(ii)任选的至少一种进一步标志物的量；及
(b)当所述量与所述至少第一标志物的参考量相比是变化的时，关联所述受试者处于心血管病症进展风险。
在本发明的优选实施方案中，本文所述方法中的进一步标志物选自下组：Nt-proBNP、血管生成素-2、生长-因子-分化-因子-15、载脂蛋白B、嗜铬粒蛋白A和金属蛋白酶组织抑制剂1。
本发明还涉及一种方法，例如用于评估受试者中的心血管病症进展风险(例如升高的风险)的体外方法，其包括：
(a)在来自所述受试者的样品中确定
(i)至少一种第一标志物的量，所述第一标志物是Tamm-Horsfall尿糖蛋白；和
(ii)任选的至少一种进一步标志物的量；及
(b)当所述量与所述至少第一标志物的参考量相比是变化的时，关联所述受试者处于心血管病症进展风险。
在本发明的优选实施方案中，本文所述方法中的进一步标志物选自下组：Nt-proBNP、生长-因子-分化-因子-15、载脂蛋白B、嗜铬粒蛋白A、金属蛋白酶组织抑制剂1和载脂蛋白(a)。
在本发明的另一个优选实施方案中，所述第一标志物选自下组：三叶因子3、α-2-巨球蛋白、血管内皮生长因子D、Tamm-Horsfall尿糖蛋白、肾-损伤-分子-1、神经纤毛蛋白-1、胰岛素样生长因子结合蛋白4、和α-谷胱甘肽-S-转移酶。
在本发明的另一个优选实施方案中，所述第一标志物选自下组：三叶因子3、α-2-巨球蛋白、血管内皮生长因子D、Tamm-Horsfall尿糖蛋白、肾-损伤-分子-1、神经纤毛蛋白-1、肝细胞生长因子受体、和α-谷胱甘肽-S-转移酶。
在本发明的另一个优选实施方案中，所述第一标志物选自下组：三叶因子3、α-2-巨球蛋白、血管内皮生长因子D、Tamm-Horsfall尿糖蛋白、肾-损伤-分子-1、神经纤毛蛋白-1、和α-谷胱甘肽-S-转移酶。
在本发明的另一个优选实施方案中，所述第一标志物是三叶因子3，其其任选地伴随至少一种进一步标志物，例如其中所述至少进一步标志物选自下组：Nt-pro BNP、过氧化物氧还蛋白-4、骨保护素、载脂蛋白B、载脂蛋白(a)、生长-因子-分化-因子-15、嗜铬粒蛋白A、半乳凝素-3、金属蛋白酶组织抑制剂1和血管生成素-2。
在本发明的另一个优选实施方案中，所述第一标志物是α-2-巨球蛋白，其任选地伴随至少一种进一步标志物，例如其中所述至少进一步标志物选自下组：Nt-pro BNP、过氧化物氧还蛋白-4、骨保护素、载脂蛋白B、载脂蛋白(a)、生长-因子-分化-因子-15、嗜铬粒蛋白A、半乳凝素-3、金属蛋白酶组织抑制剂1和血管生成素-2。
在本发明的另一个优选实施方案中，所述第一标志物是α-谷胱甘肽-S-转移酶，其任选地伴随至少一种进一步标志物，例如其中所述至少进一步标志物选自下组：Nt-proBNP、过氧化物氧还蛋白-4、骨保护素、载脂蛋白B、载脂蛋白(a)、生长-因子-分化-因子-15、嗜铬粒蛋白A、半乳凝素-3、金属蛋白酶组织抑制剂1和血管生成素-2。
在本发明的特别优选的实施方案中，本文所述的第一标志物是α-谷胱甘肽-S-转移酶且进一步标志物是Nt-pro-BNP和血管生成素-2。
在本发明的另一个优选实施方案中，所述第一标志物是血管内皮生长因子D，其任选地伴随至少一种进一步标志物，例如其中所述至少进一步标志物选自下组：Nt-pro BNP、过氧化物氧还蛋白-4、骨保护素、载脂蛋白B、载脂蛋白(a)、生长-因子-分化-因子-15、嗜铬粒蛋白A、半乳凝素-3、金属蛋白酶组织抑制剂1和血管生成素-2。
在本发明的另一个优选实施方案中，所述第一标志物是Tamm-Horsfall尿糖蛋白，其任选地伴随至少一种进一步标志物，例如其中所述至少进一步标志物选自下组：Nt-proBNP、过氧化物氧还蛋白-4、骨保护素、载脂蛋白B、载脂蛋白(a)、生长-因子-分化-因子-15、嗜铬粒蛋白A、半乳凝素-3、金属蛋白酶组织抑制剂1和血管生成素-2。
在本发明的另一个优选实施方案中，所述第一标志物是肾-损伤-分子-1，其任选地伴随至少一种进一步标志物，例如其中所述至少进一步标志物选自下组：Nt-pro BNP、过氧化物氧还蛋白-4、骨保护素、载脂蛋白B、载脂蛋白(a)、生长-因子-分化-因子-15、嗜铬粒蛋白A、半乳凝素-3、金属蛋白酶组织抑制剂1和血管生成素-2。
在本发明的另一个优选实施方案中，所述第一标志物是肝细胞生长因子受体，其任选地伴随至少一种进一步标志物，例如其中所述至少进一步标志物选自下组：Nt-proBNP、过氧化物氧还蛋白-4、骨保护素、载脂蛋白B、载脂蛋白(a)、生长-因子-分化-因子-15、嗜铬粒蛋白A、半乳凝素-3、金属蛋白酶组织抑制剂1和血管生成素-2。
在本发明的另一个优选实施方案中，所述第一标志物是胰岛素样生长因子结合蛋白4，其任选地伴随至少一种进一步标志物，例如其中所述至少进一步标志物选自下组：Nt-pro BNP、过氧化物氧还蛋白-4、骨保护素、载脂蛋白B、载脂蛋白(a)、生长-因子-分化-因子-15、嗜铬粒蛋白A、半乳凝素-3、金属蛋白酶组织抑制剂1和血管生成素-2。
在本发明的另一个优选实施方案中，所述第一标志物是神经纤毛蛋白-1，其任选地伴随至少一种进一步标志物，例如其中所述至少进一步标志物选自下组：Nt-pro BNP、过氧化物氧还蛋白-4、骨保护素、载脂蛋白B、载脂蛋白(a)、生长-因子-分化-因子-15、嗜铬粒蛋白A、半乳凝素-3、金属蛋白酶组织抑制剂1和血管生成素-2。
在本发明进一步优选的实施方案中，所述至少第一标志物是三叶因子3和α-2-巨球蛋白，其任选地伴随至少一种进一步标志物，例如其中所述至少进一步标志物选自下组：Nt-pro BNP、过氧化物氧还蛋白-4、骨保护素、载脂蛋白B、载脂蛋白(a)、生长-因子-分化-因子-15、嗜铬粒蛋白A、半乳凝素-3、金属蛋白酶组织抑制剂1和血管生成素-2。
在本发明进一步优选的实施方案中，所述至少第一标志物是三叶因子3和α-谷胱甘肽-S-转移酶，其任选地伴随至少一种进一步标志物，例如其中所述至少进一步标志物选自下组：Nt-pro BNP、过氧化物氧还蛋白-4、骨保护素、载脂蛋白B、载脂蛋白(a)、生长-因子-分化-因子-15、嗜铬粒蛋白A、半乳凝素-3、金属蛋白酶组织抑制剂1和血管生成素-2。
在本发明进一步优选的实施方案中，所述至少第一标志物是α-2-巨球蛋白和α-谷胱甘肽-S-转移酶，其任选地伴随至少一种进一步标志物，例如其中所述至少进一步标志物选自下组：Nt-pro BNP、过氧化物氧还蛋白-4、骨保护素、载脂蛋白B、载脂蛋白(a)、生长-因子-分化-因子-15、嗜铬粒蛋白A、半乳凝素-3、金属蛋白酶组织抑制剂1和血管生成素-2。
在本发明进一步优选的实施方案中，所述至少第一标志物是三叶因子3、α-2-巨球蛋白、和α-谷胱甘肽-S-转移酶，其任选地伴随至少一种进一步标志物，例如其中所述至少进一步标志物选自下组：Nt-pro BNP、过氧化物氧还蛋白-4、骨保护素、载脂蛋白B、载脂蛋白(a)、生长-因子-分化-因子-15、嗜铬粒蛋白A、半乳凝素-3、金属蛋白酶组织抑制剂1和血管生成素-2。
在本发明进一步优选的实施方案中，所述至少第一标志物是三叶因子3、α-2-巨球蛋白、和α-谷胱甘肽-S-转移酶，其任选地伴随至少一种进一步标志物，例如其中所述至少进一步标志物选自下组：Nt-pro BNP、过氧化物氧还蛋白-4、骨保护素、载脂蛋白B、载脂蛋白(a)、生长-因子-分化-因子-15、嗜铬粒蛋白A、半乳凝素-3、金属蛋白酶组织抑制剂1和血管生成素-2。
在本发明进一步优选的实施方案中，本文所述的第一和进一步标志物是一组标志物，其包括三叶因子3、α-2-巨球蛋白、α-谷胱甘肽-S-转移酶、Nt-pro BNP、过氧化物氧还蛋白-4、骨保护素、载脂蛋白B、和血管生成素-2。
在本发明进一步优选的实施方案中，本文所述的第一和进一步标志物是一组标志物，其包括三叶因子3、α-2-巨球蛋白、α-谷胱甘肽-S-转移酶、Nt-pro BNP、过氧化物氧还蛋白-4、载脂蛋白B、血管生成素-2和生长-因子-分化因子15。
在本发明另一个进一步优选的实施方案中，本文所述的第一和进一步标志物是三叶因子3、α-2-巨球蛋白、α-谷胱甘肽-S-转移酶、Nt-pro BNP、血管生成素-2、载脂蛋白B、生长-因子-分化-因子-15、过氧化物氧还蛋白-4、嗜铬粒蛋白A和半乳凝素-3。
在本发明进一步优选的实施方案中，本文所述的第一和进一步标志物是一组标志物，其包括三叶因子3、α-谷胱甘肽-S-转移酶、Nt-pro BNP、骨保护素、血管生成素-2、生长-因子-分化-因子-15、嗜铬粒蛋白A和半乳凝素-3。
在本发明进一步优选的实施方案中，本文所述的第一和进一步标志物是三叶因子3、α-谷胱甘肽-S-转移酶、Nt-pro BNP、骨保护素、血管生成素-2、生长-因子-分化-因子-15和嗜铬粒蛋白A。
在本发明进一步优选的实施方案中，所述至少第一标志物是三叶因子-3和肝细胞生长因子受体，其任选地伴随至少一种进一步标志物，例如其中所述至少进一步标志物选自下组：Nt-pro BNP、过氧化物氧还蛋白-4、骨保护素、载脂蛋白B、载脂蛋白(a)、生长-因子-分化-因子-15、嗜铬粒蛋白A、半乳凝素-3、金属蛋白酶组织抑制剂1和血管生成素-2。
在本发明进一步优选的实施方案中，所述至少第一标志物是α-2-巨球蛋白和肝细胞生长因子受体，其任选地伴随至少一种进一步标志物，例如其中所述至少进一步标志物选自下组：Nt-pro BNP、过氧化物氧还蛋白-4、骨保护素、载脂蛋白B、载脂蛋白(a)、生长-因子-分化-因子-15、嗜铬粒蛋白A、半乳凝素-3、金属蛋白酶组织抑制剂1和血管生成素-2。
在本发明进一步优选的实施方案中，所述至少第一标志物是α-谷胱甘肽-S-转移酶和肝细胞生长因子受体，其任选地伴随至少一种进一步标志物，例如其中所述至少进一步标志物选自下组：Nt-pro BNP、过氧化物氧还蛋白-4、骨保护素、载脂蛋白B、载脂蛋白(a)、生长-因子-分化-因子-15、嗜铬粒蛋白A、半乳凝素-3、金属蛋白酶组织抑制剂1和血管生成素-2。
在本发明进一步优选的实施方案中，所述至少第一标志物是三叶因子-3、α-2-巨球蛋白和肝细胞生长因子受体，其任选地伴随至少一种进一步标志物，例如其中所述至少进一步标志物选自下组：Nt-pro BNP、过氧化物氧还蛋白-4、骨保护素、载脂蛋白B、载脂蛋白(a)、生长-因子-分化-因子-15、嗜铬粒蛋白A、半乳凝素-3、金属蛋白酶组织抑制剂1和血管生成素-2。
在本发明进一步优选的实施方案中，所述至少第一标志物是三叶因子-3、α-谷胱甘肽-S-转移酶和肝细胞生长因子受体，其任选地伴随至少一种进一步标志物，例如其中所述至少进一步标志物选自下组：Nt-pro BNP、过氧化物氧还蛋白-4、骨保护素、载脂蛋白B、载脂蛋白(a)、生长-因子-分化-因子-15、嗜铬粒蛋白A、半乳凝素-3、金属蛋白酶组织抑制剂1和血管生成素-2。
在本发明进一步优选的实施方案中，所述至少第一标志物是α-2-巨球蛋白、α-谷胱甘肽-S-转移酶和肝细胞生长因子受体，其任选地伴随至少一种进一步标志物，例如其中所述至少进一步标志物选自下组：Nt-pro BNP、过氧化物氧还蛋白-4、骨保护素、载脂蛋白B、载脂蛋白(a)、生长-因子-分化-因子-15、嗜铬粒蛋白A、半乳凝素-3、金属蛋白酶组织抑制剂1和血管生成素-2。
在本发明进一步优选的实施方案中，本文所述的第一和进一步标志物是一组标志物，其包括三叶因子3、α-2-巨球蛋白、α-谷胱甘肽-S-转移酶,肝细胞生长因子受体,Nt-proBNP、血管生成素-2、载脂蛋白B、骨保护素、生长-因子-分化-因子-15和嗜铬粒蛋白A。
在一个优选实施方案中，所述至少第一标志物是神经纤毛蛋白-1和α-谷胱甘肽-S-转移酶，其任选地伴随至少一种进一步标志物，例如其中所述至少进一步标志物选自下组：Nt-pro BNP、过氧化物氧还蛋白-4、骨保护素、载脂蛋白B、载脂蛋白(a)、生长-因子-分化-因子-15、嗜铬粒蛋白A、半乳凝素-3、金属蛋白酶组织抑制剂1和血管生成素-2。
在一个优选实施方案中，所述至少第一标志物是神经纤毛蛋白-1和α-2-巨球蛋白，其任选地伴随至少一种第一进一步标志物，例如其中所述至少第一进一步标志物选自下组：Nt-pro BNP、过氧化物氧还蛋白-4、骨保护素、载脂蛋白B、载脂蛋白(a)、生长-因子-分化-因子-15、嗜铬粒蛋白A、半乳凝素-3、金属蛋白酶组织抑制剂1和血管生成素-2。
在一个优选实施方案中，所述至少第一标志物是神经纤毛蛋白-1和三叶因子-3，其任选地伴随至少一种第一进一步标志物，例如其中所述至少第一进一步标志物选自下组：Nt-pro BNP、过氧化物氧还蛋白-4、骨保护素、载脂蛋白B、载脂蛋白(a)、生长-因子-分化-因子-15、嗜铬粒蛋白A、半乳凝素-3、金属蛋白酶组织抑制剂1和血管生成素-2。
在一个优选实施方案中，所述至少第一标志物是神经纤毛蛋白-1、三叶因子-3和α-2-巨球蛋白，其任选地伴随至少一种第一进一步标志物，例如其中所述至少第一进一步标志物选自下组：Nt-pro BNP、过氧化物氧还蛋白-4、骨保护素、载脂蛋白B、载脂蛋白(a)、生长-因子-分化-因子-15、嗜铬粒蛋白A、半乳凝素-3、金属蛋白酶组织抑制剂1和血管生成素-2。
在一个优选实施方案中，所述至少第一标志物是神经纤毛蛋白-1、三叶因子-3和α-谷胱甘肽-S-转移酶，其任选地伴随至少一种第一进一步标志物，例如其中所述至少第一进一步标志物选自下组：Nt-pro BNP、过氧化物氧还蛋白-4、骨保护素、载脂蛋白B、载脂蛋白(a)、生长-因子-分化-因子-15、嗜铬粒蛋白A、半乳凝素-3、金属蛋白酶组织抑制剂1和血管生成素-2。
在一个优选实施方案中，所述至少第一标志物是神经纤毛蛋白-1、α-2-巨球蛋白和α-谷胱甘肽-S-转移酶，其任选地伴随至少一种第一进一步标志物，例如其中所述至少第一进一步标志物选自下组：Nt-pro BNP、过氧化物氧还蛋白-4、骨保护素、载脂蛋白B、载脂蛋白(a)、生长-因子-分化-因子-15、嗜铬粒蛋白A、半乳凝素-3、金属蛋白酶组织抑制剂1和血管生成素-2。
在一个优选实施方案中，本文所述的第一和进一步标志物是一组标志物，其包含三叶因子3、α-2-巨球蛋白、α-谷胱甘肽-S-转移酶、神经纤毛蛋白-1、Nt-pro BNP、血管生成素-2、载脂蛋白B、生长-因子-分化-因子-15、骨保护素、过氧化物氧还蛋白-4、嗜铬粒蛋白A和半乳凝素-3。
