CN110117312B - 脂质结合蛋白-抗原捕获模块复合物、及其制备方法和应用 - Google Patents

脂质结合蛋白-抗原捕获模块复合物、及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了脂质结合蛋白‑抗原捕获模块复合物、及其制备方法和应用。具体地，本发明提供了一种结构为R1‑(CM)m的复合物，其中，抗原捕获模块CM可位于所述脂质结合蛋白的任意位置，其中，R1为脂质结合蛋白；CM为抗原捕获模块，其位于R1中的任一位置，结构为A1‑R2‑A2‑R3，其中，A1、A2各自独立地为无或连接基团，R2为连接物，R3为亲和探针；“‑”为键。本发明还提供了采用本发明的复合物直接从细胞膜上靶向提取的膜蛋白原生抗原的方法，以及制备的原生抗原。

Description

脂质结合蛋白-抗原捕获模块复合物、及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域。具体地，本发明涉及脂质结合蛋白-抗原捕获模块复合物、及其制备方法和应用。
背景技术
抗体类药物是指基于单克隆抗体特异性识别某个靶点这一性质衍生出的生物药总称，包括单克隆抗体(monoclonal antibody)、双特异抗体(bispecific antibody)、纳米抗体(nanobody)以及抗体偶联药物(antibody-drug conjugate)等。近年来，抗体类药物已成为生物药的主流。
大部分的抗体类药物针对的靶点均为细胞膜上的受体(receptor)等膜蛋白，用以抑制配体(ligand)结合或激活细胞内通路。由于完整的受体包含跨膜区(transmembranedomain，TMD)，难以在各类表达系统(如大肠杆菌、酵母、哺乳动物细胞等)中以可溶形式表达。
目前常用的靶点蛋白获得方式为截取其胞外区部分进行可溶表达或包涵体复性等。然而，胞外区的结构有可能会受到跨膜区或胞内区结构的影响，比如本发明人与哈佛医学院和波士顿儿童医院的Bing Chen课题组一项合作研究发现，对HIV-1Env(包膜蛋白)胞内区的改变居然严重影响了Env胞外区的抗原性质，相关结果及后续结构学研究的两篇论文分别发表在《科学》(Science 2015；349:191-5和Science 2016；353:172-5)。更具体地说，剪切gp41的胞内区可以让(gp120/gp41)在膜另一端的胞外区对之前被鉴定的广泛中和抗体(如PG16和PGT145等)，完全失去灵敏度。对此结果的唯一解释就是，Env作为跨膜蛋白的胞外、跨膜和胞内区的构象与动态特征是相互关联的(图1A)。也就是说，改变胞内区的结构会破坏跨膜区的结构，而跨膜区的结构对胞外区的三聚体组装结构又起到稳定性的作用。所以，胞内区的变异破坏了Env跨膜蛋白的整体结构，间接导致了胞外区结构的不稳定。
此外，对于一些以多聚体(如三聚体)形态存在的受体，跨膜区对其胞外区聚合状态极为重要，比如TNFR家族中的Fas、TNFR1和DR5。本发明人之前的研究(Molecular Cell2016；61:602-13)表明，Fas跨膜区的三聚能力极强，且当Fas跨膜区发生一些突变时，会导致疾病的产生，因为突变导致了跨膜区三聚体的解聚(图1B)。此外，部分膜蛋白的胞外区仅由膜蛋白多次跨膜后形成的无规则卷曲(loop)所组成，因此无法脱离跨膜区独立形成构象表位(epitope)。因此，仅用靶点蛋白(受体)的胞外区并不能令人满意地精确“复刻”该靶点在细胞膜上的正确结构。
稳定的“原生抗原”可保持靶点受体的初始构象，用于体外高通量筛选以及动物体内免疫等抗体制备技术，有望大幅提升抗体靶向的精准度，降低其临床应用过程中因脱靶导致的毒性。
然而，原生抗原的制备需要MSP或Saposin、脂质以及膜蛋白三者的组装，而且膜蛋白需要高度纯化。目前的原生抗原瓶颈在于组装效率较低、均一性不理想以及无法直接从活细胞膜上提取膜蛋白。组装效率低和均一性差的原因在于部分纳米碟中并没有膜蛋白的存在，而另一部分则存在2个或以上的膜蛋白分子。由于原生抗原的制备需要纯的膜蛋白，因此膜蛋白原来结合的磷脂双分子层将在纯化中丢失，取而代之的是人为添加的脂质，这使得原生抗原略有缺憾。
综上所述，为了发挥原生抗原在抗体药物研发中的重要作用，本领域亟需一种直接从细胞膜上靶向提取膜蛋白的技术，以高保真地在体外制备原生抗原。
发明内容
本发明的目的是提供一种高保真地从细胞膜上捕获和制备原生抗原的方法，以及用于该方法的脂质结合蛋白-抗原捕获模块复合物及其应用。
在本发明的第一方面，提供了一种用于捕获原生抗原的复合物，所述复合物具有式I结构：
R1-(CM)m (I)
式中，
R1为脂质结合蛋白；
m为≥1的正整数；
CM为与R1相连的具有式II结构的抗原捕获模块，
A1-R2-A2-R3 (II)
式中，
A1为与R1相连的连接基团，或不存在；
R2为柔性连接物(或捕获臂元件)；
A2为无或连接基团
R3为亲和探针(或捕获手元件)；
各“-”为键。
在另一优选例中，m为1-10的正整数，较佳地为1、2、3、4、5、6、7、8、或9。
在另一优选例中，所述的抗原捕获模块CM连接于所述脂质结合蛋白的任意位置。
在另一优选例中，所述的抗原捕获模块CM连接于所述脂质结合蛋白的选自下组的位点：Cys、Lys、或其组合。
在另一优选例中，所述抗原捕获模块CM位于R1选自下组的位置：C末端、N末端、R1多肽链的中间位置、或其组合。
在另一优选例中，所述脂质结合蛋白R1选自下组：MSP、Saposin A、或其组合。
在另一优选例中，所述脂质结合蛋白R1为MSP全长蛋白、或其片段、或其截短形式，或其具有类似功能的衍生蛋白(如改造延长蛋白)。
在另一优选例中，所述改造延长蛋白为重复MSP蛋白中的脂质结合片段以增加MSP长度的蛋白。
在另一优选例中，所述脂质结合蛋白R1为Saposin A全长蛋白、或其片段、或其截短形式。
在另一优选例中，所述脂质结合蛋白R1为MSP全长蛋白、或其片段、或其截短，或其延长形式与Saposin A全长蛋白、片段或截短形式形成的融合蛋白。
在另一优选例中，所述MSP延长形式为MSP改造延长蛋白。
在另一优选例中，所述脂质结合蛋白R1包括野生型和突变型。
在另一优选例中，所述的脂质结合蛋白R1为MSP的半胱氨酸突变体。
在另一优选例中，所述的MSP的半胱氨酸突变体的氨基酸序列如SEQ IDNO.1或SEQID NO.2所示。
在另一优选例中，所述的脂质结合蛋白R1为Saposin A蛋白半胱氨酸突变体。
在另一优选例中，所述的Saposin A蛋白半胱氨酸突变体的氨基酸序列如SEQ IDNO.8所示。
在另一优选例中，所述连接物R2为柔性连接物(linker)。
在另一优选例中，所述连接物R2的长度为10-300A、优选50-200A、更优选100-150A、又更优选90-110A、最优选95.3A。
在另一优选例中，所述连接物R2选自下组：聚乙二醇、多肽、DNA、PNA。
在另一优选例中，所述聚乙二醇为(PEG)n，其中n为1-30的任一正整数。
在另一优选例中，n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30。
在另一优选例中，所述连接基团A1为可与脂质结合蛋白R1结合的基团。
在另一优选例中，所述连接基团A1为可与氨基(-NH2)、羧基(-COOH)、巯基(-SH)、亚氨基(＝NH)反应的化学基团。
在另一优选例中，所述可与-NH2反应的基团选自下组：NHS酯(N-hydroxysuccinimide ester)、醛基或其组合。
在另一优选例中，所述可与-SH反应的基团选自下组：马来酰亚胺(Maleimide)基团，卤乙酰基(Haloacetyl)，硫代吡啶(Pyridyldithiol)。
在另一优选例中，所述连接基团A2为可与亲和探针R3结合的基团。
在另一优选例中，所述连接基团A2为可与氨基(-NH2)、羧基(-COOH)、巯基(-SH)、亚氨基(＝NH)反应的化学基团。
在另一优选例中，所述可与-NH2反应的基团选自下组：NHS ester(N-hydroxysuccinimide ester)，醛基。
在另一优选例中，所述可与-SH反应的基团选自下组：马来酰亚胺(Maleimide)基团，卤乙酰基(Haloacetyl)，硫代吡啶(Pyridyldithiol)。
在另一优选例中，所述亲和探针R3选自下组：小分子、核酸、蛋白质或其片段。
在另一优选例中，所述亲和探针R3选自下组：可与His-tag结合的小分子、抗His-tag单链抗体(scFv)、Nanobody。
在另一优选例中，所述小分子选自下组：tri-NTA(三-氨基三乙酸)、di-NTA(二-氨基三乙酸)，tetra-NTA(四-氨基三乙酸)，NTA(氨基三乙酸)。
在另一优选例中，所述单链抗体序列如SEQ ID NO.4所示。
在本发明的第二方面，提供了一种如在本发明的第一方面所述的用于捕获原生抗原的复合物的制备方法，包括如下步骤：
(1)将亲和探针R3与连接物R2一端化学偶联，得到抗原捕获模块CM(较佳地，其结构为A1-R2-A2-R3)；
(2)将抗原捕获模块CM与脂质结合蛋白R1通过连接基团A1偶联，得到R1-(CM)m复合物；和
