CN110144362A

CN110144362A - 一种砷响应荧光素酶报告载体及其构建方法和应用

Info

Publication number: CN110144362A
Application number: CN201910351158.6A
Authority: CN
Inventors: 李先强; 陈杏娟; 许玫英
Original assignee: Guangdong Detection Center of Microbiology of Guangdong Institute of Microbiology
Current assignee: Guangdong Detection Center of Microbiology of Guangdong Institute of Microbiology
Priority date: 2019-04-28
Filing date: 2019-04-28
Publication date: 2019-08-20
Anticipated expiration: 2039-04-28
Also published as: CN110144362B

Abstract

本发明公开了一种砷响应荧光素酶报告载体及其构建方法和应用。本发明的砷响应荧光素酶报告载体，其核苷酸序列为SEQ ID NO.10所示。本发明发现sECBS‑CS12m可以像ECBS‑CS一样与ArsR较强结合，但是对砷的响应比ECBS‑CS好很多，用sECBS‑CS12m来取代pECBS‑AFBS报告载体中的ECBS‑AFBS序列，构建得到报告载体psECBS‑CS12m，发现psECBS‑CS12m对砷介导的荧光素酶基因转录诱导显著优于pECBS‑AFBS和pECBS‑CS。本发明还提供了创新策略以构建更好的报告载体，这有利于研发更敏感的、通过诱导报告基因表达来监控环境砷的生物传感器。

Description

一种砷响应荧光素酶报告载体及其构建方法和应用

技术领域：

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种砷响应荧光素酶报告载体及其构建方法和应用。

背景技术：

转录因子(TF)与其靶DNA结合序列之间的相互作用在基因转录调控中至关重要。每个真核TF都可以与染色体DNA上的一组相似DNA序列而非单个DNA序列结合。碱基组成决定了DNA序列对TF的结合亲和性，这可以通过靶序列的比对分析而获知。统计学上简单的位置权重矩阵(PWM)模型通常被用来计算保守的碱基结合序列。在保守序列内，某些碱基对与TF的相互作用是保守的，而其他碱基对则可以更加灵活并且在DNA与TF的相互作用中没有那么重要。与TF相互作用的各个碱基对的贡献由其保守性来评估。此外，保守结合序列还可以通过一些体外方法诸如ChIP-seq或SELEX等由TF特异结合的一组DNA片段或寡核苷酸来确定。然而，目前仍有超过40％的TF未知其靶结合序列。在原核细胞大肠杆菌中，大多数TF都与染色体DNA的单一位点结合，比如砷转录抑制因子(ArsR)。ArsR是一个与其操作子/启动子(O/P)序列结合的金属调控转录抑制因子。然而，由于在微生物染色体中存在大量的ArsR结合序列，通过PWM模型对这些结合序列进行比对分析也可以鉴定出其保守的结合序列或结合域。

尽管PWM法可以广泛地用于鉴定TF的DNA结合序列，但是最近也有研究表明这种基于各个保守碱基对在蛋白质相互作用的独立贡献的模型已经不足以解释各种复杂的基因转录调控，比如对蛋白-DNA调控至关重要的相关二核苷酸或三核苷酸、来自保守序列低亲和结合位点的显著差异、与TF形成多蛋白复合物的新DNA结合特异性以及保守序列上下游对结合亲和性的影响等。这些因素以及真核细胞中TF辅因子的相互作用都使得TF-DNA识别变得复杂化。在本研究中，我们采用了更加简单的原核ArsR调控系统来评估TF与靶DNA序列之间的识别作用。

ArsR属于Smt/ArsR家族蛋白，是一种通过与砷响应操纵子相互作用来控制砷抗性相关基因表达的调控蛋白。ArsR结合防止RNA聚合酶在无砷化合物的情况下与靶基因的O/P序列相互作用。ArsR一旦发生砷结合以后，ArsR蛋白即与启动子分离，随后激活砷抗性相关基因的表达。在质粒R773和大肠杆菌(E.coli)染色体中的ArsR蛋白已有较多研究。这两种ArsR蛋白质都是二聚体，在其靶DNA结合域起点处均含有Cys32-Val-Cys-Asp-Leu-Cys的砷结合序列。来自嗜酸氧化亚铁硫杆菌(Acidithiobacillusferrooxidans)的ArsR在该起点并没有砷结合序列，相反，它们的半胱氨酸残基位于第95、96和102位氨基酸残基处。Smt/ArsR家族蛋白以及A.ferrooxidans的ArsR蛋白的结合特性和保守序列均已阐明得非常清楚。

在先前的研究中，我们构建了两种砷报告载体pLHPars9和pLLPars9(砷报告载体pLHPars9和pLLPars9公开于专利号201780001826.1，发明名称：一类亚砷酸盐抑制因子报告基因质粒及其构建方法和应用中)，其分别是高拷贝数和低拷贝数的质粒。我们在质粒R773的ArsR操纵子下游添加了常见的ArsR-荧光素酶融合元件，在操纵子上游添加了两个拷贝分别来自E.coli染色体的ArsR靶DNA结合序列(ECBS)和A.ferrooxidans染色体的ArsR靶DNA结合序列(AFBS)。这两个报告载体都对亚砷酸盐高度敏感，最低检出限为0.04μM亚砷酸盐(～5μg/L)，两种报告载体对金属的特异性不同，pLLPars9对亚砷酸盐较为特异，而pLHPars9则对亚砷酸盐和锑酸盐较为特异。pLLPars9与pLHPars9的唯一区别在于它们质粒的拷贝数不同。

发明内容：

本发明的目的在于克服现有技术中砷检测中的不足，提供一种砷响应荧光素酶报告载体及其构建方法和应用。

在本研究中，我们构建了一系列报告载体，分别包含两个拷贝不同来源的ArsR靶DNA结合序列。我们发现，pLLPars9质粒(在本发明中重命名为pECBS-AFBS)内的结合序列ECBS-AFBS(其核苷酸序列为CACATTCGTTAAGTCATATATGTTTTTGACTT-TTT-ATCCACGAATATTTCTTGCA，如SEQ ID NO.1所示)中的AFBS部分(其核苷酸序列为ATCCACGAATATTTCTTGCA，如SEQ ID NO.2所示)可被聚球藻smt2/1的结合序列(即smt2/1BS，其核苷酸序列为gctaAACACATGAACAGTTATTCAGATATTcaaa，如SEQ ID NO.3所示)或arsRBC的结合序列(即arsRBCBS，其核苷酸序列为tgtgATTAATCATATGCGTTTTTGGTTATGtgtt，如SEQ ID NO.4所示)所取代，在砷处理下没有丧失荧光素酶基因的显著转录诱导，而ECBS部分(其核苷酸序列为CACATTCGTTAAGTCATATATGTTTTTGACTT，如SEQ ID NO.5所示)被smt2/1BS或arsRBCBS取代则会导致荧光素酶基因转录诱导的剧烈降低。此外，AFBS部分也可以被衍生自arsRBCBS保守序列的某些碱基替换取代。通过在第二结合序列的非保守性碱基对位置替换不同碱基从而形成一系列探针，我们测试了这些探针与ArsR蛋白的相互作用，结果发现这些探针与ArsR蛋白的相互作用存在显著差异。有些非保守碱基对会像保守碱基对一样需要与ArsR相互作用，而有些非保守碱基对也会影响ArsR蛋白结合后的功能。我们发现sECBS-CS12m可以像ECBS-CS一样与ArsR较强结合，但是sECBS-CS12m对砷的响应比ECBS-CS好很多。并证明了psECBS-CS12m对砷介导的荧光素酶基因转录诱导显著优于pECBS-AFBS和pECBS-CS。

因此，本发明的第一个目的是提供一种砷响应荧光素酶报告载体psECBS-CS12m，所述的砷响应荧光素酶报告载体psECBS-CS12m，其核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。

本发明的第二个目的是提供所述的砷响应荧光素酶报告载体psECBS-CS12m的构建方法，包括以下步骤：在体外合成如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的DNA序列，退火生成含有XbaI和HindIII粘端的双链片段，将报告载体pLLPars9用XbaI和HindIII双酶切，得到含有XbaI和HindIII粘端的线性载体，将含有XbaI和HindIII粘端的双链片段和线性载体连接，获得砷响应荧光素酶报告载体psECBS-CS12m。

本发明的第三个目的是提供所述的砷响应荧光素酶报告载体psECBS-CS12m在砷盐检测中的应用。

所述的砷盐优选为亚砷酸盐。进一步优选为亚砷酸钠。

本发明的第四个目的是提供所述的砷响应荧光素酶报告载体psECBS-CS12m在制备砷盐检测全细胞传感器中的应用。

本发明的第五个目的是提供一种砷盐检测全细胞传感器，所述的砷盐检测全细胞传感器为含有所述的砷响应荧光素酶报告载体psECBS-CS12m的基因工程菌。

所述的基因工程菌优选为大肠杆菌DH5α。

本发明发现sECBS-CS12m可以像ECBS-CS一样与ArsR较强结合，但是对砷的响应比ECBS-CS好很多，用sECBS-CS12m来取代pECBS-AFBS报告载体中的ECBS-AFBS序列，构建得到报告载体psECBS-CS12m，并转化大肠杆菌DH5α，研究了psECBS-CS12m对砷响应的荧光素酶基因转录作用，发现psECBS-CS12m对砷介导的荧光素酶基因转录诱导显著优于pECBS-AFBS和pECBS-CS。本发明还提供了创新策略以构建更好的报告载体，这有利于研发更敏感的、通过诱导报告基因表达来监控环境砷的生物传感器。

附图说明：

图1为含有两个结合序列的不同组合的报告载体的荧光素酶活性分析；其中，A为报告载体pECBS-AFBS和pAFBS-ECBS分别转化E.coli DH5α以后，使用或不用10μM亚砷酸钠处理1小时，测定无砷处理细胞(空白)与砷处理细胞(灰色)的荧光素酶活性；B为报告载体pECBS-AFBS、pAFBS-ECBS、pECBS-smt2/1BS、pECBS-arsRBCBS、psmt2/1BS-AFBS和parsRBCBS-AFBS分别转化E.coli DH5α以后，使用或不用10μM亚砷酸钠处理1小时，测定无砷处理细胞及其砷处理细胞之间的荧光素酶活性比值；C为ArsR结合核心部分序列和CS的序列，下划线核苷酸为非保守碱基对位置；D为报告载体pECBS-AFBS、pECBS-CS、pCS-AFBS、pAFBS-CS和parsRBCBS-CS分别转化E.coli DH5α以后，使用或不用10μM亚砷酸钠处理1小时，测定无砷处理细胞及其砷处理细胞之间的荧光素酶活性比值。

图2为用EMSA比较ArsR蛋白与不同DNA序列的结合情况；A为探针ECBS-AFBS与报告载体pECBS-AFBS转化E.coli DH5α后的细胞裂解物作用的EMSA以及探针AFBS-ECBS与报告载体pAFBS-ECBS转化E.coli DH5α后的细胞裂解物作用的EMSA比较，B为探针ECBS-CS与报告载体pECBS-CS转化E.coli DH5α后的细胞裂解物作用的EMSA以及探针CS-ECBS与报告载体pCS-ECBS转化E.coli DH5α后的细胞裂解物作用的EMSA比较；其中1为生物素标记探针，2为无砷处理细胞裂解物，3为砷处理细胞裂解物(10μM亚砷酸钠处理1小时)。

