CN110157781B - 一种重叠延伸PCR结合Sanger测序检测不连续多DNA位点的方法 - Google Patents

一种重叠延伸PCR结合Sanger测序检测不连续多DNA位点的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种重叠延伸PCR结合Sanger测序检测不连续多DNA位点的方法，本方法一对用于重叠延伸PCR的全长扩增的引物，其核苷酸序列如SEQ ID No.1～2所示。本发明通过一次PCR将不连续的位点连接成一条DNA片段，对这条包含多个检测位点所在片段，可以一次性进行Sanger测序分析，利用本发明可以将任意的2～4个包含各自检测位点的片段拼接连接形成融合片段，快速、简单，不需要限制性内切酶，中间无任何非目的基因的DNA序列，进而检测的检测突破了Sanger测序读长的限制，可以通过一个Sanger测序反应同时检测多个不连续的DNA位点。

Description

一种重叠延伸PCR结合Sanger测序检测不连续多DNA位点的 方法
技术领域
本发明涉及基因检测技术领域，更具体地，涉及一种重叠延伸PCR结合Sanger测序检测不连续多DNA位点的方法。
背景技术
一代测序技术是20世纪70年代中期由Fred Sanger及其同事首先发明。其基本原理是利用双脱氧核糖核苷酸在脱氧核糖碳骨架上没有聚合酶延伸链所需要的3－OH基团，用双脱氧核糖核苷酸当作链终止试剂，测序引物与单链DNA模板分子结合后，DNA聚合酶用dNTP延伸引物，延伸反应分四组进行，每一组分别用四种ddNTP(双脱氧核糖核苷酸并标记不同的荧光标记)中的一种来进行终止，最终产生一系列大小不同的分子，读取这些分子荧光信号的类别和顺序即可获得序列信息。因此一代测序技术由于其准确性好，操作越来越简便等优势，已在遗传病或者肿瘤等方面的检测得到非常广泛的应用。另一方面，由于测序成本相对较高，且测序长度在800bp左右，因此在检测不连续多位点或者多个相隔较远的位点时，往往需要分开单独扩增各个位点，并分开测序，造成成本和操作复杂度的增加。
重叠延伸PCR技术(splicing by overlapping extension PCR，SOE PCR)是指在PCR技术的基础上，采用具有互补末端的引物，使PCR产物形成了重叠链，通过重叠链的延伸，将不同来源的片段重叠拼接起来的新技术(图1)。该技术可以快速获取依靠限制性内切酶消化的方法难以得到的产物，其成功的关键是重叠互补引物的设计。SOE PCR在基因的定点突变、长片段基因的合成、基因敲除以及目的基因的扩增等方面有着独特的应用。此技术可以将任意的两个目的基因拼接连接形成2个目的基因的融合基因，中间无任何非目的基因的DNA序列，这样就避免因加入连接序列可能出现的非目的基因序列，从而在体外就可得到高质量的目的基因序列。
目前的重叠延伸PCR技术，一般包括两次PCR反应，第一次PCR形成具有重叠区域的DNA片段，回收产物；在第二次PCR中，将第一轮PCR的回收产物具有重叠区域的位置互补结合，由两侧的引物共同引导目的DNA片段的合成，不需要限制性内切酶即可以进行片段连接。
至今为止，市场上用于一代测序的技术，尚未出现一种复合定向延伸多DNA片段并测序的PCR技术。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供一种测序检测不连续多位点的方法。
本发明的第一个目的是一对用于重叠延伸PCR的通用全长扩增的引物。
本发明的第二个目的是一种用于重叠延伸PCR的引物组合。
本发明的第三个目的是所述引物或所述引物组合在多DNA片段PCR扩增、多DNA片段PCR扩增试剂盒、多DNA片段位点检测或多DNA片段位点检测试剂盒中的应用。
本发明的第四个目的是一种多DNA片段PCR扩增的方法。
本发明的第五个目的是一种多DNA片段PCR扩增的试剂盒。
本发明的第六个目的是一种多DNA片段位点检测的方法。
为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：
本专利在原有重叠延伸PCR技术的基础上进行进一步的改进，使得仅仅通过一次PCR将不连续的位点连接成一条DNA片段，对这条包含多个检测位点所在片段，可以一次性进行测序分析。在本发明中PCR包括两个阶段，第一阶段是各个位点所在的片段的扩增；第二阶段是通过各单独片段R端与F端引物区的重叠区域互补结合延伸，从而获得完整地长片段。关键点是两轮PCR反应采用Tm值相差3～8℃的嵌合引物对。
一对用于重叠延伸PCR的通用全长扩增的引物，其核苷酸序列如SEQ IDNo.1～2所示。
