CN110117619A - 一种制备小菜蛾雄性不育品系的方法及其核酸 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了制备小菜蛾雄性不育品系的方法及其核酸。本方法包括以下步骤：1)合成sgRNA，所述的sgRNA的模板从5’端到3’端包括以下可操作性元件：T7启动子，Ser2基因靶点和gRNA；2)合成Cas9mRNA，所述的Cas9mRNA的模板从5’端到3’端包括：启动子，Cas9编码序列和SV40终止子；3)将步骤1)所得的sgRNA和步骤2)所述的Cas9mRNA混合后显微注射小菜蛾新鲜卵中，孵化，即得雄性不育的小菜蛾。本发明利用CRISPR/Cas9技术敲除小菜蛾Ser2基因，提供了小菜蛾雄性不育遗传品系，解决了传统的通过辐射和四环素诱导不育昆虫的方法不能稳定有效遗传给后代的问题。通过对雌性突变体小菜蛾的释放，可用于野外防治小菜蛾虫害，为害虫防治提供新思路。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种制备小菜蛾雄性不育品系的方法及其核酸。
背景技术
小菜蛾是重要的经济作物害虫。小菜蛾(Plutella xylostella)属鳞翅目(Lepidoptera)菜蛾科(Plutellidae)，全球性分布，严重危害十字花科植物。目前，除了南北极和沙漠等极端气候区未发现小菜蛾外，其余各地都有小菜蛾的踪迹。在全球范围内，每年因小菜蛾危害造成的经济损失和防治费用高达50亿美元(Furlong et al.,2013)。更为严重的是，在小菜蛾防治过程中，其对化学杀虫剂的过度依赖造成了小菜蛾的严重抗药性，这进一步增加了防治难度(Furlong et al.,2013)。因此，发展新的防治方法对控制小菜蛾危害具有积极的意义。
昆虫不育技术(SIT)一直是害虫防治的研究及应用的热点，早期美国利用辐射不育技术首次成功地消灭了螺旋锥蝇(Cochliomyia hominivorax)，在日本通过释放通过辐射处理的不育瓜实蝇(Bactrocera cucuribitae)使其根绝成功。通过利用四环素调控地中海实蝇(Ceratitis capitata)雌性的剪接因子，可以使雌性特异性致死。虽然辐射技术和四环素特异性表达都能诱导昆虫不育，但是都不能获得稳定的遗传品系。
在昆虫交配生殖过程中，雄性精液蛋白通过射精行为转移到雌体内，该雄性精液蛋白对雄性和雌性的生殖成功是必不可少的。雄性精液蛋白能够影响雄性精子竞争的成功和雌性的生殖力、生育力、寿命及后代存活率等。据研究报道，雄性副性腺蛋白在生殖交配过程中的分泌是可塑的，可在自然选择下快速进化，且比迄今被认为的更复杂。
目前，国内对小菜蛾不育技术的研究还是处于空白阶段，没有一种针对小菜蛾雄性不育技术的报道。国外报道了一种通过雄性小菜蛾特异表达四环素后代交配致死的品系。但四环素诱导小菜蛾不育技术存在一定局限性和缺点：首先是不可遗传的，需要定室内构建品系胡期释放小菜蛾，其次每次释放工作量非常大，操作难度高。另外在鳞翅目模式昆虫家蚕中对不育技术的主要是中国农业科学院蚕业研究所研发的雄性不育系——镇江野败，与国外报道的3种类型①雄蛾阴茎肌退化slp②精子缺乏slo③精荚异常sls相比，镇江野败具有高度不育性和生殖系统发育异常多型性特点，是目前理想的不育品系，但家蚕中的镇江野败雄性不育品系是通过野桑蚕与家蚕远缘杂交育种获得，这在小菜蛾中难以操作，目前还没有发现该种害虫在种群间有像家蚕与野桑蚕之间如此大的差异。并且其不育品系的不育机制复杂，表现出多种不用的突变表型，且在遗传学上无法与基因相对应，这在小菜蛾中得到相类似不育品系十分困难。
因此，本领域急需获得一种小菜蛾可遗传的不育技术体系，且操作重复性高，未来容易在小菜蛾及其它害虫中易推广的技术方法。