本发明还涉及一种方法，例如用于评估受试者中的心血管病症进展风险(例如升高的风险)的体外方法，其包括：
(a)在来自所述受试者的样品中确定
(i)至少一种选自下组的第一标志物的量：血管内皮生长因子D、Tamm-Horsfall尿糖蛋白、肾-损伤-分子-1和α-谷胱甘肽-S-转移酶；和
(ii)任选的至少一种进一步标志物的量；及
(b)当所述量与所述至少一种第一标志物的参考量相比是变化的时，关联所述受试者处于心血管病症进展风险。
在本发明的优选实施方案中，本文所述的方法中的进一步标志物选自下组：Nt-pro BNP、生长-因子-分化-因子-15和血管生成素-2。
在本发明的另一个优选实施方案中，所述第一标志物是血管内皮生长因子D，其任选地伴随至少一种进一步标志物，例如其中所述至少进一步标志物选自下组：Nt-pro BNP、生长因子分化因子15和血管生成素-2。
在本发明的另一个优选实施方案中，所述第一标志物是Tamm-Horsfall尿糖蛋白，其任选地伴随至少一种进一步标志物，例如其中所述至少进一步标志物选自下组：Nt-proBNP、生长-因子-分化-因子-15和血管生成素-2。
在本发明的另一个优选实施方案中，所述第一标志物是α-谷胱甘肽-S-转移酶，其任选地伴随至少一种进一步标志物，例如其中所述至少进一步标志物选自下组：Nt-proBNP、生长-因子-分化-因子-15和血管生成素-2。
在本发明的特别优选的实施方案中，本文所述的第一标志物是α-谷胱甘肽-S-转移酶，而所述进一步标志物是Nt-pro-BNP和血管生成素-2。
在本发明的另一个优选实施方案中，所述第一标志物是肾-损伤-分子-1，其任选地伴随至少一种进一步标志物，例如其中所述至少进一步标志物选自下组：Nt-pro BNP、生长-因子-分化-因子-15和血管生成素-2。
在本发明的另一个优选实施方案中，所述第一标志物是血管内皮生长因子D和Tamm-Horsfall尿糖蛋白，其任选地伴随至少一种进一步标志物，例如其中所述至少进一步标志物选自下组：Nt-pro BNP、生长-因子-分化-因子-15和血管生成素-2。
在本发明的另一个优选实施方案中，所述第一标志物是血管内皮生长因子D和α-谷胱甘肽-S-转移酶，其任选地伴随至少一种进一步标志物，例如其中所述至少进一步标志物选自下组：Nt-pro BNP、生长-因子-分化-因子-15和血管生成素-2。
在本发明的另一个优选实施方案中，所述第一标志物是血管内皮生长因子D和肾-损伤-分子-1，其任选地伴随至少一种进一步标志物，例如其中所述至少进一步标志物选自下组：Nt-pro BNP、生长-因子-分化-因子-15和血管生成素-2。
在本发明的另一个优选实施方案中，所述第一标志物是Tamm-Horsfall尿糖蛋白和肾-损伤-分子-1，其任选地伴随至少一种进一步标志物，例如其中所述至少进一步标志物选自下组：Nt-pro BNP、生长-因子-分化-因子-15和血管生成素-2。
在本发明的另一个优选实施方案中，所述第一标志物是Tamm-Horsfall尿糖蛋白和α-谷胱甘肽-S-转移酶，其任选地伴随至少一种进一步标志物，例如其中所述至少进一步标志物选自下组：Nt-pro BNP、生长-因子-分化-因子-15。
在本发明的另一个优选实施方案中，所述第一标志物是肾-损伤-分子-1和α-谷胱甘肽-S-转移酶，其任选地伴随至少一种进一步标志物，例如其中所述至少进一步标志物选自下组：Nt-pro BNP、生长-因子-分化-因子-15和血管生成素-2。
在本发明的另一个优选实施方案中，所述第一标志物是血管内皮生长因子D、Tamm-Horsfall尿糖蛋白和肾-损伤-分子-1，其任选地伴随至少一种进一步标志物，例如其中所述至少进一步标志物选自下组：Nt-pro BNP、生长-因子-分化-因子-15和血管生成素-2。
在本发明的另一个优选实施方案中，所述第一标志物是血管内皮生长因子D、Tamm-Horsfall尿糖蛋白和α-谷胱甘肽-S-转移酶，其任选地伴随至少一种进一步标志物，例如其中所述至少进一步标志物选自下组：Nt-pro BNP、生长-因子-分化-因子-15和血管生成素-2。
在本发明的另一个优选实施方案中，所述第一标志物是血管内皮生长因子D、肾-损伤-分子-1和α-谷胱甘肽-S-转移酶，其任选地伴随至少一种进一步标志物，例如其中所述至少进一步标志物选自下组：Nt-pro BNP、生长-因子-分化-因子-15和血管生成素-2。
在本发明的另一个优选实施方案中，所述第一标志物是Tamm-Horsfall尿糖蛋白、肾-损伤-分子-1和α-谷胱甘肽-S-转移酶，其任选地伴随至少一种进一步标志物，例如其中所述至少进一步标志物选自下组：Nt-pro BNP、生长-因子-分化-因子-15和血管生成素-2。
在本发明的另一个优选实施方案中，所述第一标志物是血管内皮生长因子D、Tamm-Horsfall尿糖蛋白、肾-损伤-分子-1和α-谷胱甘肽-S-转移酶，其任选地伴随至少一种进一步标志物，例如其中所述至少进一步标志物选自下组：Nt-pro BNP、生长-因子-分化-因子-15和血管生成素-2。
在本发明进一步优选的实施方案中，本文所述的第一和进一步标志物是血管内皮生长因子D、Tamm-Horsfall尿糖蛋白、肾-损伤-分子-1、α-谷胱甘肽-S-转移酶、Nt-proBNP、生长-因子-分化-因子-15和血管生成素-2。
在本发明进一步优选的实施方案中，本文所述的第一和进一步标志物是α-谷胱甘肽-S-转移酶、胰岛素样生长因子结合蛋白-4、肝细胞生长因子受体、Nt-pro BNP、血管生成素-2、生长-因子-分化-因子-15、载脂蛋白B、骨保护素和嗜铬粒蛋白A。
在本发明进一步优选的实施方案中，本文所述的第一和进一步标志物是α-谷胱甘肽-S-转移酶、肝细胞生长因子受体、Nt-pro BNP、血管生成素-2、生长-因子-分化-因子-15、载脂蛋白B、骨保护素和嗜铬粒蛋白A。
在本发明进一步优选的实施方案中，本文所述的第一和进一步标志物是α-谷胱甘肽-S-转移酶、Nt-pro BNP、血管生成素-2、生长-因子-分化-因子-15、载脂蛋白B、嗜铬粒蛋白A和金属蛋白酶组织抑制剂1。
在本发明进一步优选的实施方案中，本文所述的第一和进一步标志物是Tamm-Horsfall尿糖蛋白、Nt-pro BNP、生长-因子-分化-因子-15、载脂蛋白B、嗜铬粒蛋白A、金属蛋白酶组织抑制剂1和载脂蛋白(a)。
在优选实施方案中，本发明的方法用于在没有在先心血管病症诊断的受试者中评估患上心血管疾病的风险。或者，已知受试者处于高于平均的心血管病症风险，如受试者满足一个或多个如心脏研究中定义的风险因素，所述心脏研究调查风险因素，例如Interheart研究(Yusuf等,2004,Lancet 364:953-962)或Framingham Heart研究。此种受试者可能具有一个或多个选自下组的风险因素：既往的心血管病症诊断、白蛋白尿、男性、至少50岁的年龄、升高的血液胆固醇水平(例如高于100mg/dl(2.5mmol/L)的LDL水平)、肥胖，优选为腹部肥胖、吸烟者、糖尿病，例如1型，优选为LADA或2型、升高的HbA1c水平(即>6.5％)、升高的血液(例如血清)肌酐水平(即在血清中对于女性>1.0mg/dl和对于男性>1.2mg/dl)和/或高血压。在优选实施方案中，此种受试者具有一个或多个选自下组的风险因素：既往的心血管病症、白蛋白尿、男性、至少50岁的年龄、吸烟者、糖尿病或前驱糖尿病(pre-diabetic)、升高的血液胆固醇、升高的血肌酐、升高的HbA1c水平、肥胖和高血压。
在另一个优选的实施方案中，本发明的方法用于评估受试者中的心血管病症进展风险，所述受试者具有既往的心血管病症诊断，具有糖尿病或前驱糖尿病(优选为LADA)，或具有50、55、60、63、或65岁(优选为63岁)的年龄。一个具体优选实施方案涉及本发明的方法，所述方法用于评估受试者中的心血管病症进展风险，所述受试者具有既往的心血管病症且具有糖尿病或前驱糖尿病(优选为LADA)，且具有50、55、60、63、或65岁(优选为63岁)的年龄。
受试者可以是人或非人动物，如猴、兔、大鼠或小鼠。
在整个申请中使用的术语“前驱糖尿病”或“前驱糖尿病”是指例如患有葡萄糖耐量受损(IGT)的患者，其定义为PPG值≥140且<200mg/dL(即≥7.8且<11.1mmol/L)，其FPG<126mg/dL(7.0mmol/L)，如口服葡萄糖耐量试验(OGTT)所确定的那样，或是空腹血糖受损(IFG)的患者，其定义为FPG≥110且<126mg/dL(≥6.1且<7mmol/L)，无糖尿病(PPG必须<200mg/dL[11.1mmol/L])，二者均如本领域已知的(例如75g)口服葡萄糖耐量检验(OGTT)所确定的那样。例如，(OGTT)在空腹状态进行(即没有消耗食物或除水之外的饮料至少8小时)。在OGTT期间绘制了两项血浆葡糖值：空腹值(FPG)和75g口服葡萄糖加载后2小时绘制的值得以确定(餐后血糖[PPG])。其还指早期2型糖尿病患者，其定义为FPG≥126mg/dL(7.0mmol/L)或PPG≥200mg/dL(11.1mmol/L)。
在整个申请中使用的术语“糖尿病”意指患有2型糖尿病的受试者。该术语还还指患有1型糖尿病的受试者，优选为隐匿性自身免疫性糖尿病(LADA)，如通过针对例如GAD的自体抗体的测量所诊断的，例如Naik等,2009,J Clin Endocrinol Metab,94:4635-4644中所述的。
在整个申请中使用的术语“心血管病症”意指心梗塞，中风，心脏衰竭，血运重建(例如冠状动脉，颈动脉或外周动脉的血运重建)，心绞痛，左心室肥大，狭窄(例如冠状动脉，颈动脉或下肢动脉的狭窄)。优选的是，所述心血管病症在随后2-8年、3-6年、或5-7年(例如自通过本文所述方法的诊断的时间点起)进展。
在整个申请中使用的术语“既往的心血管病症”意指具有一个或多个如下病症的诊断的患者：心肌梗塞(MI)；既往的中风；冠状动脉、颈动脉或外周动脉血运重建；心绞痛伴有记录的缺血性变化(在分级运动试验(Graded Exercise Test)[GXT]期间心电图上至少2mm ST段压低；或心脏成像研究是缺血阳性的)；或不稳定型心绞痛伴有记录的缺血性变化(至少1mm的ST段压低或肌钙蛋白升高超过正常范围但低于诊断为急性心肌梗塞的范围)；微量白蛋白尿或临床蛋白尿(在至少一个或定时收集的尿中白蛋白:肌酸酐比≥30μg/mg，其中白蛋白排泄≥20μg/分钟或≥30mg/24小时或总蛋白排泄≥500mg/24小时)；通过心电图或超声心动图测得的左心室肥大；冠状动脉、颈动脉或下肢动脉在血管造影上的显著狭窄(即50％或更多的狭窄)；和/或踝-臂指数(ABI)<0.9。
本文所述的用于评估心血管病症进展风险的方法包括在样品中确定至少一种如本文所述的第一标志物的量(例如存在、水平和/或浓度)和(ii)任选地如本文所述的至少一种进一步标志物的量；且(b)当所述量与所述至少一种第一标志物的参考量相比是变化的时，关联所述受试者处于心血管病症进展风险。
术语“确定”包括与参考量相比在样品中本文所述的第一或进一步标志物的量的定性确定。在优选的实施方案中，确定是定性或半定量确定，即，确定如本文所述的第一或进一步标志物的浓度是高于还是低于截止值(cut off value)。如技术人员会理解的，在是-(存在)或否-(不存在)测定中，通常将测定灵敏度设定为与截止值匹配。例如，可以从对照群体的检验中确定截止值。对照群体可以是针对例如性别，年龄，患上本文所述的心血管病症的风险因素(例如吸烟，高张力，肥胖，升高的血液胆固醇水平，前驱糖尿病，糖尿病和/或增加的酒精消耗)而随机化的受试者群体。优选地，设定截止值以产生90％的特异性，还优选设定截止值以产生95％的特异性，或者同样优选地设定截止值以产生98％的特异性。例如，高于截止值的值的存在可能对于患上心血管病症的风险的存在是指示性的。或者，确定如本文所述的第一或进一步标志物的浓度是否在所述标志物的具体的预定浓度范围内，并关联所述具体的预定范围是否与心血管病症进展风险相关，例如通过应用未调整和调整的Cox回归模型来关联。例如，在整个群体中发现的标记物浓度范围分为多个类别，例如3类(三分法)，4类(四分法)或5类(五分法)，优选为五分法，其中类别1定义最低浓度子范围，类别5定义最高浓度子范围。心血管病症进展的风险，例如分别从类别1增至类别3-5。
或者，术语“确定”包括对本文所述第一标志物的量的定量确定。在该实施方案中，本文所述标志物的浓度与潜在的诊断问题相关，例如疾病的阶段、疾病进展、既往心血管病症之后的随访或对治疗的响应。
对技术人员显而易见的是，本发明不应局限于限于本文所述第一或进一步标志物全长蛋白。本文所述第一或进一步标志物的生理学或人工片段、本文所述第一或进一步标志物的二级修饰、以及本文所述第一或进一步标志物的等位变体都涵盖于本发明中。人工片段优选地涵盖合成产生的肽或通过重组技术产生的肽，其至少包含一个诊断感兴趣的表位，其由来源于本文所述第一或进一步标志物的至少6个连续氨基酸组成。此种片段在免疫测定中可以有利地用于产生抗体或用作标准。更优选的是人工片段包含至少两个感兴趣的表位，其适于设置夹心免疫测定。
本文所述的全长蛋白通过序列根据其数据库条目号来定义，例如本文别处所述的SwissProt或Uniprot。
本文所用的冠词“一个”和“一种”意指一个/一种或意指多于一个/一种(例如至少一个/一种)的冠词语法所指对象。举例而言，“一种标志物”意指一种标志物或多于一种标志物。术语“至少”用于表示任选地可以存在一个或多个进一步对象。举例而言，包含作为标志物的至少第一标志物三叶因子3和作为至少进一步标志物Nt-pro BNP的标志物组可以任选地包含一种或多种其他标志物。