(3)任选地，从反应体系中分离得到所述R1-(CM)m复合物。
在另一优选例中，所述连接物R2为两端活化的连接物。
在本发明的第三方面，提供了一种用于捕获细胞膜上的膜蛋白抗原的捕获体系，包括：
(i)本发明的第一方面所述的用于捕获原生抗原的复合物；
(ii)任选的脂质结合蛋白，所述的脂质结合蛋白是未修饰的；
(iii)任选的去污剂；和
(iv)任选的细胞膜。
在另一优选例中，所述组分(i)和(ii)的摩尔比为1:5至5:1，较佳地1:2至2:1，较佳地约1:1。
在另一优选例中，所述组分(ii)不存在。
在另一优选例中，所述去污剂选自下组：DM(十烷基-B-D-麦芽糖苷)，DDM(正十二烷基β-D-麥芽糖苷)，LMNG(月桂基麦芽糖新戊二醇)。
在另一优选例中，所述细胞膜为活细胞的细胞膜。
在本发明的第四方面，提供了一种从细胞膜上捕获原生抗原的方法，包括以下步骤：
(a)提供来自细胞的细胞膜样品；
(b)将所述细胞膜样品与本发明的第一方面所述的用于捕获原生抗原的复合物混合，或与本发明的第三方面所述的捕获体系混合，从而形成混合物；
(c)任选地，从上述混合物中分离所述原生抗原。
在另一优选例中，所述的细胞膜样品包括活细胞膜、死细胞膜、或其组合。
在另一优选例中，所述分离为分子筛纯化、基于亲和标签的亲和柱层析、离子交换层析。
在另一优选例中，所述细胞为活细胞。
在另一优选例中，所述细胞为表达抗原蛋白R5的活细胞。
在另一优选例中，所述细胞为表达带亲和标签R6的抗原蛋白R5的活细胞。
在本发明的第五方面，提供了一种用本发明的第四方面所述方法制备的原生抗原。
在另一优选例中，所述原生抗原包括：
(1)抗原蛋白R5，所述的抗原蛋白R5具有来源于活细胞的具有免疫原性的表位；
(2)脂质结合蛋白R1；和
(3)脂质分子R4；
其中，所述的脂质结合蛋白R1围绕所述的脂质分子R4，而所述的脂质分子R4形成脂质层，而所述的抗原蛋白R5嵌入所述的脂质层，并露出所述的具有免疫原性的表位。
在另一优选例中，所述的原生抗原中，抗原蛋白R5与脂质结合蛋白R1(包括来自未修饰的脂质结合蛋白R1和来自复合物的脂质结合蛋白R1)的摩尔比为约1:1。
在另一优选例中，所述的原生抗原中，当m＝1时，抗原蛋白R5与亲和探针(或捕获手元件)R3的摩尔比为约1:1至1:2，较佳地为约1:1或约1:2。
在另一优选例中，当m≠1(如m＝2、3、或4)时，在所述的原生抗原中，抗原蛋白R5与亲和探针(或捕获手元件)R3的摩尔比为约1:m至1:2m，较佳地为约1:m或约1:2m。
在另一优选例中，所述抗原蛋白R5为膜蛋白。
在另一优选例中，所述膜蛋白为来源于细胞表面的膜蛋白。
在另一优选例中，所述膜蛋白为来源于活细胞表面的膜蛋白。
在另一优选例中，所述脂质分子R4为磷脂分子。
在另一优选例中，所述脂质层为磷脂双分子层。
在另一优选例中，所述磷脂双分子层来源于细胞。
在另一优选例中，所述磷脂双分子层来源于活细胞。
在另一优选例中，所述原生抗原还包括结合于脂质结合蛋白R1的一个或多个抗原捕获模块CM。
在另一优选例中，所述抗原蛋白R5上还含有亲和标签R6。
在另一优选例中，所述的R6与R3是互相作用的或互相结合的。
在另一优选例中，所述亲和标签R6为亲和纯化标签。
在另一优选例中，所述亲和标签R6选自下组：His-tag，FLAG-tag、Strep-tag、AviTag，E-tag，HA-tag，Myc-tag，MBP-tag，GST-tag，Halo-tag，V-tag。
在另一优选例中，所述亲和标签位于抗原蛋白R5的胞外区，可为N或C末端，或是胞外区其他不影响结构的部位。
在另一优选例中，所述亲和探针R3为可与亲和标签R6结合的亲和探针。
在另一优选例中，所述原生抗原为直接从细胞膜上靶向提取的膜蛋白原生抗原。
在本发明的第六方面，提供了如本发明的第五方面所述原生抗原的用途，(a)用于筛选和/或制备抗体；(b)用于制备检测抗体的检测剂。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1：跨膜区多聚体组装对胞外区结构稳定的重要性。(A)HIV-1Env蛋白的跨膜区结构对胞外区的抗体识别有很大的影响。(B)跨膜区三聚体的形成对Fas受体传导细胞凋亡信号是关键的。
图2：原生靶点最常见的三类制备方式。
图3：原核细胞(大肠杆菌)膜上表达的TSPO蛋白拓扑结构图。TSPO被大肠杆菌表达至细胞内膜上，且N端His-tag朝向细胞周质空间，而C末端则在细胞内。
图4：His-TSPO蛋白的Ni-NTA亲和纯化SDS-PAGE结果。M表示蛋白标准品，泳道1为20mM咪唑洗脱的样品，泳道2为500mM咪唑洗脱的样品。泳道2中最下面的条带即为His-TSPO，大小约为15kDa。
图5：小分子亲和探针tri-NTA(针对His-tag)的化学合成路线图。化合物9即为最终的tri-NTA。
图6：高效液相色谱(HPLC)分析tri-NTA的产品纯度。所用柱子为C18柱。HPLC纯度：95.2％。
图7：小分子亲和探针tri-NTA(针对His-tag)的核磁共振一维H谱。
图8：小分子亲和探针tri-NTA(针对His-tag)的质谱分析结果。预测分子量：1063.07。
图9：高效液相色谱(HPLC)分离亲和臂Maleimide-(PEG)6-tri-NTA。Maleimide-(PEG)6-tri-NTA为tri-NTA上的NH2与Maleimide-(PEG)6-NHS的NHS ester反应的产物。带星号标记的峰即为亲和臂Maleimide-(PEG)6-tri-NTA。
图10：带亲和臂的MSP蛋白与His-tagged蛋白His-TEV的亲和能力测定。为验证MSP--(PEG)6-tri-NTA确实能够靶向His-tag亲和标签，利用等温滴定量热法(ITC)测定MSP--(PEG)6-tri-NTA与HIS-TEV蛋白的亲和力。
图11：TSPO纳米碟的分子筛谱图。非靶向制备的TSPO纳米碟(只使用了MSP-Strep蛋白)、靶向制备的TSPO纳米碟(使用了带有亲和臂Tri-NTA-PEG24的MSP蛋白以及MSP-strep蛋白)和空的纳米碟。
图12：TSPO纳米碟的Western blot结果。非靶向制备的TSPO纳米碟(只使用了MSP-Strep蛋白)、靶向制备的TSPO纳米碟(使用了带有亲和臂Tri-NTA-PEG24的MSP-strep蛋白以及MSP-strep蛋白)在制备过程中的条件完全一致，除了所使用的MSP纳米碟蛋白有所不同(是否带有亲和臂)。使用抗Strep抗体可以检测到带亲和臂Tri-NTA-PEG24的MSP-strep蛋白以及MSP-strep蛋白，而抗His抗体可以检测到TSPO(N端有His标签)。捕获模块将TSPO纳入纳米碟的效率增加约4倍(靶向/非靶向捕获具体比例为4：1)。
图13：靶向制备的TSPO纳米碟的电镜观察结果。纳米碟的直径均为10nm左右，与正常纳米碟的大小一致。
图14：将TSPO的原生抗原用于酵母展示技术，筛选全人源抗体。小方框内的部分为PE和FITC荧光强度双阳性区域，表示针对TSPO的抗体比例。PE荧光强度代表抗体在酵母表面展示，FITC荧光强度表示有原生抗原与酵母表面的抗体结合。
图15：单克隆酵母细胞表面的抗体对TSPO原生抗原的结合能力检测。用流式细胞仪检测荧光标记后的TSPO原生抗原与三个随机挑选的阳性单克隆酵母细胞亲和力。阴性对照为未诱导抗体表达在表面的酵母细胞。M1代表该单克隆酵母细胞与TSPO原生抗原结合的细胞群。
图16：本发明原生抗原的结构示意图。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，首次开发了一种可高保真且高效地制备原生抗原的方法。具体地，本发明人利用脂质结合蛋白、抗原捕获模块(包括连接基团、连接物、亲和探针)构建了一种新型的脂质结合蛋白-抗原捕获模块复合物(R1-(CM)m)。使用所构建的复合物和纳米碟(Nanodisc)技术，可从细胞膜(例如活细胞膜)上高保真且高效地捕获(例如靶向提取)其表面的膜蛋白，从而制得原生抗原。所述原生抗原在纳米碟的磷脂双分子层环境中保持了其在细胞膜上时的原始结构和构象，可应用于精准筛选针对细胞膜蛋白真实构象的抗体药物。在此基础上完成本发明。
术语
如本文所用，术语“本发明复合物”、“本发明捕获模块复合物”或“脂质结合蛋白-抗原捕获模块复合物”等互换使用，指本发明第一方面中所述的用于从细胞膜上捕获从而形成原生抗原的复合物。
如本文所用，术语“本发明原生抗原”、“本发明抗原”或“本发明的纳米碟抗原”等互换使用，指用本发明复合物，将位于细胞膜上的膜蛋白与其周围的细胞膜组分一起捕获下来，从而形成的原生抗原。
脂质结合蛋白-抗原捕获模块复合物
本发明提供了一种用于从细胞膜上捕获膜蛋白，从而形成原生抗原的复合物。
典型地，本发明复合物具有式I结构：
R1-(CM)m (I)
式中，
R1为脂质结合蛋白；
m为≥1的正整数(如1-20，较佳地1-10，更佳地1、2、3、4、或5)；
CM为与R1相连的具有式II结构的抗原捕获模块，
A1-R2-A2-R3 (II)
式中，
A1为与R1相连的连接基团，或不存在；
R2为柔性连接物(或捕获臂元件)；