发明内容
本发明的针对小菜蛾遗传不育技术中缺乏雄性不育品系的不足，提供一种制备雄性不育的小菜蛾的方法及其核酸。
为此，本发明提供制备雄性不育的小菜蛾的方法，包括以下步骤：
1)合成sgRNA，所述的sgRNA的模板从5’端到3’端包括以下可操作性元件：T7启动子，Ser2基因靶点和gRNA；
2)合成Cas9mRNA，所述的Cas9mRNA的模板从5’端到3’端包括：启动子，Cas9编码序列和SV40终止子；
3)将步骤1)所得的sgRNA和步骤2)所述的Cas9mRNA混合后显微注射小菜蛾新鲜卵中，孵化，即得雄性不育的小菜蛾。
优选的，所述的Ser2基因靶点的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
优选的，所述的sgRNA的模板的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
优选的，所述的Cas9mRNA的模板的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
优选的，步骤3)所述的sgRNA和所述的Cas9mRNA是等摩尔量混合。
本发明还提供一种防治小菜蛾的方法，包括以下步骤：将所述的方法制备而得的雄性不育的雄性小菜蛾野外放生，通过与野生小菜蛾交配，使后代减少，降低种群数量。
本发明也提供制备雄性不育的小菜蛾的核酸，所述的核酸从5’端到3’端包括以下可操作性元件：T7启动子，Ser2基因靶点和gRNA。
优选的，所述的核酸的模板的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
本发明也提供一种制备雄性不育的小菜蛾的核酸混合物，包括所述的核酸和Cas9mRNA。
优选的，所述的Cas9mRNA的模板的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
本发明利用CRISPR/Cas9技术敲除小菜蛾Ser2基因，提供了小菜蛾雄性不育遗传品系，解决了传统的通过辐射和四环素诱导不育昆虫的方法不能稳定有效遗传给后代的问题。通过对雌性突变体小菜蛾的释放，可用于野外防治小菜蛾虫害，为害虫防治提供新思路。
附图说明
图1小菜蛾基因组结构图和敲除突变检测。A：小菜蛾Ser2基因结构及敲除靶点，红色为PAM序列；B：PCR产物检测是否突变。C：敲除后的突变类型。
图2小菜蛾Ser2基因突变影响卵孵化。A：野生型雌、雄虫交配产的卵第三天发育；B：野生型雌虫与突变的雄虫交配产卵第三天不发育；C：野生型雄虫与突变的雌虫交配产的卵第三天发育；D：突变的雌、雄虫交配产卵第三天不发育。
图3小菜蛾突变后对交配行为无影响。A野生型雌雄虫交配行为拍照；B突变体雌雄虫交配行为拍照。
图4突变体成虫交配时间与野生型交配时间对比无显著差异。
具体实施方式
本发明人经过广泛研究和反复试验，通过对基因突变位点的选择以及转基因质粒的构建，敲除小菜蛾Sericin 2-encoding(PxSer2)基因，构建了一个Ser2基因突变小菜蛾品系，发现Ser2基因突变后，雌雄突变体的正常交配行为均不受影响，雌性突变体作为亲本的小菜蛾卵孵化率正常，然而雄性突变体作为亲本的小菜蛾卵不能孵化，可见Ser2基因突变体家小菜蛾雄性高度不育，且雌虫突变体可遗传到下一代雄虫，达到稳定遗传的有效突变后代，从而完成了本发明。