SEQ ID No.1：5′-CTGCATAGTCTACTGGATCAAC-3′；
SEQ ID No.2：5′-GATCGTCAGTGCTCACTACATC-3′。
一种用于重叠延伸PCR的引物组合，包括所述的通用全长扩增引物和扩增各目的片段的片段扩增引物；
最上游的扩增片段的5’端上游片段扩增引物为该片段的常规设计的上游引物的5’端加上核苷酸序列如SEQ ID No.1所示序列，
其余的扩增片段的5’端上游片段扩增引物为该片段的常规设计的上游引物5’端加上其上游的目的片段3’端的碱基18～23个碱基，
最上游的扩增片段的3’端下游片段扩增引物为常规设计的下游引物5’端加上核苷酸序列如SEQ ID No.2所示序列；
其余扩增片段的3’端下游片段扩增引物为常规设计的下游引物；
其中所述常规设计的上游引物和下游引物与权利要求1所述引物Tm值相差3～8℃。
其中，Tm值相差的具体数值，其余的扩增片段的5’端上游片段扩增引物与其上游的目的片段3’端的碱基的重叠的数量，都是以及根据具体扩增的片段进行调整和优化。
优选地，所述常规上游引物和常规下游引物与核苷酸序列如SEQ ID No.1～2所示引物Tm值相差3～8℃。
所述引物或所述引物组合在多DNA片段PCR扩增、多DNA片段PCR扩增试剂盒、多DNA片段位点检测或多DNA片段位点检测试剂盒中的应用，也属于本发明的保护范围。
一种多DNA片段PCR扩增的方法，利用所述引物进行PCR扩增。
优选地，所述引物进行PCR扩增。
一种多DNA片段PCR扩增的试剂盒，包括所述引物。
优选地，包括利用所述引物组合。
优选地，还包括PCR反应的试剂：GeneAmpTM 10×PCR Buffer I(ABITM4379876)、25mM Mg2+、25mM dNTPs、Roche Taq酶(货号：03501221190)、H2O。
优选地，PCR扩增的体系为：GeneAmpTM 10×PCRBuffer I 3μl，25mM Mg2+2.5μl，25mM dNTPs 0.3μl，每条引物各1μl，Roche Taq酶0.5μl，模板1μl，H2O补足至25μl。
优选地，PCR扩增的程序为：95℃9min；95℃30s，52℃30s，72℃30s，10个循环；95℃30s，58℃30s，72℃45s，30个循环；72℃5min；16℃∞。
优选地，扩增产物的测序引物与通用的通用全长扩增的引物相同，或扩增产物的测序引物为通用全长扩增的引物的一段。
所述引物作为所述引物或/和所述引物组合的扩增产物的测序引物的应用，也属于本发明的保护范围。
一种多DNA片段位点检测的方法，所述方法进行多DNA片段PCR扩增后，用核苷酸序列如SEQ ID No.1～2所示引物进行的Sanger测序。
优选地，所述Sanger测序的试剂为BigDye Terminator v3.1CycleSequencingKit。
更优选地，所述Sanger测序的PCR反应的体系为：BigDye 0.5μl；5×seq Buffer1.75μl；引物各1μl；模板1μl；水补足10μl。
优选地，所述Sanger测序的PCR反应的程序为：96℃1min；96℃10s，50℃5s，60℃4min，25个循环；4℃∞。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明通过一次PCR将不连续的位点连接成一条DNA片段，对这条包含多个检测位点所在片段，可以一次性进行Sanger测序分析，利用本发明可以将任意的2～4个包含各自检测位点的片段拼接连接形成融合片段，快速、简单，不需要限制性内切酶，中间无任何非目的基因的DNA序列，进而检测的检测突破了Sanger测序读长的限制，可以通过一个Sanger测序反应同时检测多个不连续的DNA位点。
附图说明
图1为SOE-PCR一步法构建三基因融合原理图。
图2为实施例4的EGFR基因18、19、20和21号检测电泳图；M：DNA maker，从上到下大小依次为1500、1000、500、400、300、200和100bp。
图3为18号外显子p.G719A，c.2156G>C突变。
图4为19号外显子p.E746_T751>A，c.2237-2251del 15突变。
图5为20号外显子无突变。
图6为21号外显子无突变。
具体实施方式
下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1全长的扩增引物的设计及PCR反应
一、引物设计
根据引物设计原则及重叠延伸PCR的引物设计要求设计了2条通用的通用全长扩增引物：通用的通用全长扩增的引物是不和人类基因互补配对的一段22bp大小的DNA，自行设计，并根据扩增效率和扩增特异性进行筛选，得到最合适的引物，其核苷酸序列如SEQ IDNo.1～2所示，