A2为无或连接基团；
R3为亲和探针(或捕获手元件)；
各“-”为键或连接片段(如连接肽片段)。
当用本发明的复合物与细胞膜(包括活细胞的细胞膜)接触时，所述复合物可以直接从细胞膜上捕获膜上的抗原，从而形成原生抗原。
原生抗原
如本文所用，“膜蛋白原生抗原”、“原生抗原”、“抗原复合物”可以互换使用，指抗原蛋白R5、脂质结合蛋白R1、脂质分子R4形成的复合物，其中所述的抗原蛋白R5具来源于细胞膜(例如活细胞的细胞膜)的具有免疫原性的表位；所述的脂质结合蛋白R1围绕所述的脂质分子R4，而所述的脂质分子R4形成脂质层，而所述的抗原蛋白R5嵌入所述的脂质层，并露出所述的具有免疫原性的表位。
在本发明的一个具体实施方式中，原生抗原由脂质结合蛋白R1(如MSP，SaposinA)，亲和臂(包括连接物R2和亲和探针R3)，脂质分子R4，以及抗原蛋白R5组成。
在本发明的一个具体实施方式中，所述亲和臂中所述连接物R2带有连接基团A1，即所述亲和臂为抗原捕获模块CM，结构为A1-R2-R3，亲和臂与脂质结合蛋白R1通过连接基团A1以化学键偶联。
在本发明的另一个具体实施方式中，所述亲和臂中所述连接物R2带有连接基团A1，即所述亲和臂为抗原捕获模块CM(结构为A1-R2-A2-R3)，亲和臂与脂质结合蛋白R1通过连接基团A1以化学键偶联；所述亲和臂中连接物R2与亲和探针R3通过连接基团A2以化学键偶联。
在本发明的一个具体实施方式中，所述脂质分子R4为磷脂分子，优选所述磷脂分子R4形成磷脂双分子层。
典型地，所述抗原蛋白R5为来源于活细胞的膜蛋白。
典型地，所述活细胞膜上的膜蛋白一般在N末端或C末端带有亲和标签，或者也可以在膜蛋白其他不影响结构的表面插入亲和标签。
典型地，所述亲和臂上的亲和探针R3可以膜蛋白上的亲和标签R6(Affinity tag)结合。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的原生抗原为6个部分(R1-R6)：脂质结合蛋白R1、亲和臂上的连接物R2(l inker)、亲和臂上的亲和探针R3、来源于活细胞的磷脂双分子层R4、来源于活细胞表面的膜蛋白R5、膜蛋白上的亲和标签R6。
典型地，本发明的原生抗原的结构如图16所示,其中包括：
R1为脂质结合蛋白，如MSP或Saposin A；
R2为亲和臂上的连接物(linker)，比如NHS-(PEG)n-Maleimide(n为1～20)；
R3为亲和臂上的亲和探针，例如对His-tag有强亲和力的核酸、蛋白质、小分子等；
R4为来源于活细胞的磷脂双分子层；
R5为来源于活细胞表面的膜蛋白；
R6为膜蛋白上的亲和标签，例如His-tag、FLAG tag、Strep tag等亲和层析中常用的蛋白标签。
脂质结合蛋白
在本发明中，可以采用各种不同的脂质结合蛋白。代表性的脂质结合蛋白是MSP或其活性片段或其衍生蛋白。在本发明中，脂质结合蛋白可以是野生型或突变型的。
典型地，所述的脂质结合蛋白R1为MSP的半胱氨酸突变体，其氨基酸序列如SEQ IDNO.1或SEQ ID NO.2所示。
典型地，所述的脂质结合蛋白R1为Saposin A蛋白半胱氨酸突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。
抗原捕获模块
典型地，所述的亲和臂上的连接物R2为两端活化的聚乙二醇(PEG)，该连接物一端为可与-NH2反应的基团，如NHS酯(N-hydroxysuccinimide ester)，另一端为可与-SH反应的化学基团，如马来酰亚胺(Maleimide)基团。
典型地，所述亲和臂上的亲和探针为与His-tag有极强亲和力的小分子tri-NTA(三-氨基三乙酸)，其结构如图5所示；或抗His-tag单链抗体(scFv)，其序列如SEQ ID NO.4所示。
在本发明的一个优选的实施方式中，所述膜蛋白上的亲和标签为His-tag，氨基酸序列为6×His。较佳地，该亲和标签在膜蛋白上位置为N末端或C末端。
纳米碟(Nanodisc)
根据本发明，MSP纳米碟(MSP Nanodisc)是指磷脂双分子层被脂质结合蛋白MSP(apolipoprotein A1，也称为membrane scaffold protein)圈住所形成的圆盘状复合物，由于没有去污剂的的参与，可高度模拟细胞膜的结构。它的直径可由所使用的MSP蛋白长度决定，常见的为10.6nm和12.9nm，因此也被称为纳米碟。它由大约150个磷脂分子和两个MSP蛋白分子组成。
在本发明中，Saposin指能同样结合脂质分子的Saposin A蛋白质。Saposin可替代MSP蛋白包裹磷脂双分子层，从而形成另一种形式的纳米碟。
亲和臂
本发明中，亲和臂包括连接物R2和亲和探针R3。
在本发明的一个具体实施方式中，所述亲和臂中所述连接物R2带有连接基团A1，即所述亲和臂为抗原捕获模块CM，结构为A1-R2-R3，亲和臂与脂质结合蛋白R1通过连接基团A1以化学键偶联。
在本发明的另一个具体实施方式中，所述亲和臂中所述连接物R2带有连接基团A1，即所述亲和臂为抗原捕获模块CM(结构为A1-R2-A2-R3)，亲和臂与脂质结合蛋白R1通过连接基团A1以化学键偶联；所述亲和臂中连接物R2与亲和探针R3通过连接基团A2以化学键偶联。
典型地，带有亲和臂的MSP蛋白上的亲和探针(比如tri-NTA)可特异性以1:1摩尔比识别活细胞表面带有亲和标签(如6*His-tag)的膜蛋白，使得MSP蛋白得以接近目标膜蛋白，提高原生抗原制备的效率和均一性。
典型地，若膜蛋白上的亲和标签为6×His-tag(6个组氨酸)，优选的亲和探针是tri-NTA，每个NTA分子与2个His作用，因此tri-NTA可与6*His-tag以1:1的摩尔比结合。同时，它们之间的亲和力高达～10nM，且不受洗涤剂(detergent)、去污剂(如盐酸胍、尿素等)、盐离子浓度的影响。
典型地，对于反应体系存在金属螯合剂(如EDTA)以及亲和标签不是His-tag的情形，更为优选的亲和探针是scFv或纳米抗体(Nanobody)等蛋白质。
典型地，所述亲和臂中的A1-R2-A2为NHS-(PEG)n-Maleimide(即A1为NHS，R2为(PEG)n，A2为Maleimide)，n可为1～20，具体数值由膜蛋白上亲和标签与MSP蛋白的距离而定。连接物上的NHS酯与亲和探针上的-NH2反应，而Maleimide则用于与MSP蛋白突变体上的半胱氨酸(Cys)-SH基团反应形成硫醚键。
从细胞膜上捕获原生抗原的方法
本发明还提供了一种从细胞膜上捕获原生抗原的方法。
根据本发明，从细胞膜上捕获原生抗原的方法是采用本发明的复合物，通过基于MSP、Saposin等脂质结合蛋白的纳米碟技术，从细胞膜上直接捕获膜抗原，从而制得原生抗原。用本发明方法，不仅可制备全长膜蛋白抗原，而且制备的原生抗原具有与真实细胞膜的膜环境几乎相同的微环境。
典型地，本发明提供了一种直接从活细胞膜上靶向提取膜蛋白从而制备原生抗原的方法，包括下列步骤：
(1)提供细胞样品；
(2)制备带有半胱氨酸突变位点的MSP蛋白；
(3)将PEG连接物的NHS端与tri-NTA上唯一的-NH2连接以制备亲和臂；
(4)再将亲和臂上的马来酰亚胺基团与MSP纳米碟上的半胱氨酸-SH反应制备成带有亲和臂的MSP；
(5a)将带有亲和臂的MSP纳米碟与细胞表面有亲和标签膜蛋白的活细胞孵育一定时间，使亲和臂抓取膜蛋白上的亲和标签，同时让MSP蛋白锚定在膜上、圈住膜蛋白，再加入野生型的MSP蛋白与带有亲和臂的MSP蛋白形成MSP纳米碟，从细胞膜上脱落；或，
(5b)将带有亲和臂的Saposin A蛋白(单体)与细胞表面有亲和标签膜蛋白的活细胞孵育一定时间，使亲和臂抓取膜蛋白上的亲和标签，同时让Saposin A蛋白锚定在膜上、圈住膜蛋白；
(6)得到含该膜蛋白的原生抗原。
本发明方法利用带有亲和臂的MSP蛋白，可通过靶向膜蛋白上的亲和标签接近该膜蛋白，然后通过与膜蛋白周围的磷脂双分子层结合直接圈住活细胞膜上的靶点膜蛋白，再加入野生型MSP蛋白即可将组装有膜蛋白的MSP纳米碟从细胞膜上游离，得到原生抗原。因此本发明提供的靶向提取方法具有高效、特异性强、产物均一性高、采用原有细胞膜脂质、维持膜蛋白原有结构(高保真)等的优异特点。
原生抗原的用途
本发明还提供了一种原生抗原在抗体药物制备中的应用，尤其是在筛选和/或制备抗体中的应用。
本发明的原生抗原可用于体外筛选技术(如酵母展示技术、噬菌体展示技术等)，以开发针对相应膜蛋白的单克隆抗体，也可用于通过体内免疫(如用原生抗原免疫小鼠)的形式筛选单克隆抗体。
由于用本发明制备的原生抗原具有高保真的特点，且原生抗原中膜蛋白所处的膜环境(或微环境)与天然状态下的膜环境基本相同，因此特别适合开发对蛋白的结构或构象有严格要求的场合。
本发明的主要优点在于：
(1)本发明脂质结合蛋白-抗原捕获模块复合物可直接从活细胞膜上靶向提取膜蛋白原生抗原；
(2)本发明方法具有使用简便、应用广泛、高效率、靶向提取的特点；
(3)利用本发明方法制备的原生抗原具有结构保真、均一性、高稳定性等特征；
(4)本发明中的原生抗原由于亲和臂的存在具有更高的均一性、稳定性，而且其结构更接近膜蛋白的原始构象，以及所处的膜环境更贴近活细胞膜上的情形；
