CN110157668B - Cd39内化调控对p2x7r活化的作用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了CD39内化调控对P2X7R活化的作用，本发明的有益效果是提供多种Toll样受体(TLR)配体可促进BMDCs细胞表面CD39内化，进而抑制细胞外ATP的降解，导致细胞外ATP的累积后激活P2X7R信号通路，从而促进炎症反应。同时TLR配体介导的BMDCs中CD39内化的诱导是由MyD88途径介导的。该发明在控制免疫反应和炎症方面具有重要的应用价值。

Description

CD39内化调控对P2X7R活化的作用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，涉及CD39内化调控对P2X7R活化的作用。
背景技术
P2X7R广泛表达与包括骨髓源性树突状细胞(BMDCs)在内的免疫细胞表面，胞外高浓度的三磷酸腺苷(ATP)与其结合后激活信号通路在免疫反应中发挥重要作用。已知P2X7R信号通的激活需要局部高浓度的ATP累积，细胞外高浓度ATP的积累一方面需要细胞释放大量ATP，另一方面需要减少ATP的降解。已知核苷三磷酸二磷酸水解酶-1(CD39)是细胞外ATP代谢的关键酶之一，因此免疫炎症病程中进入体内的病原相关分子模式如Toll样受体(TLR)配体等，能否通过调节BMDCs中CD39的表达和功能，进而导致细胞外ATP的堆积，激活P2X7R信号通路，促进炎症反应。
发明内容
本发明的目的在于提供CD39内化调控对P2X7R活化的作用，本发明的有益效果是提供多种Toll样受体(TLR)配体可促进BMDCs细胞表面CD39内化，进而抑制细胞外ATP的降解，导致细胞外ATP的累积后激活P2X7R信号通路，从而促进炎症反应。同时TLR配体介导的BMDCs中CD39内化的诱导是由MyD88途径介导的。该发明在控制免疫反应和炎症方面具有重要的应用价值。
本发明提出了CD39内化调控对P2X7R活化的作用。
进一步，TLR4配体脂多糖(LPS)处理BMDCs骨髓源性树突状细胞后，BMDCs细胞膜上所述CD39数量减少，而细胞上的CD39总量保持不变。
进一步，LPS可促进BMDCs上所述CD39内吞，减少CD39水解ATP的作用，增加细胞外ATP堆积，激活P2X7R嘌呤能离子通道型受体7，进而促进BMDCs炎性因子IL-1β的生成和释放。
进一步，除了polyI:C聚肌胞苷酸,Toll样受体3(TLR3)配体,所有其他的Toll样受体配体如TLR 1/2配体,Pam3csk4三酰脂肽；TLR2配体,PGN-BS(从革兰氏阳性细菌枯草芽孢杆菌中纯化的肽聚糖)；TLR4配体,LPS；TLR7/8配体,CL075(一种噻唑并喹啉酮衍生物，其激活人外周血单核细胞中的TLR7、TLR8)，TLR9配体,ODN 1585(A类CpG寡核苷酸特异性激活小鼠TLR9)都显示出类似促进BMDCs细胞膜上CD39的内化作用。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行详细说明。
为了推断TLR配体可以改变BMDCs中CD39的表达或活性，我们选用TLR4配体LPS处理BMDCs细胞，并检测BMDCs中CD39的表达。TLR配体是影响DCs在免疫应答中功能的重要因素。DCs表达各种类型的TLR，它们的功能由病原体相关分子模式(PAMPS)强烈塑造。TLR配体的结合激活相关信号通路促进DC成熟、细胞因子产生和抗原呈递功能。研究显示在某些细胞类型和DC中存在CD39。当LPS处理的BMDCs中膜CD39表达显著降低时，这些细胞中的Cd39mRNA和全细胞总CD39表达与未处理的BMDCs中的水平相同,揭示LPS促进BMDCs膜CD39的内化。LPS诱导的膜CD39表达下调可能是由于表面暴露的CD39被运输到细胞质中(内吞作用)引起。