鳞翅目包括蛾、蝶两类昆虫。属于有翅亚纲、全变态类。全世界已知约20万种，中国已知约8000余种。该目为昆虫纲中仅次于鞘翅目的第2个大目。包括麦蛾科；粉蝶科，如麦蛾、棉红铃虫、马铃薯块茎蛾和甘薯麦蛾等；卷蛾科，如棉褐带卷蛾、大豆食心虫等；螟蛾科，如梨大食心虫、玉米螟等；尺蛾科，如大造桥虫等；粉蝶科，如菜粉蝶等；夜蛾科，如粉蚊夜蛾、棉铃虫等；毒蛾科，如舞毒蛾等；凤蝶科，如玉带风蝶、金风蝶等；舟蛾科，如舟形毛虫等；灯蛾科，如黄腹灯蛾、红腹灯蛾、美国白蛾等；天蛾科，如葡萄天蛾等；蚕蛾科，如家蚕等；天蚕蛾科，如樗蚕等；弄蝶科，如稻苞虫等。鳞翅目昆虫的分布范围极广，以热带种类最为丰富。绝大多数种类的幼虫为害各类栽培植物，体形较大者常食尽叶片或钻蛀枝干。体形较小者往往卷叶、缀叶、结鞘、吐丝结网或钻入植物组织取食为害。成虫多以花蜜等作为补充营养，或口器退化不再取食，一般不造成直接危害。
综上所述，鳞翅目昆虫大多数是害虫，也有少数，例如家蚕是有经济价值的昆虫。因此，对鳞翅目昆虫的大规模雄性不育技术进行研究，对于害虫的防治以及有经济价值的转基因产物将产生极大的现实意义。
因此，在优选的实施方式中，本发明的鳞翅目昆虫是小菜蛾。
丝氨酸蛋白酶类是精液蛋白中的而重要成分，其中小菜蛾Sericin2-encoding(PxSer2)基因编码的一种丝氨酸蛋白酶是雄性交配生殖成功至关重要的物质。
本发明优选Ser2基因靶点序列，在CRISPR/Cas9技术中作为靶点序列敲除Ser2基因，从而得到雄性不育突变体的功能。根据CRISPR/Cas9系统的靶标位点特点，本发明优选的靶点位于小菜蛾Ser2基因的第九外显子。更优选的，命名为PxSer2-sg，序列为5’-GGGCTCGGAAAGGGTAGCGATGG-3’(SEQ ID NO:1)。
因此，本发明包括与本发明的优选Ser2基因靶点序列1(SEQ ID NO:1)具有50％或以上(优选60％以上，70％以上，80％以上，更优选90％以上，更优选95％以上，最优选98％以上，如99％)同源性的核酸，所述核酸也具有在CRISPR/Cas9技术中作为靶点序列敲除Ser2基因，从而得到不育突变体的功能。“同源性”是指按照位置相同的百分比，两条或多条核酸之间的相似水平(即序列相似性或同一性)。
鉴于本发明的教导和现有技术，本领域普通技术人员不难理解，尽管本发明的实例中提供了来源于小菜蛾的Ser2基因的靶点序列，但是来源于鳞翅目的其它昆虫，例如斜纹夜蛾，与本发明启动子具有一定同源性(保守性)的Ser2基因靶点序列，只要本领域技术人员在阅读了本申请后根据本申请提供的信息可以方便地从其它昆虫中分离得到该Ser2基因靶点序列并验证其功能。
本发明的优点在于：提供了可遗传的稳定的小菜蛾雄性不育品系，突破传统的辐射和四环素诱导昆虫不育技术的不可遗传，首次敲除小菜蛾Ser2基因，为防治小菜蛾提供新策略，为其它害虫防治提供新思路。
PxSer2基因克隆：
根据小菜蛾基因组数据库http://dbm.dna.affrc.go.jp/px/，调取并下载PxSer2基因全部序列，与NCBI数据库CDS序列比对找到外显子序列，通过设计引物扩增外显子验证序列正确性并检测是否含有SNP，检测无SNP后序列可直接用于设计CRISPR/Cas9敲除的靶点。
sgRNA的合成：
在小菜蛾PxSer2基因第九个外显子设计靶点，命名为PxSer2-sg，序列为5’-GGGCTCGGAAAGGGTAGCGATGG-3’。小菜蛾Ser2基因结构及敲除靶点参见图1A。
sgRNA用MEGA Script Kit(Ambion)试剂盒合成，测序正确后备用，序列为SEQ IDNO:2所示。
Cas9mRNA的合成：
将含有Cas9的载体PTD1-T7-Cas9(购买于北京唯尚立德生物科技有限公司)进行线性化，序列上游含有T7启动子序列TAATACGACTCACTATAGG。使用mMESSAGE mMA CHINE kit(Ambion)试剂盒进行合成，测序正确后备用。序列如SEQ ID NO:3所示。
小菜蛾雄性不育品系构建：