(5)本发明中的原生抗原制备技术可直接从活细胞表明将膜蛋白提取出、放入纳米碟中，无需像现有技术一样将膜蛋白事先纯化，大大简化了操作流程；
(6)本发明中的原生抗原制备技术可改变亲和标签和对应的亲和探针、调节亲和臂的长度，适用性广泛；
(7)本发明中的原生抗原制备技术可克服哺乳动物细胞表达体系膜蛋白表达量低的问题，靶向制备原生抗原。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。本发明中所涉及的实验材料如无特殊说明均可从市售渠道获得。
实施例1：活细胞(原核细胞)上膜蛋白的表达:
对于在原核细胞表面表达膜蛋白，以大肠杆菌细胞为例，在其细胞膜上表达TSPO(Translocator protein)膜蛋白。根据文献报道，TSPO蛋白表达在大肠杆菌内膜上，其N末端在膜外，而C末端在膜内(见图3)。因此，在TSPO蛋白的N末端添加His-tag(HHHHHH)，其最终的氨基酸序列如下所示：
HHHHHHNMDWALFLTFLAASGAPATTGALLKPDEWYDNLNKPWWNPPRWVFPLAWTSLYFLMSLAAMRVAQLEGSGQALAFYAAQLAFNTLWTPVFFGMKRMATALAVVMVMWLFVAATMWAFFQLDTWAGVLFVPYLIWATAATGLNFEAMRLN(SEQ ID NO.6)
将His-TSPO的基因优化为大肠杆菌偏爱的密码子序列，人工合成该序列后，将其克隆至pET28a质粒的NcoI和XhoI酶切位点之间。将合成好的pET28a-His-TSPO转化BL21(DE3)感受态细胞，铺LB琼脂板。挑取BL21(DE3)单菌落，加入至LB培养基中(卡那霉素抗性，50ug/mL)，37度培养至OD600为0.5，加入0.1mM的IPTG表达诱导剂，并将温度调低至16度，继续培养过夜。
为确认His-TSPO蛋白在大肠杆菌内表达，利用Ni-NTA亲和层析纯化His-TSPO蛋白，结果如图4所示。在SDS-PAGE胶上，泳道2的15kDa位置出现纯的条带，表明His-TSPO可被Ni-NTA亲和层析法纯化，验证了该蛋白可被大肠杆菌表达且带有His-tag。
实施例2：制备纳米碟“框架蛋白”MSP和Saposin
对于MSP蛋白，需要分别制备其野生型和半胱氨酸突变体。野生型MSP氨基酸全长序列见SEQ ID NO.5，MSP半胱氨酸突变体的氨基酸序列见SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2。
MGSSHHHHHHENLYFQGSTFSKLREQLGPVTQEFWDNLEKETEGLRQEMSKDLEEVKAKVQPYLDDFQKKWQEEMELYRQKVEPLRAELQEGARQKLHELQEKLSPLGEEMRDRARAHVDALRTHLAPYSDELRQRLAARLEALKENGGARLAEYHAKATEHLSTLSEKAKPALEDLRQGLLPVLESFKVSFLSALEEYTKKLNTQ(SEQ ID NO.5)
SEQ ID NO.1MSP半胱氨酸突变体S86C氨基酸序列(其中，突变后的C用下划线表示，位于第50位)
MGSSHHHHHHENLYFQGSTFSKLREQLGPVTQEFWDNLEKETEGLRQEMCKDLEEVKAKVQPYLDDFQKKWQEEMELYRQKVEPLRAELQEGARQKLHELQEKLSPLGEEMRDRARAHVDALRTHLAPYSDELRQRLAARLEALKENGGARLAEYHAKATEHLSTLSEKAKPALEDLRQGLLPVLESFKVSFLSALEEYTKKLNTQ
SEQ ID NO.2MSP半胱氨酸突变体A95C氨基酸序列(其中，突变后的C用下划线表示，位于第58位)
MGSSHHHHHHENLYFQGSTFSKLREQLGPVTQEFWDNLEKETEGLRQEMSKDLEEVKCKVQPYLDDFQKKWQEEMELYRQKVEPLRAELQEGARQKLHELQEKLSPLGEEMRDRARAHVDALRTHLAPYSDELRQRLAARLEALKENGGARLAEYHAKATEHLSTLSEKAKPALEDLRQGLLPVLESFKVSFLSALEEYTKKLNTQ
对于MSP野生型的制备，首先将其基因序列经大肠杆菌表达密码子优化，克隆进pET21b质粒，构建pET21b-HIS-MSP表达载体。取1ul表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3)，挑取转化后的BL21(DE3)单菌落至LB培养基中(含50ug/mL卡那霉素)，37度培养至OD600＝0.7，加入终浓度为1mM的IPTG诱导表达，37度继续培养3到4小时。离心收集表达完成后的菌体，重悬于50mM Tris-HCl，pH8.0500mM NaCl,1％TritonX-100,1mM EDTA，蛋白酶抑制剂cocktail(Sigma)，利用超声破碎。加入DNaseI水解酶在冰上孵育1小时。孵育结束后，菌液在17000rpm离心20分钟收集上清。利用Ni-NTA亲和纯化HIS-MSP蛋白，先将Ni-NTA填料用上样缓冲液平衡，上样缓冲液为：50mM Tris,pH8.0 500mM NaCl,1％TritonX-100。然后加入上述破碎后菌液上清，使其缓慢流穿Ni-NTA亲和柱，再用10倍柱体积上样缓冲液洗涤、平衡柱子。紧接着用10倍柱体积洗涤缓冲液一(50mM Tris-HCl，pH8.0 500mM NaCl，50mMCholate)冲柱子。然后用10倍柱体积50mM Tris-HCl,pH8.0 500mM NaCl洗柱。加入10倍柱体积洗涤缓冲液二(50mM Tris-HCl,pH8.0 500mM NaCl，20mM咪唑)洗去非特异性结合在柱子上的杂蛋白，最后用洗脱缓冲液(50mM Tris-HCl,pH8.0 500mM NaCl，500mM咪唑)洗脱HIS-MSP。利用透析法将HIS-MSP的缓冲液置换成50mM Tris pH8,20mM NaCl,1mM EDTA,2mMDTT。加入HIS-TEV酶除去HIS-MSP中的His-Tag，酶解完成后再利用透析法将缓冲液换成50mM Tris pH8.0,500mM NaCl，然后用Ni-NTA纯化，收集流穿柱子的MSP蛋白，浓缩至1mM，至此得到纯化后的MSP蛋白。
MSP蛋白半胱氨酸突变体的制备与野生型MSP蛋白的制备相同，除了在菌体破碎、蛋白纯化、蛋白保存的过程中在所有缓冲液中添加足量还原剂，如10mMTCEP或二硫苏糖醇(DTT)或beta-巯基乙醇(BME)。
对于MSP-Strep半胱氨酸突变体蛋白的制备，表达部分同野生型MSP蛋白。
序列如下：
MGSSTFSKLREQLGPVTQEFWDNLEKETEGLRQEMCKDLEEVKAKVQPYLDDFQKKWQEEMELYRQKVEPLRAELQEGARQKLHELQEKLSPLGEEMRDRARAHVDALRTHLAPYSDELRQRLAARLEALKENGGARLAEYHAKATEHLSTLSEKAKPALEDLRQGLLPVLESFKVSFLSALEEYTKKLNTQGGGGSSSAWSHPQFEK(SEQ ID NO.7)
用Strep Tactin填料纯化MSP-Strep半胱氨酸突变体。上样缓冲液为50mMNaH2PO4,150mM NaCl，5mM DTT,pH 7.4，洗脱缓冲液为50mM NaH2PO4,150mMNaCl，5mM DTT,2.5mMdethiobiotin(脱硫生物素),pH 7.4。用上样缓冲液平衡填料后，然后加入包含目的蛋白的菌液上清。使其缓慢流穿Strep Tactin亲和柱，再用20倍柱体积上样缓冲液洗涤、平衡柱子。最后用5倍柱体积的洗脱缓冲液洗脱结合在填料上的MSP-Strep半胱氨酸突变体。
对于Saposin A蛋白半胱氨酸突变体，其氨基酸序列如下所示或见SEQ IDNO.3。
MHHHHHHSSGVDLGTENLYFQSMGSLPCDICKDVVTAAGDMLKDNATEEEILVYLEKTCDWLPKPNMSASCKEIVDSYLPVILDIIKGEMSRPGEVCSALNLCES。(其中，下划线部分来源于表达载体pNIC-Bsa4)。
SEQ ID NO.8Saposin A半胱氨酸突变体N21C氨基酸序列(HIS-Saposin经过TEV酶切后得到的产物)。
SLPCDICKDVVTAAGDMLKDCATEEEILVYLEKTCDWLPKPNMSASCKEIVDSYLPVILDIIKGEMSRPGEVCSALNLCES
