CN110152022A - 降低纳米颗粒引起的急性毒性的络合物、制备方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种降低纳米颗粒引起的急性毒性的络合物、制备方法及应用。该络合物为由纳米颗粒和金属阳离子形成的络合物；其中，纳米颗粒为表面具有羧基的纳米颗粒。本发明的络合物能够有效地降低多羧基纳米药物给药过程中引起的急性副作用，能够改善多羧基的纳米颗粒在体内应用中存在的缺陷，减少药物不良反应，提高药物耐受性。

Description

降低纳米颗粒引起的急性毒性的络合物、制备方法及应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种降低纳米颗粒引起的急性毒性的络合物、制备方法及应用。
背景技术
随着时间进入21世纪，纳米科学技术取得了巨大的研究进展。纳米材料是指至少在一个维度上的尺寸小于100纳米的材料，或者以这种材料为基本结构单位组成的材料。纳米材料具有纳米尺寸效应、表面效应、宏观量子隧穿效应等等，目前越来越多的纳米材料被应用于生物医药领域，如白蛋白复合的紫杉醇制剂、纳米氧化铁的静脉补铁剂、纳米胶体金颗粒和纳米氧化硅材料用于免疫诊断等。
Patrick Couvreur等人在2012年第11期的《化学综述》的第5818至5878页总结性的阐述了当纳米颗粒(主要是磁性纳米颗粒)作为药物应用于体内(尤其是静脉给药)时，颗粒的表面电荷和表面修饰基团是其安全性和有效性的决定因素。这是由于体内的生理环境条件是pH为7.4，盐浓度大约为150毫摩尔羧基/升，而纳米材料的尺寸效应决定了其有超大的比表面积和超高的表面能，如果没有表面基团的修饰，在生理条件下会出现明显的团聚现象，无法发挥纳米颗粒药物本身的药效，同时会影响药物的体内代谢方式，使大部分药物团聚在肺部，引起生理毒性。所以通常的纳米颗粒药物表面会进行修饰，包括各种小分子以及大分子，同时由于体内的生理环境中大部分蛋白带有负电荷，为了保持纳米药物的稳定性，这些表面修饰的纳米药物通常会带有负电基团，包括羟基、羧基、磷酸基，而这些基团又以羧基最为常见，这是因为羧基为体内最为常见的官能团，相对于磷酸基和羟基来说它可以进一步修饰发挥更多的作用，而羧基本身的结构使其和无机纳米材料本身的结合更加牢固。
多聚糖超顺磁氧化铁注射液(Ferumoxytol)于2009年6月30日在美国获准上市，主要用于治疗慢性肾病(CKD)引起的缺铁性贫血。它的主要成份是一种三氧化二铁纳米颗粒，表面被多聚葡萄糖山梨醇羧甲醚层所包覆，含有大量的羧基，纳米颗粒的直径17-31纳米。该表面聚合物的羧基含量为1.2-1.6毫摩尔羧基/克，主要用于减少纳米颗粒在体内给药过程中的免疫原性，同时多羧基的存在能够有效地降低颗粒本身游离铁的含量(游离铁含量的高低与给药后的超敏反应直接相关)。但是在临床应用过程中，该药物引起了明显副作用(过敏、心脏毒性等)，美国食品药品监督局(FDA)在2015年在该药物上标注“黑框”，提示该药物的临床风险。但目前还没有关于如何降低该副作用的报道。
CN201210438840.7、CN201310447554.1、CN201410391019.3公开了一类具有聚丙烯酸球刷结构的纳米颗粒的合成及其在蛋白固定化中的性能，最终应用于免疫分析中。这类颗粒具有多羧基结构，中心为80纳米左右的二氧化硅颗粒，表面为聚丙烯酸(聚合度为75-450不等)修饰，这类结构具有超高的羧基含量，可以实现超高量的蛋白偶联，在免疫分析中起到信号放大的作用。目前这类纳米颗粒在体内诊断中能够有效地提高信噪比(两个数量级)，尤其适用于微量生物信号的检测。与此同时，这类材料在体内诊断微量生物信号，如ctDNA、微量肿瘤细胞等也具有潜在的应用价值。该纳米颗粒的主要成份二氧化硅为可降解材料，美国食品药品监督局(FDA)已批注该材料用于体内应用，所以这类多羧基材料在体内给药安全性也值得关注和研究。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于克服了现有技术中多羧基纳米颗粒临床给药时存在安全性问题等缺陷，提供了一种降低纳米颗粒引起的急性毒性的络合物、制备方法及应用。本发明的络合物能够有效地降低多羧基纳米药物给药过程中引起的急性副作用，能够改善多羧基的纳米颗粒在体内应用中存在的缺陷，减少药物不良反应，提高药物耐受性。
本申请人制备了一种高分子-金属氧化物复合物，该类复合物也同样属于纳米颗粒，表面为多羧基修饰的金属氧化物纳米颗粒。这类纳米颗粒能够有效地降低游离铁含量，同时提供纳米颗粒在体内的循环时间，主要应用于磁共振成像，包括淋巴疾病的诊断、早期肝癌的诊断、心血管疾病的诊断等。但是申请人在动物给药实验过程中发现，这类纳米颗粒在动物实验中会引起动物的急性毒性反应，影响这类产品的体内应用。
本发明是通过下述技术方案来解决上述技术问题。
本发明提供了一种降低纳米颗粒引起的急性毒性的络合物，所述络合物为由纳米颗粒和金属阳离子形成的络合物；其中，所述纳米颗粒为表面具有羧基的纳米颗粒。
本发明中，本领域技术人员知晓，所述纳米颗粒为可用于制备能够注入动物体内的药物制剂或营养物质的纳米颗粒，所述由纳米颗粒引起的急性毒性具体指的是所述纳米颗粒在注入动物体内后引起的急性毒性反应，例如呼吸困难、呆卧少动、四肢无力、兴奋、运动失调、反应迟缓、闭眼犯困等。