图3为ECBS和CS之间的3Ts接头对砷处理去除阻遏蛋白的影响；A为报告载体pECBS-CS和pECBS-CS(-3T)分别转化E.coli DH5α细胞后，使用或不用10μM亚砷酸钠处理1小时，测定无砷处理细胞(空白)与砷处理细胞(灰色)的荧光素酶活性；B为报告载体pECBS-CS和pECBS-CS(-3T)分别转化E.coli DH5α细胞后，使用或不用10μM亚砷酸钠处理1小时，测定无砷处理细胞及其砷处理细胞之间的荧光素酶活性比值；C为探针ECBS-CS与报告载体pECBS-CS转化E.coli DH5α后的细胞裂解物作用的EMSA以及探针ECBS-CS(-3T)与报告载体pECBS-CS(-3T)转化E.coli DH5α后的细胞裂解物作用的EMSA比较，其中1为生物素标记探针，2为无砷处理细胞裂解物，3为砷处理细胞裂解物(10μM亚砷酸钠处理1小时)。

图4为滤膜板测定法；A为滤膜测定法的流程图，包括3个步骤：探针与细胞裂解物混合、混合物加至基于NC的过滤板、分析结合了蛋白的探针；B为报告载体转化E.coli DH5α以后，使用或不用10μM亚砷酸钠处理1小时，制得细胞裂解物，滤膜板测定探针ECBS-AFBS与报告载体pECBS-AFBS转化E.coli DH5α后的细胞裂解物的结合、探针AFBS-ECBS与报告载体pAFBS-ECBS转化E.coli DH5α后的细胞裂解物的结合、探针ECBS-CS与报告载体pECBS-CS转化E.coli DH5α后的细胞裂解物的结合、探针CS-ECBS与报告载体pCS-ECBS转化E.coli DH5α后的细胞裂解物的结合以及探针ECBS-CS(-3T)与报告载体pECBS-CS(-3T)转化E.coliDH5α后的细胞裂解物的结合；C为报告载体pECBS-AFBS转化E.coli DH5α以后，使用10μM亚砷酸钠处理1小时，制得细胞裂解物，连续2倍稀释后与ECBS-AFBS探针混合，分别用EMSA和滤膜板测定法分析混合物。

图5为对在非保守碱基对处进行替换的探针的滤膜板测定与荧光素酶活性分析；A为在非保守碱基对处进行替换的探针的列表；B为报告载体转化E.coli DH5α以后，使用或不用10μM亚砷酸钠处理1小时，制得细胞裂解物，通过滤膜板测定法测定细胞裂解物与转化的报告载体对应探针的结合强度，其中探针ECBS-AFBS对应报告载体pECBS-AFBS，探针ECBS-CS对应报告载体pECBS-CS，探针ECBS-arsRBCBS对应报告载体pECBS-arsRBCBS，探针ECBS-smt2/1BS对应报告载体pECBS-smt2/1BS，探针sECBS-CS1m对应报告载体psECBS-CS1m，探针sECBS-CS2m对应报告载体psECBS-CS2m，探针sECBS-CS3m对应报告载体psECBS-CS3m，探针sECBS-CS4m对应报告载体psECBS-CS4m，探针sECBS-CS5m对应报告载体psECBS-CS5m，探针sECBS-CS6m对应报告载体psECBS-CS6m，探针sECBS-CS7m对应报告载体psECBS-CS7m，探针sECBS-CS8m对应报告载体psECBS-CS8m，探针sECBS-CS9m对应报告载体psECBS-CS9m，探针sECBS-CS10m对应报告载体psECBS-CS10m，探针sECBS-CS11m对应报告载体psECBS-CS11m，探针sECBS-CS12m对应报告载体psECBS-CS12m，探针sECBS-CS13m对应报告载体psECBS-CS13m，探针sECBS-CS14m对应报告载体psECBS-CS14m，探针sECBS-CS15m对应报告载体psECBS-CS15m，探针sECBS-CS16m对应报告载体psECBS-CS16m；C为报告载体转化E.coli DH5α以后，使用或不用10μM亚砷酸钠处理1小时，制得细胞裂解物，通过滤膜板测定法测定探针与对应报告载体转化E.coli DH5α后的无砷处理细胞裂解物及其砷处理细胞裂解物结合的比值，其中探针ECBS-AFBS对应报告载体pECBS-AFBS，探针ECBS-CS对应报告载体pECBS-CS，探针ECBS-arsRBCBS对应报告载体pECBS-arsRBCBS，探针ECBS-smt2/1BS对应报告载体pECBS-smt2/1BS，探针sECBS-CS1m对应报告载体psECBS-CS1m，探针sECBS-CS2m对应报告载体psECBS-CS2m，探针sECBS-CS3m对应报告载体psECBS-CS3m，探针sECBS-CS4m对应报告载体psECBS-CS4m，探针sECBS-CS5m对应报告载体psECBS-CS5m，探针sECBS-CS6m对应报告载体psECBS-CS6m，探针sECBS-CS7m对应报告载体psECBS-CS7m，探针sECBS-CS8m对应报告载体psECBS-CS8m，探针sECBS-CS9m对应报告载体psECBS-CS9m，探针sECBS-CS10m对应报告载体psECBS-CS10m，探针sECBS-CS11m对应报告载体psECBS-CS11m，探针sECBS-CS12m对应报告载体psECBS-CS12m，探针sECBS-CS13m对应报告载体psECBS-CS13m，探针sECBS-CS14m对应报告载体psECBS-CS14m，探针sECBS-CS15m对应报告载体psECBS-CS15m，探针sECBS-CS16m对应报告载体psECBS-CS16m。

图6为sECBS-CS9m、sECBS-CS12m和sECBS-CS15m的EMSA分析以及具有相应结合序列的报告载体的荧光素酶活性分析；A为探针sECBS-CS9m、sECBS-CS12m和sECBS-CS15m分别与报告载体psECBS-CS9m、psECBS-CS12m和psECBS-CS转化E.coli DH5α后的无砷处理细胞和砷处理细胞裂解物混合并进行EMSA分析，其中1为生物素标记探针，2为无砷处理细胞裂解物，3为砷处理细胞裂解物(10μM亚砷酸钠处理1小时)；B为报告载体psECBS-CS9m、psECBS-CS12m和psECBS-CS15m分别转化E.coli DH5α细胞以后，使用或不用10μM亚砷酸钠处理1小时，测定无砷处理细胞(空白)与砷处理细胞(灰色)的荧光素酶活性；C为报告载体pECBS-CS、pECBS-AFBS和psECBS-CS12m分别转化E.coli DH5α细胞以后，用10μM亚砷酸钠处理15分钟、30分钟、60分钟和120分钟，测定砷处理细胞的荧光素酶活性。

具体实施方式：

以下是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1：

1材料与方法

1.1质粒构建

通过修饰pLLPars9(在本研究中重命名为pECBS-AFBS，其核苷酸序列如SEQ IDNO.6所示)的结合序列，构建了一系列结合序列顺序和来源不同的报告载体。首先在体外合成正义和反义链DNA序列，并退火生成含有XbaI和HindIII粘端的双链片段，然后把双链片段克隆至pLLPars9的XbaI和HindIII位点以取代ECBS-AFBS(其核苷酸序列为CACATTCGTTA AGTCATATATGTTTTTGACTT-TTT-ATCCACGAATATTTCTTGCA，如SEQ ID NO.1所示)，从而获得了不同序列结构的报告载体pAFBS-ECBS、pECBS-smt2/1BS、pECBS-arsRBCBS、psmt2/1BS-AFBS、parsRBCBS-AFBS、pCS-AFBS、parsRBCBS-CS、pAFBS-CS、pECBS-CS、pECBS-CS(-3T)、psECBS-CS9m、psECBS-CS12m和psECBS-CS15m。

以报告载体psECBS-CS12m为例，具体构建方法为：体外合成正义链(其核苷酸序列为：CTAGAATTCGTTAAGTCATATATGTTTTTGACTT-TTT-TACAGTCAAATAGCTATTTGACTGTAGTATTGAA，如SEQ ID NO.7所示，加粗部分为XbaI和HindIII粘端)和反义链(AGCTTTCAATACTACAGTCAA ATAGCTATTTGACTGTA-AAA-AAGTCAAAAACATATATGACTTAACGAATT，如SEQ ID NO.8所示，加粗部分为XbaI和HindIII粘端)，退火生成含有XbaI和HindIII粘端的双链片段，将报告载体pLLPars9用XbaI和HindIII双酶切，得到含有XbaI和HindIII粘端的线性载体，将含有XbaI和HindIII粘端的双链片段与线性载体连接，将连接产物转化大肠杆菌E.coli DH5α感受态细胞，涂布于含有25μg/mL氯霉素的LB平板上过夜培养，挑取阳性克隆，测序验证了sECBS-CS12m(其核苷酸序列为ttcgTTAAGTCATATATGTTTTTGACTT-TTT-TACAGTCAAATAGCTATTTGACTGTA，如SEQ ID NO.9所示)取代了pLLPars9载体上的ECBS-AFBS(其核苷酸序列为CACATTCGTTAAGTCATATATGTTTTTGACTT-TTT-ATCCACGAATATTTCTTGCA，如 SEQ ID NO.1所示)，获得报告载体psECBS-CS12m(其核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示)。

用上述方法分别构建报告载体pAFBS-ECBS(AFBS-ECBS(其核苷酸序列为ATCCACGAATATTTCTTGCA-TTT-CACATTCGTTAAGTCATATATGTTTTTGACTT，如SEQ ID NO.11所示)取代了pLLPars9载体上的ECBS-AFBS)、pECBS-smt2/1BS(ECBS-smt2/1BS(其核苷酸序列为CACATTCGTTAAGTCATATATGTTTTTGACTT-TTT-GCTAAACACATGAACAGTTATTCAGATATTCAAA，如SEQID NO.12所示)取代了pLLPars9载体上的ECBS-AFBS)、pECBS-arsRBCBS(ECBS-arsRBCBS(其核苷酸序列为CACATTCGTTAAGTCATATATGTTTTTGACTT-TTT-TGTGATTAATCATATGCGTTTTTGGTT ATGTGTT，如SEQ ID NO.13所示)取代了pLLPars9载体上的ECBS-AFBS)、psmt2/1BS-AFBS(smt2/1BS-AFBS(其核苷酸序列为GCTAAACACATGAACAGTTATTCAGATATTCAAA-TTT-ATCCACGAATATTTCTTGCA，如SEQ ID NO.14所示)取代了pLLPars9载体上的ECBS-AFBS)、parsRBCBS-AFBS(arsRBCBS-AFBS(其核苷酸序列为TGTGATTAATCATATGCGTTTTTGGTTATGTG TT-TTT-ATCCACGAATATTTCTTGCA，如SEQ ID NO.15所示)取代了pLLPars9载体上的ECBS-AFBS)、pCS-AFBS(CS-AFBS(其核苷酸序列为TAAAATCAAATACGTATTTGATTATA-TTT-ATCCACGAATATTTCTTGCA，如SEQ ID NO.16所示)取代了pLLPars9载体上的ECBS-AFBS)、parsRBCBS-CS(arsRBCBS-CS(其核苷酸序列为TGTGATTAATCATATGCGTTTTTGGTTATGTGTT-TTT-TAAAATCAAATACGTATTTGATTATA，如SEQ ID NO.17所示)取代了pLLPars9载体上的ECBS-AFBS)、pAFBS-CS(AFBS-CS(其核苷酸序列为ATCCACGAATATTTCTTGCA-TTT-TAAAATCAAATACGTATTTGATTATA，如SEQ ID NO.18所示)取代了pLLPars9载体上的ECBS-AFBS)、pECBS-CS(ECBS-CS(其核苷酸序列为CACATTCGTTAAGTCATATATGTTTTTGACTT-TTT-TAAAATCAAATACGTATTTGATTATA，如SEQ ID NO.19所示)取代了pLLPars9载体上的ECBS-AFBS)、pECBS-CS(-3T)(ECBS-CS(-3T)(其核苷酸序列为CACATTCGTTAAGTCATATATGTTTTTGA CTT-TAAAATCAAATACGTATTTGATTATA，如SEQ ID NO.20所示)取代了pLLPars9载体上的ECBS-AFBS)、psECBS-CS9m(sECBS-CS9m(其核苷酸序列为TTCGTTAAGTCATATATGTTTTTGACTT-TTT-TACAATCAAATAGCTATTTGATTGTA，如SEQ ID NO.21所示)取代了pLLPars9载体上的ECBS-AFBS)和psECBS-CS15m(sECBS-CS15m(其核苷酸序列为TTCGTTAAGTCATATATGTTTTTGACTT-TTT-TAGACTCAAATAGCTATTTGAGTCTA，如SEQ ID NO.22所示)取代了ECBS-AFBS)。