首先将Saposin A蛋白半胱氨酸突变体基因序列经大肠杆菌表达密码子优化，然后利用Golden gate Assembly法将其克隆至pNIC-Bsa4表达载体的BsaI酶切位点内。取1ul表达载体转化大肠杆菌Rosetta gami-2(DE3)(Novagen)，挑取转化后的Rosetta gami-2(DE3)单菌落至LB培养基中(含卡那霉素、四环素、氯霉素)，37度培养至OD600＝0.5～0.7，加入终浓度为1mM的IPTG诱导表达，37度继续培养3到4小时。离心收集表达完成后的菌体，重悬于20mM HEPES,pH7.5,150mM NaCl,10mM TCEP，20mM咪唑缓冲液中，超声破碎。超高速(26000g)离心30分钟收集上清，然后将上清加热至85摄氏度10～15分钟，再次超高速离心30分钟，收集上清。上清用Ni-NTA亲和层析法纯化，流程与MSP的纯化过程相似，缓冲液则换成20mM HEPES,pH 7.5,150mM NaCl,10mM TCEP。最后用His-TEV酶去除Saposin A蛋白半胱氨酸突变体N末端的His-tag标签，具体操作同样参考MSP蛋白的纯化过程。最终得到无His-tag的纯Saposin A。
实施例3：亲和探针的制备
以亲和标签为His-tag为例，亲和探针可为tri-NTA等与His-tag有高亲和力的小分子，也可为抗His-tag的scFv等高亲和力蛋白质大分子。
(1)Tri-NTA的合成
Tri-NTA的合成路线见图5。
首先合成化合物1：将溴乙酸叔丁酯(tert-Butyl bromoacetate)(3ml,20mmol)与EDIAP(4.3ml,25mmol)加入到化合物0的DMF溶液(40ml)中(1.65g，5mmol)，在氮气脱氧条件下加热到55摄氏度不断搅拌反应过夜。将反应液加热到60度除去挥发物，再加入20ml的乙酸乙酯，过滤。沉淀用乙酸乙酯继续洗涤三次。收集滤液，浓缩。用硅胶柱纯化，流动相为cyclohexane/ethylacetate(3:1)，得到1.7g的化合物1，得率为62.4％。
合成化合物2：将10％Pd/C(200mg)用氮气吹除溶剂后加入到上述化合物1(1.7g)的100毫升甲醇溶液中。反应瓶填充氢气，然后剧烈搅拌反应液6小时。过滤除去Pd/C，还原条件下除去挥发物，得到1.4g化合物2，为油状液体，得率100％。
合成化合物3：将化合物2(1.4g，3.25nmol)溶解在无水二氯甲烷(100ml)中，再加入Tetraaza cyclam(217mg，1mmol)。然后加入TBTU(1.35g，4.2mmol)和EDIAP(1ml)，吹氮气。室温连续搅拌反应12小时后，在还原条件下除去挥发物质，然后加入二氯甲烷(50ml)。有机相用15ml的去离子水洗三次，干燥。真空脱去挥发溶剂，剩下的油状物用硅胶柱纯化，梯度洗脱，流动相A为100％乙酸乙酯，流动相B为50％乙酸乙酯/甲醇，洗脱体积为5倍柱体积。得到油状化合物3的量为1g，得率67％。
合成化合物5：化合物3(1g，0.694mmol)溶解于30ml的无水二氯甲烷中。加入TBTU(312mg,0.972mmol，1.4eq)和EDIAP(170mg,0.230ML,1.32mmol,1.9eq)，氮气吹，连续搅拌反应12小时，真空除去挥发试剂，加入70ml的二氯甲烷混匀。反应液的有机相用25ml去离子水洗涤三次，干燥，还原条件下浓缩成油状物质。过硅胶柱纯化，梯度洗脱，流动相A为100％乙酸乙酯，流动相B为10％乙酸乙酯/甲醇，洗脱体积为5倍柱体积。得到油状化合物5的量为1g，得率87％。
合成化合物9(Tri-NTA)：将苯酚(250mg)，TIS(250ul)和乙二硫醇(250ul)和水(250ul)与40ml的三氟乙酸混合，加入化合物5(200mg)，室温条件反应12小时。还原条件下除去挥发试剂，剩余的油状物用10ml的三氟乙酸溶解。产物用冷的Diethylether溶解，再用冷的Diethylether洗涤10次，每次15ml，过滤后得到的白色固体即为化合物9，共110mg，得率71％。
Tri-NTA的鉴定：首先利用C18柱对获得的tri-NTA进行HPLC纯度分析，结果如图6所示，其纯度约为95.7％。然后用核磁共振收集它的一维H谱，结果如图7所示，初步验证了其结构正确性。最后用质谱分析了产物的分子量，结果如图8所示，正负电荷模式的结果表明tri-NTA的实际分子量为1062.5，与其理论分子量1063一致。上述鉴定结果表明已成功合成具有正确结构、高纯度的tri-NTA。
(2)抗His-tag单链抗体(scFv)的制备
抗His-tag的单链抗体氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
SEQ ID NO.4抗His-tag的单链抗体氨基酸序列：
QVQLQQSGPEDVKPGASVKISCKASGYTFTDYYMNWVKQSPGKGLEWIGDINPNNGGTSYNQKFKGRATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDSSVYYCESQSGAYWGQGTTVTVSAGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDYKDILMTQTPSSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPFTFGSGTKLEIKR
首先将scFv蛋白对应的基因序列经大肠杆菌表达密码子优化，在它的N末端添加Strep-tag。然后将该基因克隆至pET22b载体的NcoI和XhoI酶切位点之间。pET22b载体上存在pelB信号肽，可将表达后的scFv引导至大肠杆菌周质空间，从而便于二硫键形成。取1ul表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3)，挑取转化后的BL21(DE3)单菌落至LB培养基中(含100ug/mL氨苄青霉素)，37度培养至OD600＝0.7，加入终浓度为0.1mM的IPTG诱导表达，16度继续培养过夜。离心收集菌体，超声破碎后用Strep-Tactin Superflow填料(Qiagen)亲和纯化带Strep-tag的scFv。
实施例4：亲和臂的制备
亲和臂由亲和探针R3和连接物(linker)R2(优选连接物两端带有连接基团A1和A2，即A1-R2-A2)组成。本实施例以tri-NTA作为亲和探针R3，以Maleimide-(PEG)6-NHS作为两端带有连接基团的连接物(linker)A1-R2-A2，说明亲和臂的制备过程。
反应目的是将tri-NTA上唯一的NH2与Maleimide-(PEG)6-NHS的NHS ester反应，得到产物Maleimide-(PEG)6-tri-NTA。将10mg tri-NTA(9.41umol)粉末溶解于5ml碳酸钠缓冲液(pH 8.3)中，同时将tri-NTA粉末用DMSO配制成250mM的母液。取152ul的tri-NTA母液加入到上述tri-NTA溶液中，快速搅拌混匀，室温避光反应2小时。用1M Tris-HCl终止反应，反应结束后过C8柱纯化(结果见图9)，收集出峰的组分，用核磁鉴定出Maleimide-(PEG)6-tri-NTA的产物峰，冷冻干燥后置于-80度保存备用。
实施例5：制备带有亲和臂的纳米碟蛋白
将合成好的亲和臂与纳米碟蛋白偶联，制备出带有亲和臂、能靶向特定亲和标签的纳米碟蛋白。在本实施例中，以MSP蛋白半胱氨酸突变体S87C为纳米碟蛋白，以实施例4中的Maleimide-(PEG)6-tri-NTA为亲和臂，作为例子展示带有亲和臂的纳米碟蛋白制备过程。
在MSP蛋白半胱氨酸突变体S87C(以下简称为MSP S87C)的溶液中加入4倍摩尔比的还原剂(如TCEP、DTT等)，室温放置1小时。用PD10脱盐柱除去MSP S87C溶液中的还原剂，同时将缓冲液置换为磷酸盐缓冲液(pH 7.4)。加入2倍摩尔比过量的Maleimide-(PEG)6-tri-NTA，室温反应2小时。最后加入6倍于MSP S87C摩尔比的NiSO4，使得每个NTA能够结合上Ni离子，恢复其对His-tag的亲和力。用PD10脱盐柱除去未反应的小分子，得到纯的产物MSP--(PEG)6-tri-NTA。
为验证MSP--(PEG)6-tri-NTA确实能够靶向His-tag亲和标签，利用等温滴定量热法(ITC)测定MSP--(PEG)6-tri-NTA与HIS-TEV蛋白的亲和力。结果见图10，表明滴定过程中有极强的放热反应，即MSP--(PEG)6-tri-NTA能快速结合HIS-TEV，证实了MSP--(PEG)6-tri-NTA可靶向结合His-tag。
实施例6：利用带有亲和臂的纳米碟蛋白直接从活细胞(原核细胞)膜上靶向提取膜蛋白原生抗原
由于实施例1中的His-TSPO表达在大肠杆菌的内膜上，因此首先需要将大肠杆菌的外膜破碎，暴露出大肠杆菌内膜以及在其上面的His-TSPO的N端His-tag。
将实施例1中500ml表达有His-TSPO的大肠杆菌细胞离心收集菌体，加入60ml的30mM Tris-HCl pH 8,20％蔗糖缓冲液，再加入120ul 0.5M EDTA，pH 8(终浓度为1mM)。在室温下缓慢搅拌10分钟。在4度以10000g转速离心10分钟收集菌体，用60ml预冷的5mMMgSO4重悬细胞，然后在冰上缓慢搅拌10分钟，在此过程中，细胞外膜逐渐破碎。4度10000g的转速离心10分钟收集仅含细胞内膜的大肠杆菌菌体。