本发明中，所述表面具有羧基的纳米颗粒为本领域常规使用的表面具有羧基的纳米颗粒，所述羧基可来源于羧基多糖、聚丙烯酸、聚乳酸和聚氨基酸中的一种或多种，所述纳米颗粒较佳地为多聚糖超顺磁氧化铁、聚丙烯酸二氧化硅颗粒或多羧基氧化铁颗粒。
本发明中，所述表面具有羧基的纳米颗粒的粒径可为常规，例如5-5000nm，较佳地为20-150nm，更佳地为30-140nm，进一步更佳地为50-120nm。
本发明中，较佳地，所述纳米颗粒的表面的羧基与所述金属阳离子的摩尔比为(2：1)-(8：1)，更佳地为(2:1)-(4:1)。
其中，所述多聚糖超顺磁氧化铁市售可得，例如将购自AMAG Pharmaceuticals公司的Ferumoxytol Injection干燥即可；其中，所述干燥的操作和条件可为本领域常规，例如，所述干燥可为冻干，所述冻干的温度较佳地为-10℃～-50℃，所述冻干的时间较佳地为18-36h；又例如，所述干燥可为喷雾干燥，所述喷雾干燥的操作和条件可为常规。
其中，本领域技术人员知晓，所述聚丙烯酸二氧化硅颗粒可为聚丙烯酸修饰的中心为硅核的球刷，较佳地，所述聚丙烯酸球刷可通过专利CN201210438840.7的说明书中第[0009]-[0045]段描述的方法制备得到。
其中，所述多羧基氧化铁颗粒为本领域常规使用的多羧基氧化铁颗粒，例如聚丙烯酸氧化铁颗粒，较佳地，所述聚丙烯酸氧化铁颗粒可通过如下方法获得：
将溶液A与溶液B在200-230℃下反应得到聚丙烯酸氧化铁复合物分子胶体，经后处理干燥即可；
其中，所述溶液A可通过以下步骤获得：将聚丙烯酸和二甘醇混合，之后与三氯化铁混合即可；所述聚丙烯酸、所述二甘醇和所述三氯化铁的用量比为(4-16g)：(480-520mL)：(1-3g)；
其中，所述溶液B可通过以下步骤获得：将二甘醇和氢氧化钠混合即可；所述二甘醇和所述氢氧化钠的用量比为(60-120mL)：(6-12g)。
其中，所述反应的操作和条件为本领域常规的操作和条件，所述反应较佳地在微波反应器中进行，所述反应的时间较佳地为15-60min，更佳地为25-35min，进一步更佳地为30min。较佳地，所述反应采用热注入法，例如，所述反应为将所述溶液B加入所述溶液A中；其中，所述溶液B的温度较佳地为40-90℃，更佳地为50-70℃；所述溶液A的温度较佳地为150-240℃，更佳地为200-230℃，进一步更佳地为220℃；可将所述溶液A置于微波反应器中使其达到150-240℃。
其中，所述三氯化铁可为本领域常规使用的三氯化铁，例如六水合三氯化铁。
其中，所述后处理的操作和条件为本领域常规的后处理的操作和条件，例如，所述后处理的操作为采用超滤将所述聚丙烯酸氧化铁复合物分子胶体中未参与反应的聚合物和溶剂去除即可；其中，所述超滤得到的溶液的导电率较佳地低于100微西门子；其中，本领域技术人员知晓，为得到稳定的聚丙烯酸氧化铁颗粒，还可将所述滤液置于50-90℃的水浴中，之后通入空气进行氧化，直至溶液颜色不再发生变化即可；其中，所述空气较佳地为高纯空气。
其中，所述干燥的操作和条件可为本领域常规，例如，所述干燥可为冻干，所述冻干的温度较佳地为-10℃～-50℃，所述冻干的时间较佳地为18-36h；又例如，所述干燥可为喷雾干燥，所述喷雾干燥的操作和条件可为常规。
其中，所述溶液A的制备过程中，所述聚丙烯酸的分子量可为常规，较佳地为500-50000Da，更佳地为1000Da；所述混合的操作和条件为本领常规，例如，所述混合可通过加热、超声、搅拌使混合均匀。
其中，所述溶液B的制备过程中，所述混合的操作和条件为本领常规，例如，所述混合可通过加热、超声、搅拌使混合均匀。
本发明中，本领域技术人员知晓，所述纳米颗粒还能够以包含所述纳米颗粒的溶液的形式使用，其中，可通过将所述纳米颗粒与注射用水混合即可。
其中，例如，可以使用包含所述多聚糖超顺磁氧化铁的注射剂，其中，所述多聚糖超顺磁氧化铁的注射剂中的铁的质量浓度较佳地为30mg/mL；可以使用包含所述聚丙烯酸二氧化硅颗粒的溶液，其中，包含所述聚丙烯酸二氧化硅颗粒的溶液中的聚丙烯酸二氧化硅颗粒的质量浓度较佳地为10-100mg/mL；可以使用包含所述聚丙烯酸氧化铁颗粒的溶液，其中，包含所述聚丙烯酸氧化铁颗粒的溶液中的铁元素的质量浓度较佳地为1-50mg/mL。
其中，较佳地，所述包含多聚糖超顺磁氧化铁的注射剂为购自AMAG Pharmaceuticals公司的Ferumoxytol Injection。
其中，较佳地，可按照专利CN201210438840.7的说明书中第[0009]-[0045]段描述的方法制备得到包含所述聚丙烯酸二氧化硅颗粒的溶液。
其中，较佳地，可通过如下步骤制备得到包含所述聚丙烯酸氧化铁颗粒的溶液：
将溶液A与溶液B在200℃下反应得到聚丙烯酸氧化铁复合物分子胶体，后处理之后与注射用水混合即可；
其中，所述溶液A可通过以下步骤获得：将聚丙烯酸和二甘醇混合，之后与三氯化铁混合即可；所述聚丙烯酸、所述二甘醇和所述三氯化铁的用量比为(4-16g)：(480-520mL)：(1-3g)；
其中，所述溶液B可通过以下步骤获得：将二甘醇和氢氧化钠混合即可；所述二甘醇和所述氢氧化钠的用量比为(60-120mL)：(6-12g)。