本文所用的术语“标志物”或“生化标志物”意指用作分析患者的检验仪样品的靶标的分子。在此种分子的一个实施方案中，靶标是蛋白或多肽。在另一个实施方案中，这样的分子靶标也可以是非蛋白质分子。在本发明中用作标志物的蛋白或多肽预期包括所述蛋白质的天然形成的变体以及所述蛋白或所述变体的片段，特别是免疫可检测的片段。免疫可检测的片段优选为包含所述标志物多肽的至少6、7、8、10、12、15或20个连续氨基酸。本领域技术人员会认识到由细胞释放的或胞外基质中存在的蛋白可以是(例如在炎症过程中)损坏的并且能被降解或切割成此类片段。一些标志物合成为非活性形式，其随后可以通过蛋白水解激活。技术人员会理解，蛋白或其片段还可以复合体的一部分而存在。此类复合体还可用作本发明意义上的标志物。多种标志物多肽是由相同的基因编码的，但可能在其等电点(＝PI)或分子量(＝MW)上不同，或二者均不同，例如其是因为可变的mRNA或前mRNA处理所致。变体的氨基酸序列与对应的标志物序列(尤其是本文所述的标志物的全长标志物序列)为80％、85％、90％、95％或更多相同的。此外或可供选择地，标志物多肽或其变体可以携带翻译后修饰。优选的翻译后修饰是糖基化、酰化、和/或磷酸化。
在一个实施方案中，标记物胰岛素样生长因子结合蛋白-4的量是从胰岛素样生长因子结合蛋白-4的直接蛋白表达所确定的量。
在进一步实施方案中，确定的标志物胰岛素样生长因子结合蛋白的量是本文所述的全长胰岛素样生长因子结合蛋白-4或与对应的本文所述胰岛素样生长因子结合蛋白-4全长标志物序列80％、85％、90％、95％或更多相同的变体。
优选地，本文所述的第一或进一步标志物通过使用特异性结合剂而从样品特异性地测得。
特异性结合剂对其对应的靶分子具有至少107l/mol的亲和力。所述特异性结合剂对其对应的靶分子优选地具有108l/mol或同样优选地具有109l/mol的亲和力。技术人员会认识到，术语具体用于表示样品中存在的其他生物分子不显著地结合至特异性针对所述标志物的结合剂。优选地，对靶分子之外的生物分子的结合水平导致该结合亲和力至多分别仅有其针对靶分子的亲和力的10％或更低，仅5％或更低，仅2％或更低，仅1％或更低。优选的特异性结合剂针对亲和力及特异性均满足上述两条最小标准。
特异性结合剂优选为与本文所述的第一或进一步标志物是抗体反应性的。术语抗体意指多克隆抗体、单克隆抗体、此类抗体的抗原结合片段、单链抗体，以及意指包含抗体结合域的遗传构建体。
可以使用保留上述特异性结合剂的标准的抗体片段。抗体通过现有技术水平的程序来生成，例如Tijssen(Tijssen,P.,Practice and theory of enzyme immunoassays,11,Elsevier Science Publishers B.V.,Amsterdam,全书，特别是第43-78页)中所述那样。此外，技术人员完全知晓基于免疫吸附剂的方法，其可用于抗体的特异性分离。通过这些方式，多克隆抗体的质量以及因此其在免疫测定中的性能可以得到加强。(Tijssen,P.,如前文，第108-115页)。
对于本发明中公开的成果，可以使用在兔中产生的多克隆抗体。然而，显然也可以使用来自不同物种(例如大鼠或豚鼠)的多克隆抗体以及单克隆抗体。由于单克隆抗体可以以任何所需量产生且具有恒定特性，它们代表了用于临床惯常测定的开发的理想工具。在本发明的方法中，针对本文所述第一或进一步标志物的单克隆抗体的产生和使用分别代表其他优选实施方案。
本领域技术人员会了解，由于本文所述的第一或进一步标志物已经认定为可用于评估心血管病症进展风险的标志物，因此多种免疫诊断程序可用于达到于本发明的成果相兼容的结果。例如，用于产生抗体的替代策略是可以使用的。除其他策略外，此类策略包括使用合成的肽，其代表了本文所述的用于免疫的第一或进一步标志物的表位。或者，可以使用DNA免疫，也称为DNA疫苗接种。
为了确定获取自受试者的样品中的所述第一或进一步标志物，将样品与针对所述第一或进一步标志物的特异性结合剂在合适条件下温育以形成结合剂标志物的复合物。此类条件不需要是指定的，因为技术人员不需要花费创造性劳动即可容易地鉴定出此类合适的温育条件。测量结合剂标志物复合物的量并用于评估心血管疾病进展的风险。技术人员会理解，有大量的测量所述结合剂标志物复合物的量的方法，其全部详细技术在相关教材中(参阅例如Tijssen P.,见前文,或Diamandis,E.P.和Christopoulos,T.K.(编),Immunoassay,Academic Press,Boston(1996))。
例如本文所述的标志物可以以夹心型测定形式来测得。在此种测定中，第一特异性结合剂用于捕获一侧的标志物，而带有用于直接或间接检测的标记的第二特异性结合剂用于另一侧。
在优选的实施方案中，样品中本文所述标志物的测量通过使用夹心免疫测定来进行，其中使用链霉亲和素包被的微量滴定板。在这种夹心测定中，生物素化的针对本文所述标志物的多克隆抗体用作捕获抗体，而地高辛化的(digoxigenylated)针对所述标志物的多克隆抗体用作第二特异性结合配偶体。形成的夹心复合物最终通过抗地高辛的(anti-digoxigenin)辣根过氧化物酶偶联物和合适的过氧化物酶底物来可视化。
如上文所述，可从来自受试者样品的液体样品确定第一或进一步标志物。
在优选的实施方案中，用作为液体样品材料的血清来实施本发明的方法。
本文所用的术语“样品”意指生物样品，其出于评估目的而获得。在本发明的方法中，样品或受试者的样品优选地可以包括任何流体或组织提取物。例如，检验样品包括血液、血清、血浆、脑脊液和唾液。优选的样品为全血、血清、或血浆，其中血清是最优选的。
在一个实施方案中，所述评估是在体外进行的。受试者样品随后被弃去。受试者样品仅用于本发明的体外方法且受试者样品的材料不转移回受试者的身体中。通常，所述样品是液体样品，例如全血、血清、或血浆，优选血清。
生化标志物可以单独确定或是在本发明优选实施方案中其可以用基于阵列技术的芯片或珠进行共同测量。随后或是通过例如使用针对各个标志物或参考量的单独的截留来解读生化标志物的浓度，或是其可以组合用于解读。
本发明中确立的数据表明：标志物三叶因子3、α-2-巨球蛋白、血管内皮生长因子D、Tamm-Horsfall尿糖蛋白、肾-损伤-分子-1、肝细胞生长因子受体、神经纤毛蛋白-1、胰岛素样生长因子结合蛋白4、和α-谷胱甘肽-S-转移酶会形成用于诊断目的标志物组的不可缺少的一部分。
本发明因此涉及使用三叶因子3、α-2-巨球蛋白、血管内皮生长因子D、Tamm-Horsfall尿糖蛋白、肾-损伤-分子-1、肝细胞生长因子受体、神经纤毛蛋白-1、胰岛素样生长因子结合蛋白4、和α-谷胱甘肽-S-转移酶作为用于心血管病症进展的风险标志物组的标志物。
具体而言，本发明具体涉及使用至少一种标志物，例如本文所述的选自三叶因子3、α-2-巨球蛋白、血管内皮生长因子D、Tamm-Horsfall尿糖蛋白、肾-损伤-分子-1、肝细胞生长因子受体、神经纤毛蛋白-1、胰岛素样生长因子结合蛋白4、和α-谷胱甘肽-S-转移酶的第一标志物，以及任选的至少一种本文所述的进一步标志物，用于评估受试者中的心血管病症进展风险，其中确定来自受试者的样品中所述标志物的量相对于所述标志物的参考量是改变的，则指示所述风险。
本发明还涉及使用包含三叶因子3、α-2-巨球蛋白、血管内皮生长因子D、Tamm-Horsfall尿糖蛋白、肾-损伤-分子-1、肝细胞生长因子受体、神经纤毛蛋白-1、胰岛素样生长因子结合蛋白4和/或α-谷胱甘肽-S-转移酶的标志物组，以及任选的至少一种本文所述的进一步标志物，用于评估评估受试者中的心血管病症进展风险，其中确定来自受试者的样品中至少三叶因子3、α-2-巨球蛋白、血管内皮生长因子D、Tamm-Horsfall尿糖蛋白、肾-损伤-分子-1、肝细胞生长因子受体、神经纤毛蛋白-1、胰岛素样生长因子结合蛋白4和/或α-谷胱甘肽-S-转移酶的量与至少三叶因子3、α-2-巨球蛋白、血管内皮生长因子D、Tamm-Horsfall尿糖蛋白、肾-损伤-分子-1、肝细胞生长因子受体、神经纤毛蛋白-1、胰岛素样生长因子结合蛋白4和/或α-谷胱甘肽-S-转移酶的参考量相比是改变的，则指示所述风险。
本文所述的进一步标志物可以选自下组：Nt-pro BNP、过氧化物氧还蛋白-4、骨保护素、载脂蛋白B、载脂蛋白(a)、生长-因子-分化-因子-15、嗜铬粒蛋白A、半乳凝素-3、金属蛋白酶组织抑制剂1和血管生成素-2。
本发明还涉及使用至少一种标志物，例如选自三叶因子3、α-2-巨球蛋白、和α-谷胱甘肽-S-转移酶的本文所述的第一标志物，以及任选的本文所述进一步标志物，用于评估受试者中心血管病症进展的风险，其中所确定来自受试者的样品中所述标志物的量与所述标志物的参考量相比是改变的，则指示所述风险。
本发明还涉及使用包含三叶因子3、α-2-巨球蛋白、和/或α-谷胱甘肽-S-转移酶以及任选的至少一种本文所述进一步标志物以及任选的本文所述进一步标志物的标志物组，用于评估受试者中的心血管病症进展风险，其中确定来自受试者的样品中至少三叶因子3、α-2-巨球蛋白、和/或α-谷胱甘肽-S-转移酶的量与至少三叶因子3、α-2-巨球蛋白、和/或α-谷胱甘肽-S-转移酶的参考量相比是改变的，则指示所述风险。
在一个实施方案中，所述进一步标志物选自下组：Nt-pro BNP、过氧化物氧还蛋白-4、骨保护素、载脂蛋白B和血管生成素-2。
在另一个实施方案中，所述进一步标志物选自下组：Nt-pro BNP、过氧化物氧还蛋白-4、载脂蛋白B、血管生成素-2和生长-因子-分化-因子-15。
在另一个实施方案中，所述进一步标志物选自下组：Nt-pro BNP、血管生成素-2、载脂蛋白B、生长-因子-分化-因子-15、过氧化物氧还蛋白-4、嗜铬粒蛋白A、和半乳凝素-3。
本发明还涉及使用至少一种标志物，例如选自三叶因子-3和α-谷胱甘肽-S-转移酶的本文所述第一标志物，以及任选的本文所述进一步标志物，用于评估受试者中的心血管病症进展风险，其中确定来自受试者的样品中所述标志物的量与所述标志物的参考量相比是改变的，则指示所述风险。
本发明还涉及使用包含三叶因子-3和/或α-谷胱甘肽-S-转移酶以及任选的至少一种本文所述进一步标志物的标志物组，用于评估受试者中的心血管病症进展风险，其中确定来自受试者的样品中至少三叶因子-3和/或α-谷胱甘肽-S-转移酶的量与至少三叶因子-3和/或α-谷胱甘肽-S-转移酶的参考量相比是变化的，则指示所述风险。
在另一个优选的实施方案中，所述进一步标志物选自下组：Nt-pro BNP、骨保护素、血管生成素-2、生长-因子-分化-因子-15、嗜铬粒蛋白A和半乳凝素-3。
在另一个优选的实施方案中，所述进一步标志物选自下组：Nt-pro BNP、骨保护素、血管生成素-2、生长-因子-分化-因子-15和嗜铬粒蛋白A。
本发明还涉及使用至少一种标志物，例如选自三叶因子-3、α-2-巨球蛋白、α-谷胱甘肽-S-转移酶、和肝细胞生长因子受体的第一标志物，以及任选的本文所述进一步标志物，用于评估受试者中的心血管病症进展风险，其中确定来自受试者的样品中所述标志物的量与所述标志物的参考量相比是改变的，则指示所述风险。
本发明还涉及使用包含三叶因子-3、α-2-巨球蛋白、α-谷胱甘肽-S-转移酶和/或肝细胞生长因子受体以及任选的至少一种本文所述进一步标志物的标志物组，用于评估受试者中的心血管病症进展风险，其中确定来自受试者的样品中至少三叶因子-3、α-2-巨球蛋白、α-谷胱甘肽-S-转移酶和/或肝细胞生长因子受体的量与至少三叶因子-3、α-2-巨球蛋白、α-谷胱甘肽-S-转移酶和/或肝细胞生长因子受体的参考量相比是改变的，则指示所述风险。
在另一个实施方案中，所述进一步标志物选自下组：Nt-pro BNP、血管生成素-2、载脂蛋白B、骨保护素、生长-因子-分化-因子15和嗜铬粒蛋白A。
本发明还涉及使用至少一种标志物，例如选自三叶因子-3、α-2-巨球蛋白、α-谷胱甘肽-S-转移酶和神经纤毛蛋白-1的第一标志物，以及任选的本文所述进一步标志物，用于评估受试者中的心血管病症进展风险，其中确定来自受试者的样品中所述标志物的量与所述标志物的参考量相比是改变的，则指示所述风险。
本发明还涉及使用包含三叶因子3、α-2-巨球蛋白、α-谷胱甘肽-S-转移酶和/或神经纤毛蛋白-1以及任选的至少一种本文所述进一步标志物的标志物组，用于评估受试者中的心血管病症进展风险，其中确定来自受试者的样品中至少三叶因子3、α-2-巨球蛋白、α-谷胱甘肽-S-转移酶和/或神经纤毛蛋白-1的量与至少三叶因子3、α-2-巨球蛋白、α-谷胱甘肽-S-转移酶和/或神经纤毛蛋白-1的参考量相比是改变的，则指示所述风险。
在另一个实施方案中，所述进一步标志物选自下组：Nt-pro BNP、血管生成素-2、载脂蛋白B、生长-因子-分化-因子-15、骨保护素、过氧化物氧还蛋白-4、嗜铬粒蛋白A和半乳凝素-3。
本发明中确立的数据还表明：标志物血管内皮生长因子D、Tamm-Horsfall尿糖蛋白、肾-损伤-分子-1和α-谷胱甘肽-S-转移酶形成适用于诊断目的标志物组的不可缺少的一部分。
因此本发明涉及使用血管内皮生长因子D、Tamm-Horsfall尿糖蛋白、肾-损伤-分子-1和α-谷胱甘肽-S-转移酶用作心血管病症进展的风险标志物组的标志物。
具体而言，本发明还涉及使用至少一种标志物，例如选自血管内皮生长因子D、Tamm-Horsfall尿糖蛋白、肾-损伤-分子-1和/或α-谷胱甘肽-S-转移酶的本文所述第一标志物，以及任选的至少一种进一步标志物，用于评估受试者中的心血管病症进展风险，其中确定来自受试者的样品中所述标志物的量与所述标志物的参考量相比是改变的，则指示所述风险。
本发明还涉及使用包含血管内皮生长因子D、Tamm-Horsfall尿糖蛋白、肾-损伤-分子-1和/或α-谷胱甘肽-S-转移酶以及任选的至少一种本文所述的进一步标志物的标志物组，用于评估受试者中的心血管病症进展风险，其中确定来自受试者的样品中至少血管内皮生长因子D、Tamm-Horsfall尿糖蛋白、肾-损伤-分子-1和/或α-谷胱甘肽-S-转移酶的量与至少血管内皮生长因子D、Tamm-Horsfall尿糖蛋白、肾-损伤-分子-1和/或α-谷胱甘肽-S-转移酶的参考量相比是改变的，则指示所述风险。
优选的标志物可以选自下组：Nt-pro BNP、生长-因子-分化-因子-15和血管生成素-2。
本发明还涉及使用选自α-谷胱甘肽-S-转移酶、胰岛素样生长因子结合蛋白-4和肝细胞生长因子受体的至少一种标志物，以及任选的至少一种进一步标志物，用于评估受试者中的心血管病症进展风险，其中确定来自受试者的样品中所述标志物的量与所述标志物的参考量相比是改变的，则指示所述风险。