将合成好的sgRNA和Cas9mRNA通过显微注射系统，注射到小菜蛾的卵中，注射后的小菜蛾卵放在25℃培养箱直到孵化，饲养孵化出来的小菜蛾，在4龄幼虫或者蛹期将注射的雌、雄虫分开，抽取血淋巴检测是否突变，获得的雄虫突变体在成虫时与野生型雌虫交配确定是否产生不孵化的无效卵，突变雌虫与野生型雄虫交配产生突变雄虫继续检测是否产生无效卵。
实施例1sgRNA的合成
sgRNA用MEGA Script Kit(Ambion)试剂盒合成。具体步骤包括：
1.在小菜蛾PxSer2基因第九个外显子设计靶点，命名为PxSer2-sg，序列为5’-GGGCTCGGAAAGGGTAGCGATGG-3’。设计引物如下：
正向引物：
sgRNA-F:TAATACGACTCACTATAGGGCTCGGAAAGGGTAGCGAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCC
反向引物(公用引物)：
sgRNA-R:AAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAAGTTGATAACGGACTAGCCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAA
使用KOD-Plus高保真酶(宝生物工程公司)按如下体系配置PCR反应体系，获得114bp片段的模板。
PCR程序为：98℃2min预变性；98℃10s，55℃15s，68℃10s，20个循环；68℃充分延伸2min。
2.PCR产物胶回收(Gel Extraction Kit D2500)，连接至pJET1.2(生产商ThermoFisher Science)平末端载体上，菌落PCR检测反向插入的克隆，检测引物为：
pJET-F500:TAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAG
sgRNA-R20:AAAAGCACCGACTCGGTGCC，用宝生物公司的2×Mix(PCR产物大小约为600bp)，PCR程序为：98℃2min预变性；98℃10s，55℃30s，72℃30s，35个循环；72℃充分延伸2min。送测选择无SNP的质粒为模板。
3.sgRNA模板的准备
合成反应体系：(KOD Plus)
3-4管50μl的PCR产物回收，最终溶于10μl的无核酸酶水。
4.sgRNA合成。根据Kit要求反应体系如下：
上述体系在37℃水浴锅过夜放置充分反应，经过酚：氯仿：异戊醇抽提纯化，用1/10体积的醋酸钠和2倍体积的无水乙醇沉淀，75％乙醇洗涤2-3变后用无核酸酶水溶解，得sgRNA，放-80℃冰箱备用。
实施例2Cas9mRNA的合成
1.PTD1-T7-Cas9(购于北京唯尚立德生物科技有限公司)用NotI进行线性化。用以下酶切体系进行过夜酶切。
Fermentas酶切体系：
电泳检测酶切产物。和酶切之前的载体进行同时跑胶，线性化后的载体由于分子阻力较大，要跑的慢一些。根据条带的大小确认是否完全切开。完全切开的模板才可以继续进行下一步。
2.合成Cas9mRNA。用试剂盒(T7)配好以下反应体系后于37℃反应过夜。
反应体系如下：
上述体系在37℃水浴锅放置4-6h充分反应，经过酚：氯仿：异戊醇抽提纯化，用1/10体积的醋酸钠和2倍体积的无水乙醇沉淀，75％乙醇洗涤2-3变后用无核酸酶水溶解，得Cas9mRNA，放-80℃冰箱备用。
实施例3突变体小菜蛾的获得及检测
1.突变体的获得：将实施例1制备的sgRNA和实施例2制备的Cas9mRNA等量(摩尔量)混合后注射到小菜蛾初产卵中。小菜蛾注射方法为：收集小菜蛾新卵，整齐排布于载玻片，甲醛熏蒸5分钟，表面消毒。按照终浓度sgRNA300ng/μl、Cas9mRNA 300ng/μl配制注射体系，注射位点选择于小菜蛾卵近尖端1/3处。注射后的卵放于25℃的无菌环境中孵化，饲养。