SEQ ID No.1：5′-CTGCATAGTCTACTGGATCAAC-3′；
SEQ ID No.2：5′-GATCGTCAGTGCTCACTACATC-3′；
扩增各目的片段的片段扩增引物(搭接目的DNA片段)的设计(以连接两个目的DNA片段为例)：
最上游的扩增片段的5’端上游片段扩增引物为该片段的常规设计的上游引物的5’端加上核苷酸序列如SEQ ID No.1所示序列，
其余的扩增片段的5’端上游片段扩增引物为该片段的常规设计的上游引物5’端加上其上游的目的片段3’端的碱基18～23个碱基，
最上游的扩增片段的3’端下游片段扩增引物为常规设计的下游引物5’端加上核苷酸序列如SEQ ID No.2所示序列；
其余扩增片段的3’端下游片段扩增引物为常规设计的下游引物的，
其中所述常规设计的上游引物和下游引物与权利要1所述引物Tm值相差3～8℃。
扩增产物的测序引物与通用的通用全长扩增的引物相同，不过测序引物只需要一段即可。
二、多DNA片段位点重叠延伸PCR反应
利用上一步获得的引物进行扩增。
通过大量的实验对比，控制Mg2+浓度和模板量，做到不同反应的高效率扩增，特异性好。
最终确定最优的PCR反应体系为：GeneAmpTM 10×PCRBuffer I 3μl，25mMMg2+ 2.5μl，25mM dNTPs 0.3μl，每条引物各1μl，Roche Taq酶0.5μl，模板1μl，H2O补足至25μl；
PCR扩增的程序为：95℃9min；95℃30s，52℃30s，72℃30s，10个循环；95℃30s，58℃30s，72℃45s，30个循环；72℃5min；16℃∞。
实施例2一种多DNA片段位点检测的方法
一、多DNA片段的扩增
按照实施例1中多DNA片段位点重叠延伸PCR反应进行DNA片段位的PCR扩增。
二、检测
对实施例1的扩增产物用核苷酸序列如SEQ ID No.1～2所示引物进行的Sanger测序。
优选地，所述Sanger测序的试剂为BigDye Terminator v3.1CycleSequencingKit。
更优选地，所述Sanger测序的PCR反应的体系为：BigDye 0.5μl；5×seq Buffer1.75μl；引物各1μl；模板1μl；水补足10μl。
优选地，所述Sanger测序的PCR反应的程序为：96℃1min；96℃10s，50℃5s，60℃4min，25个循环；4℃∞。
实施例3一种多DNA片段PCR扩增的试剂盒
一种多DNA片段PCR扩增的试剂盒，
包括其核苷酸序列如SEQ ID No.1～2所示的通用全长扩增引物和扩增各目的片段的片段扩增引物；
最上游的扩增片段的5’端上游片段扩增引物为该片段的常规设计的上游引物的5’端加上核苷酸序列如SEQ ID No.1所示序列，
其余的扩增片段的5’端上游片段扩增引物为该片段的常规设计的上游引物5’端加上其上游的目的片段3’端的碱基18～23个碱基，
最上游的扩增片段的3’端下游片段扩增引物为常规设计的下游引物5’端加上核苷酸序列如SEQ ID No.2所示序列；
其余扩增片段的3’端下游片段扩增引物为常规设计的下游引物的，
其中所述常规设计的上游引物和下游引物与权利要1所述引物Tm值相差3～8℃
包括PCR反应的试剂：10×GeneAmpTM 10×PCR Buffer I、25mM Mg2+、25mM dNTPs、Roche Taq酶、H2O；
PCR扩增的体系为：GeneAmpTM 10×PCR Buffer I 3μl，25mM Mg2+2.5μl，25mMdNTPs 0.3μl，每条引物各1μl，Roche Taq酶0.5μl，模板1μl，H2O补足至25μl；
PCR扩增的程序为：95℃9min；95℃30s，52℃30s，72℃30s，10个循环；95℃30s，58℃30s，72℃45s，30个循环；72℃5min；16℃∞。
实施例4多DNA片段位点的扩增及检测
EGFR基因18、19、20和21号外显子搭接检测
一、实验方法
(1)利用实施例3中的一种多DNA片段PCR扩增的试剂盒(实施例1所述方法)对EGFR基因的18、19、20和21号外显子进行扩增。
其中，设计引物如表1。
表1：
Figure BDA0001931471790000071
(2)PCR产物的琼脂糖凝胶电泳及回收。
用2％(w/w)的琼脂糖凝胶进行电泳；电泳条件为120V，20min，采用商品化的琼脂糖凝胶回收试剂盒回收目的片段。
(3)一种多DNA片段位点检测的方法