1.2荧光素酶活性测定法

将含有报告载体的E.coli DH5α涂布到含有25μg/mL氯霉素的LB平板上，37℃培养16h，挑取单菌落接种于含有25μg/mL氯霉素的2mL LB培养基中37℃振荡培养12小时，得到过夜培养物。将过夜培养物置于100mL预热且新鲜制备的含25μg/mL氯霉素的LB培养基中稀释50倍。稀释的细胞在37℃下再额外培养3小时，直到O.D.达到0.5。在37℃下使用或不用10μM亚砷酸钠(AsIII)处理细胞60分钟，得到细胞培养物。取20μL处理后的细胞培养物与50μL荧光素酶底物混合，在化学发光仪(Veritas)上测定荧光素酶的活性。

1.3制备细胞裂解物

将使用或不用亚砷酸钠处理的1mL细胞培养物在10,000rpm下离心1分钟，细胞沉淀物重悬于300μL裂解缓冲液(10mM Tris-HCl，pH 8.0，0.1MNaCl，1mM EDTA和0.1％[w/v]TRITON X-100)中。加入7.5μL新鲜制备的溶菌酶溶液(溶菌酶溶液的配制方法：将溶菌酶溶于pH8.010mM Tris-HCl中，得到溶菌酶浓度为10mg/mL的溶菌酶溶液；将溶菌酶溶液加入到含有细胞沉淀物的裂解缓冲液后，溶菌酶的终浓度为0.25mg/mL)，并通过轻拍试管使之充分混合，得到裂解混合物，裂解混合物在室温下培养10分钟。离心后，上清液(即细胞裂解物)用于电泳迁移变化测定(EMSA)或滤膜板测定。

1.4电泳迁移变化测定(EMSA)

将3μg细胞裂解物与2μL 5×结合缓冲液和1μLpoly d((I-C)混合，加ddH₂O补足至9μL，并在冰上培养5分钟。将1μL生物素标记探针加入上述混合物中并于22℃培养30分钟。在0.5×TBE中使用6.5％的非变性聚丙烯酰胺凝胶在4℃、100V条件下电泳大约50-60分钟。随后凝胶转移至NB膜上，添加15mL封闭缓冲液后在室温条件下封闭20分钟，用链霉亲和素-HRP和化学发光底物(用鲁米诺增加化学发光，Pierce)检测印记上的生物素标记探针。用成像仪获取图像。

1.5滤膜板测定法

将2μL细胞裂解物与10μL 2×结合缓冲混合物(40mM HEPES、20mM硫酸铵、2mMDTT、20mM KCl和0.4％Tween-20，余量为水，pH7.6)、1μL生物素标记探针(DNA双链探针)和7μLddH₂O混合形成结合反应体系。在室温(25℃)下培养30分钟后，得到蛋白-探针复合物，然后将结合反应体系加到用清洗缓冲液(100mM Tris-HCl、2.5mM EDTA和0.1％Tween-20，余量为水，pH7.6)预先清洗的滤膜测定板(硝酸纤维素膜(NC)基的96孔板)上，在冰上培养20分钟，使蛋白-探针复合物结合到硝酸纤维素膜上，然后倒置600g离心2分钟。弃去流出液，用清洗缓冲液(100mM Tris-HCl、2.5mM EDTA和0.1％Tween-20，余量为水，pH7.6)清洗滤膜测定板。加入2μL洗脱缓冲液(0.5％SDS、100mM Tris-HCl、2.5mM EDTA和0.1％Tween-20，余量为水，pH7.6)，使结合到硝酸纤维素膜上的蛋白-探针复合物中的蛋白质变性，释放出结合的DNA双链探针，收集释放的DNA双链探针。在杂交前将收集的DNA双链探针于95℃加热3分钟，使DNA双链探针变性。通过以下方式进行杂交：在预结合有DNA双链探针正义链互补序列的硝酸纤维素膜基的96孔板(杂交板)中，加入18μL杂交缓冲液(40mM HEPES、20mM硫酸铵、20mM KCl和0.4％Tween-20，余量为水，pH7.6)，添加2μL经过加热变性的DNA双链探针，在42℃杂交12小时后，用清洗缓冲液(100mM Tris-HCl，pH7.6，2.5mM EDTA和0.1％Tween-20)清洗杂交板。添加20μL辣根过氧化物酶(HRP)标记的链霉亲和素，37℃孵育30分钟后，用清洗缓冲液(100mM Tris-HCl，pH7.6，2.5mM EDTA和0.1％Tween-20)清洗杂交板。加入20μL HRP的化学发光底物鲁米诺Luminol，然后用化学发光仪读取光子数，以相对光单位(RLUs)记录发光情况。

2结果

2.1含有ECBS和任意其他ArsR结合序列的启动子具有较高的砷响应转录诱导作用

在先前的研究中，我们发现含有两个拷贝数的ArsR结合序列(BS)(一个来自E.coli(EC)染色体DNA的ArsR结合序列(ECBS)，另一个来自A.ferrooxidans(AF)染色体DNA的ArsR结合序列(AFBS))的荧光素酶报告载体pLLPars9(在本研究中命名为pECBS-AFBS)显示出比仅含有一个拷贝数或两个相同拷贝数的ECBS或AFBS的报告载体对砷处理具有更好的响应。在本研究中，我们交换了ECBS和AFBS的位置，生成了pAFBS-ECBS报告载体。在报告载体转化至大肠杆菌DH5α后，对pECBS-AFBS和pAFBS-ECBS的荧光素酶活性进行测定和比较(图1A)，结果发现与用pECBS-AFBS形成的9倍转录诱导作用相比，pAFBS-ECBS砷处理细胞的荧光素酶基因转录诱导活性仅是未处理对照细胞的2倍(图1B)。与pECBS-AFBS相比，pAFBS-ECBS的砷响应转录诱导的倍数减少了70％以上。该结果表明，这两个结合序列的顺序在报告载体响应砷的过程中至关重要。

此外，我们用smt2/1的结合序列(smt2/1BS)或arsRBC的结合序列(arsRBCBS)取代了ECBS-AFBS内的AFBS部分，从而形成报告载体pECBS-smt2/1BS和pECBS-arsRBCBS，并比较了它们的转化细胞在有无砷处理条件下的荧光素酶活性。如图1B所示，pECBS-smt2/1BS和pECBS-arsRBCBS的砷响应转录诱导的作用轻微降低，比pECBS-AFBS减少了大约15-25％的诱导倍数。这表明，第二位置处的AFBS对砷响应转录诱导并非至关重要，可以被其他ArsR结合序列替代。当用smt2/1的结合序列(smt2/1BS)或arsRBC的结合序列(arsRBCBS)取代ECBS-AFBS内的ECBS从而形成了报告载体psmt2/1BS-AFBS和parsRBCBS-AFBS时，我们发现有无砷处理下报告载体的荧光素酶活性比显著降低，与pECBS-AFBS相比减少了大约70％，如图1B所示。这表明了ECBS需要作为第一结合序列以获得对砷有较好的响应性。

根据arsRBC和cadCA的保守序列，我们设计了结合序列CS(结合序列CS的核苷酸序列为：TAAAATCAAATACGTATTTGATTATA，如SEQ ID NO.23所示，图1C)并替换了AFBS或ECBS部分，从而分别构建了pECBS-CS(将报告载体pLLPars9上的ECBS-AFBS替换成了ECBS-CS(其核苷酸序列为CACATTCGTTAAGTCATATATGTTTTTGACTT-TTT-TAAAATCAAATACGTATTTGATTATA，如SEQ ID NO.19所示)和pCS-AFBS(将报告载体pLLPars9上的ECBS-AFBS替换成了CS-AFBS(其核苷酸序列为TAAAATCAAATACGTATTTGATTATA-TTT-ATCCACGAATATTTCTTGCA，如SEQ IDNO.16所示)。荧光素酶活性测定显示出pECBS-CS与pECBS-AFBS相比在对砷的响应中无显著差异。然而，pCS-AFBS则显示出了显著变化(图1D)。此外，当我们用arsRBCBS或AFBS取代ECBS-CS中的ECBS来构建parsRBCBS-CS(将报告载体pLLPars9上的ECBS-AFBS替换成了arsRBCBS-CS(其核苷酸序列为TGTGATTAATCATATGCGTTTTTGGTTATGTGTT-TTT-TAAAATCAAATACGTATTTGATTATA，如SEQ ID NO.17所示)和pAFBS-CS(将报告载体pLLPars9上的ECBS-AFBS替换成了AFBS-CS(其核苷酸序列为ATCCACGAATATTTCTTGCA-TTT-TAAAATCAAATACGTATTTGATTATA，如SEQ ID NO.18所示)时，像上文所示的任意在第一位置处不含ECBS的其他报告载体一样，它们的砷响应转录诱导作用显著降低。这些带有CS的报告载体的结果表明ECBS必须是第一结合序列。

2.2砷无法从AFBS-ECBS和CS-ECBS探针中去除阻遏蛋白ArsR

为了检验ECBS-AFBS(其核苷酸序列为：CACATTCGTTAAGTCATATATGTTTTTGACTT-TTT-ATCCACGAATATTTCTTGCA，如SEQ ID NO.1所示)与AFBS-ECBS(其核苷酸序列为：ATCCACGAATATTTCTTGCA-TTT-CACATTCGTTAAGTCATATATGTTTTTGACTT，如SEQ ID NO.11所示)在ArsR蛋白结合中是否存在任何差异，我们进行了EMSA实验。将生物素标记探针ECBS-AFBS(ECBS-AFBS探针的正义链为：5’-CACATTCGTTAAGTCATATATGTTTTTGACTT-TTT-ATCCACGAATATTTCTTGCA-3’(如SEQ ID NO.1所示)，反义链为：5’-TGCAAGAAATATTCGTGGATAAAAAGTCAAAAACATATATGACTTAACGAATGTG-3’(如SEQ ID NO.24所示)；正义链的5’端标记有生物素)与转化了报告载体pECBS-AFBS的大肠杆菌DH5α细胞的使用或不用砷处理的细胞裂解物混合；将生物素标记探针AFBS-ECBS(AFBS-ECBS探针的正义链为：5’-ATCCACGAATATTTCTTGCA-TTT-CACATTCGTTAAGTCATATATGTTTTTGACTT-3’(如SEQ ID NO.11所示)，反义链为：5’-AAGTCAAAAACATATATGACTTAACGAATGTGAAATGCAAGAAATATTCGTGGAT-3’(如SEQ ID NO.25所示)；正义链的5’端标记有生物素)与转化了报告载体pAFBS-ECBS的大肠杆菌DH5α细胞的使用或不用砷处理的细胞裂解物混合。如之前所报道，在对照细胞裂解物(不用砷处理)中，用ECBS-AFBS探针观察到了探针的两条位移带，在砷处理细胞裂解物中探针位移带的强度显著降低(图2A)，表明砷处理会导致ECBS-AFBS探针与结合ArsR阻遏蛋白之间的相互作用降低。然而，当利用AFBS-ECBS探针来进行EMSA实验时，我们发现砷处理细胞裂解物与未处理对照细胞裂解物之间的探针位移带的数量和强度均无差异。这表明，砷处理无法从AFBS-ECBS探针中去除阻遏蛋白。