2.突变检测：用解剖剪取小菜蛾成虫的翅，用试剂盒提取基因组(TissuegenDNAKit，康为世纪生物科技有限公司)设计检测突变引物(PxSer2-TF：CCTAGGCGCGACAGTATATAGCC，PxSer2-TR：GGACACAGATTGATAAATCATGG)，PCR后送公司测序，如果突变，那么测序结果出现双峰(图1B)。再将PCR产物胶回收，连接转化到PMD-18T载体(宝生物公司购买)，挑取单克隆测序，检测突变类型(图1C)。将突变雌虫与野生雄虫交配、突变雄虫与野生雌虫交配、突变雌雄虫交配、野生型雌雄虫交配，观察交配行为、交配时间、产卵孵化率等指标。
交配行为：雌雄虫都突变的小菜蛾交配时进行拍照与野生型雌雄虫交配时拍照进行对比，观察行为是否不同，结果显示两个突变体交配与野生型交配时的行为是没差别的(图3)。交配时间：统计野生型的雌雄虫开始交配到结束，雌雄突变体开始交配到结束的时间，进行显著性分析，结果交配时间无差异(图4)。可见Ser突变雌性及雄性小菜蛾的交配没有受到影响。
产卵孵化率：野生型雌、雄虫交配产的卵第三天发育；野生型雌虫与突变的雄虫交配产卵第三天不发育；野生型雄虫与突变的雌虫交配产的卵第三天发育；突变的雌、雄虫交配产卵第三天不发育(图2)。可见获得的Ser突变雄性小菜蛾不育。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (10)
1.一种制备雄性不育的小菜蛾的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)合成sgRNA，所述的sgRNA的模板从5’端到3’端包括以下可操作性元件：T7启动子，Ser2基因靶点和gRNA；
2)合成Cas9 mRNA，所述的Cas9 mRNA的模板从5’端到3’端包括：启动子，Cas9编码序列和SV40终止子；
3)将步骤1)所得的sgRNA和步骤2)所述的Cas9 mRNA混合后显微注射小菜蛾新鲜卵中，孵化，即得雄性不育的小菜蛾。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的Ser2基因靶点的核苷酸序列如SEQ IDNO:1所示。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的sgRNA的模板的核苷酸序列如SEQ IDNO:2所示。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的Cas9 mRNA的模板的核苷酸序列如SEQID NO:3所示。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)所述的sgRNA和所述的Cas9 mRNA是等摩尔量混合。
6.一种防治小菜蛾的方法，其特征在于，包括以下步骤：将如权利要求1所述的方法制备而得的雄性不育的雄性小菜蛾野外放生，通过与野生小菜蛾交配，使后代减少，降低种群数量。
7.一种制备雄性不育的小菜蛾的核酸，其特征在于，所述的核酸从5’端到3’端包括以下可操作性元件：T7启动子，Ser2基因靶点和gRNA。
8.如权利要求7所述的核酸，其特征在于，所述的核酸的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
9.一种制备雄性不育的小菜蛾的核酸混合物，其特征在于，包括如权利要求7所述的核酸和Cas9 mRNA。
10.如权利要求9所述的核酸混合物，其特征在于，所述的Cas9 mRNA的模板的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
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