按照实施例2的方法对上一步的扩增产物进行Sanger测序，具体的：使用核苷酸序列如SEQ ID No.1～2所示的测序引物进行Sanger测序，采用BigDyeTerminator试剂盒进行测序PCR，将测序PCR产物用酒精纯化，加入Hi-Di甲酰胺，上样，按照ABI 3500XL Dx的仪器说明书进行设置开始运行程序，结果下机后进行分析。
二、实验结果
结果如图1到图6所示，通过一次扩增，扩增到位于EGFR基因18、19、20和21号外显子目的片段，扩增片段全长782bp，经过一个Sanger测序反应就对全长进行了测序，成功对4个外显子的相关位点进行了检测。
序列表
<110> 广州凯普医药科技有限公司
广州凯普医学检验所有限公司
广州凯普生物科技有限公司
<120> 一种重叠延伸PCR结合Sanger测序检测不连续多DNA位点的方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ctgcatagtc tactggatca ac 22
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gatcgtcagt gctcactaca tc 22

Claims (3)

1.一种多DNA片段PCR扩增的方法，其特征在于，利用一种用于重叠延伸PCR的引物组合进行PCR扩增，所述引物组合，包括一对用于重叠延伸PCR的通用全长扩增的引物和扩增各目的片段的片段扩增引物，用于重叠延伸PCR的通用全长扩增的引物，其核苷酸序列如SEQID No.1～2所示；
最上游的扩增片段的5’端上游片段扩增引物为该片段的常规设计的上游引物的5’端加上核苷酸序列如SEQ ID No.1所示序列，
其余的扩增片段的5’端上游片段扩增引物为该片段的常规设计的上游引物5’端加上其上游的目的片段3’端的碱基18～23个碱基，
最上游的扩增片段的3’端下游片段扩增引物为常规设计的下游引物5’端加上核苷酸序列如SEQ ID No.2所示序列；
其余扩增片段的3’端下游片段扩增引物为常规设计的下游引物的，
其中所述常规设计的上游引物和下游引物与权利要1所述引物Tm值相差3～8℃；
所述方法PCR扩增的体系为：GeneAmpTM 10×PCR BufferI 3μl，25mM Mg2+ 2.5μl，25mMdNTPs 0.3μl，每条引物各1μl，Roche Taq酶0.5μl，模板1μl，H2O补足至25μl；
所述方法PCR扩增的程序为：95℃ 9min；95℃ 30s，52℃ 30s，72℃ 30s，10个循环；95℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 45s，30个循环；72℃ 5min；16℃ ∞。
2.一种多DNA片段PCR扩增的试剂盒，其特征在于，包括一种用于重叠延伸PCR的引物组合进行PCR扩增，所述引物组合，包括一对用于重叠延伸PCR的通用全长扩增的引物和扩增各目的片段的片段扩增引物，用于重叠延伸PCR的通用全长扩增的引物，其核苷酸序列如SEQ ID No.1～2所示；
最上游的扩增片段的5’端上游片段扩增引物为该片段的常规设计的上游引物的5’端加上核苷酸序列如SEQ ID No.1所示序列，
其余的扩增片段的5’端上游片段扩增引物为该片段的常规设计的上游引物5’端加上其上游的目的片段3’端的碱基18～23个碱基，
最上游的扩增片段的3’端下游片段扩增引物为常规设计的下游引物5’端加上核苷酸序列如SEQ ID No.2所示序列；
其余扩增片段的3’端下游片段扩增引物为常规设计的下游引物的，
其中所述常规设计的上游引物和下游引物与权利要1所述引物Tm值相差3～8℃；
还包括PCR反应的试剂：GeneAmpTM 10×PCR Buffer I、25mM Mg2+、25mM dNTPs、RocheTaq酶、H2O；
PCR扩增的体系为：GeneAmpTM 10×PCR Buffer I 3μl，25mM Mg2+ 2.5μl，25mM dNTPs0.3μl，每条引物各1μl，Roche Taq酶0.5μl，模板1μl，H2O补足至25μl；
PCR扩增的程序为：95℃ 9min；95℃ 30s，52℃ 30s，72℃ 30s，10个循环；95℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 45s，30个循环；72℃ 5min；16℃ ∞。
3.一种多DNA片段位点检测的方法，其特征在于，用权利要求1所述方法进行多DNA片段PCR扩增后，用核苷酸序列如SEQ ID No.1～2所示引物进行的Sanger测序。
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