接下来，我们用EMSA实验比较了ECBS-CS探针(ECBS-CS探针的正义链为：5’-CACA TTCGTTAAGTCATATATGTTTTTGACTT-TTT-TAAAATCAAATACGTATTTGATTATA-3’(如SEQ ID NO.19所示)，反义链为：5’-TATAATCAAATACGTATTTGATTTTAAAAAAGTCAAAAACATATATGACTTAACGAATGTG-3’(如SEQ ID NO.26所示)；正义链的5’端标记有生物素)与CS-ECBS探针(CS-ECBS探针的正义链为：5’-TAAAATCAAATACGTATTTGATTATA-TTT-CACATTCGTTAAGTCATATATGTTTTTGAC TT-3’(如SEQ ID NO.27所示)，反义链为：5’-AAGTCAAAAACATATATGACTTAACGAATGTGAAATATAATCAAATACGTATTTGATTTTA-3’(如SEQ ID NO.28所示)；正义链的5’端标记有生物素)。结果发现ECBS-CS探针显示出了对照细胞裂解物中有两条位移带，砷处理细胞裂解物中的探针位移带的强度则非常弱(图2B)。但是CS-ECBS探针的对照细胞和砷处理细胞裂解物之间的探针位移带的强度却无显著差异。该结果与AFBS-ECBS探针一致，表明砷处理无法从CS-ECBS探针中去除阻遏蛋白。

2.3砷处理去除阻遏蛋白需要ECBS和CS之间的3Ts接头

3Ts接头位于ECBS和CS之间，为了检验其是否有必要，我们从pECBS-CS中去除了3Ts接头，从而形成了pECBS-CS(-3T)报告载体(将报告载体pLLPars9上的ECBS-AFBS替换成了ECBS-CS(-3T)(其核苷酸序列为CACATTCGTTAAGTCATATATGTTTTTGACTT-TAAAATCAAATACGTATTTGATTATA，如SEQ ID NO.20所示)。使用或不用亚砷酸钠处理pECBS-CS(-3T)转化细胞后，测定砷响应的荧光素酶转录诱导活性。结果发现与未处理的对照细胞相比，砷处理的pECBS-CS转化细胞的荧光素酶活性没有显著降低；然而，砷处理的pECBS-CS(-3T)细胞中却观察到了这种荧光素酶活性的显著降低(图3A)。该结果表明砷介导的荧光素酶基因转录诱导需要ECBS和CS之间的3Ts接头。

此外，为了检验没有3Ts接头是否会影响二聚体阻遏蛋白ArsR与结合序列结合的空间位阻或者影响阻遏蛋白从结合序列中去除，我们用ECBS-CS探针(ECBS-CS探针的正义链为：5’-CACATTCGTTAAGTCATATATGTTTTTGACTT-TTT-TAAAATCAAATACGTATTTGATTATA-3’(如SEQ ID NO.19所示)，反义链为：5’-TATAATCAAATACGTATTTGATTTTAAAAAAGTCAAAAACATATATGACTTAACGAATGTG-3’(如SEQ ID NO.26所示)；正义链的5’端标记有生物素)和ECBS-CS(-3T)探针(ECBS-CS(-3T)探针的正义链为：5’-CACATTCGTTAAGTCATATATGTTTTTGACTT-TAAAATCAAATACGTATTTGATTATA-3’(如SEQ ID NO.20所示)，反义链为：5’-TATAATCAAATACGTATTTGATTTTAAAGTCAAAAACATATATGACTTAACGAATGTG-3’(如SEQ ID NO.29所示)；正义链的5’端标记有生物素)进行了EMSA实验。结果如图3B所示，采用ECBS-CS探针的结果显示了对照细胞裂解物中存在与ECBS-AFBS探针一样的两条位移带，但在砷处理细胞裂解物中探针位移带明显减少。没有3Ts接头的ECBS-CS(-3T)探针在对照细胞和砷处理细胞裂解物中都存在两条探针位移带，这表明没有3Ts接头不会干扰阻遏蛋白与结合序列的结合也不存在空间位阻。但是该结果也表明没有3Ts接头会妨碍砷处理从结合序列中去除阻遏蛋白。

2.4用滤膜板测定法快速分析DNA结合序列

尽管pECBS-arsRBCBS和pECBS-CS含有相同的保守序列，但它们对砷处理的响应具有显著的中等差异。我们假设这种差异只能由第二结合序列的非保守碱基对的贡献引起。为了明确非保守碱基对在序列结合和砷响应荧光素酶基因转录诱导中的贡献，我们仅在ECBS-arsRBCBS第二结合序列进行非保守碱基对的替换，从而构建了一系列探针和报告载体。根据arsRBCBS的保守序列，仅有4个碱基对是非保守性的。当我们对这4个碱基对的不同组合进行调查时，需要一系列探针进行测试。

EMSA通常用于监控蛋白质/DNA的相互作用。由于通量较低，在样本量较大的情况下，EMSA分析可能会比较费时。为此我们研发了快速的过滤结合分析法(滤膜板测定法)，该方法能够同时有效地监控若干探针与其结合蛋白的相互作用(测定流程图如图4A所示)。在该测定中，将探针分别与亚砷酸钠处理与否的E.coli细胞裂解物混合培养后，将混合物加至硝酸纤维素膜(NC)基的96孔板上。只有结合了蛋白质的探针才能够停留在板上，游离的探针在离心作用下从NC膜96孔板上滤过。清洗96孔板后再用SDS处理使结合在板上的蛋白质变性，探针即从结合的变性蛋白质中释放出来。收集这些探针与预结合有互补序列的板进行杂交，再用链霉亲和素和化学发光底物进一步监控发光情况。

为了检验滤膜板测定的可行性，我们采用了探针ECBS-AFBS、AFBS-ECBS、ECBS-CS、CS-ECBS和ECBS-CS(-3T)，并将它们分别与砷处理和未处理的细胞裂解物混合。在用滤膜板测定前先用EMSA验证含有探针的细胞裂解混合物。滤膜板测定表明ECBS-AFBS探针与未经砷处理的细胞裂解物的结合远比与经砷处理的细胞裂解物的结合更强，探针与对照细胞和砷处理细胞裂解物的结合强度比大约为5：1(图4B)。AFBS-ECBS探针与对照细胞和砷处理细胞裂解物的结合均较强，且在这两种结合中没有观察到明显差异。用ECBS-CS探针的结果与ECBS-AFBS探针相似，探针与对照细胞和砷处理细胞裂解物的结合比大约为3：1。此外，ECBS-CS(-3T)和CS-ECBS探针都显示出与两种不同细胞裂解物的结合无差异(图4B)。用滤膜板测定的这些结果与EMSA测定结果一致。而滤膜板测定与EMSA测定的唯一区别在于它不能像EMSA一样呈现出两个明显的探针位移带。

接下来，我们采用两种测定方法对转化了报告载体pECBS-AFBS的大肠杆菌DH5α细胞的使用或不用砷处理的细胞裂解物连续2倍稀释后与ECBS-AFBS探针混合。如图4C所示，EMSA能在1:16稀释的细胞裂解物中检测到探针，而滤膜板测定则可以在1:64稀释的细胞裂解物中检测到探针，这表明滤膜板测定的灵敏性是EMSA的4倍。因此，滤膜板测定法能够快速有效地分析若干探针与靶蛋白的结合。

2.5采用滤膜板测定法鉴定在蛋白结合中至关重要的非保守碱基对

原始E.coli ArsR结合序列ECBS为CACA TTCG TT AA GT CA TA TA(TG)TT TT TGAC TT(如SEQ ID NO.5所示)。根据与其他ArsR结合序列的比较发现5’端处的8个碱基对可能与砷介导的基因转录诱导无关。为了减少寡核苷酸合成的成本，我们去除了5’端处的4个碱基对，使ECBS变成TTCG TT AA GT CA TA TA(TG)TT TT TG AC TT(sECBS，如SEQ IDNO.30所示)。采用去除4个碱基的短序列sECBS取代ECBS来构建报告载体psECBS-AFBS，功能分析显示psECBS-AFBS和pECBS-AFBS两者无差异(数据未示出)。