其中，所述反应的操作和条件为本领域常规的操作和条件，所述反应较佳地在微波反应器中进行，所述反应的时间较佳地为15-60min，更佳地为25-35min，进一步更佳地为30min。较佳地，所述反应采用热注入法，例如，所述反应为将所述溶液B加入所述溶液A中；其中，所述溶液B的温度较佳地为40-90℃，更佳地为50-70℃；所述溶液A的温度较佳地为150-240℃，更佳地为200-230℃，进一步更佳地为220℃；可将所述溶液A置于微波反应器中使其达到150-240℃。
其中，所述三氯化铁可为本领域常规使用的三氯化铁，例如六水合三氯化铁。
其中，所述后处理的操作和条件为本领域常规的后处理的操作和条件，例如，所述后处理的操作为采用超滤将所述聚丙烯酸氧化铁复合物分子胶体中未参与反应的聚合物和溶剂去除即可；其中，所述超滤得到的溶液的导电率较佳地低于100微西门子；其中，本领域技术人员知晓，为得到稳定的聚丙烯酸氧化铁颗粒，还可将所述滤液置于50-90℃的水浴中，之后通入空气进行氧化，直至溶液颜色不再发生变化即可；其中，所述空气较佳地为高纯空气。
其中，所述注射用水为本领域常规使用的注射用水，所述注射用水的用量可为常规，较佳地，所述注射用水的使用使包含所述聚丙烯酸氧化铁颗粒的溶液中的铁元素的质量浓度为1-50mg/mL。
其中，所述溶液A的制备过程中，所述聚丙烯酸的分子量可为常规，较佳地为500-50000Da，更佳地为1000Da；所述混合的操作和条件为本领常规，例如，所述混合可通过加热、超声、搅拌使混合均匀。
其中，所述溶液B的制备过程中，所述混合的操作和条件为本领常规，例如，所述混合可通过加热、超声、搅拌使混合均匀。
本发明中，所述金属阳离子为本领常规的能够与羧基发生络合反应的金属阳离子，例如所述金属阳离子可为二价或三价的金属阳离子；较佳地，所述金属阳离子可为钙离子、镁离子、二价铁离子、锌离子和三价铁离子中的一种或多种；在本发明的一个具体实施例中，所述金属阳离子较佳地为钙离子；在本发明的另一个具体实施例中，所述金属阳离子较佳地为钙离子和镁离子。
本发明中，所述金属阳离子可通过常规的形式获得，如所述金属阳离子的氯化物、所述金属阳离子的溴化物或所述金属阳离子的氢氧化物，一般地，例如氯化钙，氯化镁，氯化亚铁等，也可以是包含所述金属阳离子的注射液，例如氯化钙注射液等。
本发明还提供了一种所述络合物的制备方法，其包括下述步骤：将纳米颗粒与金属阳离子进行配伍即可；
其中，所述纳米颗粒的表面的羧基与金属阳离子的摩尔比为10：(1-10)。
其中，所述配伍为本领域技术人员均知的配伍，例如将所述纳米颗粒与包含所述金属阳离子的注射液或者溶液混合。
其中，所述混合的操作和条件可为常规，例如采用超声使所述纳米颗粒与包含所述离子的注射液或者溶液混合均匀，所述超声的时间较佳地为2-3min。
其中，所述纳米颗粒的表面的羧基与所述金属阳离子的摩尔比较佳地为(2：1)-(8：1)。
本发明还提供了一种包含所述络合物的组合物，较佳地，所述组合物中还包含游离的金属阳离子和/或游离的羧基。
本发明中，较佳地，所述组合物可通过以下方法制得：
将纳米颗粒与金属阳离子进行配伍即可；
其中，所述纳米颗粒为表面具有羧基的纳米颗粒；
其中，所述纳米颗粒的表面的羧基与所述金属阳离子的摩尔比为10：(1-20)。
其中，所述表面具有羧基的纳米颗粒为本领域常规使用的表面具有羧基的纳米颗粒，所述羧基可来源于羧基多糖、聚丙烯酸、聚乳酸和聚氨基酸中的一种或多种，所述纳米颗粒较佳地为多聚糖超顺磁氧化铁、聚丙烯酸二氧化硅颗粒或多羧基氧化铁颗粒。
其中，所述多聚糖超顺磁氧化铁市售可得，例如购自AMAG Pharmaceuticals公司的Ferumoxytol Injection。
其中，本领域技术人员知晓，所述聚丙烯酸二氧化硅颗粒可为聚丙烯酸修饰的中心为硅核的球刷，较佳地，所述聚丙烯酸球刷可通过专利CN201210438840.7的说明书中第[0009]-[0045]段描述的方法制备得到。
其中，所述多羧基氧化铁颗粒为本领域常规使用的多羧基氧化铁颗粒，例如聚丙烯酸氧化铁颗粒，较佳地，所述聚丙烯酸氧化铁颗粒可通过如下方法获得：
将溶液A与溶液B在200-230℃下反应得到聚丙烯酸氧化铁复合物分子胶体，经后处理干燥即可；
其中，所述溶液A可通过以下步骤获得：将聚丙烯酸和二甘醇混合，之后与无水三氯化铁混合即可；所述聚丙烯酸、所述二甘醇和所述三氯化铁的用量比为(4-16g)：(480-520mL)：(1-3g)；
其中，所述溶液B可通过以下步骤获得：将二甘醇和氢氧化钠混合即可；所述二甘醇和所述氢氧化钠的用量比为(60-120mL)：(6-12g)。
其中，所述反应的操作和条件为本领域常规的操作和条件，所述反应较佳地在微波反应器中进行，所述反应的时间较佳地为15-60min，更佳地为25-35min，进一步更佳地为30min。较佳地，所述反应采用热注入法，例如，所述反应为将所述溶液B加入所述溶液A中；其中，所述溶液B的温度较佳地为40-90℃，更佳地为50-70℃；所述溶液A的温度较佳地为150-240℃，更佳地为200-230℃，进一步更佳地为220℃；可将所述溶液A置于微波反应器中使其达到150-240℃。
其中，所述三氯化铁可为本领域常规使用的三氯化铁，例如六水合三氯化铁。