为了阐明LPS诱导的膜CD39表达下调是由内吞作用介导，我们测试了多种内吞作用抑制剂来抑制膜CD39表达降低的能力。测试中包括网格蛋白依赖性或非依赖性途径的胞吞作用抑制剂。使用LPS处理的BMDCs中膜CD39表达的下调几乎完全被添加的甲基-β-环糊精(MβCD，胞膜窖介导的内吞抑制剂)阻断。而在LPS处理或未处理的BMDCs中，细胞总CD39表达和Cd39mRNA表达没有差异。因此，可以确定内吞作用(即内化作用)是导致LPS处理的BMDCs中膜CD39表达下调的原因。
为了确定BMDCs膜CD39内化可改变细胞外ATP代谢。我们使用50ng/mlLPS处理BMDCs，并选择LPS处理后0，15和72小时，三个时间点添加外源ATP至终浓度3mM。结果显示BMDCs中的CD39内化最早在LPS处理后9小时检测到，在处理后18小时达最大水平并维持数小时后逐渐下降；在LPS处理后约75小时，膜CD39表达几乎恢复到未处理的BMDsC中的水平。第一次和第三次添加ATP不会在培养基中引起ATP积累；当在处理后15小时添加ATP时(此时LPS处理的BMDCs中发生了强烈的CD39内化)，检测到显著的ATP积累(在培养基中超过1mM数小时)。使用内吞抑制剂MβCD抑制CD39内化后，LPS处理后18和24小时，细胞外ATP的浓度显著降低；MβCD与CD39抑制剂ARL共存时，MβCD的作用几乎完全被阻断。进一步证实细胞外ATP积累是由CD39内化引起的。
LPS处理BMDCs激活膜CD39内化，促进细胞外ATP积累。我们接下来阐明哪种ATP受体(P2X4R或P2X7R)被这种累积的ATP激活。P2X7R在BMDCs中表达。我们用LPS处理BMDCs(LPS-BMDCs)或含有MβCD的LPS处理BMDCs(LPS-BMDCs/MβCD)后，向细胞中加入ATP(终浓度1或3mM)。在无外源ATP时，LPS-BMDCs和LPS-BMDCs/MβCD中均未检测到钙积累。当添加外源ATP时，在LPS处理的CD39内化的BMDCs中检测到显著的钙积累，而在LPS/MβCD处理的无CD39内化的BMDC中发现钙积累水平大大降低。在选择性P2X7R拮抗剂氧化的ATP(OX-ATP,80μM)存在下，外源ATP诱导的LPS-BMDCs中钙的积累被抑制；选择性P2X4R拮抗剂苏拉明(suramin，100μM)存在下，外源ATP诱导的LPS-BMDCs中钙的积累不被抑制。ATP(3mM)在LPS-BMDCs/MβCD中没有诱导显著的细胞内钙积累，但用非代谢型ATP类似物2-methylthio-ATP或P2X7R激动剂Bz-ATP处理后，成功地诱导了这些细胞中的钙积累。因此，证实LPS处理BMDCs激活膜CD39内化，促进细胞外ATP积累，而胞外积累的ATP是通过P2X7R信号导致LPS-BMDCs中的细胞内钙积累。
为了检验胞外积累的ATP通过P2X7R信号促进LPS-BMDCs中IL-1β的产生，我们使用了外源性P2X7R拮抗剂OX-ATP和激动剂Bz-ATP。研究显示联合使用LPS引发和ATP激活受体，可以显著增加BMDCs中IL-1(α和β)的产生。LPS引发加ATP刺激的BMDCs表现出较快的大荧光染料(如噁唑黄)摄取，比单独的LPS引发或ATP刺激的BMDCs中观察到更强的荧光信号。证实噁唑黄的摄取取决于ATP的介导和P2X7R激活。P2X7R的激活需要高浓度的ATP(毫摩尔[mM])。我们测试了CD39内化是否通过控制细胞外ATP代谢，进而激活P2X7R，影响LPS-BMDCs产生IL-1β。在不添加外源ATP的情况下,LPS-BMDCs和LPS-BMDCs/MβCD均产生恒定量的IL-1β，当暴露于不同浓度的ATP时，LPS-BMDCs显示出对ATP的敏感性显着增加，在500μM的浓度下，ATP仅在LPS-BMDCs中显著促进IL-1β的产生，并且需要2.5mM的ATP浓度才能在LPS/MβCD-BMDCs中获得相同的结果。1mM ATP诱导的LPS-BMDCs产生IL-1β几乎完全被P2X7R拮抗剂OX-ATP消除，但不被P2X4R拮抗剂苏拉明消除。ATP+ARL(CD39抑制剂)或Bz-ATP(选择性P2X7R激动剂)显著增加LPS/MβCD-BMDCs IL-1β的产生。这些均表明LPS激活BMDCs中的膜CD39内化，导致细胞外ATP的积累并促进P2X7R激活，促进IL-1β的产生。