本发明还涉及使用包含α-谷胱甘肽-S-转移酶、胰岛素样生长因子结合蛋白4和/或肝细胞生长因子受体以及至少一种本文所述的进一步标志物的标志物组，用于评估受试者中的心血管病症进展风险，其中确定来自受试者的样品中至少α-谷胱甘肽-S-转移酶、胰岛素样生长因子结合蛋白4和/或肝细胞生长因子受体的量与至少α-谷胱甘肽-S-转移酶、胰岛素样生长因子结合蛋白4和/或肝细胞生长因子受体的参考量相比是改变的，则指示所述风险。
进一步标志物可以选自下组：Nt-pro BNP、血管生成素-2、生长-因子-分化-因子-15、载脂蛋白B、骨保护素和嗜铬粒蛋白A。
在另一个实施方案中，本发明涉及使用选自α-谷胱甘肽-S-转移酶和肝细胞生长因子受体的至少一种标志物，以及任选的至少一种进一步标志物，用于评估受试者中的心血管病症进展风险，其中确定来自受试者的样品中所述标志物的量与所述标志物的参考量相比是改变的，则指示所述风险。
在另一个实施方案中，本发明涉及使用包含α-谷胱甘肽-S-转移酶和/或肝细胞生长因子受体以及任选的至少一种进一步标志物的标志物组，用于评估受试者中的心血管病症进展风险，其中确定来自受试者的样品中至少α-谷胱甘肽-S-转移酶和/或肝细胞生长因子受体的量与至少α-谷胱甘肽-S-转移酶和/或肝细胞生长因子受体的参考量相比是改变的，则指示所述风险。
在优选的实施方案中，所述进一步标志物选自下组：Nt-pro BNP、血管生成素-2、生长-因子-分化-因子-15、载脂蛋白B、骨保护素和嗜铬粒蛋白A。
在另一个实施方案中，本发明涉及使用至少一种标志物，其为α-谷胱甘肽-S-转移酶，以及任选的至少一种进一步标志物，用于评估受试者中的心血管病症进展风险，其中确定来自受试者的样品中所述标志物的量与所述标志物的参考量相比是改变的，则指示所述风险。
在另一个实施方案中，本发明涉及使用包含α-谷胱甘肽-S-转移酶和任选的至少一种进一步标志物的标志物组，用于评估受试者中的心血管病症进展风险，其中确定来自受试者的样品中至少α-谷胱甘肽-S-转移酶的量与至少α-谷胱甘肽-S-转移酶的参考量相比是改变的，则指示所述风险。
在优选的实施方案中，所述进一步标志物选自下组：Nt-pro BNP、血管生成素-2、生长-因子-分化-因子-15、载脂蛋白B、嗜铬粒蛋白A和金属蛋白酶组织抑制剂1。
在另一个实施方案中，本发明涉及使用至少一种标志物，其为Tamm-Horsfall尿糖蛋白，以及任选的至少一种进一步标志物，用于评估受试者中的心血管病症进展风险，其中确定来自受试者的样品中所述标志物的量与所述标志物的参考量相比是改变的，则指示所述风险。
在另一个实施方案中，本发明涉及使用包含Tamm-Horsfall尿糖蛋白和任选的至少一种进一步标志物的标志物组，用于评估受试者中的心血管病症进展风险，其中确定来自受试者的样品中至少Tamm-Horsfall尿糖蛋白的量与至少Tamm-Horsfall尿糖蛋白的参考量相比是改变的，则指示所述风险。
在优选的实施方案中，所述进一步标志物选自下组：Nt-pro BNP、生长-因子-分化-因子-15、载脂蛋白B、嗜铬粒蛋白A、金属蛋白酶组织抑制剂1和载脂蛋白(a)。
在本文所述的用途中，优选的第一标志物选自下组：三叶因子3、α-2-巨球蛋白、血管内皮生长因子D、Tamm-Horsfall尿糖蛋白、肾-损伤-分子-1、神经纤毛蛋白-1、胰岛素样生长因子结合蛋白4、和α-谷胱甘肽-S-转移酶，其任选地伴随至少一种本文所述的进一步标志物，例如所述进一步标志物选自下组：Nt-pro BNP、过氧化物氧还蛋白-4、骨保护素、载脂蛋白B、生长-因子-分化-因子-15、嗜铬粒蛋白A、半乳凝素-3、金属蛋白酶组织抑制剂1和血管生成素-2。
在本文所述的用途中，优选的第一标志物选自下组：三叶因子3、α-2-巨球蛋白、血管内皮生长因子D、Tamm-Horsfall尿糖蛋白、肾-损伤-分子-1、神经纤毛蛋白-1、肝细胞生长因子受体、和α-谷胱甘肽-S-转移酶，其任选地伴随至少一种本文所述的进一步标志物，例如所述进一步标志物选自下组：Nt-pro BNP、过氧化物氧还蛋白-4、骨保护素、载脂蛋白B、生长-因子-分化-因子-15、嗜铬粒蛋白A、半乳凝素-3、金属蛋白酶组织抑制剂1和血管生成素-2。
在本文所述的用途中，优选的第一标志物选自下组：三叶因子3、α-2-巨球蛋白、血管内皮生长因子D、Tamm-Horsfall尿糖蛋白、肾-损伤-分子-1、神经纤毛蛋白-1、和α-谷胱甘肽-S-转移酶，其任选地伴随至少一种本文所述的进一步标志物，例如所述进一步标志物选自下组：Nt-pro BNP、过氧化物氧还蛋白-4、骨保护素、载脂蛋白B、生长-因子-分化-因子-15、嗜铬粒蛋白A、半乳凝素-3、金属蛋白酶组织抑制剂1和血管生成素-2。
在本文所述的用途中，优选的第一标志物是三叶因子3，其任选地伴随至少一种本文所述的进一步标志物，例如所述进一步标志物选自下组：Nt-pro BNP、过氧化物氧还蛋白-4、骨保护素、载脂蛋白B、载脂蛋白(a)、生长-因子-分化-因子-15、嗜铬粒蛋白A、半乳凝素-3、金属蛋白酶组织抑制剂1和血管生成素-2。
在本文所述的用途中，优选的第一标志物是α-2-巨球蛋白，其任选地伴随至少一种本文所述的进一步标志物，例如所述进一步标志物选自下组：Nt-pro BNP、过氧化物氧还蛋白-4、骨保护素、载脂蛋白B、载脂蛋白(a)、生长-因子-分化-因子-15、嗜铬粒蛋白A、半乳凝素-3、金属蛋白酶组织抑制剂1和血管生成素-2。
在本文所述的用途中，优选的第一标志物是α-谷胱甘肽-S-转移酶，其任选地伴随至少一种本文所述的进一步标志物，例如所述进一步标志物选自下组：Nt-pro BNP、过氧化物氧还蛋白-4、骨保护素、载脂蛋白B、载脂蛋白(a)、生长-因子-分化-因子-15、嗜铬粒蛋白A、半乳凝素-3、金属蛋白酶组织抑制剂1和血管生成素-2。
在本文所述的用途中，优选的第一标志物是血管内皮生长因子D，其任选地伴随至少一种本文所述的进一步标志物，例如所述进一步标志物选自下组：Nt-pro BNP、过氧化物氧还蛋白-4、骨保护素、载脂蛋白B、载脂蛋白(a)、生长-因子-分化-因子-15、嗜铬粒蛋白A、半乳凝素-3、金属蛋白酶组织抑制剂1和血管生成素-2。
在本文所述的用途中，优选的第一标志物是Tamm-Horsfall尿糖蛋白，其任选地伴随至少一种本文所述的进一步标志物，例如所述进一步标志物选自下组：Nt-pro BNP、过氧化物氧还蛋白-4、骨保护素、载脂蛋白B、载脂蛋白(a)、生长-因子-分化-因子-15、嗜铬粒蛋白A、半乳凝素-3、金属蛋白酶组织抑制剂1和血管生成素-2。
在本文所述的用途中，优选的第一标志物是肾-损伤-分子-1，其任选地伴随至少一种本文所述的进一步标志物，例如所述进一步标志物选自下组：Nt-pro BNP、过氧化物氧还蛋白-4、骨保护素、载脂蛋白B、载脂蛋白(a)、生长-因子-分化-因子-15、嗜铬粒蛋白A、半乳凝素-3、金属蛋白酶组织抑制剂1和血管生成素-2。
在本文所述的用途中，优选的第一标志物是肝细胞生长因子受体，其任选地伴随至少一种本文所述的进一步标志物，例如所述进一步标志物选自下组：Nt-pro BNP、过氧化物氧还蛋白-4、骨保护素、载脂蛋白B、载脂蛋白(a)、生长-因子-分化-因子-15、嗜铬粒蛋白A、半乳凝素-3、金属蛋白酶组织抑制剂1和血管生成素-2。
在本文所述的用途中，优选的第一标志物是胰岛素样生长因子结合蛋白4，其任选地伴随至少一种本文所述的进一步标志物，例如所述进一步标志物选自下组：Nt-pro BNP、过氧化物氧还蛋白-4、骨保护素、载脂蛋白B、载脂蛋白(a)、生长-因子-分化-因子-15、嗜铬粒蛋白A、半乳凝素-3、金属蛋白酶组织抑制剂1和血管生成素-2。
在本文所述的用途中，优选的第一标志物是神经纤毛蛋白-1，其任选地伴随至少一种本文所述的进一步标志物，例如所述进一步标志物选自下组：Nt-pro BNP、过氧化物氧还蛋白-4、骨保护素、载脂蛋白B、载脂蛋白(a)、生长-因子-分化-因子-15、嗜铬粒蛋白A、半乳凝素-3、金属蛋白酶组织抑制剂1和血管生成素-2。
特别优选的本发明的用途或本发明的标志物组的用途包括α-谷胱甘肽-S-转移酶、Nt-pro BNP和血管生成素-2作为标志物。
特别优选的本发明的用途或本发明的标志物组的用途包括三叶因子3、α-2-巨球蛋白和任选的至少一种进一步标志物作为标志物。优选的进一步标志物选自下组：Nt-proBNP、过氧化物氧还蛋白-4、骨保护素、载脂蛋白B、载脂蛋白(a)、生长-因子-分化-因子-15、嗜铬粒蛋白A、半乳凝素-3、金属蛋白酶组织抑制剂1和血管生成素-2。
优选的本发明的用途或本发明的标志物组的用途包括α-2-巨球蛋白、α-谷胱甘肽-S-转移酶和任选的至少一种进一步标志物作为标志物。优选的进一步标志物选自下组：Nt-pro BNP、过氧化物氧还蛋白-4、骨保护素、载脂蛋白B、载脂蛋白(a)、生长-因子-分化-因子-15、嗜铬粒蛋白A、半乳凝素-3、金属蛋白酶组织抑制剂1和血管生成素-2。
优选的本发明的用途或本发明的标志物组的用途包括三叶因子3、α-谷胱甘肽-S-转移酶和任选的至少一种进一步标志物作为标志物。优选的进一步标志物选自下组：Nt-pro BNP、过氧化物氧还蛋白-4、骨保护素、载脂蛋白B、载脂蛋白(a)、生长-因子-分化-因子-15、嗜铬粒蛋白A、半乳凝素-3、金属蛋白酶组织抑制剂1和血管生成素-2。
优选的本发明的用途或本发明的标志物组的用途包括三叶因子3、α-2-巨球蛋白、α-谷胱甘肽-S-转移酶、Nt-pro BNP、过氧化物氧还蛋白-4、骨保护素、载脂蛋白B、和血管生成素-2作为标志物。
优选的本发明的用途或本发明的标志物组的用途包括三叶因子3、α-2-巨球蛋白、α-谷胱甘肽-S-转移酶、Nt-pro BNP、过氧化物氧还蛋白-4、载脂蛋白B、血管生成素-2、和生长-因子-分化-因子15作为标志物。
优选的本发明的用途或本发明的标志物组的用途包括三叶因子3、α-2-巨球蛋白、α-谷胱甘肽-S-转移酶、Nt-pro BNP、血管生成素-2、载脂蛋白B、生长-因子-分化-因子-15、过氧化物氧还蛋白4、嗜铬粒蛋白A和半乳凝素-3作为标志物。
另一优选的本发明的用途或本发明的标志物组的用途包括三叶因子3、α-谷胱甘肽-S-转移酶、Nt-pro BNP、骨保护素、血管生成素-2、生长-因子-分化-因子-15、嗜铬粒蛋白A和半乳凝素-3作为标志物。
另一优选的本发明的用途或本发明的标志物组的用途包括三叶因子3、α-谷胱甘肽-S-转移酶、Nt-pro BNP、骨保护素、血管生成素-2、生长-因子-分化-因子-15和嗜铬粒蛋白A作为标志物。
另一优选的本发明的用途或本发明的标志物组的用途包括三叶因子3、α-2-巨球蛋白、α-谷胱甘肽-S-转移酶、肝细胞生长因子受体、Nt-pro BNP、血管生成素-2、载脂蛋白B、骨保护素、生长-因子-分化-因子-15和嗜铬粒蛋白A作为标志物。
另一优选的本发明的用途或本发明的标志物组的用途包括三叶因子3、α-2-巨球蛋白、α-谷胱甘肽-S-转移酶、神经纤毛蛋白-1、Nt-pro BNP、血管生成素-2、载脂蛋白B、生长-因子-分化-因子-15、骨保护素、过氧化物氧还蛋白-4、嗜铬粒蛋白A和半乳凝素-3作为标志物。
本发明优选的标志物组包含血管内皮生长因子D和至少一种进一步标志物。优选的进一步标志物选自下组：Nt-pro BNP、生长-因子-分化-因子-15和血管生成素-2。
本发明优选的标志物组包含α-谷胱甘肽-S-转移酶和至少一种进一步标志物。优选的进一步标志物选自下组：Nt-pro BNP、生长-因子-分化-因子-15和血管生成素-2。
本发明优选的标志物组包含Tamm-Horsfall尿糖蛋白和至少一种进一步标志物。优选的进一步标志物选自下组：Nt-pro BNP、生长-因子-分化-因子-15和血管生成素-2。
本发明优选的标志物组包含肾-损伤-分子-1和至少一种进一步标志物。优选的进一步标志物选自下组：Nt-pro BNP、生长-因子-分化-因子-15和血管生成素-2。
在本发明进一步优选的实施方案中，所述标志物组包含血管内皮生长因子D和Tamm-Horsfall尿糖蛋白以及任选的至少一种进一步标志物。优选的进一步标志物选自下组：生长-因子-分化-因子-15、Nt-pro BNP、和血管生成素-2。
在本发明进一步优选的实施方案中，所述标志物组包含血管内皮生长因子D和α-谷胱甘肽-S-转移酶以及任选的至少一种进一步标志物。优选的进一步标志物选自下组：生长-因子-分化-因子-15、Nt-pro BNP、和血管生成素-2。
在本发明进一步优选的实施方案中，所述标志物组包含血管内皮生长因子D和肾-损伤-分子-1以及任选的至少一种进一步标志物。优选的进一步标志物选自下组：生长-因子-分化-因子-15、Nt-pro BNP、和血管生成素-2。
在本发明进一步优选的实施方案中，所述标志物组包含Tamm-Horsfall尿糖蛋白和肾-损伤-分子-1以及任选的至少一种进一步标志物。优选的进一步标志物选自下组：生长-因子-分化-因子-15、Nt-pro BNP、和血管生成素-2。
在本发明进一步优选的实施方案中，所述标志物组包含Tamm-Horsfall尿糖蛋白和α-谷胱甘肽-S-转移酶以及任选的至少一种进一步标志物。优选的进一步标志物选自下组：生长-因子-分化-因子-15、Nt-pro BNP、和血管生成素-2。
在本发明进一步优选的实施方案中，所述标志物组包含肾-损伤-分子-1和α-谷胱甘肽-S-转移酶以及任选的至少一种进一步标志物。优选的进一步标志物选自下组：生长-因子-分化-因子-15、Nt-pro BNP、和血管生成素-2。
在本发明进一步优选的实施方案中，所述标志物组包含血管内皮生长因子D、Tamm-Horsfall尿糖蛋白和肾-损伤-分子-1以及任选的至少一种进一步标志物。优选的进一步标志物选自下组：生长-因子-分化-因子-15、Nt-pro BNP、和血管生成素-2。
在本发明进一步优选的实施方案中，所述标志物组包含血管内皮生长因子D、Tamm-Horsfall尿糖蛋白和α-谷胱甘肽-S-转移酶以及任选的至少一种进一步标志物。优选的进一步标志物选自下组：生长-因子-分化-因子-15、Nt-pro BNP、和血管生成素-2。
在本发明进一步优选的实施方案中，所述标志物组包含血管内皮生长因子D、肾-损伤-分子-1和α-谷胱甘肽-S-转移酶以及任选的至少一种进一步标志物。优选的进一步标志物选自下组：生长-因子-分化-因子-15、Nt-pro BNP、和血管生成素-2。