其中，所述后处理的操作和条件为本领域常规的后处理的操作和条件，例如，所述后处理的操作为采用超滤将所述聚丙烯酸氧化铁复合物分子胶体中未参与反应的聚合物和溶剂去除即可；其中，所述超滤得到的溶液的导电率较佳地低于100微西门子；其中，本领域技术人员知晓，为得到稳定的聚丙烯酸氧化铁颗粒，还可将所述滤液置于50-90℃的水浴中，之后通入空气进行氧化，直至溶液颜色不再发生变化即可；其中，所述空气较佳地为高纯空气。
其中，所述干燥的操作和条件可为本领域常规，例如，所述干燥可为冻干，所述冻干的温度较佳地为-10℃～-50℃，所述冻干的时间较佳地为18-36h；又例如，所述干燥可为喷雾干燥，所述喷雾干燥的操作和条件可为常规。
其中，所述溶液A的制备过程中，所述聚丙烯酸的分子量可为常规，较佳地为500-50000Da，更佳地为1000Da；所述混合的操作和条件为本领常规，例如，所述混合可通过加热、超声、搅拌使混合均匀。
其中，所述溶液B的制备过程中，所述混合的操作和条件为本领常规，例如，所述混合可通过加热、超声、搅拌使混合均匀。
本发明中，本领域技术人员知晓，所述纳米颗粒还能够以包含所述纳米颗粒的溶液的形式使用，其中，可通过将所述纳米颗粒与注射用水混合即可。
其中，例如，可以使用包含所述多聚糖超顺磁氧化铁的注射剂，其中，所述多聚糖超顺磁氧化铁的注射剂中的铁的质量浓度较佳地为30mg/mL；可以使用包含所述聚丙烯酸二氧化硅颗粒的溶液，其中，包含所述聚丙烯酸二氧化硅颗粒的溶液中的聚丙烯酸二氧化硅颗粒的质量浓度较佳地为10-100mg/mL；可以使用包含所述聚丙烯酸氧化铁颗粒的溶液，其中，包含所述聚丙烯酸氧化铁颗粒的溶液中的铁元素的质量浓度较佳地为1-50mg/mL。
其中，较佳地，所述包含多聚糖超顺磁氧化铁的注射剂为购自AMAG Pharmaceuticals公司的Ferumoxytol Injection。
其中，较佳地，可按照专利CN201210438840.7的说明书中第[0009]-[0045]段描述的方法制备得到包含所述聚丙烯酸二氧化硅颗粒的溶液。
其中，较佳地，可通过如下步骤制备得到包含所述聚丙烯酸氧化铁颗粒的溶液：
将溶液A与溶液B在200℃下反应得到聚丙烯酸氧化铁复合物分子胶体，后处理之后与注射用水混合即可；
其中，所述溶液A可通过以下步骤获得：将聚丙烯酸和二甘醇混合，之后与三氯化铁混合即可；所述聚丙烯酸、所述二甘醇和所述三氯化铁的用量比为(4-16g)：(480-520mL)：(1-3g)；
其中，所述溶液B可通过以下步骤获得：将二甘醇和氢氧化钠混合即可；所述二甘醇和所述氢氧化钠的用量比为(60-120mL)：(6-12g)。
其中，所述反应的操作和条件为本领域常规的操作和条件，所述反应较佳地在微波反应器中进行，所述反应的时间较佳地为15-60min，更佳地为25-35min，进一步更佳地为30min。较佳地，所述反应采用热注入法，例如，所述反应为将所述溶液B加入所述溶液A中；其中，所述溶液B的温度较佳地为40-90℃，更佳地为50-70℃；所述溶液A的温度较佳地为150-240℃，更佳地为200-230℃，进一步更佳地为220℃；可将所述溶液A置于微波反应器中使其达到150-240℃。
其中，所述三氯化铁可为本领域常规使用的三氯化铁，例如六水合三氯化铁。
其中，所述后处理的操作和条件为本领域常规的后处理的操作和条件，例如，所述后处理的操作为采用超滤将所述聚丙烯酸氧化铁复合物分子胶体中未参与反应的聚合物和溶剂去除即可；其中，所述超滤得到的溶液的导电率较佳地低于100微西门子；其中，本领域技术人员知晓，为得到稳定的聚丙烯酸氧化铁颗粒，还可将所述滤液置于50-90℃的水浴中，之后通入空气进行氧化，直至溶液颜色不再发生变化即可；其中，所述空气较佳地为高纯空气。
其中，所述注射用水为本领域常规使用的注射用水，所述注射用水的用量可为常规，较佳地，所述注射用水的使用使包含所述聚丙烯酸氧化铁颗粒的溶液中的铁元素的质量浓度为1-50mg/mL。
其中，所述溶液A的制备过程中，所述聚丙烯酸的分子量可为常规，较佳地为500-50000Da，更佳地为1000Da；所述混合的操作和条件为本领常规，例如，所述混合可通过加热、超声、搅拌使混合均匀。
其中，所述溶液B的制备过程中，所述混合的操作和条件为本领常规，例如，所述混合可通过加热、超声、搅拌使混合均匀。
本发明中，所述表面具有羧基的纳米颗粒的粒径可为常规，例如5-5000nm，较佳地为20-150nm，更佳地为30-140nm，进一步更佳地为50-120nm。
本发明中，较佳地，所述纳米颗粒的表面的羧基与金属阳离子的摩尔比为(2：1)-(8：1)。
本发明中，所述金属阳离子为本领常规的能够与羧基发生络合反应的金属阳离子，例如所述金属阳离子可为二价或三价的金属阳离子；较佳地，所述金属阳离子可为钙离子、镁离子、二价铁离子、锌离子和三价铁离子中的一种或多种；在本发明的一个具体实施例中，所述金属阳离子较佳地为钙离子；在本发明的另一个具体实施例中，所述金属阳离子较佳地为钙离子和镁离子。
本发明中，所述金属阳离子可通过常规的形式获得，如所述金属阳离子的氯化物、所述金属阳离子的溴化物或所述金属阳离子的氢氧化物，一般地，例如氯化钙，氯化镁，氯化亚铁等，也可以是包含所述金属阳离子的注射液，例如氯化钙注射液。
本发明中，所述配伍为本领域技术人员均知的配伍，例如将所述纳米颗粒与包含所述金属阳离子的注射液或者化合物混合。
其中，所述混合的操作和条件可为常规，例如采用超声使所述纳米颗粒与包含所述离子的注射液或者溶液混合均匀，所述超声的时间较佳地为2-3min。