不同的TLR配体在BMDCs中诱导膜CD39内化的作用是否不同，我们使用不同的TLR配体或组合处理BMDCs 24小时。除了TLR3配体(polyI：C，10μg/ml)外，所有测试的TLR配体在诱导BMDCs膜CD39内化方面显示出类似的作用，包括TLR1/2配体Pam3csk4(5μg/ml)，TLR2配体PGN-BS(10μg/ml)，TLR4配体LPS(50ng/ml)，TLR7/8配体CL075(1μg/ml)和TLR9配体ODN1585(1μM)。用TLR配体的不同组合(LPS、LPS+Pam3csk4、LPS+Pam3csk4+PGN、LPS+Pam3csk4+PGN+CL075)处理BMDCs，未观察到不同TLR配体的协同效应，表明这些TLR配体可以共享诱导CD39内化的相同途径。
与其他TLR配体相比，LPS被证明具有与其他TLR配体相似的诱导CD39内化的能力，除了TLR3配体polyI：C。除了TLR3之外的所有TLR都是通过MyD88介导的。为了检测TLR配体诱导的BMDCs膜CD39内化是由MyD88途径介导，我们使用了MyD88抑制剂，检测是否可阻断BMDCs中CD39内化。TLR配体[Pam3csk4(5μg/ml)、LPS(50ng/ml)和ODN1585(1μM)]诱导的BMDCs膜CD39内化均可被MyD88抑制剂完全阻断。证实TLR配体诱导的BMDCs膜CD39内化是由MyD88途径介导的。
综上：当LPS处理的BMDCs膜CD39表达显着降低时，这些细胞中的Cd39mRNA和总CD39表达与未处理的BMDC中的水平相同。这些结果表明，LPS诱导的BMDCs膜CD39表达下调可能是由于表面暴露的CD39被内吞所致。为了测试该假设，设计了添加内吞作用抑制剂以阻断CD39内化的实验。测试中包括网格蛋白依赖性或非依赖性途径的胞吞作用抑制剂。LPS处理的BMDCs膜CD39表达的下调几乎完全被添加的胞膜窖介导的内吞抑制剂MβCD阻断。而在LPS处理或未处理的BMDCs中，细胞总CD39表达和Cd39mRNA表达没有差异。充分证明内吞作用导致LPS处理的BMDC中膜CD39下调。
在证实CD39的胞吞作用后，我们需要确定CD39内化是否改变细胞外ATP代谢并诱导BMDCs功能改变。结果显示LPS处理的CD39lowBMDCs引起ATP的长期积累，其激活P2X7R信号传导以诱导细胞内钙积累和IL-1β产生。与其他TLR配体相比，LPS被证明具有与其他TLR配体相似的诱导CD39内化的能力，除TLR3配体polyI：C。除了TLR3之外的所有TLR通过MyD88依赖性途径发挥作用，并且各种TLR配体缺乏协同效应，强烈表明这些TLR配体可以共享诱导CD39内化的相同途径。如所预期的，结果证明了TLR配体通过MyD88依赖性途径诱导BMDCs中的CD39内化。我们的结果表明，在TLR配体处理后，BMDCs中CD39发生内化。这有利于细胞外ATP积聚和P2X7R活化，进而促进IL-1β产生，并可能介导促炎作用。通过操纵CD39内化可能成为控制免疫应答和炎症反应的新策略。

Claims (3)

1. 一种调控小鼠BMDCs的P2X7R活化的方法，其特征在于，所述方法包括使用TLR配体离体处理小鼠BMDCs，促进细胞膜上CD39的内化，减少CD39水解三磷酸腺苷ATP的作用，增加细胞外ATP堆积，激活P2X7R；所述TLR配体选自TLR1/2配体Pam3csk4、TLR2配体PGN-BS、TLR4配体LPS、TLR7/8配体CL075、TLR9配体ODN 1585。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述TLR配体为LPS。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，激活P2X7R能促进BMDCs炎性因子IL-1β的生成和释放。
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