通过对arsRBC、cadCA、smtS2/S1、smtS4/S3、ziaA、czrAB和nmtA的O/P序列之中的ArsR结合序列进行比对获得了ArsR的核心结合序列(其核苷酸序列为：TAXAXTCAAATAXXTATTTGAXTXTA，下划线碱基对为非保守碱基对，图1C)，在4个非保守碱基对之中，有2个碱基对位于反向重复区TAxAxTCAAAta xx taTTTGaxTxTA的每一侧。为了调查这些非保守碱基对在ArsR结合中的贡献，我们系统地在重复区的左侧位置设计了不同的核苷酸(TA、TT、TC、TG、AA、AT、AC、AG、CA、CT、CC、CG、GA、GT、GC和GG)，在重复区的右侧生成相应的互补核苷酸，分别构建序列sECBS-CS1m(其核苷酸序列为TTCGTTAAGTCATATATGTTTTTGACTT-TTT-TATAATCAAATAGCTATTTGATTATA，如SEQ ID NO.31所示)、sECBS-CS2m(其核苷酸序列为TTCGTTAAGTCATATATGTTTTTGACTT-TTT-TATATTCAAATAGCTATTTGAATATA，如SEQ ID NO.32所示)、sECBS-CS3m(其核苷酸序列为TTCGTTAAGTCATATATGTTTTTGACTT-TTT-TATACTCAAATAGCTATTTGAGTATA，如SEQ ID NO.33所示)、sECBS-CS4m(其核苷酸序列为TTCGTTAAGTCATATATGTTTTTGACTT-TTT-TATAGTCAAATAGCTATTTGACTATA，如SEQ ID NO.34所示)、sECBS-CS5m(其核苷酸序列为TTCGTTAAGTCATATATGTTTTTGACTT-TTT-TAAAATCAAATAGCTATTTGATTTTA，如SEQ ID NO.35所示)、sECBS-CS6m(其核苷酸序列为TTCGTTAAGTCATATATGTTTTTGACTT-TTT-TAAATTCAAATAGCTATTTGAATTTA，如SEQ ID NO.36所示)、sECBS-CS7m(其核苷酸序列为TTCGTTAAGTCATATATGTTTTTGACTT-TTT-TAAACTCAAATAGCTATTTGAGTTTA，如SEQ ID NO.37所示)、sECBS-CS8m(其核苷酸序列为TTCGTTAAGTCATATATGTTTTTGACTT-TTT-TAAAGTCAAATAGCTATTTGACTTTA，如SEQ ID NO.38所示)、sECBS-CS9m(其核苷酸序列为TTCGTTAAGTCATATATGTTTTTGACTT-TTT-TACAATCAAATAGCTATTTGATTGTA，如SEQ ID NO.21所示)、sECBS-CS10m(其核苷酸序列为TTCGTTAAGTCATATATGTTTTTGACTT-TTT-TACATTCAAATAGCTATTTGAATGTA，如SEQ ID NO.39所示)、sECBS-CS11m(其核苷酸序列为TTCGTTAAGTCATATATGTTTTTGACTT-TTT-TACACTCAAATAGCTATTTGAGTGTA，如SEQ ID NO.40所示)、sECBS-CS12m(其核苷酸序列为TTCGTTAAGTCATATATGTTTTTGACTT-TTT-TACAGTCAAATAGCTATTTGACTGTA，如SEQ ID NO.9所示)、sECBS-CS13m(其核苷酸序列为TTCGTTAAGTCATATATGTTTTTGACTT-TTT-TAGAATCAAATAGCTATTTGATTCTA，如SEQ ID NO.41所示)、sECBS-CS14m(其核苷酸序列为TTCGTTAAGTCATATATGTTTTTGACTT-TTT-TAGATTCAAATAGCTATTTGAATCTA，如SEQ ID NO.42所示)、sECBS-CS15m(其核苷酸序列为TTCGTTAAGTCATATATGTTTTTGACTT-TTT-TAGACTCAAATAGCTATTTGAGTCTA，如SEQ ID NO.22所示)和sECBS-CS16m(其核苷酸序列为TTCGTTAAGTCATATATGTTTTTGACTT-TTT-TAGAGTCAAATAGCTATTTGACTCTA，如SEQ ID NO.43所示)，如图5A所示。我们构建了一系列探针，sECBS-CS1m探针(sECBS-CS1m探针的正义链为：5’-TTCGTTAAGTCATATATGTTTTTGACTT-TTT-TATAATCAAATAGCTATTTGATTATA-3’(如SEQ IDNO.31所示)，反义链为：5’-TATAATCAAATAGCTATTTGATTATAAAAAAGTCAAAAACATATATGACTTAACGAA-3’(如SEQ ID NO.44所示)；正义链的5’端标记有生物素)、sECBS-CS2m探针(sECBS-CS2m探针的正义链为：5’-TTCGTTAAGTCATATATGTTTTTGACTT-TTT-TATATTCAAATAGCTATTTGAATATA-3’(如SEQ ID NO.32所示)，反义链为：5’-TATATTCAAATAGCTATTTGAATATAAAAAAGTCAAAAACATATATGACTTAACGAA-3’(如SEQ ID NO.45所示)；正义链的5’端标记有生物素)、sECBS-CS3m探针(sECBS-CS3m探针的正义链为：5’-TTCGTTAAGTCATATATGTTTTTGACTT-TTT-TATACTCAAATAGCTATTTGAGTATA-3’(如SEQ ID NO.33所示)，反义链为：5’-TATACTCAAATAGCTATTTGAGTATAAAAAAGTCAAAAACATATATGACTTAACGAA-3’(如SEQ ID NO.46所示)；正义链的5’端标记有生物素)、sECBS-CS4m探针(sECBS-CS4m探针的正义链为：5’-TTCGTTAAGTCATATATGTTTTTGACTT-TTT-TATAGTCAAATAGCTATTTGACTATA-3’(如SEQ ID NO.34所示)，反义链为：5’-TATAGTCAAATAGCTATTTGACTATAAAAAAGTCAAAAACATATATGACTTAACGAA-3’(如SEQ ID NO.47所示)；正义链的5’端标记有生物素)、sECBS-CS5m探针(sECBS-CS5m探针的正义链为：5’-TTCGTTAAGTCATATATGTTTTTGACTT-TTT-TAAAATCAAATAGCTATTTGATTTTA-3’(如SEQ ID NO.35所示)，反义链为：5’-TAAAATCAAATAGCTATTTGATTTTAAAAAAGTCAAAAACATATATGACTTAACGAA-3’(如SEQ ID NO.48所示)；正义链的5’端标记有生物素)、sECBS-CS6m探针(sECBS-CS6m探针的正义链为：5’-TTCGTTAAGTCATATATGTTTTTGACTT-TTT-TAAATTCAAATAGCTATTTGAATTTA-3’(如SEQ ID NO.36所示)，反义链为：5’-TAAATTCAAATAGCTATTTGAATTTAAAAAAGTCAAAAACATATATGACTTAACGAA-3’(如SEQ ID NO.49所示)；正义链的5’端标记有生物素)、sECBS-CS7m探针(sECBS-CS7m探针的正义链为：5’-TTCGTTAAGTCATATATGTTTTTGACTT-TTT-TAAACTCAAATAGCTATTTGAGTTTA-3’(如SEQ ID NO.37所示)，反义链为：5’-TAAACTCAAATAGCTATTTGAGTTTAAAAAAGTCAAAAACATATATGACTTAACGAA-3’(如SEQ ID NO.50所示)；正义链的5’端标记有生物素)、sECBS-CS8m探针(sECBS-CS8m探针的正义链为：5’-TTCGTTAAGTCATATATGTTTTTGACTT-TTT-TAAAGTCAAATAGCTATTTGACTTTA-3’(如SEQ ID NO.38所示)，反义链为：5’-TAAAGTCAAATAGCTATTTGACTTTAAAAAAGTCAAAAACATATATGACTTAACGAA-3’(如SEQ ID NO.51所示)；正义链的5’端标记有生物素)、sECBS-CS9m探针(sECBS-CS9m探针的正义链为：5’-TTCGTTAAGTCATATATGTTTTTGACTT-TTT-TACAATCAAATAGCTATTTGATTGTA-3’(如SEQ ID NO.21所示)，反义链为：5’-TACAATCAAATAGCTATTTGATTGTAAAAAAGTCAAAAACATATATGACTTAACGAA-3’(如SEQ ID NO.52所示)；正义链的5’端标记有生物素)、sECBS-CS10m探针(sECBS-CS10m探针的正义链为：5’-TTCGTTAAGTCATATATGTTTTTGACTT-TTT-TACATTCAAATAGCTATTTGAATGTA-3’(如SEQ ID NO.39所示)，反义链为：5’-TACATTCAAATAGCTATTTGAATGTAAAAAAGTCAAAAACATATATGACTTAACGAA-3’(如SEQ ID NO.53所示)；正义链的5’端标记有生物素)、sECBS-CS11m探针(sECBS-CS11m探针的正义链为：5’-TTCGTTAAGTCATATATGTTTTTGACTT-TTT-TACACTCAAATAGCTATTTGAGTGTA-3’(如SEQ ID NO.40所示)，反义链为：5’-TACACTCAAATAGCTATTTGAGTGTAAAAAAGTCAAAAACATATATGACTTAACGAA-3’(如SEQ ID NO.54所示)；正义链的5’端标记有生物素)、sECBS-CS12m探针(sECBS-CS12m探针的正义链为：5’-TTCGTTAAGTCATATATGTTTTTGACTT-TTT-TACAGTCAAATAGCTATTTGACTGTA-3’(如SEQ ID NO.9所示)，反义链为：5’-TACAGTCAAATAGCTATTTGACTGTAAAAAAGTCAAAAACATATATGACTTAACGAA-3’(如SEQ ID NO.55所示)；正义链的5’端标记有生物素)、sECBS-CS13m探针(sECBS-CS13m探针的正义链为：5’-TTCGTTAAGTCATATATGTTTTTGACTT-TTT-TAGAATCAAATAGCTATTTGATTCTA-3’(如SEQ ID NO.41所示)，反义链为：5’-TAGAATCAAATAGCTATTTGATTCTAAAAAAGTCAAAAACATATATGACTTAACGAA-3’(如SEQ ID NO.56所示)；正义链的5’端标记有生物素)、sECBS-CS14m探针(sECBS-CS14m探针的正义链为：5’-TTCGTTAAGTCATATATGTTTTTGACTT-TTT-TAGATTCAAATAGCTATTTGAATCTA-3’(如SEQ ID NO.42所示)，反义链为：5’-TAGATTCAAATAGCTATTTGAATCTAAAAAAGTCAAAAACATATATGACTTAACGAA-3’(如SEQ ID NO.57所示)；正义链的5’端标记有生物素)、sECBS-CS15m探针(sECBS-CS15m探针的正义链为：5’-TTCGTTAAGTCATATATGTTTTTGACTT-TTT-TAGACTCAAATAGCTATTTGAGTCTA-3’(如SEQ ID NO.22所示)，反义链为：5’-TAGACTCAAATAGCTATTTGAGTCTAAAAAAGTCAAAAACATATATGACTTAACGAA-3’(如SEQ ID NO.58所示)；正义链的5’端标记有生物素)和sECBS-CS16m探针(sECBS-CS16m探针的正义链为：5’-TTCGTTAAGTCATATATGTTTTTGACTT-TTT-TAGAGTCAAATAGCTATTTGACTCTA-3’(如SEQ ID NO.43所示)，反义链为：5’-TAGAGTCAAATAGCTATTTGACTCTAAAAAAGTCAAAAACATATATGACTTAACGAA-3’(如SEQ ID NO.59所示)；正义链的5’端标记有生物素)。采用生物素标记的这些探针与砷处理与否的E.Coli DH5α的细胞裂解物混合后进行滤膜板测定。如图5B所示，探针sECBS-CS9m和sECBS-CS10m远比探针ECBS-AFBS、ECBS-arsRBCBS、ECBS-smt2/1BS或ECBS-CS与砷处理与否的细胞裂解物结合都要强，而另一探针sECBS-CS15m比探针ECBS-AFBS、ECBS-arsRBCBS、ECBS-smt2/1BS或ECBS-CS与砷处理与否的细胞裂解物结合都要弱。因此，非保守碱基对能改变序列和ArsR的结合亲和性。此外，我们还发现有一个探针sECBS-CS12m在对照细胞裂解物中与蛋白质强烈结合，而在砷处理细胞裂解物中与蛋白质的结合较弱，该探针与砷处理与否的细胞裂解物结合时的差异比任何其他探针都大(图5C)。

2.6非保守核苷酸对在ArsR蛋白结合和荧光素酶基因转录诱导中的贡献

根据滤膜板测定的结果，我们选择了三种探针，即结合最强的sECBS-CS9m探针、结合最弱的sECBS-CS15m探针和荧光素酶基因转录诱导作用最高的sECBS-CS12m探针，来进行EMSA分析。如图6A所示，EMSA中位移带的强度相当于滤膜测定中的结合强度，sECBS-CS9m探针最强，sECBS-CS15m探针最弱。在对照细胞和砷处理细胞裂解物之间sECBS-CS12m探针位移带结合强度的差异最大。这些结果再次证明了非保守碱基对的变化可以导致ArsR蛋白结合的差异。而且，非保守碱基对的变化可以增强砷处理对ArsR结合蛋白的去除，这种功能超出了结合本身。