在本发明进一步优选的实施方案中，所述标志物组包含Tamm-Horsfall尿糖蛋白、肾-损伤-分子-1和α-谷胱甘肽-S-转移酶以及任选的至少一种进一步标志物。优选的进一步标志物选自下组：生长-因子-分化-因子-15、Nt-pro BNP、和血管生成素-2。
在本发明进一步优选的实施方案中，所述标志物组包含血管内皮生长因子D、Tamm-Horsfall尿糖蛋白、肾-损伤-分子-1和α-谷胱甘肽-S-转移酶以及任选的至少一种进一步标志物。优选的进一步标志物选自下组：生长-因子-分化-因子-15、Nt-pro BNP、和血管生成素-2。
本发明优选的标志物组还包含血管内皮生长因子D、Tamm-Horsfall尿糖蛋白、肾-损伤-分子-1、α-谷胱甘肽-S-转移酶、Nt-pro BNP、生长-因子-分化-因子-15和血管生成素-2。
另一优选的本发明的用途或本发明的标志物组的用途包括α-谷胱甘肽-S-转移酶、胰岛素样生长因子结合蛋白-4、肝细胞生长因子受体、Nt-pro BNP、血管生成素-2、生长-因子-分化-因子-15、载脂蛋白B、骨保护素和嗜铬粒蛋白A作为标志物。
另一优选的本发明的用途或本发明的标志物组的用途包括Tamm-Horsfall尿糖蛋白、嗜铬粒蛋白A、金属蛋白酶组织抑制剂-1、载脂蛋白(a)、Nt-pro BNP、生长-因子-分化-因子-15和载脂蛋白B作为标志物。
另一优选的本发明的用途或本发明的标志物组的用途包括α-谷胱甘肽-S-转移酶和肝细胞生长因子受体、Nt-pro BNP、血管生成素-2、生长-因子-分化-因子-15、载脂蛋白B、骨保护素和嗜铬粒蛋白A作为标志物。
另一优选的本发明的用途或本发明的标志物组的用途包括α-谷胱甘肽-S-转移酶、Nt-pro BNP、血管生成素-2、生长-因子-分化-因子-15、载脂蛋白B、嗜铬粒蛋白A和金属蛋白酶组织抑制剂1作为标志物。
技术人员会认识到，有许多方法用于使用对两种或更多周标志物的量的确定，以便在研究中关联诊断问题。在一项非常简单但通常有效的方法中，如果样品中的标志物与参考量相比是改变的，则推断为阳性结果，即患者中存在心血管病症进展风险。例如，对于标志物三叶因子3、α-2-巨球蛋白、生长-因子-分化-因子-15、血管内皮生长因子D、肾-损伤-分子-1、Nt-pro BNP、过氧化物氧还蛋白-4、骨保护素、载脂蛋白B、胰岛素样生长因子结合蛋白4、金属蛋白酶组织抑制剂1、载脂蛋白(a)和血管生成素-2，高于参考量的水平预示较高的心血管病症进展风险。相反，例如对于标志物谷胱甘肽-S-转移酶、嗜铬粒蛋白A、肝细胞生长因子受体、半乳凝素-3、神经纤毛蛋白-1和Tamm-Horsfall尿糖蛋白，高于参考量的水平预示较低的心血管病症进展风险。
然而，频繁地评估了标志物的组合。优选地，将对标志物组的标志物(例如三叶因子3和Nt-pro BNP)测得的值进行数学上的组合并将组合值与潜在诊断问题相关联。标志物值可以通过任何合适的现有技术水平的数学方法来组合。用于将标志物组合与疾病相关联的公知数学方法采用诸如判别分析(DA)(即线性、二次、正则DA)，核方法(即SVM)，非参数方法(即k-最近-相邻分类分析)，PLS(偏最小二乘)，基于树型的方法(即逻辑回归，CART，随机森林法，Boosting/Bagging方法)，广义线性模型(即逻辑回归)，基于主成分的方法(即SIMCA)、广义加法模型，基于模糊逻辑的方法，基于神经网络和遗传算法的方法。本领域技术人员能够没有障碍地选择评估本发明的标志物组合的适当方法中。这些统计学方法的细节可见于如下参考文献：Ruczinski,I.,等,J.of Computational and GraphicalStatistics,12(2003)475-511；Friedman,J.H.,J.of the American StatisticalAssociation 84(1989)165-175；Hastie,Trevor,Tibshirani,Robert,Friedman,Jerome,The Elements of Statistical Learning,Springer Series in Statistics,2001；Breiman,L.,Friedman,J.H.,Olshen,R.A.,Stone,C.J.(1984)Classification andregression trees,California:Wadsworth；Breiman,L.,Random Forests,MachineLearning,45(2001)5-32；Pepe,M.S.,The Statistical Evaluation of Medical Testsfor Classification and Prediction,Oxford Statistical Science Series,28(2003)；和Duda,R.O.,Hart,P.E.,Stork,D.G.,Pattern Classification,Wiley Interscience,第二版(2001)。
本发明进一步优选的实施方案是使用优化的多元截留(multivariate cut-off)用于潜在的生物标志物组合以及区分状态A和状态B，例如区分风险和非风险。在这种类型的分析中，标志物不再是独立的而是形成标志物组。
诊断方法的准确性最佳的是通过其受试者工作特征(ROC)来描述(尤其参见Zweig,M.H.和Campbell,G.,Clin.Chem.39(1993)561-577)。ROC图表是所有灵敏度/特异性对的图，其是由于随观察到的整个数据范围而连续改变判定阈值所致。
实验室检验的临床表现取决于其诊断准确性，或者将受试者正确分类为临床相关亚组的能力。诊断准确度测量检验正确区分两种不同条件的研究的受试者的能力。此类条件是例如健康和疾病或良性对恶性疾病。
在每种情况下，ROC图通过绘制判定阈值的完整范围的灵敏度对1-特异性的图来描绘两个分布之间的重叠。在y轴上是灵敏度或真阳性分数[定义为(真阳性检验结果的数目)/(真阳性的数目+假阴性检验结果的数目)]。这也被称为在疾病或病况存在下的阳性。它仅从受影响的亚组计算。在x轴上是假阳性分数，或1-特异性[定义为(假阳性结果的数目)/(真阴性的数目+假阳性结果的数目)]。它是特异性的指数，并且完全从未受影响的亚组计算。因为通过使用来自两个不同亚组的检验结果完全分开地计算了真阳性和假阳性分数，所以ROC图与样品中疾病的流行是无关的。ROC图上的每个点表示对应于特定判定阈值的灵敏度/1-特异性对。具有完美区分(在两个结果分布中没有重叠)的检验具有通过左上角的ROC图，其中真阳性分数为1.0或100％(完美灵敏度)，并且假阳性分数是0(完美特异性)。没有区分(两组的结果的相同分布)的检验的理论图是从左下角到右上角的45°对角线。大多数曲线落在这两个极限之间。(如果ROC曲线完全低于45°对角线，这很容易通过将“阳性”的标准从“大于”逆转至“小于”来补救，反之亦然。)定性而言，曲线越接近左上角，检验的整体准确度越高。
量化实验室检验的诊断准确性的一种优选方式是通过单个数字表示其性能。这样的总体参数例如是所谓的“总误差”或者“曲线下面积＝AUC”。最常见的整体测量是ROC曲线下的面积。按照惯例，这个区域总是>0.5(如果不是，可以将决定规则反转使其成为这样)。值范围是1.0(两组检验值的完美分离)至0.5(两组检验值之间没有明显分布差异)。该区域不仅取决于曲线的特定部分，如最接近对角线的点或在90％特异性处的灵敏度，而且取决于整个曲线。这是一个定量的、描述性的表达，其表达了ROC曲线有多接近完美(面积＝1.0)。
公开了用于开发诊断检验例如试剂盒(例如检测、筛选、监测、预测和预后检验)的系统和方法。
本发明还涉及用于实施本发明的方法的试剂盒，其包含特异性确定至少三叶因子3、α-2-巨球蛋白、血管内皮生长因子D、Tamm-Horsfall尿糖蛋白、肾-损伤-分子-1、肝细胞生长因子受体、神经纤毛蛋白-1、胰岛素样生长因子结合蛋白4、和α-谷胱甘肽-S-转移酶以及任选的至少一种进一步标志物所需要的试剂，以及用于进行所述确定的辅助试剂。
本发明还涉及用于实施本发明的方法的试剂盒，其包含特异性确定至少所述进一步标志物Nt-pro BNP、过氧化物氧还蛋白-4、骨保护素、载脂蛋白B、载脂蛋白(a)、生长-因子-分化-因子-15、嗜铬粒蛋白A、半乳凝素-3、金属蛋白酶组织抑制剂1和血管生成素-2所需要的试剂。
本发明还涉及用于实施本发明的方法的试剂盒，其包含特异性确定至少三叶因子3、α-2-巨球蛋白、血管内皮生长因子D、Tamm-Horsfall尿糖蛋白、肾-损伤-分子-1、神经纤毛蛋白-1、胰岛素样生长因子结合蛋白4、和α-谷胱甘肽-S-转移酶所需要的试剂。
本发明还涉及用于实施本发明的方法的试剂盒，其包含特异性确定至少三叶因子3、α-2-巨球蛋白、血管内皮生长因子D、Tamm-Horsfall尿糖蛋白、肾-损伤-分子-1、神经纤毛蛋白-1、肝细胞生长因子受体、和α-谷胱甘肽-S-转移酶所需要的试剂。
本发明还涉及用于实施本发明的方法的试剂盒，其包含特异性确定至少三叶因子3、α-2-巨球蛋白、血管内皮生长因子D、Tamm-Horsfall尿糖蛋白、肾-损伤-分子-1、神经纤毛蛋白-1、和α-谷胱甘肽-S-转移酶所需要的试剂。
本发明还涉及用于实施本发明的方法的试剂盒，其包含特异性确定至少三叶因子3、α-2-巨球蛋白、α-谷胱甘肽-S-转移酶所需要的试剂，以及任选的用于进行所述确定的辅助试剂。
本发明还涉及用于实施本发明的方法的试剂盒，其包含特异性确定至少进一步标志物Nt-pro BNP、过氧化物氧还蛋白4、骨保护素、载脂蛋白B、和/或血管生成素-2所需要的试剂，以及任选的用于进行所述确定的辅助试剂。
本发明还涉及用于实施本发明的方法的试剂盒，其包含特异性确定至少进一步标志物Nt-pro BNP、过氧化物氧还蛋白4、载脂蛋白B、血管生成素-2和/或生长-因子-分化-因子-15所需要的试剂，以及任选的用于进行所述确定的辅助试剂。
本发明还涉及用于实施本发明的方法的试剂盒，其包含特异性确定至少进一步标志物Nt-pro BNP、血管生成素-2、载脂蛋白B、生长-因子-分化-因子-15、过氧化物氧还蛋白-4、嗜铬粒蛋白A和/或半乳凝素-3所需要的试剂，以及任选的用于进行所述确定的辅助试剂。
本发明还涉及用于实施本发明的方法的试剂盒，其包含特异性确定至少三叶因子3、任选的至少一种本文所述的进一步标志物(例如Nt-pro BNP、过氧化物氧还蛋白-4、骨保护素、载脂蛋白B、载脂蛋白(a)、生长-因子-分化-因子-15、嗜铬粒蛋白A、半乳凝素-3、金属蛋白酶组织抑制剂1和血管生成素-2)所需要的试剂。以及任选的用于进行所述确定的辅助试剂。
本发明还涉及用于实施本发明的方法的试剂盒，其包含特异性确定至少α-2-巨球蛋白、任选的至少一种本文所述的进一步标志物(例如Nt-pro BNP、过氧化物氧还蛋白-4、骨保护素、载脂蛋白B、载脂蛋白(a)、生长-因子-分化-因子-15、嗜铬粒蛋白A、半乳凝素-3、金属蛋白酶组织抑制剂1和血管生成素-2)所需要的试剂。以及任选的用于进行所述确定的辅助试剂。
本发明还涉及用于实施本发明的方法的试剂盒，其包含特异性确定至少α-谷胱甘肽-S-转移酶、任选的至少一种本文所述的进一步标志物(例如Nt-pro BNP、过氧化物氧还蛋白-4、骨保护素、载脂蛋白B、载脂蛋白(a)、生长-因子-分化-因子-15、嗜铬粒蛋白A、半乳凝素-3、金属蛋白酶组织抑制剂1和血管生成素-2)所需要的试剂。以及任选的用于进行所述确定的辅助试剂。
本发明还涉及特别优选的用于实施本发明的方法的试剂盒，其包含特异性确定α-谷胱甘肽-S-转移酶、Nt-pro BNP和血管生成素-2所需要的试剂。
本发明还涉及用于实施本发明的方法的试剂盒，其包含特异性确定至少三叶因子3、α-2-巨球蛋白、α-谷胱甘肽-S-转移酶、Nt-pro BNP、过氧化物氧还蛋白4、骨保护素、载脂蛋白B和血管生成素-2所需要的试剂，以及任选的用于进行所述确定的辅助试剂。
本发明还涉及用于实施本发明的方法的试剂盒，其包含特异性确定至少三叶因子3、α-2-巨球蛋白、α-谷胱甘肽-S-转移酶、Nt-pro BNP、过氧化物氧还蛋白4、载脂蛋白B、血管生成素-2和生长-因子-分化-因子-15所需要的试剂。
本发明还涉及用于实施本发明的方法的试剂盒，其包含特异性确定至少三叶因子3、α-2-巨球蛋白、α-谷胱甘肽-S-转移酶、嗜铬粒蛋白A、半乳凝素-3、Nt-pro BNP、血管生成素-2、载脂蛋白B、生长-因子-分化-因子-15、和过氧化物氧还蛋白4所需要的试剂。
本发明还涉及用于实施本发明的方法的试剂盒，其包含特异性确定至少三叶因子3和α-谷胱甘肽-S-转移酶和任选的至少一种进一步标志物所需要的试剂，以及用于进行所述确定的辅助试剂。
优选的进一步标志物选自下组：Nt-pro BNP、骨保护素、血管生成素-2、生长-因子-分化-因子-15、嗜铬粒蛋白A和半乳凝素-3。
更优选的标志物选自下组：Nt-pro BNP、骨保护素、血管生成素-2、生长-因子-分化-因子-15和嗜铬粒蛋白A。
本发明还涉及用于实施本发明的方法的试剂盒，其包含特异性确定至少三叶因子3、谷胱甘肽-S-转移酶、Nt-pro BNP、骨保护素、血管生成素-2、生长-因子-分化-因子-15、嗜铬粒蛋白A和半乳凝素-3所需要的试剂。
本发明还涉及用于实施本发明的方法的试剂盒，其包含特异性确定至少三叶因子3、α-谷胱甘肽-S-转移酶、Nt-pro BNP、骨保护素、血管生成素-2、生长-因子-分化-因子-15、和嗜铬粒蛋白A所需要的试剂。
本发明还涉及用于实施本发明的方法的试剂盒，其包含特异性确定至少三叶因子3、α-2-巨球蛋白、α-谷胱甘肽-S-转移酶和肝细胞生长因子受体、任选的至少一种进一步标志物所需要的试剂，以及用于进行所述确定的辅助试剂。
优选的进一步标志物选自下组：Nt-pro BNP、血管生成素-2、载脂蛋白B、骨保护素、生长-因子-分化-因子-15和嗜铬粒蛋白A。