本发明还提供了一种所述络合物在制备用于降低由纳米颗粒引起的急性毒性的药物中的应用。
本发明还提供了一种所述络合物在用于降低纳米颗粒引起的急性毒性中的方法，较佳地，所述方法为用于非治疗或诊断疾病目的的降低纳米颗粒引起的急性毒性的方法。
本发明中，所述方法可为常规的使用方法，例如，将所述络合物经消毒合格后与注射用水混合，配置成注射剂，通过静脉注射或滴注的方式，按照100-300mg/kg的用量注入动物体内，较佳地为150-250mg/kg，更佳地为200mg/kg。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明的积极进步效果在于：
本发明使用的络合物能够有效地降低多羧基纳米药物给药过程中引起的急性副作用，能够改善多羧基的纳米颗粒在体内应用中存在的缺陷，减少药物不良反应，提高药物耐受性。
附图说明
图1为本发明效果实施例1中采用等温滴定量热法(iTC)检测二价钙离子与聚丙烯酸氧化铁颗粒的络合过程。
图2为本发明效果实施例2中实施例1样品的透射电镜图。
图3为本发明效果实施例2中实施例2样品的透射电镜图。
图4为本发明效果实施例3中实施例1、实施例2和对比例1的产品的粒径分布图。
图5为本发明效果实施例5中分别加入实施例1、对比例1和对比例3得到的样品后模拟体液(SBF)中钾离子的变化。
图6为本发明效果实施例5中分别加入实施例1、对比例1和对比例3得到的样品后模拟体液(SBF)中镁离子的变化。
图7为本发明效果实施例5中分别加入实施例1、对比例1和对比例3得到的样品后模拟体液(SBF)中氯离子的变化。
图8为本发明效果实施例5中分别加入实施例1、对比例1和对比例3得到的样品后模拟体液(SBF)中钙离子的变化。
图9为本发明效果实施例6中使用实施例1得到的样品在不同给药剂量下大鼠血液中钙离子浓度的变化，以及使用对比例1得到的样品大鼠血液中钙离子浓度的变化。
图10为本发明效果实施例7中注射对比例1得到的样品前大鼠心脏超声图。
图11为本发明效果实施例7中注射对比例1得到的样品前大鼠的心率。
图12为本发明效果实施例7中注射对比例1得到的样品后10秒大鼠心脏血流的变化。
图13为本发明效果实施例7中注射对比例1得到的样品后30秒大鼠心脏血流的变化。
图14为本发明效果实施例7中注射对比例1得到的样品后1分钟大鼠心脏血流的变化。
图15为本发明效果实施例7中注射对比例1得到的样品后2分钟大鼠心脏血流的变化。
图16为本发明效果实施例7中注射实施例1得到的样品后30秒大鼠心脏血流的变化。
图17为本发明效果实施例7中注射实施例1得到的样品后1分钟大鼠心脏血流的变化。
图18为本发明效果实施例7中注射实施例1得到的样品后2分钟大鼠心脏血流的变化。
图19为本发明效果实施例7中注射实施例1得到的样品后4分钟大鼠心脏血流的变化。
图20为本发明效果实施例7中注射实施例1得到的样品后6分钟大鼠心脏血流的变化。
图21为本发明效果实施例7中注射实施例1得到的样品后1分钟大鼠腹主动脉血流的变化。
图22为本发明效果实施例7中注射实施例1得到的样品后2分钟大鼠腹主动脉血流的变化。
图23为本发明效果实施例7中注射实施例1得到的样品后4分钟大鼠腹主动脉血流的变化。
图24为本发明效果实施例7中注射实施例1得到的样品后6分钟大鼠腹主动脉血流的变化。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。
以下实施例和对比例中，包含聚丙烯酸氧化铁颗粒的溶液和包含聚丙烯酸二氧化硅颗粒的溶液的制备方法如下：
包含聚丙烯酸氧化铁颗粒的溶液的制备：
首先，用量筒量取一缩二乙二醇20mL，再用精密天平称量2g氢氧化钠，通过超声、加热、搅拌使其溶解在一缩二乙二醇中，配成溶液B，溶液B放入70℃烘箱中恒温；其次，称取数均分子量为1000Da的聚丙烯酸6g于烧杯中，再称量500mL一缩二乙二醇于烧杯中，搅拌、超声使二者溶解；快速称量六水合三氯化铁2g，通过加热、超声、搅拌使其溶解在一缩二乙二醇和聚丙烯酸的混合液中，配成溶液A(溶液呈棕色)；最后，溶液A置于三口烧瓶中在微波反应器中200℃恒温20min，然后快速加入热的溶液B，反应瞬间进行，恒温30min。之后进行冷却，得到聚丙烯酸-氧化铁复合物分子胶体，之后超滤将聚丙烯酸氧化铁复合物分子胶体中未参与反应的聚合物和溶剂去除，经检测，超滤后溶液的导电率为64微西门子，然后与注射用水混合，得到包含聚丙烯酸氧化铁颗粒的溶液，铁含量为10mg/mL。
得到的为表面分子量为1000左右的聚丙烯酸修饰的磁性氧化铁纳米颗粒，这类超羧化氧化铁颗粒的水合粒径为30-50nm，与多聚糖超顺磁氧化铁相接近，表面羧基含量为16.0mmol/g铁。
包含聚丙烯酸二氧化硅颗粒的溶液的制备：
按照专利CN201210438840.7的说明书中第[0009]-[0045]段描述的方法，合成聚合度为75的聚丙烯酸修饰的中心为硅核的球刷，浓度为10mg/mL球刷，该球刷的水合粒径为120-140nm，表面羧基含量为2.7mmol/g球刷，之后与注射用水混合，最终得到的二氧化硅纳米颗粒的注射用水的浓度为1-100mg/mL。
以下实施例和对比例中，多聚糖超顺磁氧化铁注射液购自美国AMAGPharmaceuticals的Ferumoxytol Injection，产品规格为30mg/mL，粒径为30-50nm，该表面聚合物的羧基含量为1.4mmol/g铁，按照说明书的使用方法直接进行静脉给药。