为了调查少数结合序列的对砷响应的荧光素酶基因转录诱导的作用，我们用序列sECBS-CS12m、sECBS-CS9m和sECBS-CS15m来取代pECBS-AFBS报告载体中的ECBS-AFBS序列，以便构建psECBS-CS12m(其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，将报告载体pLLPars9上的ECBS-AFBS替换成了sECBS-CS12m)、psECBS-CS9m(将报告载体pLLPars9上的ECBS-AFBS替换成了sECBS-CS9m)和psECBS-CS15m(将报告载体pLLPars9上的ECBS-AFBS替换成了sECBS-CS15m)报告载体。如预期，psECBS-CS12m对砷响应的荧光素酶基因转录诱导作用优于其他两个报告载体psECBS-CS9m和psECBS-CS15m(图6B)。此外，我们将psECBS-CS12m与pECBS-AFBS和pECBS-CS进行了比较。报告载体转化的大肠杆菌细胞用10μM亚砷酸钠处理15、30、60和120分钟。如图6C所示，psECBS-CS12m对砷介导的荧光素酶基因转录诱导显著优于pECBS-AFBS和pECBS-CS。

3讨论

除了S2/S1和S4/S3的smt操纵子具有两个反向重复区以外，金属诱导的操纵子一般含有一个12-2-12结构的反向重复区。每个重复区被一个ArsR同源二聚体占据。在我们先前的砷响应报告载体的研究中，我们设计了像smt操纵子一样的两个结合序列ECBS-AFBS，并且发现其在砷处理下的荧光素酶基因的转录诱导比单一结合序列在砷处理下的荧光素酶基因转录诱导要强。我们还发现用这两个不同的结合序列对砷响应的基因转录诱导优于两个ECBS或两个AFBS的相同序列的诱导。在本研究中，我们发现ECBS必须位于第一结合序列的位置，如果ECBS被诸如smt2/1BS或arsRBCBS的其他结合序列取代，则其对砷响应的基因转录诱导作用显著降低。此外，在第二结合序列位置处的AFBS可被其它结合序列取代，但诱导作用不被显著影响。这表明强的基因转录诱导作用需要这两个结合序列排列在合适的顺序。由于两个结合序列分别与两个二聚体结合，因此通过二聚体-二聚体相互作用可以稳定蛋白-DNA复合物。这两个结合序列的顺序改变以后，即AFBS-ECBS，两个二聚体之间仍然可以结合，但该顺序有可能会影响砷与阻遏蛋白的相互作用或影响阻遏蛋白从结合序列中去除。

目前蛋白质-DNA识别作用比人们原来认识的更为复杂。采用简单的PWM模型可以分析DNA序列中的一个结合部分。但是最近的研究已表明PWM模型无法解释更为复杂的基因转录调控，如影响保守序列对蛋白质结合亲和性的保守序列两侧核苷酸。在本研究中，我们发现如sECBS-CS15m的结合序列内的非保守位置碱基对可以导致其与ArsR蛋白的较低结合，而如sECBS-CS9m的结合序列内的非保守位置碱基对则能导致其与ArsR蛋白的较高结合。尽管这两种结合序列仍都保留了结合序列内的保守序列，但是这是采用PWM模型不能解释出来的。更有趣的是，我们的研究证明非保守位置碱基对可以影响砷响应的基因转录诱导作用，这种功能超出了DNA结合功能本身。我们发现了sECBS-CS12m可以像ECBS-CS一样与ArsR较强结合，但是sECBS-CS12m对砷的响应比ECBS-CS好很多。它们与ArsR的结合水平相似，但砷响应的基因转录诱导率却不同，表明砷处理从CS12m的DNA结合序列中去除结合蛋白ArsR要比从CS的DNA结合序列中除去要快。因此，与AFBS-ECBS一样，这些非保守碱基对与阻遏蛋白的相互作用会影响砷与阻遏蛋白的结合或砷诱导的阻遏蛋白构象变化，从而阻断了阻遏蛋白从结合序列中去除。这表现在AFBS-ECBS对砷不敏感，而sECBS-CS12m对砷变得更为敏感。

砷作为天然存在元素广泛地分布于整个环境中。长期暴露于饮用水和食物中的砷会引起人类多种疾病。为了防止进一步的砷暴露，需要快速、成本效益好的现场技术来监控供水中的砷。基于细菌的测定法是一项新兴技术，可以在砷污染的情况下监控砷诱导的基因表达。与不适用于现场检测的、基于设备的传统方法相比，基于细菌的测定法对于野外检测砷来说既可靠又便宜。更显著地，它们可以测定不同暴露与剂量下的砷生物利用度的差异。基于细菌的测定法的关键成分是报告载体，包括启动子/操作子(或操纵子)和报告子基因。好的报告载体应显示出高敏感性和特异性、低内源性背景和宽的动态响应范围。在先前的研究中，我们构建了pLLPars9报告载体(即本研究中的pECBS-AFBS)，并证明其是迄今为止所构建的砷响应最佳的报告载体。在本研究中，我们证明了报告载体psECBS-CS12m显著优于pLLPars9。该研究还提供了创新策略以构建更好的报告载体，这有利于研发更敏感的、通过诱导报告基因表达来监控环境砷的生物传感器。

序列表

<110> 广东省微生物研究所(广东省微生物分析检测中心)

<120> 一种砷响应荧光素酶报告载体及其构建方法和应用

<160> 59

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cacattcgtt aagtcatata tgtttttgac tttttatcca cgaatatttc ttgca 55

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atccacgaat atttcttgca 20

<210> 3

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gctaaacaca tgaacagtta ttcagatatt caaa 34

<210> 4

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tgtgattaat catatgcgtt tttggttatg tgtt 34

<210> 5

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cacattcgtt aagtcatata tgtttttgac tt 32

<210> 6

<211> 5654

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gaattccgga tgagcattca tcaggcgggc aagaatgtga ataaaggccg gataaaactt 60

gtgcttattt ttctttacgg tctttaaaaa ggccgtaata tccagctgaa cggtctggtt 120

ataggtacat tgagcaactg actgaaatgc ctcaaaatgt tctttacgat gccattggga 180

tatatcaacg gtggtatatc cagtgatttt tttctccatt ttagcttcct tagctcctga 240

aaatctcgat aactcaaaaa atacgcccgg tagtgatctt atttcattat ggtgaaagtt 300

ggaacctctt acgtgccgat caacgtctca ttttcgccaa aagttggccc agggcttccc 360

ggtatcaaca gggacaccag gatttattta ttctgcgaag tgatcttccg tcacaggtat 420

ttattcggcg caaagtgcgt cgggtgatgc tgccaactta ctgatttagt gtatgatggt 480

gtttttgagg tgctccagtg gcttctgttt ctatcagctg tccctcctgt tcagctactg 540

acggggtggt gcgtaacggc aaaagcaccg ccggacatca gcgctagcgg agtgtatact 600

ggcttactat gttggcactg atgagggtgt cagtgaagtg cttcatgtgg caggagaaaa 660

aaggctgcac cggtgcgtca gcagaatatg tgatacagga tatattccgc ttcctcgctc 720

actgactcgc tacgctcggt cgttcgactg cggcgagcgg aaatggctta cgaacggggc 780

ggagatttcc tggaagatgc caggaagata cttaacaggg aagtgagagg gccgcggcaa 840

agccgttttt ccataggctc cgcccccctg acaagcatca cgaaatctga cgctcaaatc 900

agtggtggcg aaacccgaca ggactataaa gataccaggc gtttccccct ggcggctccc 960

tcgtgcgctc tcctgttcct gcctttcggt ttaccggtgt cattccgctg ttatggccgc 1020

gtttgtctca ttccacgcct gacactcagt tccgggtagg cagttcgctc caagctggac 1080

tgtatgcacg aaccccccgt tcagtccgac cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt 1140