本发明还涉及用于实施本发明的方法的试剂盒，其包含特异性确定至少肝细胞生长因子受体、任选的至少一种本文所述的进一步标志物(例如Nt-pro BNP、过氧化物氧还蛋白-4、骨保护素、载脂蛋白B、载脂蛋白(a)、生长-因子-分化-因子-15、嗜铬粒蛋白A、半乳凝素-3、金属蛋白酶组织抑制剂1和血管生成素-2)所需要的试剂，以及任选的用于进行所述确定的辅助试剂。
本发明还涉及用于实施本发明的方法的试剂盒，其包含特异性确定至少三叶因子3、α-2-巨球蛋白、α-谷胱甘肽-S-转移酶、嗜铬粒蛋白A、肝细胞生长因子受体、Nt-pro BNP、血管生成素-2、载脂蛋白B、骨保护素、生长-因子-分化-因子-15所需要的试剂。
本发明还涉及用于实施本发明的方法的试剂盒，其包含特异性确定至少三叶因子3、α-2-巨球蛋白、α-谷胱甘肽-S-转移酶和/或神经纤毛蛋白-1、任选的至少一种进一步标志物所需要的试剂，以及用于进行所述确定的辅助试剂。
优选的进一步标志物选自下组：Nt-pro BNP、血管生成素-2、载脂蛋白B、生长-因子-分化-因子-15、骨保护素、过氧化物氧还蛋白-4、嗜铬粒蛋白A和半乳凝素-3。
本发明还涉及用于实施本发明的方法的试剂盒，其包含特异性确定至少神经纤毛蛋白-1、任选的至少一种本文所述的进一步标志物(例如Nt-pro BNP、过氧化物氧还蛋白-4、骨保护素、载脂蛋白B、载脂蛋白(a)、生长-因子-分化-因子-15、嗜铬粒蛋白A、半乳凝素-3、金属蛋白酶组织抑制剂1和血管生成素-2)所需要的试剂，以及任选的用于进行所述确定的辅助试剂。
本发明还涉及用于实施本发明的方法的试剂盒，其包含特异性确定至少三叶因子3、α-2-巨球蛋白、α-谷胱甘肽-S-转移酶、嗜铬粒蛋白A、半乳凝素-3、神经纤毛蛋白-1、Nt-pro BNP、血管生成素-2、载脂蛋白B、生长-因子-分化-因子-15、骨保护素、和过氧化物氧还蛋白4所需要的试剂。
本发明还涉及用于实施本发明的方法的试剂盒，其包含特异性确定至少血管内皮生长因子D、任选的至少一种本文所述的进一步标志物(例如Nt-pro BNP、过氧化物氧还蛋白-4、骨保护素、载脂蛋白B、载脂蛋白(a)、生长-因子-分化-因子-15、嗜铬粒蛋白A、半乳凝素-3、金属蛋白酶组织抑制剂1和血管生成素-2)所需要的试剂，以及任选的用于进行所述确定的辅助试剂。
本发明还涉及用于实施本发明的方法的试剂盒，其包含特异性确定至少Tamm-Horsfall尿糖蛋白、任选的至少一种本文所述的进一步标志物(例如Nt-pro BNP、过氧化物氧还蛋白-4、骨保护素、载脂蛋白B、载脂蛋白(a)、生长-因子-分化-因子-15、嗜铬粒蛋白A、半乳凝素-3、金属蛋白酶组织抑制剂1和血管生成素-2)所需要的试剂，以及任选的用于进行所述确定的辅助试剂。
本发明还涉及用于实施本发明的方法的试剂盒，其包含特异性确定至少肾-损伤-分子-1、任选的至少一种本文所述的进一步标志物(例如Nt-pro BNP、过氧化物氧还蛋白-4、骨保护素、载脂蛋白B、载脂蛋白(a)、生长-因子-分化-因子-15、嗜铬粒蛋白A、半乳凝素-3、金属蛋白酶组织抑制剂1和血管生成素-2)所需要的试剂，以及任选的用于进行所述确定的辅助试剂。
本发明还涉及用于实施本发明的方法的试剂盒，其包含特异性确定至少血管内皮生长因子D、Nt-pro BNP、生长-因子-分化-因子-15和血管生成素-2所需要的试剂，以及任选的用于进行所述确定的辅助试剂。
本发明还涉及用于实施本发明的方法的试剂盒，其包含特异性确定至少Tamm-Horsfall尿糖蛋白、Nt-pro BNP、生长-因子-分化-因子-15和血管生成素-2所需要的试剂，以及任选的用于进行所述确定的辅助试剂。
本发明还涉及用于实施本发明的方法的试剂盒，其包含特异性确定至少肾-损伤-分子-1、Nt-pro BNP、生长-因子-分化-因子-15和血管生成素-2所需要的试剂，以及任选的用于进行所述确定的辅助试剂。
本发明还涉及用于实施本发明的方法的试剂盒，其包含特异性确定至少α-谷胱甘肽-S-转移酶、Nt-pro BNP、生长-因子-分化-因子-15和血管生成素-2所需要的试剂，以及任选的用于进行所述确定的辅助试剂。
本发明还涉及用于实施本发明的方法的试剂盒，其包含特异性确定至少血管内皮生长因子D、Tamm-Horsfall尿糖蛋白、肾-损伤-分子-1、α-谷胱甘肽-S-转移酶、生长-因子-分化-因子-15、Nt-pro BNP、和血管生成素所需要的试剂，以及任选的用于进行所述确定的辅助试剂。
本发明还涉及用于实施本发明的方法的试剂盒，其包含特异性确定至少α-谷胱甘肽-S-转移酶、胰岛素样生长因子结合蛋白4和/或肝细胞生长因子受体、任选的至少一种进一步标志物所需要的试剂，以及用于进行所述确定的辅助试剂。
优选的进一步标志物选自下组：Nt-pro BNP、血管生成素-2、生长-因子-分化-因子-15、载脂蛋白B、骨保护素和嗜铬粒蛋白A。
本发明还涉及用于实施本发明的方法的试剂盒，其包含特异性确定至少胰岛素样生长因子结合蛋白4、任选的至少一种本文所述的进一步标志物(例如Nt-pro BNP、过氧化物氧还蛋白-4、骨保护素、载脂蛋白B、载脂蛋白(a)、生长-因子-分化-因子-15、嗜铬粒蛋白A、半乳凝素-3、金属蛋白酶组织抑制剂1和血管生成素-2)所需要的试剂，以及任选的用于进行所述确定的辅助试剂。
本发明还涉及用于实施本发明的方法的试剂盒，其包含特异性确定至少α-谷胱甘肽-S-转移酶、胰岛素样生长因子结合蛋白4、嗜铬粒蛋白A、肝细胞生长因子受体、Nt-proBNP、血管生成素-2、生长-因子-分化-因子-15、载脂蛋白B、和骨保护素所需要的试剂。
本发明还涉及用于实施本发明的方法的试剂盒，其包含特异性确定至少α-谷胱甘肽-S-转移酶和/或肝细胞生长因子受体、任选的至少一种进一步标志物所需要的试剂，以及用于进行所述确定的辅助试剂，二者均如本文所述。
优选的进一步标志物选自下组：Nt-pro BNP、血管生成素-2、生长-因子-分化-因子-15、载脂蛋白B、骨保护素和嗜铬粒蛋白A。
本发明还涉及用于实施本发明的方法的试剂盒，其包含特异性确定至少α-谷胱甘肽-S-转移酶、嗜铬粒蛋白A、肝细胞生长因子受体、Nt-pro BNP、血管生成素-2、生长-因子-分化-因子-15、载脂蛋白B、和骨保护素所需要的试剂。
本发明还涉及用于实施本发明的方法的试剂盒，其包含特异性确定至少α-谷胱甘肽-S-转移酶、任选的至少一种进一步标志物所需要的试剂，以及用于进行所述确定的辅助试剂。
优选的进一步标志物选自下组：Nt-pro BNP、血管生成素-2、生长-因子-分化-因子-15、载脂蛋白B、嗜铬粒蛋白A和金属蛋白酶-1组织抑制剂。
本发明还涉及用于实施本发明的方法的试剂盒，其包含特异性确定至少α-谷胱甘肽-S-转移酶、嗜铬粒蛋白A、金属蛋白酶组织抑制剂-1、Nt-pro BNP、血管生成素-2、生长-因子-分化-因子-15、和载脂蛋白B所需要的试剂。
本发明还涉及用于实施本发明的方法的试剂盒，其包含特异性确定至少Tamm-Horsfall尿糖蛋白、任选的至少一种进一步标志物所需要的试剂，以及用于进行所述确定的辅助试剂。
优选的进一步标志物选自下组：Nt-pro BNP、生长-因子-分化-因子-15、载脂蛋白B、嗜铬粒蛋白A、金属蛋白酶组织抑制剂1和载脂蛋白(a)。
本发明还涉及用于实施本发明的方法的试剂盒，其包含特异性确定至少Tamm-Horsfall尿糖蛋白、嗜铬粒蛋白A、金属蛋白酶组织抑制剂-1、载脂蛋白(a)、Nt-pro BNP、生长-因子-分化-因子-15和载脂蛋白B所需要的试剂。
本发明的进一步描述如下：
1.一种用于评估受试者中的心血管病症进展风险的方法，其包括：
(a)在来自所述受试者的样品中确定
(i)至少一种选自下组的第一标志物的量：三叶因子3、α-2-巨球蛋白、血管内皮生长因子D、Tamm-Horsfall尿糖蛋白、肾-损伤-分子-1、肝细胞生长因子受体、神经纤毛蛋白-1、胰岛素样生长因子结合蛋白4、和α-谷胱甘肽-S-转移酶；和
(ii)任选的至少一种进一步标志物的量；及
(b)当所述量与所述至少一种第一标志物的参考量相比是变化的时，关联所述受试者处于心血管病症进展风险。
2.项1的方法，其中所述进一步标志物选自下组：Nt-pro BNP、过氧化物氧还蛋白-4、骨保护素、载脂蛋白B、载脂蛋白(a)、生长-因子-分化-因子-15、嗜铬粒蛋白A、半乳凝素-3、金属蛋白酶组织抑制剂1和血管生成素-2。
3.一种用于评估受试者中的心血管病症进展进展风险的方法，其包括：
(a)在来自所述受试者的样品中确定
(i)至少一种选自下组的第一标志物的量：三叶因子3、α-2-巨球蛋白、和α-谷胱甘肽-S-转移酶；和
(ii)任选的至少一种进一步标志物的量；及
(b)当所述量与所述至少一种第一标志物的参考量相比是变化的时，关联所述受试者处于心血管病症进展风险。
4.项1-3的方法，其中所述进一步标志物选自下组：Nt-pro BNP、过氧化物氧还蛋白-4、骨保护素、载脂蛋白B、和血管生成素-2。
5.项1-3的方法，其中所述进一步标志物选自下组：Nt-pro BNP、过氧化物氧还蛋白-4、载脂蛋白B、血管生成素-2、和生长-因子-分化-因子-15。
6.项1-3任一项的方法，其中所述进一步标志物选自下组：Nt-pro BNP、血管生成素-2、载脂蛋白B、生长-因子-分化-因子-15、过氧化物氧还蛋白-4、嗜铬粒蛋白A和半乳凝素-3。
7.一种用于评估受试者中的心血管病症进展进展风险的方法，其包括：
(a)在来自所述受试者的样品中确定
(i)至少一种选自下组的第一标志物的量：三叶因子3和α-谷胱甘肽-S-转移酶；和
(ii)任选的至少一种进一步标志物的量；及
(b)当所述量与所述至少一种第一标志物的参考量相比是变化的时，关联所述受试者处于心血管病症进展风险。
8.项7的方法，其中所述进一步标志物选自下组：Nt-pro BNP、骨保护素、血管生成素-2、生长-因子-分化-因子-15、嗜铬粒蛋白A和半乳凝素-3。
9.项7的方法，其中所述进一步标志物选自下组：Nt-pro BNP、骨保护素、血管生成素-2、生长-因子-分化-因子-15和嗜铬粒蛋白A。
10.一种用于评估受试者中的心血管病症进展进展风险的方法，其包括：
(a)在来自所述受试者的样品中确定
(i)至少一种选自下组的第一标志物的量：三叶因子3、α-2-巨球蛋白、α-谷胱甘肽-S-转移酶和肝细胞生长因子受体；和
(ii)任选的至少一种进一步标志物的量；及
(b)当所述量与所述至少一种第一标志物的参考量相比是变化的时，关联所述受试者处于心血管病症进展风险。
11.项10的方法，其中所述标志物选自下组：Nt-pro BNP、血管生成素-2、载脂蛋白B、骨保护素、生长-因子-分化-因子-15和嗜铬粒蛋白A。
12.一种用于评估受试者中的心血管病症进展进展风险的方法，其包括：
(a)在来自所述受试者的样品中确定
(i)至少一种选自下组的第一标志物的量：三叶因子3、α-2-巨球蛋白、α-谷胱甘肽-S-转移酶和神经纤毛蛋白-1；和
(ii)任选的至少一种进一步标志物的量；及
(b)当所述量与所述至少一种第一标志物的参考量相比是变化的时，关联所述受试者处于心血管病症进展风险。
13.项12的方法，其中所述进一步标志物选自下组：Nt-pro BNP、血管生成素-2、载脂蛋白B、生长-因子-分化-因子-15、骨保护素、过氧化物氧还蛋白-4、嗜铬粒蛋白A和半乳凝素-3。
14.一种用于评估受试者中的心血管病症进展进展风险的方法，其包括：
(a)在来自所述受试者的样品中确定
(i)至少一种选自下组的第一标志物的量：血管内皮生长因子D、Tamm-Horsfall尿糖蛋白、肾-损伤-分子-1和α-谷胱甘肽-S-转移酶；和
(ii)任选的至少一种进一步标志物的量；及
(b)当所述量与所述至少一种第一标志物的参考量相比是变化的时，关联所述受试者处于心血管病症进展风险。
15.项14的方法，其中所述进一步标志物选自下组：Nt-pro BNP、生长-因子-分化-因子-15和血管生成素-2。
16.一种用于评估受试者中的心血管病症进展进展风险的方法，其包括：
(a)在来自所述受试者的样品中确定
(i)至少一种选自下组的第一标志物的量：α-谷胱甘肽-S-转移酶、胰岛素样生长因子结合蛋白-4和肝细胞生长因子受体；和
(ii)任选的至少一种进一步标志物的量；及
(b)当所述量与所述至少一种第一标志物的参考量相比是变化的时，关联所述受试者处于心血管病症进展风险。
17.项16的方法，其中所述进一步标志物选自下组：Nt-pro BNP、血管生成素-2、生长-因子-分化-因子-15、载脂蛋白B、骨保护素和嗜铬粒蛋白A。
18.一种用于评估受试者中的心血管病症进展进展风险的方法，其包括：
(a)在来自所述受试者的样品中确定
(i)至少一种选自下组的第一标志物的量：α-谷胱甘肽-S-转移酶和肝细胞生长因子受体；和
(ii)任选的至少一种进一步标志物的量；及
(b)当所述量与所述至少一种第一标志物的参考量相比是变化的时，关联所述受试者处于心血管病症进展风险。
19.项18的方法，其中所述进一步标志物选自下组：Nt-pro BNP、血管生成素-2、生长-因子-分化-因子-15、载脂蛋白B、骨保护素和嗜铬粒蛋白A。
20.一种用于评估受试者中的心血管病症进展进展风险的方法，其包括：
(a)在来自所述受试者的样品中确定
(i)至少一种第一标志物的量，所述第一标志物是α-谷胱甘肽-S-转移酶；和(ii)任选的至少一种进一步标志物的量；及
(b)当所述量与所述至少一种第一标志物的参考量相比是变化的时，关联所述受试者处于心血管病症进展风险。
21.项20的方法，其中所述进一步标志物选自下组：Nt-pro BNP、血管生成素-2、生长-因子-分化-因子-15、载脂蛋白B、嗜铬粒蛋白A和金属蛋白酶组织抑制剂1。
22.一种用于评估受试者中的心血管病症进展进展风险的方法，其包括：
(a)在来自所述受试者的样品中确定
(i)至少一种第一标志物的量，所述第一标志物是Tamm-Horsfall尿糖蛋白；和
(ii)任选的至少一种进一步标志物的量；及
(b)当所述量与所述至少一种第一标志物的参考量相比是变化的时，关联所述受试者处于心血管病症进展风险。
23.项22的方法，其中所述进一步标志物选自下组：Nt-pro BNP、生长-因子-分化-因子-15、载脂蛋白B、嗜铬粒蛋白A、金属蛋白酶组织抑制剂1和载脂蛋白(a)。
24.项1-23任一项的方法，其中所述第一标志物为：