处理后的细胞用冷的PBS(pH 7.4)洗涤两次，加入摩尔比为1:1的MSP--(PEG)24-tri-NTA和MSP混合物孵育10～60分钟。孵育结束后300g离心10分钟收集细胞，用冷PBS(pH7.4)洗涤两次。加入0.5％的DM(癸基-β-D-麦芽糖苷)继续在4度孵育过夜。用透析或者Bio-Beads的方式除去去污剂。离心收集上清，加入20mM的EDTA使得tri-NTA和His-tag分开，便于后续亲和纯化。若MSP上有亲和标签(如Strep)，则用Strep亲和纯化填料先纯化原生抗原，再用cobalt填料针对His-tag蛋白进行进一步纯化。最后将样品超滤浓缩后用分子筛分离出来源于活细胞膜的膜蛋白原生抗原。
实施例7：原生抗原的鉴定
用分子筛、Western blot、电镜等方法验证膜蛋白是否已成功放入纳米碟中。
(1)分子筛
用Sepharose 6 10/300GL层析柱分离原生抗原纳米碟。将实施例6中初步纯化的原生抗原纳米碟浓缩至0.5ml，上样后用分子筛进一步纯化和分析。
结果如图11所示，靶向提取、制备的原生抗原纳米碟在分子筛谱图中呈现单一的蛋白峰，且相比非靶向提取的原生抗原纳米碟(纳米碟蛋白不带有亲和臂和亲合探针)峰型更窄，表明该样品非常均一。同时该蛋白峰比空的纳米碟出峰时间更早，表明纳米碟中确实存在膜蛋白(原生抗原)使得其总分子量大于空的纳米碟。
(2)Western blot分析原生抗原纳米碟的蛋白组成
实施例6中靶向制备的原生抗原纳米碟包含了带有Strep标签的纳米碟蛋白和带有His标签的TSPO膜蛋白。因此，鉴于分子筛谱图已证实原生抗原纳米碟的均一性、完整性，利用抗Strep和His抗体可以进一步验证两种蛋白是否组装在一起。
结果如图12所示，利用带亲和臂纳米碟蛋白靶向制备的TSPO纳米碟包含更多的TSPO蛋白，相比用普通纳米碟蛋白(无亲和臂)非靶向制备的TSPO纳米碟更有效率，捕获模块将TSPO纳入纳米碟的效率增加约4倍(靶向/非靶向捕获具体比例为4：1)。另外，Westernblot的结果表明TSPO蛋白和纳米碟蛋白均存在于样品中，而分子筛结果又表明样品高度均一，表明TSPO蛋白已成功与纳米碟蛋白组装成原生抗原纳米碟。
(3)电镜观察原生抗原纳米碟样品
为进一步确认TSPO纳米碟样品的均一性，将样品用甲酸铀酰负染后，在电镜下观察样品中蛋白颗粒的形状。
结果如图13所示，TSPO纳米碟样品中均为呈现圆盘状的典型纳米碟，表明样品非常均一。
实施例8：利用膜蛋白原生抗原筛选全人源抗体
将实施例6中制备的原生抗原中His-TSPO用抗His单抗荧光标记，同时用抗Strep抗体荧光标记MSP蛋白，双标后的原生抗原纳米碟作为酵母展示技术筛选过程的抗原，同时利用空纳米碟作为抗原对照，用细胞分选仪筛选时间隔加入空纳米碟作为抗原的筛选，最终目的在于筛选出只针对原生抗原中TSPO胞外区部分的单链抗体。其他流程参考GingerChao et al.,Isolating and engineering human antibodies using yeast surfacedisplay.Nature Protocols.1,755-768(2006)中描述的筛选流程。经过三轮筛选，阳性克隆率高达50％以上(见图14)。
将筛选到的阳性酵母稀释后铺SDCAA平板，在30度孵育3～4天直至看到米粒大小白色菌落。挑选多个单克隆菌落，在SDCAA培养液中培养过夜。利用流式细胞仪检测各酵母单克隆对TSPO原生抗原的结合情况，实施例6中制备的TSPO原生抗原的N端用抗His单抗-FITC直接荧光标记，将荧光标记后的TSPO原生抗原用于酵母单克隆的免疫染色。结果如图15所示，各阳性酵母单克隆细胞菌表现出对TSPO原生抗原不同程度的亲和力，表明原生抗原可应用于抗体筛选，且像TSPO这样多次跨膜、胞外区暴露程度低的膜蛋白也可制备成原生抗原，成功筛选到抗体。
讨论
在抗原制备领域，如何将完整的靶点蛋白(受体)在体外完美地“复刻”，使之成为“原生靶点”，难点在于跨膜区的稳定。
如图2所示，有三种方法可以供选择。1.用去污剂(detergent，含有亲水基和疏水基)将膜蛋白的跨膜区包裹，形成胶束(micelle)；2.将膜蛋白插入脂质体(liposome)，形成胞外区在脂质体外的“人造细胞”(artificial cell)；3.利用去污剂包裹部分脂质，而膜蛋白则插入脂质中，形成圆盘状的双分子胶束(bicelle)。
然而，胶束(micelle)和双分子胶束(bicelle)中的膜蛋白虽然已非常接近，但需要高浓度去污剂和脂质维持该体系，使得它们无法成为抗原用于体内免疫或体外高通量筛选。脂质体(Liposome)可以较好地模拟膜环境，但它作为抗原载体在高通量筛选的过程无法稳定。
因此，“纳米碟”(Nanodisc)和Salipro等脂质结合蛋白辅助的体系可有效稳定膜蛋白，使之能非常稳定地存在于水溶液中。Nanodisc和Salipro分别用membrane scaffoldprotein(MSP)和saposin A来替代去污剂“圈住”脂质，使膜蛋白稳定地置于“脂质碟”中，高度模拟真实的膜环境，从而构建出“原生抗原”。
在本发明中，通过使用本发明的特殊结构的脂质结合蛋白-抗原捕获模块复合物，可以极其高效、准确、且高保真地捕获处于天然状态的膜蛋白，进而形成原生抗原。由于用本发明制备的原生抗原具有高保真的特点，因此特别适合开发对蛋白的结构或构象有严格要求的场合。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
本发明涉及的序列信息
SEQ ID NO.1MSP半胱氨酸突变体S86C氨基酸序列，其中突变位点用下划线表示
MGSSHHHHHHENLYFQGSTFSKLREQLGPVTQEFWDNLEKETEGLRQEMCKDLEEVKAKVQPYLDDFQKKWQEEMELYRQKVEPLRAELQEGARQKLHELQEKLSPLGEEMRDRARAHVDALRTHLAPYSDELRQRLAARLEALKENGGARLAEYHAKATEHLSTLSEKAKPALEDLRQGLLPVLESFKVSFLSALEEYTKKLNTQ
SEQ ID NO.2MSP半胱氨酸突变体A95C氨基酸序列，其中突变位点用下划线表示
MGSSHHHHHHENLYFQGSTFSKLREQLGPVTQEFWDNLEKETEGLRQEMSKDLEEVKCKVQPYLDDFQKKWQEEMELYRQKVEPLRAELQEGARQKLHELQEKLSPLGEEMRDRARAHVDALRTHLAPYSDELRQRLAARLEALKENGGARLAEYHAKATEHLSTLSEKAKPALEDLRQGLLPVLESFKVSFLSALEEYTKKLNTQ
SEQ ID NO.3Saposin A半胱氨酸突变体N21C氨基酸序列，其中突变位点用下划线表示
SLPCDICKDVVTAAGDMLKDCATEEEILVYLEKTCDWLPKPNMSASCKEIVDSYLPVILDIIKGEMSRPGEVCSALNLCES
SEQ ID NO.4抗His-tag的单链抗体氨基酸序列
QVQLQQSGPEDVKPGASVKISCKASGYTFTDYYMNWVKQSPGKGLEWIGDINPNNGGTSYNQKFKGRATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDSSVYYCESQSGAYWGQGTTVTVSAGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDYKDILMTQTPSSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPFTFGSGTKLEIKR
SEQ ID NO.5MSP野生型氨基酸序列
MGSSHHHHHHENLYFQGSTFSKLREQLGPVTQEFWDNLEKETEGLRQEMSKDLEEVKAKVQPYLDDFQKKWQEEMELYRQKVEPLRAELQEGARQKLHELQEKLSPLGEEMRDRARAHVDALRTHLAPYSDELRQRLAARLEALKENGGARLAEYHAKATEHLSTLSEKAKPALEDLRQGLLPVLESFKVSFLSALEEYTKKLNTQ
序列表
<110> 安升（上海）医药科技有限公司
<120> 脂质结合蛋白-抗原捕获模块复合物、及其制备方法和应用
<130> P2017-1729
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 206
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 1
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1 5 10 15
Gly Ser Thr Phe Ser Lys Leu Arg Glu Gln Leu Gly Pro Val Thr Gln
20 25 30
Glu Phe Trp Asp Asn Leu Glu Lys Glu Thr Glu Gly Leu Arg Gln Glu
35 40 45