gagtccaacc cggaaagaca tgcaaaagca ccactggcag cagccactgg taattgattt 1200

agaggagtta gtcttgaagt catgcgccgg ttaaggctaa actgaaagga caagttttgg 1260

tgactgcgct cctccaagcc agttacctcg gttcaaagag ttggtagctc agagaacctt 1320

cgaaaaaccg ccctgcaagg cggttttttc gttttcagag caagagatta cgcgcagacc 1380

aaaacgatct caagaagatc atcttattaa tcagataaaa tatttctaga acacattcgt 1440

taagtcatat atgtttttga ctttttatcc acgaatattt cttgcagtat tgaaagcttt 1500

gtgattaatc atatgcgttt ttggttatgt gttgtttgac ttaatatcag agccgagaga 1560

tacttgtttt ctacaaagga gagggaaatg ttgcaactaa caccacttca gttatttaaa 1620

aacctgtccg atgaaacccg tttgggtatc gtgttgttgc tcagggagat gggagagttg 1680

tgcgtgtgtg atctttgcat ggcactggat caatcacagc ccaaaatatc ccgtcatctg 1740

gcgatgctac gggaaagtgg aatccttctg gatcgtaaac agggaaaatg ggttcactac 1800

cgcttatcac cgcatattcc ttcatgggct gcccagatta ttgagcaggc ctggttaagc 1860

caacaggacg acgttcaggt catcgcacgc aagccggatc ctggaagacg ccaaaaacat 1920

aaagaaaggc ccggcgccat tctatccgct ggaagatgga accgctggag agcaactgca 1980

taaggctatg aagagatacg ccctggttcc tggaacaatt gcttttacag atgcacatat 2040

cgaggtggac atcacttacg ctgagtactt cgaaatgtcc gttcggttgg cagaagctat 2100

gaaacgatat gggctgaata caaatcacag aatcgtcgta tgcagtgaaa actctcttca 2160

attctttatg ccggtgttgg gcgcgttatt tatcggagtt gcagttgcgc ccgcgaacga 2220

catttataat gaacgtgaat tgctcaacag tatgggcatt tcgcagccta ccgtggtgtt 2280

cgtttccaaa aaggggttgc aaaaaatttt gaacgtgcaa aaaaagctcc caatcatcca 2340

aaaaattatt atcatggatt ctaaaacgga ttaccaggga tttcagtcga tgtacacgtt 2400

cgtcacatct catctacctc ccggttttaa tgaatacgat tttgtgccag agtccttcga 2460

tagggacaag acaattgcac tgatcatgaa ctcctctgga tctactggtc tgcctaaagg 2520

tgtcgctctg cctcatagaa ctgcctgcgt gagattctcg catgccagag atcctatttt 2580

tggcaatcaa atcattccgg atactgcgat tttaagtgtt gttccattcc atcacggttt 2640

tggaatgttt actacactcg gatatttgat atgtggattt cgagtcgtct taatgtatag 2700

atttgaagaa gagctgtttc tgaggagcct tcaggattac aagattcaaa gtgcgctgct 2760

ggtgccaacc ctattctcct tcttcgccaa aagcactctg attgacaaat acgatttatc 2820

taatttacac gaaattgctt ctggtggcgc tcccctctct aaggaagtcg gggaagcggt 2880

tgccaagagg ttccatctgc caggtatcag gcaaggatat gggctcactg agactacatc 2940

agctattctg attacacccg agggggatga taaaccgggc gcggtcggta aagttgttcc 3000

attttttgaa gcgaaggttg tggatctgga taccgggaaa acgctgggcg ttaatcaaag 3060

aggcgaactg tgtgtgagag gtcctatgat tatgtccggt tatgtaaaca atccggaagc 3120

gaccaacgcc ttgattgaca aggatggatg gctacattct ggagacatag cttactggga 3180

cgaagacgaa cacttcttca tcgttgaccg cctgaagtct ctgattaagt acaaaggcta 3240

tcaggtggct cccgctgaat tggaatccat cttgctccaa caccccaaca tcttcgacgc 3300

aggtgtcgca ggtcttcccg acgatgacgc cggtgaactt cccgccgccg ttgttgtttt 3360

ggagcacgga aagacgatga cggaaaaaga gatcgtggat tacgtcgcca gtcaagtaac 3420

aaccgcgaaa aagttgcgcg gaggagttgt gtttgtggac gaagtaccga aaggtcttac 3480

cggaaaactc gacgcaagaa aaatcagaga gatcctcata aaggccaaga agggcggaaa 3540

gatcgccgtg taagtcgacc gatgcccttg agagccttca acccagtcag ctccttccgg 3600

tgggcgcggg gcatgactat cgtcgccgca cttatgactg tcttctttat catgcaactc 3660

gtaggacagg tgccggcagc gctctgggtc attttcggcg aggaccgctt tcgctggagc 3720

gcgacgatga tcggcctgtc gcttgcggta ttcggaatct tgcacgccct cgctcaagcc 3780

ttcgtcactg gtcccgccac caaacgtttc ggcgagaagc aggccattat cgccggcatg 3840

gcggccgacg cgctgggcta cgtcttgctg gcgttcgcga cgcgaggctg gatggccttc 3900

cccattatga ttcttctcgc ttccggcggc atcgggatgc ccgcgttgca ggccatgctg 3960

tccaggcagg tagatgacga ccatcaggga cagcttcaag gatcgctcgc ggctcttacc 4020

agcctaactt cgatcattgg accgctgatc gtcacggcga tttatgccgc ctcggcgagc 4080

acatggaacg ggttggcatg gattgtaggc gccgccctat accttgtctg cctccccgcg 4140

ttgcgtcgcg gtgcatggag ccgggccacc tcgacctgaa tggaagccgg cggcacctcg 4200

ctaacggatt caccactcca agaattggag ccaatcaatt cttgcggaga actgtgaatg 4260

cgcaaaccaa cccttggcag aacatatcca tcgcgtccgc catctccagc agccgcacgc 4320

ggcgcatctc gggcagcgtt gggtcctggc cacgggtgcg catgatcgtg ctcctgtcgt 4380

tgaggacccg gctaggctgg cggggttgcc ttactggtta gcagaatgaa tcaccgatac 4440

gcgagcgaac gtgaagcgac tgctgctgca aaacgtctgc gacctgagca acaacatgaa 4500

tggtcttcgg tttccgtgtt tcgtaaagtc tggaaacgcg gaagtcccct acgtgctgct 4560

gaagttgccc gcaacagaga gtggaaccaa ccggtgatac cacgatacta tgactgagag 4620

tcaacgccat gagcggcctc atttcttatt ctgagttaca acagtccgca ccgctgtccg 4680

gtagctcctt ccggtgggcg cggggcatga ctatcgtcgc cgcacttatg actgtcttct 4740

ttatcatgca actcgtagga caggtgccgg cagcgcccaa cagtcccccg gccacggggc 4800

ctgccaccat acccacgccg aaacaagcgc cctgcaccat tatgttccgg atctgcatcg 4860

caggatgctg ctggctaccc tgtggaacac ctacatctgt attaacgaag cgctaaccgt 4920

ttttatcagg ctctgggagg cagaataaat gatcatatcg tcaattatta cctccacggg 4980

gagagcctga gcaaactggc ctcaggcatt tgagaagcac acggtcacac tgcttccggt 5040

agtcaataaa ccggtaaacc agcaatagac ataagcggct atttaacgac cctgccctga 5100

accgacgacc gggtcgaatt tgctttcgaa tttctgccat tcatccgctt attatcactt 5160

attcaggcgt agcaaccagg cgtttaaggg caccaataac tgccttaaaa aaattacgcc 5220

ccgccctgcc actcatcgca gtactgttgt aattcattaa gcattctgcc gacatggaag 5280

ccatcacaaa cggcatgatg aacctgaatc gccagcggca tcagcacctt gtcgccttgc 5340

gtataatatt tgcccatggt gaaaacgggg gcgaagaagt tgtccatatt ggccacgttt 5400

aaatcaaaac tggtgaaact cacccaggga ttggctgaga cgaaaaacat attctcaata 5460

aaccctttag ggaaataggc caggttttca ccgtaacacg ccacatcttg cgaatatatg 5520

tgtagaaact gccggaaatc gtcgtggtat tcactccaga gcgatgaaaa cgtttcagtt 5580

tgctcatgga aaacggtgta acaagggtga acactatccc atatcaccag ctcaccgtct 5640

ttcattgcca tacg 5654

<210> 7

<211> 71

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ctagaattcg ttaagtcata tatgtttttg acttttttac agtcaaatag ctatttgact 60

gtagtattga a 71

<210> 8

<211> 71

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

agctttcaat actacagtca aatagctatt tgactgtaaa aaagtcaaaa acatatatga 60

cttaacgaat t 71

<210> 9

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ttcgttaagt catatatgtt tttgactttt ttacagtcaa atagctattt gactgta 57

<210> 10

<211> 5656

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gaattccgga tgagcattca tcaggcgggc aagaatgtga ataaaggccg gataaaactt 60

gtgcttattt ttctttacgg tctttaaaaa ggccgtaata tccagctgaa cggtctggtt 120

ataggtacat tgagcaactg actgaaatgc ctcaaaatgt tctttacgat gccattggga 180

tatatcaacg gtggtatatc cagtgatttt tttctccatt ttagcttcct tagctcctga 240

aaatctcgat aactcaaaaa atacgcccgg tagtgatctt atttcattat ggtgaaagtt 300

ggaacctctt acgtgccgat caacgtctca ttttcgccaa aagttggccc agggcttccc 360

ggtatcaaca gggacaccag gatttattta ttctgcgaag tgatcttccg tcacaggtat 420

ttattcggcg caaagtgcgt cgggtgatgc tgccaactta ctgatttagt gtatgatggt 480

gtttttgagg tgctccagtg gcttctgttt ctatcagctg tccctcctgt tcagctactg 540

acggggtggt gcgtaacggc aaaagcaccg ccggacatca gcgctagcgg agtgtatact 600

ggcttactat gttggcactg atgagggtgt cagtgaagtg cttcatgtgg caggagaaaa 660

aaggctgcac cggtgcgtca gcagaatatg tgatacagga tatattccgc ttcctcgctc 720

actgactcgc tacgctcggt cgttcgactg cggcgagcgg aaatggctta cgaacggggc 780

ggagatttcc tggaagatgc caggaagata cttaacaggg aagtgagagg gccgcggcaa 840

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agtggtggcg aaacccgaca ggactataaa gataccaggc gtttccccct ggcggctccc 960

tcgtgcgctc tcctgttcct gcctttcggt ttaccggtgt cattccgctg ttatggccgc 1020

gtttgtctca ttccacgcct gacactcagt tccgggtagg cagttcgctc caagctggac 1080

tgtatgcacg aaccccccgt tcagtccgac cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt 1140