(a)三叶因子3，任选地伴随至少一种进一步标志物；
(b)α-2-巨球蛋白，任选地伴随至少一种进一步标志物；
(c)α-谷胱甘肽-S-转移酶，任选地伴随至少一种进一步标志物；
(d)血管内皮生长因子D，任选地伴随至少一种进一步标志物；
(e)Tamm-Horsfall尿糖蛋白，任选地伴随至少一种进一步标志物；
(f)肾-损伤-分子-1，任选地伴随至少一种进一步标志物；
(g)肝细胞生长因子受体，任选地伴随至少一种进一步标志物；
(h)胰岛素样生长因子结合蛋白4，任选地伴随至少一种进一步标志物；和/或
(i)神经纤毛蛋白-1，任选地伴随至少一种进一步标志物。
25.项1-21或24任一项的方法，其中所述第一标志物是α-谷胱甘肽-S-转移酶且所述进一步标志物是Nt-pro BNP和血管生成素-2。
26.项1或2的方法，其中所述第一标志物选自下组：三叶因子3、α-2-巨球蛋白、血管内皮生长因子D、Tamm-Horsfall尿糖蛋白、肾-损伤-分子-1、神经纤毛蛋白-1、胰岛素样生长因子结合蛋白4、和α-谷胱甘肽-S-转移酶。
27.项1或2的方法，其中所述第一标志物选自下组：三叶因子3、α-2-巨球蛋白、血管内皮生长因子D、Tamm-Horsfall尿糖蛋白、肾-损伤-分子-1、神经纤毛蛋白-1、肝细胞生长因子受体、和α-谷胱甘肽-S-转移酶。
28.项1或2的方法，其中所述第一标志物选自下组：三叶因子3、α-2-巨球蛋白、血管内皮生长因子D、Tamm-Horsfall尿糖蛋白、肾-损伤-分子-1、神经纤毛蛋白-1、和α-谷胱甘肽-S-转移酶。
29.项1-4任一项的方法，其中所述标志物是三叶因子3、α-2-巨球蛋白、α-谷胱甘肽-S-转移酶、Nt-pro BNP、过氧化物氧还蛋白4、骨保护素、载脂蛋白B和血管生成素-2。
30.项1-3或5任一项的方法，其中所述标志物是三叶因子3、α-2-巨球蛋白、α-谷胱甘肽-S-转移酶、Nt-pro BNP、过氧化物氧还蛋白4、载脂蛋白B、血管生成素-2、和生长-因子-分化-因子-15。
31.项1-3或6任一项的方法，其中所述标志物是三叶因子3、α-2-巨球蛋白、α-谷胱甘肽-S-转移酶、Nt-pro BNP、血管生成素-2、载脂蛋白B、生长-因子-分化-因子-15、过氧化物氧还蛋白-4、嗜铬粒蛋白A和半乳凝素-3。
32.项1-3、7或8任一项的方法，其中所述标志物是三叶因子3、α-谷胱甘肽-S-转移酶、Nt-pro BNP、骨保护素、血管生成素-2、生长-因子-分化-因子-15、嗜铬粒蛋白A和半乳凝素-3。
33.项1-3、7或9任一项的方法，其中所述标志物是三叶因子3、α-谷胱甘肽-S-转移酶、Nt-pro BNP、骨保护素、血管生成素-2、生长-因子-分化-因子-15和嗜铬粒蛋白A。
34.项1-2、10或11任一项的方法，其中所述标志物是三叶因子3、α-2-巨球蛋白、α-谷胱甘肽-S-转移酶、肝细胞生长因子受体、Nt-pro BNP、血管生成素-2、载脂蛋白B、骨保护素、生长-因子-分化-因子-15和嗜铬粒蛋白A。
35.项1-2、12或13任一项的方法，其中所述标志物是三叶因子3、α-2-巨球蛋白、α-谷胱甘肽-S-转移酶、神经纤毛蛋白-1、Nt-pro BNP、血管生成素-2、载脂蛋白B、生长-因子-分化-因子-15、骨保护素、过氧化物氧还蛋白-4、嗜铬粒蛋白A和半乳凝素-3。
36.项1-2、14或15任一项的方法，其中所述标志物是血管内皮生长因子D、Tamm-Horsfall尿糖蛋白、肾-损伤-分子-1、α-谷胱甘肽-S-转移酶、Nt-pro BNP、生长因子分化因子15和血管生成素-2。
37.项1-2、16或17任一项的方法，其中所述标志物是α-谷胱甘肽-S-转移酶、胰岛素样生长因子结合蛋白-4、肝细胞生长因子受体、Nt-pro BNP、血管生成素-2、生长-因子-分化-因子-15、载脂蛋白B、骨保护素和嗜铬粒蛋白A。
38.项1-2、18或19任一项的方法，其中所述标志物是α-谷胱甘肽-S-转移酶、肝细胞生长因子受体、Nt-pro BNP、血管生成素-2、生长-因子-分化-因子-15、载脂蛋白B、骨保护素和嗜铬粒蛋白A。
39.项1-2、20或21任一项的方法，其中所述标志物是α-谷胱甘肽-S-转移酶、Nt-pro BNP、血管生成素-2、生长-因子-分化-因子-15、载脂蛋白B、嗜铬粒蛋白A和金属蛋白酶组织抑制剂1。
40.项1-2、22或23任一项的方法，其中所述标志物是Tamm-Horsfall尿糖蛋白、Nt-pro BNP、生长-因子-分化-因子-15、载脂蛋白B、嗜铬粒蛋白A、金属蛋白酶组织抑制剂1和载脂蛋白(a)。
41.前述项中任一项的方法，其中所述心血管病症是心肌梗塞、中风、和/或心脏衰竭。
42.前述项中任一项的方法，其中：
(i)所述受试者患有前驱糖尿病或糖尿病；
(ii)所述受试者年龄至少50岁；且/或
(iii)所述受试者具有既往的心血管病症。
43.项42的方法，其中所述受试者：
(i)患有前驱糖尿病或糖尿病；
(ii)年龄至少50岁；且
(iii)具有既往的心血管病症。
44.前述项中任一项的方法，其中所述受试者具有一个或多个选自下组的风险因素：既往的心血管病症、白蛋白尿、男性、至少50岁的年龄、吸烟者、糖尿病或前驱糖尿病、升高的血液胆固醇、升高的血肌酐、升高的HbA1c水平、肥胖和高血压。
45.项44的方法，其中所述受试者具有风险因素既往的心血管病症、白蛋白尿、男性、至少55岁的年龄、升高的血液胆固醇水平、吸烟者、糖尿病或前驱糖尿病、和高血压。
46.前述项中任一项的方法，其中所述样品为体液和/或组织提取物。
47.至少一种选自下组的第一标志物和任选的至少一种进一步标志物在评估受试者中的心血管病症进展风险中的用途：三叶因子3、α-2-巨球蛋白、血管内皮生长因子D、Tamm-Horsfall尿糖蛋白、肾-损伤-分子-1、肝细胞生长因子受体、神经纤毛蛋白-1、胰岛素样生长因子结合蛋白4、和α-谷胱甘肽-S-转移酶，其中确定来自受试者的样品中所述标志物的量与所述标志物的参考量相比是改变的，则指示所述风险。
48.一种标志物组在评估受试者中的心血管病症进展风险中的用途，所述标志物组包含第一标志物：三叶因子3、α-2-巨球蛋白、血管内皮生长因子D、Tamm-Horsfall尿糖蛋白、肾-损伤-分子-1、肝细胞生长因子受体、神经纤毛蛋白-1、胰岛素样生长因子结合蛋白4、和/或α-谷胱甘肽-S-转移酶，以及任选的至少一种进一步标志物，其中确定来自受试者的样品中至少三叶因子3、α-2-巨球蛋白、血管内皮生长因子D、Tamm-Horsfall尿糖蛋白、肾-损伤-分子-1、肝细胞生长因子受体、神经纤毛蛋白-1、胰岛素样生长因子结合蛋白4、和/或α-谷胱甘肽-S-转移酶的量与至少三叶因子3、α-2-巨球蛋白、血管内皮生长因子D、Tamm-Horsfall尿糖蛋白、肾-损伤-分子-1、肝细胞生长因子受体、神经纤毛蛋白-1、胰岛素样生长因子结合蛋白4、和/或α-谷胱甘肽-S-转移酶的参考量相比是改变的，则指示所述风险。
49.至少一种选自下组的标志物和任选的至少一种进一步标志物在评估受试者中的心血管病症进展风险中的用途：三叶因子3、α-2-巨球蛋白、和α-谷胱甘肽-S-转移酶，其中确定来自受试者的样品中所述标志物的量与所述标志物的参考量相比是改变的，则指示所述风险。
50.一种标志物组在评估受试者中的心血管病症进展风险中的用途，所述标志物组包含三叶因子3、α-2-巨球蛋白和/或α-谷胱甘肽-S-转移酶以及任选的至少一种进一步标志物，其中确定来自受试者的样品中至少三叶因子3、α-2-巨球蛋白和/或α-谷胱甘肽-S-转移酶的量与至少三叶因子3、α-2-巨球蛋白和/或α-谷胱甘肽-S-转移酶的参考量相比是改变的，则指示所述风险。
51.至少一种选自下组的第一标志物和任选的至少一种进一步标志物在评估受试者中的心血管病症进展风险中的用途：三叶因子3和α-谷胱甘肽-S-转移酶，其中确定来自受试者的样品中所述标志物的量与所述标志物的参考量相比是改变的，则指示所述风险。
52.一种标志物组在评估受试者中的心血管病症进展风险中的用途，所述标志物组包含三叶因子3和/或α-谷胱甘肽-S-转移酶以及任选的至少一种进一步标志物，其中确定来自受试者的样品中至少三叶因子3和/或α-谷胱甘肽-S-转移酶的量与至少三叶因子3和/或α-谷胱甘肽-S-转移酶的参考量相比是改变的，则指示所述风险。
53.至少一种选自下组的第一标志物和任选的至少一种进一步标志物在评估受试者中的心血管病症进展风险中的用途：三叶因子3、α-2-巨球蛋白、α-谷胱甘肽-S-转移酶和肝细胞生长因子受体，其中确定来自受试者的样品中所述标志物的量与所述标志物的参考量相比是改变的，则指示所述风险。
54.一种标志物组在评估受试者中的心血管病症进展风险中的用途，所述标志物组包含三叶因子3、α-2-巨球蛋白、α-谷胱甘肽-S-转移酶和/或肝细胞生长因子受体以及任选的至少一种进一步标志物，其中确定来自受试者的样品中至少三叶因子3、α-2-巨球蛋白、α-谷胱甘肽-S-转移酶和/或肝细胞生长因子受体的量与至少三叶因子3、α-2-巨球蛋白、α-谷胱甘肽-S-转移酶和/或肝细胞生长因子受体的参考量相比是改变的，则指示所述风险。
55.至少一种选自下组的第一标志物和任选的至少一种进一步标志物在评估受试者中的心血管病症进展风险中的用途：三叶因子3、α-2-巨球蛋白、α-谷胱甘肽-S-转移酶和神经纤毛蛋白-1，其中确定来自受试者的样品中所述标志物的量与所述标志物的参考量相比是改变的，则指示所述风险。
56.一种标志物组在评估受试者中的心血管病症进展风险中的用途，所述标志物组包含三叶因子3、α-2-巨球蛋白、α-谷胱甘肽-S-转移酶和/或神经纤毛蛋白-1以及任选的至少一种进一步标志物，其中确定来自受试者的样品中至少三叶因子3、α-2-巨球蛋白、α-谷胱甘肽-S-转移酶和/或神经纤毛蛋白-1的量与至少三叶因子3、α-2-巨球蛋白、α-谷胱甘肽-S-转移酶和/或神经纤毛蛋白-1的参考量相比是改变的，则指示所述风险。
57.至少一种选自下组的标志物和任选的至少一种进一步标志物在评估受试者中的心血管病症进展风险中的用途：血管内皮生长因子D、Tamm-Horsfall尿糖蛋白、肾-损伤-分子-1和/或α-谷胱甘肽-S-转移酶，其中确定来自受试者的样品中所述标志物的量与所述标志物的参考量相比是改变的，则指示所述风险。
58.一种标志物组在评估受试者中的心血管病症进展风险中的用途，所述标志物组包含血管内皮生长因子D、Tamm-Horsfall尿糖蛋白、肾-损伤-分子-1和/或α-谷胱甘肽-S-转移酶以及任选的至少一种进一步标志物，其中确定来自受试者的样品中至少血管内皮生长因子D、Tamm-Horsfall尿糖蛋白、肾-损伤-分子-1和/或α-谷胱甘肽-S-转移酶的量与至少血管内皮生长因子D、Tamm-Horsfall尿糖蛋白、肾-损伤-分子-1和/或α-谷胱甘肽-S-转移酶的参考量相比是改变的，则指示所述风险。
59.至少一种选自下组的标志物和任选的至少一种进一步标志物在评估受试者中的心血管病症进展风险中的用途：α-谷胱甘肽-S-转移酶、胰岛素样生长因子结合蛋白-4和肝细胞生长因子受体，其中确定来自受试者的样品中所述标志物的量与所述标志物的参考量相比是改变的，则指示所述风险。
60.一种标志物组在评估受试者中的心血管病症进展风险中的用途，所述标志物组包含α-谷胱甘肽-S-转移酶、胰岛素样生长因子结合蛋白-4和/或肝细胞生长因子受体以及任选的至少一种进一步标志物，其中确定来自受试者的样品中至少α-谷胱甘肽-S-转移酶、胰岛素样生长因子结合蛋白-4和/或肝细胞生长因子受体的量与至少α-谷胱甘肽-S-转移酶、胰岛素样生长因子结合蛋白-4和/或肝细胞生长因子受体的参考量相比是改变的，则指示所述风险。
61.至少一种选自下组的标志物和任选的至少一种进一步标志物在评估受试者中的心血管病症进展风险中的用途：α-谷胱甘肽-S-转移酶和肝细胞生长因子受体，其中确定来自受试者的样品中所述标志物的量与所述标志物的参考量相比是改变的，则指示所述风险。
62.一种标志物组在评估受试者中的心血管病症进展风险中的用途，所述标志物组包含α-谷胱甘肽-S-转移酶和/或肝细胞生长因子受体以及任选的至少一种进一步标志物，其中确定来自受试者的样品中至少α-谷胱甘肽-S-转移酶和/或肝细胞生长因子受体的量与至少α-谷胱甘肽-S-转移酶和/或肝细胞生长因子受体的参考量相比是改变的，则指示所述风险。
63.至少一种标志物α-谷胱甘肽-S-转移酶和任选的至少一种进一步标志物在评估受试者中的心血管病症进展风险中的用途，其中确定来自受试者的样品中所述标志物的量与所述标志物的参考量相比是改变的，则指示所述风险。
64.包含α-谷胱甘肽-S-转移酶以及任选的至少一种进一步标志物的标志物组在评估受试者中的心血管病症进展风险中的用途，其中确定来自受试者的样品中至少α-谷胱甘肽-S-转移酶的量与至少α-谷胱甘肽-S-转移酶的参考量相比是改变的，则指示所述风险。
65.至少一种标志物Tamm-Horsfall尿糖蛋白和任选的至少一种进一步标志物在评估受试者中的心血管病症进展风险中的用途，其中确定来自受试者的样品中所述标志物的量与所述标志物的参考量相比是改变的，则指示所述风险。
66.包含Tamm-Horsfall尿糖蛋白以及任选的至少一种进一步标志物的标志物组在评估受试者中的心血管病症进展风险中的用途，其中确定来自受试者的样品中至少Tamm-Horsfall尿糖蛋白的量与至少Tamm-Horsfall尿糖蛋白的参考量相比是改变的，则指示所述风险。
67.项47-66任一项的用途，其中所述第一标志物是：
(a)三叶因子3，任选地伴随至少一种进一步标志物；
(b)α-2-巨球蛋白，任选地伴随至少一种进一步标志物；
(c)α-谷胱甘肽-S-转移酶，任选地伴随至少一种进一步标志物；
(d)血管内皮生长因子D，任选地伴随至少一种进一步标志物；
(e)Tamm-Horsfall尿糖蛋白，任选地伴随至少一种进一步标志物；
(f)肾-损伤-分子-1，任选地伴随至少一种进一步标志物；
(g)肝细胞生长因子受体，任选地伴随至少一种进一步标志物；
(h)胰岛素样生长因子结合蛋白4，任选地伴随至少一种进一步标志物；和/或
(i)神经纤毛蛋白-1，任选地伴随至少一种进一步标志物.