Met Cys Lys Asp Leu Glu Glu Val Lys Ala Lys Val Gln Pro Tyr Leu
50 55 60
Asp Asp Phe Gln Lys Lys Trp Gln Glu Glu Met Glu Leu Tyr Arg Gln
65 70 75 80
Lys Val Glu Pro Leu Arg Ala Glu Leu Gln Glu Gly Ala Arg Gln Lys
85 90 95
Leu His Glu Leu Gln Glu Lys Leu Ser Pro Leu Gly Glu Glu Met Arg
100 105 110
Asp Arg Ala Arg Ala His Val Asp Ala Leu Arg Thr His Leu Ala Pro
115 120 125
Tyr Ser Asp Glu Leu Arg Gln Arg Leu Ala Ala Arg Leu Glu Ala Leu
130 135 140
Lys Glu Asn Gly Gly Ala Arg Leu Ala Glu Tyr His Ala Lys Ala Thr
145 150 155 160
Glu His Leu Ser Thr Leu Ser Glu Lys Ala Lys Pro Ala Leu Glu Asp
165 170 175
Leu Arg Gln Gly Leu Leu Pro Val Leu Glu Ser Phe Lys Val Ser Phe
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Leu Ser Ala Leu Glu Glu Tyr Thr Lys Lys Leu Asn Thr Gln
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<210> 2
<211> 206
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<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 2
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Gly Ser Thr Phe Ser Lys Leu Arg Glu Gln Leu Gly Pro Val Thr Gln
20 25 30
Glu Phe Trp Asp Asn Leu Glu Lys Glu Thr Glu Gly Leu Arg Gln Glu
35 40 45
Met Ser Lys Asp Leu Glu Glu Val Lys Cys Lys Val Gln Pro Tyr Leu
50 55 60
Asp Asp Phe Gln Lys Lys Trp Gln Glu Glu Met Glu Leu Tyr Arg Gln
65 70 75 80
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115 120 125
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<213> 人工序列(Artificial sequence)
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20 25 30
Asp Val Val Thr Ala Ala Gly Asp Met Leu Lys Asp Asn Ala Thr Glu
35 40 45
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50 55 60
Pro Asn Met Ser Ala Ser Cys Lys Glu Ile Val Asp Ser Tyr Leu Pro
65 70 75 80
Val Ile Leu Asp Ile Ile Lys Gly Glu Met Ser Arg Pro Gly Glu Val
85 90 95
Cys Ser Ala Leu Asn Leu Cys Glu Ser
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<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 4
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Asp Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asp Ile Asn Pro Asn Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ser Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Glu Ser Gln Ser Gly Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val
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Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
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Pro Ser Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys
145 150 155 160
Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu
165 170 175
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Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly
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Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
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<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 5
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Glu His Leu Ser Thr Leu Ser Glu Lys Ala Lys Pro Ala Leu Glu Asp
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<213> 人工序列(Artificial sequence)
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His His His His His His Asn Met Asp Trp Ala Leu Phe Leu Thr Phe
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Leu Ala Ala Ser Gly Ala Pro Ala Thr Thr Gly Ala Leu Leu Lys Pro
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Asp Glu Trp Tyr Asp Asn Leu Asn Lys Pro Trp Trp Asn Pro Pro Arg
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Ala Ala Met Arg Val Ala Gln Leu Glu Gly Ser Gly Gln Ala Leu Ala
65 70 75 80
Phe Tyr Ala Ala Gln Leu Ala Phe Asn Thr Leu Trp Thr Pro Val Phe
85 90 95
Phe Gly Met Lys Arg Met Ala Thr Ala Leu Ala Val Val Met Val Met
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Trp Ala Gly Val Leu Phe Val Pro Tyr Leu Ile Trp Ala Thr Ala Ala
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<213> 人工序列(Artificial sequence)