实施例1
使用包含聚丙烯酸氧化铁颗粒的溶液，按照羧基含量与钙元素摩尔比为2:1计算，向10mL的包含聚丙烯酸氧化铁颗粒的溶液中加入2.35mL氯化钙注射液(规格10mL，0.5g二水合氯化钙，含有钙元素136mg)，超声2min混合均匀。
取样分析：加入钙离子的聚丙烯酸氧化铁颗粒的粒径为24.00±3.34nm，多分散系数小于0.3，24小时内稳定。
实施例2
使用包含聚丙烯酸氧化铁颗粒的溶液，按照羧基含量与钙元素摩尔比为8:3计算，向10mL的包含聚丙烯酸氧化铁颗粒的溶液中加入1.76mL氯化钙注射液(规格10mL，0.5g二水合氯化钙，含有钙元素136mg)，超声2min混合均匀。
取样分析：加入钙离子后的聚丙烯酸氧化铁颗粒的粒径为25.32±5.21nm，多分散系数小于0.3，24小时内稳定。
实施例3
使用包含聚丙烯酸氧化铁颗粒的溶液，按照羧基含量与钙元素摩尔比为4:1计算，向10mL的包含聚丙烯酸氧化铁颗粒的溶液中加入1.18mL氯化钙注射液(规格10mL，0.5g二水合氯化钙，含有钙元素136mg)，超声2min混合均匀。
取样分析：加入钙离子后的聚丙烯酸氧化铁颗粒的粒径为27.38±4.39nm，多分散系数小于0.3，24小时内稳定。
实施例4
使用包含聚丙烯酸氧化铁颗粒的溶液，按照羧基含量与二价铁离子摩尔比为2:1计算，向10mL的包含聚丙烯酸氧化铁颗粒的溶液中加入101.6mg氯化亚铁，超声2min混合均匀。
取样分析：加入铁离子后的聚丙烯酸氧化铁颗粒的粒径为24.76±3.88nm，多分散系数小于0.3，24小时内稳定。
实施例5
使用包含聚丙烯酸氧化铁颗粒的溶液，按照羧基含量与二价镁离子摩尔比为2:1计算，向10mL的包含聚丙烯酸氧化铁颗粒的溶液中加入76.0mg氯化镁，超声2min中混合均匀。
取样分析：加入镁离子后的聚丙烯酸氧化铁颗粒的粒径为26.56±4.84nm，多分散系数小于0.3，24小时内稳定。
实施例6
使用包含聚丙烯酸氧化铁颗粒的溶液，按照羧基含量与钙离子、二价镁离子摩尔比为4:1:1计算，向10mL的包含聚丙烯酸氧化铁颗粒的溶液中加入44.4mg氯化钙和38.0mg氯化镁，超声2min混合均匀。
取样分析：加入钙离子、镁离子后的聚丙烯酸氧化铁颗粒的粒径为24.53±3.95nm，多分散系数小于0.3，24小时内稳定。
实施例7
使用包含聚丙烯酸氧化铁颗粒的溶液，按照羧基含量与钙离子、二价镁离子摩尔比为8:2:1计算，向10mL的包含聚丙烯酸氧化铁颗粒的溶液中加入44.4mg氯化钙和19.0mg氯化镁，超声2min混合均匀。
取样分析：加入钙离子、镁离子后的聚丙烯酸氧化铁颗粒的粒径为27.19±6.47nm，多分散系数小于0.3，24小时内稳定。
实施例8
使用包含聚丙烯酸氧化铁颗粒的溶液，按照羧基含量与钙离子摩尔比为2:1计算，向10mL的包含聚丙烯酸氧化铁颗粒的溶液中加入15.0mg氯化钙，超声2min混合均匀。
取样分析：加入钙离子后的聚丙烯酸二氧化硅颗粒粒径为120.34±12.54nm，多分散系数小于0.3，24小时内稳定。
实施例9
使用包含聚丙烯酸二氧化硅颗粒的溶液，按照羧基含量与钙离子摩尔比为8:3计算，向10mL的包含聚丙烯酸二氧化硅颗粒的溶液中加入11.3mg氯化钙，超声2min混合均匀。
取样分析：加入钙离子后的聚丙烯酸二氧化硅颗粒粒径为123.17±11.28nm，多分散系数小于0.3，24小时内稳定。
实施例10
使用包含聚丙烯酸二氧化硅颗粒的溶液，按照羧基含量与钙离子摩尔比为4:1计算，向10mL的包含聚丙烯酸二氧化硅颗粒的溶液中加入7.5mg氯化钙，超声2min混合均匀。
取样分析：加入钙离子后的聚丙烯酸二氧化硅颗粒粒径为128.31±13.74nm，多分散系数小于0.3，24小时内稳定。
实施例11
使用多聚糖超顺磁氧化铁注射液，按照羧基含量与钙离子摩尔比为2:1计算，向10mL的多聚糖超顺磁氧化铁注射液中加入23.3mg氯化钙，超声2min混合均匀。
取样分析：与氯化钙配伍之后的多聚糖超顺磁氧化铁的粒径为30.43±1.57nm，多分散系数小于0.3，24小时内稳定。
实施例12
将实施例2的到的样品加入100mL的生理盐水中，摇晃均匀。
取样分析：粒径为27.18±3.82nm，多分散系数小于0.3，24小时内稳定。
对比例1
直接使用如上制备得到的包含聚丙烯酸氧化铁颗粒的溶液。
对比例2
直接使用如上述制备的包含聚丙烯酸二氧化硅颗粒的溶液。
对比例3
直接使用如上所述的多聚糖超顺磁氧化铁注射液。
对比例4
使用实施例8得到的样品，采用静脉注射，450mg/kg小鼠。
对比例5
使用实施例9得到的样品，采用静脉注射，450mg/kg小鼠。
对比例6
使用实施例9得到的样品，采用滴注，450mg/kg小鼠。
对比例7
使用实施例10得到的样品，采用静脉注射，450mg/kg小鼠。
效果实施例1