68.项47-67任一项的用途，其中所述进一步标志物选自下组：Nt-pro BNP、过氧化物氧还蛋白-4、骨保护素、载脂蛋白B、载脂蛋白(a)、生长-因子-分化-因子-15、嗜铬粒蛋白A、半乳凝素-3、金属蛋白酶组织抑制剂1和血管生成素-2。
69.项47-64、67或68的用途，其中所述标志物是α-谷胱甘肽-S-转移酶且所述进一步标志物是Nt-pro BNP和血管生成素-2。
70.项47-50、53-55、56、67或68任一项的用途，其中所述标志物是三叶因子3、α-2-巨球蛋白、α-谷胱甘肽-S-转移酶、Nt-pro BNP、过氧化物氧还蛋白4、骨保护素、载脂蛋白B和血管生成素-2。
71.项47-50、53-55、56、67或68任一项的用途，其中所述标志物是三叶因子3、α-2-Macrogobulin、α-谷胱甘肽-S-转移酶、Nt-pro BNP、过氧化物氧还蛋白4、载脂蛋白B、血管生成素-2和生长-因子-分化因子15。
72.项47-50、53-55、56、67或68任一项的用途，其中所述标志物是三叶因子3、α-2-巨球蛋白、α-谷胱甘肽-S-转移酶、Nt-pro BNP、血管生成素-2、载脂蛋白B、生长-因子-分化-因子-15、过氧化物氧还蛋白-4、嗜铬粒蛋白A和半乳凝素-3。
73.项47-56、67或68任一项的用途，其中所述标志物是三叶因子3、α-谷胱甘肽-S-转移酶、Nt-pro BNP、骨保护素、血管生成素-2、生长-因子-分化-因子-15、嗜铬粒蛋白A和半乳凝素-3。
74.项47-56、67或68任一项的用途，其中所述标志物是三叶因子3、α-谷胱甘肽-S-转移酶、Nt-pro BNP、骨保护素、血管生成素-2、生长-因子-分化-因子-15和嗜铬粒蛋白A。
75.项47、48、53、54、67或68任一项的用途，其中所述标志物是三叶因子3、α-2-巨球蛋白、α-谷胱甘肽-S-转移酶、肝细胞生长因子受体、Nt-pro BNP、血管生成素-2、载脂蛋白B、骨保护素、生长-因子-分化-因子-15和嗜铬粒蛋白A。
76.项47、48、55、56、67或68任一项的用途，其中所述标志物是三叶因子3、α-2-巨球蛋白、α-谷胱甘肽-S-转移酶、神经纤毛蛋白-1、Nt-pro BNP、血管生成素-2、载脂蛋白B、生长-因子-分化-因子-15、骨保护素、过氧化物氧还蛋白-4、嗜铬粒蛋白A和半乳凝素-3。
77.项47、48、57、58、67或68任一项的用途，其中所述标志物是血管内皮生长因子D、Tamm-Horsfall尿糖蛋白、肾-损伤-分子-1、α-谷胱甘肽-S-转移酶、Nt-pro BNP、生长因子分化因子-15和血管生成素-2。
78.项47、48、59、60、67或68任一项的用途，其中所述标志物是α-谷胱甘肽-S-转移酶、胰岛素样生长因子结合蛋白-4、肝细胞生长因子受体、Nt-pro BNP、血管生成素-2、生长-因子-分化-因子-15、载脂蛋白B、骨保护素和嗜铬粒蛋白A。
79.项47、48、61、62、67或68任一项的用途，其中所述标志物是α-谷胱甘肽-S-转移酶、肝细胞生长因子受体、Nt-pro BNP、血管生成素-2、生长-因子-分化-因子-15、载脂蛋白B、骨保护素和嗜铬粒蛋白A。
80.项47-64、67或68任一项的用途，其中所述标志物是α-谷胱甘肽-S-转移酶、Nt-pro BNP、血管生成素-2、生长-因子-分化-因子-15、载脂蛋白B、嗜铬粒蛋白A和金属蛋白酶组织抑制剂1。
81.项47、48或65至68任一项的用途，其中所述标志物是Tamm-Horsfall尿糖蛋白、Nt-pro BNP、生长-因子-分化-因子-15、载脂蛋白B、嗜铬粒蛋白A、金属蛋白酶组织抑制剂1和载脂蛋白(a)。
82.一种用于实施项1-46任一项的方法的试剂盒，其包含特异性确定至少三叶因子3、α-2-巨球蛋白、血管内皮生长因子D、Tamm-Horsfall尿糖蛋白、肾-损伤-分子-1、肝细胞生长因子受体、神经纤毛蛋白-1、胰岛素样生长因子结合蛋白4、和α-谷胱甘肽-S-转移酶以及任选的至少一种进一步标志物所需要的试剂，以及任选的用于进行所述确定的辅助试剂。
83.项82的试剂盒，其中所述进一步标志物选自下组：Nt-pro BNP、过氧化物氧还蛋白-4、骨保护素、载脂蛋白B、载脂蛋白(a)、生长-因子-分化-因子-15、嗜铬粒蛋白A、半乳凝素-3、金属蛋白酶组织抑制剂1和血管生成素-2。
实施例
1.建模及验证集的产生
如核准的SAP中所述，将8401名个体分为2组，其通过区域来分层：a)建模(67％)和b)验证(33％)组。因为无法从中国获得血液，与如下地区达成了协议：北美洲及澳洲；南美洲：欧洲(包括南非)；和印度。每个集合中的患者特征记录如下。
Figure BDA0001992808990000551
Figure BDA0001992808990000561
Figure BDA0001992808990000562
Figure BDA0001992808990000571
Figure BDA0001992808990000572
Figure BDA0001992808990000581
Figure BDA0001992808990000582
2.添加至基础临床模型时的第一共同主要的独立预测因子
1.因为最终生物标志物列表包括了初始测定的284种生物标志物中的237种，用于纳入至SAP中的模型中的p值从0.05/284＝0.00018增加至0.05/237＝0.00021。
2.公认临床模型中的性别和年龄标准仅通过二分年龄变量来针对年龄调整(即性别特异性的年龄)。因为性别也被视为重要的并且在匹配的INTERHEART研究中可能表现不佳，我们同意在建模群体中针对性别调整。关于吸烟，二手烟不纳入至模型中从而不收集该数据，并将吸烟变量分层为当前对比非吸烟者。
3.因此，在测定任何生物标志物之前被添入(forced into)基础临床模型的最终变量如下所示(基于SAP)：
a)在先CV结局(Y/N) e)LDL胆固醇/HDL胆固醇
b)报告的/测得的白蛋白尿(Y/N) f)当前吸烟者(Y/N)
c)男性>55y或女性>65y(Y/N) g)在先糖尿病(Y/N)
d)性别(M/F) h)在先高血压(Y/N)
4.为了评估在同一模型中分析序数和连续数据的可能性，将具有5个水平的缺点序数数据对比具有无限可能水平的连续数，运行了灵敏度分析，其中192个连续变量中的每一个的原始非变换数据，使用五分法将数据划分为5类，并且重新运行模型。将结果与混合连续和有序数据的模型进行比较。
a.当有序和连续的生物标志物被纳入相同的分析中时，这些生物标志物当被添加至临床模型时在P<0.05/237处是显著的：
i.三叶因子3
ii.血管生成素-2
iii.N末端pro BNP(序数的(ordinal)生物标志物)
iv.α-谷胱甘肽-S-转移酶
v.骨保护素
vi.α-2-巨球蛋白
vii.过氧化物氧还蛋白-4
viii.载脂蛋白B
b.当将连续的生物标志物的原始数据转换为5个序数水平并添加至45个序数生物标志物，这些生物标志物当被添加至临床模型时在P<0.05/237处是显著的(这些与步骤a中鉴定的那些不同的生物标志物以斜体表示)：
i.三叶因子3
ii.VEGF D
iii.N末端pro BNP
iv.α-谷胱甘肽-S-转移酶
v.生长/分化因子15
vi.α-2-巨球蛋白
vii.过氧化物氧还蛋白-4
viii.载脂蛋白B
5.因为序数的生物标志物之一进入了步骤4a中的模型中(NT-pro BNP或var190)，决定使用来自步骤4a的模型，这是由于其使用了最多的信息来鉴定纳入的生物标志物。还探索了步骤4b中的模型作为灵敏度分析。
来源于建模集的最终模型示于下文。尚未在验证集中进行验证。
Figure BDA0001992808990000601
用于纳入的P<0.05/237或0.00021097；危险比以参数中的每1SD变化来表示((NB–所述SD是转换值的SD，如果变量因非常态化而被转换的话)
可能性比率检验：添加生物标志物至基础临床模型将模型卡方从198增加至613(LR检验＝415df＝8及p<0.001)。
具有95％CI的C统计值：临床模型＝0.63(0.61,0.65)；临床+生物标志物＝0.72(0.71,0.74)
具有4类风险可能性(<5％、5-10％、10-20％、<20％)的模型校准(Hosmer-Lemeshow)：最大生存时间(7.84年)处的卡方从294至35(p＝5.58E-5)
在最大生存时间(7.84年)处，使用拔靴法(Bootstraps method)的净再分类指数(Net reclassification Index,NRI)＝0.27(95％CI 0.24,0.32)
6.为了探索基础临床模型对纳入的生物标志物的属性的效果，在纳入后重复了基础临床模型中一些额外因子的选择过程，如下文所示：
Figure BDA0001992808990000611
Figure BDA0001992808990000612
Figure BDA0001992808990000621
3.当添加至基础临床模型时第二共同主要的独立预测因子
1.来自第2节的步骤1-3在本节保持不变
2.重复来自第2节的步骤4并得到如下结果：
a.当将序数和连续的生物标志物纳入相同分析中时，这些生物标志物在添加至临床模型时在P<0.05/237处是显著的：
i.N末端pro BNP(序数的生物标志物)
ii.生长/分化因子15(GDF 15)
iii.血管生成素-2
iv.VEGF D(序数的生物标志物)
v.Tamm-Horsfall尿糖蛋白
vi.肾-损伤-分子-1(序数的生物标志物)
vii.谷胱甘肽S-转移酶α
b.当连续的生物标志物的原始值被转换为5个序数水平且被添加至45个序数的生物标志物时，相同的生物标志物在添加至临床模型时在P<0.05/237处是显著的；不过进入的顺序稍有不同。
i.N末端pro BNP
ii.生长/分化因子15(GDF 15)
iii.VEGF D
iv.Tamm-Horsfall尿糖蛋白
v.肾-损伤-分子-1
vi.谷胱甘肽S-转移酶α
vii.血管生成素-2
3.来源于建模集的最终模型示于下文。其满足比例性的检验。
Figure BDA0001992808990000631
用于纳入的P<0.05/237或0.00021097；危险比以参数中的每1SD变化来表示((NB–所述SD是转换值的SD，如果变量因非常态化而被转换的话)
可能性比率检验：添加生物标志物至基础临床模型将模型卡方从332增加至679(LR检验＝348df＝7及p<0.001)。
具有95％CI的C统计值：临床模型＝0.63(0.61,0.64)；临床+生物标志物＝0.68(0.67,0.69)
具有4类风险可能性(<5％、5-10％、10-20％、<20％)的模型校准(Hosmer-Lemeshow)：最大生存时间(7.84年)处的卡方从110至18(p<0.01)
在最大生存时间(7.84年)处，使用拔靴法的净再分类指数(NRI)＝0.12(95％CI0.10,0.14)
Figure BDA0001992808990000632
Figure BDA0001992808990000641
4.验证集中结果的验证
使用验证集，计算了两个共同主要结局的临床和临床+生物标志物模型二者的C统计值(在建模集中鉴定出的)以及NRI。还计算了将这两个值最大化的截止点的灵敏度和特异性。在验证集中未进行前向选择(forward selection)。下表显示了这些分析的结果。
Figure BDA0001992808990000642
Figure BDA0001992808990000643
Figure BDA0001992808990000651
来自这些分析的结论是验证集得到了与建模集一致的发现。
5.整个数据集中结果的验证
为了进行最终验证，用全部8401名参与者针对第一和第二共同主要结局重复了前向选择过程。这些模型以及危险比的估计(其用灵敏度分析得出，其中将年龄、肌酐、以及年龄和肌酐二者添加至基础临床模型)针对各个结局示于下文。
下文还针对各个结局显示了所有8401人的运行中鉴定的各个生物标志物的HR和CI的估计，以及各个模型的C统计值和NRI，其根据用拔靴法(bootstrapping)运行临床模型1000次以及临床+生物标志物模型1000次(即带复位地随机抽取8401人的1000个样品)而得到。
a)第一共同主要结局
Figure BDA0001992808990000652
Figure BDA0001992808990000661
Figure BDA0001992808990000662
Figure BDA0001992808990000663
Figure BDA0001992808990000671
Figure BDA0001992808990000672
Figure BDA0001992808990000681
a)第二共同主要结局
Figure BDA0001992808990000682
Figure BDA0001992808990000683
Figure BDA0001992808990000691
Figure BDA0001992808990000692
Figure BDA0001992808990000701
Figure BDA0001992808990000702

Claims (10)

1.(i)特异性确定第一标志物血管内皮生长因子D、Tamm-Horsfall尿糖蛋白、肾-损伤-分子-1和α-谷胱甘肽-S-转移酶的量所需的试剂和(ii)用于对进一步的标志物Nt-proBNP、生长-因子-分化-因子-15和血管生成素-2的量进行确定的辅助试剂在制备用于评估受试者中的心血管病症进展风险的试剂盒中的用途，其中当所述量与所述第一和进一步的标志物的参考量相比是变化的时，所述受试者处于心血管病症进展风险。
2.(i)特异性确定第一标志物α-谷胱甘肽-S-转移酶、胰岛素样生长因子结合蛋白-4和肝细胞生长因子受体的量所需的试剂和(ii) 用于对进一步的标志物Nt-pro BNP、血管生成素-2、生长-因子-分化-因子-15、载脂蛋白B、骨保护素和嗜铬粒蛋白A的量进行确定的辅助试剂在制备用于评估受试者中的心血管病症进展风险的试剂盒中的用途，其中当所述量与所述第一和进一步的标志物的参考量相比是变化的时，关联所述受试者处于心血管病症进展风险。
3.根据权利要求1或2的用途，其中所述心血管病症是心肌梗塞、中风和/或心脏衰竭。
4.根据权利要求1或2的用途，其中：
(i)所述受试者患有前驱糖尿病或糖尿病；
(ii)所述受试者年龄至少50岁；且/或
(iii)所述受试者具有既往的心血管病症。
5.权利要求4的用途，其中所述受试者：
(i)患有前驱糖尿病或糖尿病；且
(ii)年龄至少50岁；且
(iii)具有既往的心血管病症。
6.根据权利要求1或2的用途，其中所述受试者具有一个或多个选自下组的风险因素：既往的心血管病症、白蛋白尿、男性、至少50岁的年龄、吸烟者、糖尿病或前驱糖尿病、升高的血液胆固醇、升高的血肌酐、升高的HbA1c水平、肥胖和高血压。
7.权利要求6的用途，其中所述受试者具有风险因素既往的心血管病症、白蛋白尿、男性、至少55岁的年龄、升高的血液胆固醇水平、吸烟者、糖尿病或前驱糖尿病、和高血压。
8.根据权利要求1或2的用途，其中来自所述受试者的样品为体液和/或组织提取物。
9.特异性确定标志物血管内皮生长因子D、Tamm-Horsfall尿糖蛋白、肾-损伤-分子-1和α-谷胱甘肽-S-转移酶、Nt-pro BNP、生长-因子-分化-因子-15和血管生成素-2的量所需的试剂在制备用于在体外评估受试者中的心血管病症进展风险的试剂盒中的用途，其中确定来自所述受试者的样品中所述标志物的量与所述标志物的参考量相比是改变的，则指示所述风险。
10.特异性确定标志物α-谷胱甘肽-S-转移酶、胰岛素样生长因子结合蛋白-4、肝细胞生长因子受体、Nt-pro BNP、血管生成素-2、生长-因子-分化-因子-15、载脂蛋白B、骨保护素和嗜铬粒蛋白A的量所需的试剂在制备用于在体外评估受试者中的心血管病症进展风险的试剂盒中的用途，其中确定来自所述受试者的样品中所述标志物的量与所述标志物的参考量相比是改变的，则指示所述风险。
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