gagtccaacc cggaaagaca tgcaaaagca ccactggcag cagccactgg taattgattt 1200

agaggagtta gtcttgaagt catgcgccgg ttaaggctaa actgaaagga caagttttgg 1260

tgactgcgct cctccaagcc agttacctcg gttcaaagag ttggtagctc agagaacctt 1320

cgaaaaaccg ccctgcaagg cggttttttc gttttcagag caagagatta cgcgcagacc 1380

aaaacgatct caagaagatc atcttattaa tcagataaaa tatttctaga attcgttaag 1440

tcatatatgt ttttgacttt tttacagtca aatagctatt tgactgtagt attgaaagct 1500

ttgtgattaa tcatatgcgt ttttggttat gtgttgtttg acttaatatc agagccgaga 1560

gatacttgtt ttctacaaag gagagggaaa tgttgcaact aacaccactt cagttattta 1620

aaaacctgtc cgatgaaacc cgtttgggta tcgtgttgtt gctcagggag atgggagagt 1680

tgtgcgtgtg tgatctttgc atggcactgg atcaatcaca gcccaaaata tcccgtcatc 1740

tggcgatgct acgggaaagt ggaatccttc tggatcgtaa acagggaaaa tgggttcact 1800

accgcttatc accgcatatt ccttcatggg ctgcccagat tattgagcag gcctggttaa 1860

gccaacagga cgacgttcag gtcatcgcac gcaagccgga tcctggaaga cgccaaaaac 1920

ataaagaaag gcccggcgcc attctatccg ctggaagatg gaaccgctgg agagcaactg 1980

cataaggcta tgaagagata cgccctggtt cctggaacaa ttgcttttac agatgcacat 2040

atcgaggtgg acatcactta cgctgagtac ttcgaaatgt ccgttcggtt ggcagaagct 2100

atgaaacgat atgggctgaa tacaaatcac agaatcgtcg tatgcagtga aaactctctt 2160

caattcttta tgccggtgtt gggcgcgtta tttatcggag ttgcagttgc gcccgcgaac 2220

gacatttata atgaacgtga attgctcaac agtatgggca tttcgcagcc taccgtggtg 2280

ttcgtttcca aaaaggggtt gcaaaaaatt ttgaacgtgc aaaaaaagct cccaatcatc 2340

caaaaaatta ttatcatgga ttctaaaacg gattaccagg gatttcagtc gatgtacacg 2400

ttcgtcacat ctcatctacc tcccggtttt aatgaatacg attttgtgcc agagtccttc 2460

gatagggaca agacaattgc actgatcatg aactcctctg gatctactgg tctgcctaaa 2520

ggtgtcgctc tgcctcatag aactgcctgc gtgagattct cgcatgccag agatcctatt 2580

tttggcaatc aaatcattcc ggatactgcg attttaagtg ttgttccatt ccatcacggt 2640

tttggaatgt ttactacact cggatatttg atatgtggat ttcgagtcgt cttaatgtat 2700

agatttgaag aagagctgtt tctgaggagc cttcaggatt acaagattca aagtgcgctg 2760

ctggtgccaa ccctattctc cttcttcgcc aaaagcactc tgattgacaa atacgattta 2820

tctaatttac acgaaattgc ttctggtggc gctcccctct ctaaggaagt cggggaagcg 2880

gttgccaaga ggttccatct gccaggtatc aggcaaggat atgggctcac tgagactaca 2940

tcagctattc tgattacacc cgagggggat gataaaccgg gcgcggtcgg taaagttgtt 3000

ccattttttg aagcgaaggt tgtggatctg gataccggga aaacgctggg cgttaatcaa 3060

agaggcgaac tgtgtgtgag aggtcctatg attatgtccg gttatgtaaa caatccggaa 3120

gcgaccaacg ccttgattga caaggatgga tggctacatt ctggagacat agcttactgg 3180

gacgaagacg aacacttctt catcgttgac cgcctgaagt ctctgattaa gtacaaaggc 3240

tatcaggtgg ctcccgctga attggaatcc atcttgctcc aacaccccaa catcttcgac 3300

gcaggtgtcg caggtcttcc cgacgatgac gccggtgaac ttcccgccgc cgttgttgtt 3360

ttggagcacg gaaagacgat gacggaaaaa gagatcgtgg attacgtcgc cagtcaagta 3420

acaaccgcga aaaagttgcg cggaggagtt gtgtttgtgg acgaagtacc gaaaggtctt 3480

accggaaaac tcgacgcaag aaaaatcaga gagatcctca taaaggccaa gaagggcgga 3540

aagatcgccg tgtaagtcga ccgatgccct tgagagcctt caacccagtc agctccttcc 3600

ggtgggcgcg gggcatgact atcgtcgccg cacttatgac tgtcttcttt atcatgcaac 3660

tcgtaggaca ggtgccggca gcgctctggg tcattttcgg cgaggaccgc tttcgctgga 3720

gcgcgacgat gatcggcctg tcgcttgcgg tattcggaat cttgcacgcc ctcgctcaag 3780

ccttcgtcac tggtcccgcc accaaacgtt tcggcgagaa gcaggccatt atcgccggca 3840

tggcggccga cgcgctgggc tacgtcttgc tggcgttcgc gacgcgaggc tggatggcct 3900

tccccattat gattcttctc gcttccggcg gcatcgggat gcccgcgttg caggccatgc 3960

tgtccaggca ggtagatgac gaccatcagg gacagcttca aggatcgctc gcggctctta 4020

ccagcctaac ttcgatcatt ggaccgctga tcgtcacggc gatttatgcc gcctcggcga 4080

gcacatggaa cgggttggca tggattgtag gcgccgccct ataccttgtc tgcctccccg 4140

cgttgcgtcg cggtgcatgg agccgggcca cctcgacctg aatggaagcc ggcggcacct 4200

cgctaacgga ttcaccactc caagaattgg agccaatcaa ttcttgcgga gaactgtgaa 4260

tgcgcaaacc aacccttggc agaacatatc catcgcgtcc gccatctcca gcagccgcac 4320

gcggcgcatc tcgggcagcg ttgggtcctg gccacgggtg cgcatgatcg tgctcctgtc 4380

gttgaggacc cggctaggct ggcggggttg ccttactggt tagcagaatg aatcaccgat 4440

acgcgagcga acgtgaagcg actgctgctg caaaacgtct gcgacctgag caacaacatg 4500

aatggtcttc ggtttccgtg tttcgtaaag tctggaaacg cggaagtccc ctacgtgctg 4560

ctgaagttgc ccgcaacaga gagtggaacc aaccggtgat accacgatac tatgactgag 4620

agtcaacgcc atgagcggcc tcatttctta ttctgagtta caacagtccg caccgctgtc 4680

cggtagctcc ttccggtggg cgcggggcat gactatcgtc gccgcactta tgactgtctt 4740

ctttatcatg caactcgtag gacaggtgcc ggcagcgccc aacagtcccc cggccacggg 4800

gcctgccacc atacccacgc cgaaacaagc gccctgcacc attatgttcc ggatctgcat 4860

cgcaggatgc tgctggctac cctgtggaac acctacatct gtattaacga agcgctaacc 4920

gtttttatca ggctctggga ggcagaataa atgatcatat cgtcaattat tacctccacg 4980

gggagagcct gagcaaactg gcctcaggca tttgagaagc acacggtcac actgcttccg 5040

gtagtcaata aaccggtaaa ccagcaatag acataagcgg ctatttaacg accctgccct 5100

gaaccgacga ccgggtcgaa tttgctttcg aatttctgcc attcatccgc ttattatcac 5160

ttattcaggc gtagcaacca ggcgtttaag ggcaccaata actgccttaa aaaaattacg 5220

ccccgccctg ccactcatcg cagtactgtt gtaattcatt aagcattctg ccgacatgga 5280

agccatcaca aacggcatga tgaacctgaa tcgccagcgg catcagcacc ttgtcgcctt 5340

gcgtataata tttgcccatg gtgaaaacgg gggcgaagaa gttgtccata ttggccacgt 5400

ttaaatcaaa actggtgaaa ctcacccagg gattggctga gacgaaaaac atattctcaa 5460

taaacccttt agggaaatag gccaggtttt caccgtaaca cgccacatct tgcgaatata 5520

tgtgtagaaa ctgccggaaa tcgtcgtggt attcactcca gagcgatgaa aacgtttcag 5580

tttgctcatg gaaaacggtg taacaagggt gaacactatc ccatatcacc agctcaccgt 5640

ctttcattgc catacg 5656

<210> 11

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

atccacgaat atttcttgca tttcacattc gttaagtcat atatgttttt gactt 55

<210> 12

<211> 69

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

cacattcgtt aagtcatata tgtttttgac tttttgctaa acacatgaac agttattcag 60

atattcaaa 69

<210> 13

<211> 69

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

cacattcgtt aagtcatata tgtttttgac ttttttgtga ttaatcatat gcgtttttgg 60

ttatgtgtt 69

<210> 14

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

gctaaacaca tgaacagtta ttcagatatt caaatttatc cacgaatatt tcttgca 57

<210> 15

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

tgtgattaat catatgcgtt tttggttatg tgtttttatc cacgaatatt tcttgca 57

<210> 16

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

taaaatcaaa tacgtatttg attatattta tccacgaata tttcttgca 49

<210> 17

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

tgtgattaat catatgcgtt tttggttatg tgttttttaa aatcaaatac gtatttgatt 60

ata 63

<210> 18

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

atccacgaat atttcttgca ttttaaaatc aaatacgtat ttgattata 49

<210> 19

<211> 61

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

cacattcgtt aagtcatata tgtttttgac ttttttaaaa tcaaatacgt atttgattat 60

a 61

<210> 20

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

cacattcgtt aagtcatata tgtttttgac tttaaaatca aatacgtatt tgattata 58

<210> 21

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

ttcgttaagt catatatgtt tttgactttt ttacaatcaa atagctattt gattgta 57

<210> 22

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

ttcgttaagt catatatgtt tttgactttt ttagactcaa atagctattt gagtcta 57

<210> 23

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

taaaatcaaa tacgtatttg attata 26

<210> 24

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

tgcaagaaat attcgtggat aaaaagtcaa aaacatatat gacttaacga atgtg 55

<210> 25

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

aagtcaaaaa catatatgac ttaacgaatg tgaaatgcaa gaaatattcg tggat 55

<210> 26

<211> 61

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

tataatcaaa tacgtatttg attttaaaaa agtcaaaaac atatatgact taacgaatgt 60

g 61

<210> 27

<211> 61

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

taaaatcaaa tacgtatttg attatatttc acattcgtta agtcatatat gtttttgact 60

t 61

<210> 28

<211> 61

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

aagtcaaaaa catatatgac ttaacgaatg tgaaatataa tcaaatacgt atttgatttt 60

a 61

<210> 29

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

tataatcaaa tacgtatttg attttaaagt caaaaacata tatgacttaa cgaatgtg 58

<210> 30

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

ttcgttaagt catatatgtt tttgactt 28

<210> 31

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

ttcgttaagt catatatgtt tttgactttt ttataatcaa atagctattt gattata 57

<210> 32

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

ttcgttaagt catatatgtt tttgactttt ttatattcaa atagctattt gaatata 57

<210> 33

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

ttcgttaagt catatatgtt tttgactttt ttatactcaa atagctattt gagtata 57

<210> 34

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 34

ttcgttaagt catatatgtt tttgactttt ttatagtcaa atagctattt gactata 57

<210> 35

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 35

ttcgttaagt catatatgtt tttgactttt ttaaaatcaa atagctattt gatttta 57

<210> 36

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 36

ttcgttaagt catatatgtt tttgactttt ttaaattcaa atagctattt gaattta 57

<210> 37

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 37

ttcgttaagt catatatgtt tttgactttt ttaaactcaa atagctattt gagttta 57

<210> 38

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 38

ttcgttaagt catatatgtt tttgactttt ttaaagtcaa atagctattt gacttta 57

<210> 39

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 39

ttcgttaagt catatatgtt tttgactttt ttacattcaa atagctattt gaatgta 57

<210> 40

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 40

ttcgttaagt catatatgtt tttgactttt ttacactcaa atagctattt gagtgta 57

<210> 41

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 41

ttcgttaagt catatatgtt tttgactttt ttagaatcaa atagctattt gattcta 57

<210> 42

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 42

ttcgttaagt catatatgtt tttgactttt ttagattcaa atagctattt gaatcta 57

<210> 43

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 43

ttcgttaagt catatatgtt tttgactttt ttagagtcaa atagctattt gactcta 57

<210> 44

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 44

tataatcaaa tagctatttg attataaaaa agtcaaaaac atatatgact taacgaa 57

<210> 45

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 45

tatattcaaa tagctatttg aatataaaaa agtcaaaaac atatatgact taacgaa 57

<210> 46

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 46

tatactcaaa tagctatttg agtataaaaa agtcaaaaac atatatgact taacgaa 57

<210> 47

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 47

tatagtcaaa tagctatttg actataaaaa agtcaaaaac atatatgact taacgaa 57

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<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 48

taaaatcaaa tagctatttg attttaaaaa agtcaaaaac atatatgact taacgaa 57

<210> 49

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 49

taaattcaaa tagctatttg aatttaaaaa agtcaaaaac atatatgact taacgaa 57

<210> 50

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 50

taaactcaaa tagctatttg agtttaaaaa agtcaaaaac atatatgact taacgaa 57

<210> 51

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 51

taaagtcaaa tagctatttg actttaaaaa agtcaaaaac atatatgact taacgaa 57

<210> 52

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 52

tacaatcaaa tagctatttg attgtaaaaa agtcaaaaac atatatgact taacgaa 57

<210> 53

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 53

tacattcaaa tagctatttg aatgtaaaaa agtcaaaaac atatatgact taacgaa 57

<210> 54

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 54

tacactcaaa tagctatttg agtgtaaaaa agtcaaaaac atatatgact taacgaa 57

<210> 55

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 55

tacagtcaaa tagctatttg actgtaaaaa agtcaaaaac atatatgact taacgaa 57

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<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 56

tagaatcaaa tagctatttg attctaaaaa agtcaaaaac atatatgact taacgaa 57

<210> 57

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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tagattcaaa tagctatttg aatctaaaaa agtcaaaaac atatatgact taacgaa 57

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<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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tagactcaaa tagctatttg agtctaaaaa agtcaaaaac atatatgact taacgaa 57

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<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 59

tagagtcaaa tagctatttg actctaaaaa agtcaaaaac atatatgact taacgaa 57

Claims

1.一种砷响应荧光素酶报告载体psECBS-CS12m，其特征在于，所述的砷响应荧光素酶报告载体psECBS-CS12m，其核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。

2.权利要求1所述的砷响应荧光素酶报告载体psECBS-CS12m的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：在体外合成如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的DNA序列，退火生成含有XbaI和HindIII粘端的双链片段，将报告载体pLLPars9用XbaI和HindIII双酶切，得到含有XbaI和HindIII粘端的线性载体，将含有XbaI和HindIII粘端的双链片段和线性载体连接，获得砷响应荧光素酶报告载体psECBS-CS12m。

3.权利要求1所述的砷响应荧光素酶报告载体psECBS-CS12m在砷盐检测中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的砷盐为亚砷酸盐。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的亚砷酸盐为亚砷酸钠。

6.权利要求1所述的砷响应荧光素酶报告载体psECBS-CS12m在制备砷盐检测全细胞传感器中的应用。

7.一种砷盐检测全细胞传感器，其特征在于，所述的砷盐检测全细胞传感器为含有权利要求1所述的砷响应荧光素酶报告载体psECBS-CS12m的基因工程菌。

8.根据权利要求7所述的砷盐检测全细胞传感器，其特征在于，所述的基因工程菌为大肠杆菌DH5α。