本效果实施例采用等温滴定量热法(iTC)检测离子络合过程，采用GE公司的MicroCal iTC200来定量测定在制备实施例1过程中二价钙离子与聚丙烯酸氧化铁颗粒的络合过程，其中聚丙烯酸氧化铁颗粒溶液的浓度为1mg/mL，测试在25℃条件下进行，将二价钙离子溶液分20次滴入200uL的聚丙烯酸氧化铁颗粒溶液中，搅拌速率为1000rpm，每次滴入的间隔时间为180s，计算二价钙离子与聚丙烯酸氧化铁颗粒的结合常数(此处的结合常数本领域技术人员知晓可作为表达络合反应的络合常数)，化学计量数等参数。如图1所示，二价钙离子与聚丙烯酸氧化铁颗粒能够快速有效的结合，结合常数为3.94±1.12×104M-1，实施例1可以快速进行络合作用形成稳定的络合物。
效果实施例2
透射电子显微镜(TEM)可以直观观测到颗粒的形貌、尺寸，是一种比较直观的纳米颗粒测试手段。将实施例1和实施例2的样品使用超纯水稀释10倍，用10ul枪吸取10ul样品滴在铜网上，待液滴中的水分挥发干，颗粒就会沉积在铜网上，随后进行TEM测试(JEM-2010，JEOL，日本电子株式会社)。实施例1的透射电镜图如图2(图中标尺为50nm)所示，统计照片中的粒径分布为4.77±0.93nm，实施例2的透射电镜图如图3(图中标尺为100nm)所示，统计照片中的粒径分布为4.68±1.14nm，表明络合对于对比例1的中心氧化铁粒径没有明显的变化。
效果实施例3
将实施例1和实施例2的样品使用超纯水稀释10倍，取20ul样品分散在1mL超纯水中进行动态光散射(DLS)测量，使用仪器为Malvern公司的Nano-ZS。测试前仪器的设置中，选择测试三次，最后结果取三次平均值，样品在25℃下恒温1min。结果如图4所示，实施例1和实施例2的水合粒径分别为24.00±3.34nm和25.32±5.21nm，而对比例1的水合粒径为32.50±4.57nm，结果表明二价钙离子络合之后实施例1和2的颗粒水力学直径降低，能够形成稳定的络合物。
需要说明的是：以下效果实施例4-8中，对比例1中的给药剂量是以铁的质量为基准的，对比例2中的给药剂量是以纳米颗粒的质量为基准的，举例说明，下表对比例1中铁元素占整体纳米材料的重量为10％-30％之间，换算后对比例1以纳米颗粒质量为基准的给药剂量为833-2500mg/mL。
效果实施例4
在前期的急性实验中，我们考察对比例1的大鼠急性毒性，通过静脉给药方式，每个剂量注射10只大鼠，给药剂量在100mg/kg时，大鼠出现明显的毒副作用和死亡现象，主要的毒副作用为：呼吸困难，尿失禁，严重肌张力，四肢无力等现象，10只大鼠共出现6只死亡现象，计算IC50＜100mg/kg。说明对比例1在临床使用过程中，存在一定的安全性风险，安全剂量较低，有潜在的使用隐患。
效果实施例5给药过程中模拟体液离子浓度的变化
取1.3mL模拟体液(SBF)于4mL离心管中，各取450μL(约200mg/kg)对比例1和实施例1加入到SBF中，然后快速取样，每次取样50μL，超滤分离出纳米颗粒并检测SBF中钾离子(图5)、镁离子(图6)、氯离子(图7)和钙离子(图8)成份的变化，测定时间点为1min，3min，5min，1h，12h，24h，每个时间点测定3个重复，记录数据，结果如图5-8。如图所示，对比例1在与SBF混合后，会明显的降低各种离子的浓度，主要为钾离子、镁离子、氯离子以及钙离子。结合对比例1的动物实验数据和临床数据，我们认为二价阳离子(钙离子和镁离子)的降低是引起急性的主要原因，这是由于这两种离子主要调节体内肌肉的运动过程。所以在实施例1中我们通过添加钙离子来减少急性反应，从图上我们可以看出，与对比例相比，实施例1中各组离子水平基本与对照组相一致。
效果实施例6给药过程中大鼠血液中钙离子的变化
24只SD大鼠，清洁级动物，月龄相同，体重200±20g，培养环境温度为20℃，相对湿度45％，昼夜均为12h。在给药之前，先用1％戊巴比妥钠，将大鼠麻醉，注射量为900μL/只，在大鼠麻醉之后，将其固定在木板上，然后利用脱毛膏，将大鼠胸腔位置进行脱毛。不同剂量的实施例1经尾静脉注射给药。注射完5分钟后，利用5mL注射器对大鼠进行心脏取血。将取出的血液转移至真空取血管之中，取完后快速进行4℃离心，3000转离心10分钟，分离出血清，进行血液中钙离子浓度的测定。如图9所示，对比例1进行给药后，仍出现明显的钙离子降低现象，同时大鼠出现明显低钙特征(肌肉无力、尿失禁等)，不同剂量的实施例1在给药后钙离子浓度均有不同程度的提高，同时大鼠均未出现明显的毒副作用，在高剂量组(300mg/kg)中，大鼠出现兴奋等高钙特征，10分钟之后恢复。
效果实施例7给药过程中大鼠心脏血流变化
4只SD大鼠，均为雄性，体重均在180g左右，选用的麻醉剂为1％戊巴比妥钠，每只大鼠注射1mL戊巴比妥钠进行麻醉。尾静脉注射对比例1(100mg/kg)和实施例1(100mg/kg)，将大鼠及固定板放在诊断仪边的床上，在大鼠胸腔上涂抹上超声传导胶，然后将超声探头置于大鼠的心脏位置处，进行超声成像。如图10-15所示，对比例1给药后10秒左右心脏血流迅速受到影响，由图12表明注射之后大鼠心脏的血流立即发生紊乱，绿色、红色、黄色和蓝色箭头分别代表不同的血流方向。由图13表明血流量减少，同时血流速减缓，心肌收缩力下降，表明在5min之内，大鼠死亡(图14和图15)，可以迅速观察到心脏血流方向及流速紊乱的现象，说明对比例1对于大鼠的心脏具有明显的影响。如图16-24所示，在注射实施例1前后，大鼠的心脏血流量以及方向没有明显的影响，但随着时间的增加，心脏血流速出现了一定的下降；而腹主动脉血流速也出现一定下降，随后恢复；其中，图18和22表明注射实施例1后，血流量有一定程度的减少，这是由于大量注射引起的血流降低，腹主动脉晚于心脏出现该现象，与大鼠血流顺序相一致。图19、20、24表明血流已恢复正常水平。总体来说，实施例1对于大鼠的心脏以及腹主动脉的影响十分小。
效果实施例8小鼠急性毒性实验
按照《化学药物急性毒性试验技术指导原则》，每组若干只小鼠，雌雄各半，各组实施例进行尾静脉给药或者生理盐水稀释滴注给药，给药后，观察小鼠活动，记录异常情况。结果如表1所示，通过实验我们发现经过配伍的实施例能够明显的提高耐受剂量，对于对比例1来说，可以将小鼠的最大耐受剂量由低于100mg/kg提高至最少250mg/kg；对于对比例2来说，可以将小鼠的最大耐受剂量由250mg/kg提高到450mg/kg。
需要说明的是，对比例1和对比例2中的副反应为呼吸困难和少动，主要原因为静脉注射引起体内离子浓度的变化，这种变化不可逆(多羧基纳米颗粒与血液中离子结合并被动物的肝脾清除，血液中降低的金属离子不能通过自身代谢补充)，需要通过额外补充金属阳离子才能够消除。对比例4-7中引起的副作用与添加金属离子的饱和程度以及二氧化硅颗粒中其他成分相关，未饱和的对比例同样会引起离子浓度的降低。
而实施例1-7和实施例11与12中的急性副反应在注射5分钟之后消除，动物体自身的离子通道代谢平衡而得到恢复。
表1小鼠急性毒性实验统计表
虽然以上描述了本发明的具体实施方式，但是本领域的技术人员应当理解，这仅是举例说明，本发明的保护范围是由所附权利要求书限定的。本领域的技术人员在不背离本发明的原理和实质的前提下，可以对这些实施方式做出多种变更或修改，但这些变更和修改均落入本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种降低纳米颗粒引起的急性毒性的络合物，其特征在于，所述络合物为由纳米颗粒和金属阳离子形成的络合物；其中，所述纳米颗粒为表面具有羧基的纳米颗粒。
2.如权利要求1所述的络合物，其特征在于，所述纳米颗粒为多聚糖超顺磁氧化铁、聚丙烯酸二氧化硅颗粒或多羧基氧化铁颗粒；
所述纳米颗粒的粒径为5-5000nm，较佳地为20-150nm，更佳地为30-140nm，进一步更佳地为50-120nm；
所述纳米颗粒的表面的羧基与所述金属阳离子的摩尔比为(2：1)-(8：1)，较佳地为(2:1)-(4:1)；
所述金属阳离子为二价的金属阳离子或三价的金属阳离子；
所述金属阳离子为钙离子、镁离子、二价铁离子、锌离子和三价铁离子中的一种或多种；
所述金属阳离子以所述金属阳离子的氯化物、所述金属阳离子的溴化物、所述金属阳离子的氢氧化物或包含所述金属阳离子的注射液的形式使用；
和/或，所述金属阳离子以氯化钙，氯化镁，氯化亚铁或氯化钙注射液的形式使用。
3.如权利要求2所述的络合物，其特征在于，所述聚丙烯酸氧化铁颗粒通过如下方法获得：
将溶液A与溶液B在200-230℃下反应得到聚丙烯酸氧化铁复合物分子胶体，经后处理干燥即可；
其中，所述溶液A通过以下步骤获得：将聚丙烯酸和二甘醇混合，之后与三氯化铁混合即可；所述聚丙烯酸、所述二甘醇和所述三氯化铁的用量比为(4-16g)：(480-520mL)：(1-3g)；
其中，所述溶液B通过以下步骤获得：将二甘醇和氢氧化钠混合即可；所述二甘醇和所述氢氧化钠的用量比为(60-120mL)：(6-12g)。
4.如权利要求3所述的络合物，其特征在于，所述反应在微波反应器中进行；
所述反应的时间为15-60min，较佳地为25-35min，更佳地为30min；
所述反应的操作为将所述溶液B加入所述溶液A中；
所述溶液B的温度为40-90℃，较佳地为50-70℃；
所述溶液A的温度为150-240℃，较佳地为200-230℃，更佳地为220℃；
所述后处理的操作为采用超滤将所述聚丙烯酸氧化铁复合物分子胶体中未参与反应的聚合物和溶剂去除即可；
所述干燥为冻干；
和/或，所述聚丙烯酸的分子量为500-50000Da，较佳地为1000Da。
5.如权利要求4所述的络合物，其特征在于，所述超滤得到的溶液的导电率低于100微西门子；
所述冻干的温度为-10℃～-50℃；
和/或，所述冻干的时间为18-36h。
6.一种如权利要求1-5中任一项所述的络合物的制备方法，其特征在于，其包括下述步骤：将所述纳米颗粒与所述金属阳离子进行配伍即可；
其中，所述纳米颗粒的表面的羧基与所述金属阳离子的摩尔比为10：(1-10)。
7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述纳米颗粒以包含所述纳米颗粒的溶液的形式使用，较佳地，所述纳米颗粒的溶液通过将所述纳米颗粒与注射用水混合得到；
所述配伍为将所述纳米颗粒与所述金属阳离子混合，较佳地，所述混合采用超声进行，所述超声的时间为2-3min；
和/或，所述纳米颗粒的表面的羧基与所述金属阳离子的摩尔比为(2：1)-(8：1)。
8.一种包含如权利要求1-5中任一项所述的络合物的组合物，其特征在于，所述组合物中还包含游离的金属阳离子和/或游离的羧基。
9.一种如权利要求1所述的络合物在制备用于降低由纳米颗粒引起的急性毒性的药物中的应用。
10.一种如权利要求1所述的络合物在用于非治疗或诊断疾病目的的降低纳米颗粒引起的急性毒性的方法。
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