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Gln Glu Met Cys Lys Asp Leu Glu Glu Val Lys Ala Lys Val Gln Pro
35 40 45
Tyr Leu Asp Asp Phe Gln Lys Lys Trp Gln Glu Glu Met Glu Leu Tyr
50 55 60
Arg Gln Lys Val Glu Pro Leu Arg Ala Glu Leu Gln Glu Gly Ala Arg
65 70 75 80
Gln Lys Leu His Glu Leu Gln Glu Lys Leu Ser Pro Leu Gly Glu Glu
85 90 95
Met Arg Asp Arg Ala Arg Ala His Val Asp Ala Leu Arg Thr His Leu
100 105 110
Ala Pro Tyr Ser Asp Glu Leu Arg Gln Arg Leu Ala Ala Arg Leu Glu
115 120 125
Ala Leu Lys Glu Asn Gly Gly Ala Arg Leu Ala Glu Tyr His Ala Lys
130 135 140
Ala Thr Glu His Leu Ser Thr Leu Ser Glu Lys Ala Lys Pro Ala Leu
145 150 155 160
Glu Asp Leu Arg Gln Gly Leu Leu Pro Val Leu Glu Ser Phe Lys Val
165 170 175
Ser Phe Leu Ser Ala Leu Glu Glu Tyr Thr Lys Lys Leu Asn Thr Gln
180 185 190
Gly Gly Gly Gly Ser Ser Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys
195 200 205
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<211> 81
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 8
Ser Leu Pro Cys Asp Ile Cys Lys Asp Val Val Thr Ala Ala Gly Asp
1 5 10 15
Met Leu Lys Asp Cys Ala Thr Glu Glu Glu Ile Leu Val Tyr Leu Glu
20 25 30
Lys Thr Cys Asp Trp Leu Pro Lys Pro Asn Met Ser Ala Ser Cys Lys
35 40 45
Glu Ile Val Asp Ser Tyr Leu Pro Val Ile Leu Asp Ile Ile Lys Gly
50 55 60
Glu Met Ser Arg Pro Gly Glu Val Cys Ser Ala Leu Asn Leu Cys Glu
65 70 75 80
Ser

Claims (20)

1.一种用于捕获原生抗原的复合物，其特征在于，所述复合物具有式I结构：
R1-(CM)m (I)
式中，
R1为脂质结合蛋白；
m为≥1的正整数；
CM为与R1相连的具有式II结构的抗原捕获模块，
A1-R2-A2-R3 (II)
式中，
A1为与R1相连的连接基团，或不存在；
R2为柔性连接物，所述连接物R2为聚乙二醇；
A2为无或连接基团；
R3为亲和探针，所述亲和探针R3选自下组：可与His-tag结合的小分子、抗His-tag单链抗体(scFv)、Nanobody；所述小分子选自下组：tri-NTA (三-氨基三乙酸)、di-NTA(二-氨基三乙酸)，tetra-NTA(四-氨基三乙酸)，NTA(氨基三乙酸)；
各“-”为键；
m为2、3、4、5、6、7、8、或9；所述的抗原捕获模块CM连接于所述脂质结合蛋白的选自下组的位点：Cys、Lys、或其组合；所述脂质结合蛋白R1选自下组：MSP、Saposin A、或其组合；
所述原生抗原包括：
(1) 抗原蛋白R5，所述的抗原蛋白R5具有来源于活细胞的具有免疫原性的表位；
(2)脂质结合蛋白R1；和
(3)脂质分子R4；
其中，所述的脂质结合蛋白R1围绕所述的脂质分子R4，而所述的脂质分子R4形成脂质层，而所述的抗原蛋白R5嵌入所述的脂质层，并露出所述的具有免疫原性的表位；所述抗原蛋白R5上还含有亲和标签R6，所述亲和标签R6为His-tag，所述的R6与R3是互相作用的或互相结合的，并且所述原生抗原为直接从细胞膜上靶向提取的膜蛋白原生抗原。
2.如权利要求1所述的复合物，其特征在于，所述抗原捕获模块CM位于R1选自下组的位置：C末端、N末端、R1多肽链的中间位置、或其组合。
3.如权利要求1所述的复合物，其特征在于，所述脂质结合蛋白R1为MSP全长蛋白、或其片段、或其截短形式，或其具有类似功能的衍生蛋白。
4.如权利要求1所述的复合物，其特征在于，所述的脂质结合蛋白R1为MSP的半胱氨酸突变体。
5.如权利要求4所述的复合物，其特征在于，所述的MSP的半胱氨酸突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。
6.如权利要求1所述的复合物，其特征在于，所述的脂质结合蛋白R1为Saposin A蛋白半胱氨酸突变体。
7.如权利要求6所述的复合物，其特征在于，所述的Saposin A蛋白半胱氨酸突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。
8.如权利要求1所述的复合物，其特征在于，所述连接物R2的长度为10-300A。
9.如权利要求1所述的复合物，其特征在于，所述聚乙二醇为(PEG)n，其中n为1-30的任一正整数。
10.如权利要求1所述的复合物，其特征在于，所述连接基团A1为可与氨基(-NH2)、羧基(-COOH)、巯基(-SH)、亚氨基(=NH)反应的化学基团。
11.如权利要求10所述的复合物，其特征在于，所述可与-NH2反应的基团选自下组：NHS酯、醛基或其组合。
12.如权利要求10所述的复合物，其特征在于，所述可与-SH反应的基团选自下组：马来酰亚胺基团，卤乙酰基，硫代吡啶。
13.如权利要求1所述的复合物，其特征在于，所述连接基团A2为可与氨基、羧基、巯基、亚氨基反应的化学基团。
14.如权利要求1所述的复合物，其特征在于，所述单链抗体序列如SEQ ID NO.4所示。
15.一种如权利要求1所述的用于捕获原生抗原的复合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将亲和探针R3与连接物R2一端化学偶联，得到抗原捕获模块CM，其结构为A1-R2-A2-R3，所述亲和探针R3选自下组：可与His-tag结合的小分子、抗His-tag单链抗体(scFv)、Nanobody；所述小分子选自下组：tri-NTA (三-氨基三乙酸)、di-NTA(二-氨基三乙酸)，tetra-NTA(四-氨基三乙酸)，NTA(氨基三乙酸)；
(2)将抗原捕获模块CM与脂质结合蛋白R1通过连接基团A1偶联，得到R1-(CM)m复合物；和
(3)任选地，从反应体系中分离得到所述R1-(CM)m复合物；
所述脂质结合蛋白R1选自下组：MSP、Saposin A、或其组合；
所述原生抗原包括：
(1) 抗原蛋白R5，所述的抗原蛋白R5具有来源于活细胞的具有免疫原性的表位；
(2)脂质结合蛋白R1；和
(3)脂质分子R4；
其中，所述的脂质结合蛋白R1围绕所述的脂质分子R4，而所述的脂质分子R4形成脂质层，而所述的抗原蛋白R5嵌入所述的脂质层，并露出所述的具有免疫原性的表位；所述抗原蛋白R5上还含有亲和标签R6，所述亲和标签R6为His-tag，所述的R6与R3是互相作用的或互相结合的，并且所述原生抗原为直接从细胞膜上靶向提取的膜蛋白原生抗原。
16.如权利要求15所述的制备方法，其特征在于，所述连接物R2为两端活化的连接物。
17.一种用于捕获细胞膜上的膜蛋白抗原的捕获体系，其特征在于，包括：
(i) 权利要求1所述的用于捕获原生抗原的复合物，所述原生抗原为直接从细胞膜上靶向提取的膜蛋白原生抗原；
(ii) 任选的脂质结合蛋白，所述的脂质结合蛋白是未修饰的；和
(iii) 任选的细胞膜。
18.如权利要求17所述的捕获体系，其特征在于，所述组分(i)和(ii)的摩尔比为1:5至5:1。
19.如权利要求17所述的捕获体系，其特征在于，所述细胞膜为活细胞的细胞膜。
20.一种从细胞膜上捕获原生抗原的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(a) 提供来自细胞的细胞膜样品；
(b) 将所述细胞膜样品与权利要求1所述的用于捕获原生抗原的复合物混合，或与权利要求17所述的捕获体系混合，从而形成混合物；
(c) 任选地，从上述混合物中分离所述原生抗原，所述原生抗原为直接从细胞膜上靶向提取的膜蛋白原生抗原；所述原生抗原包括：
(1) 抗原蛋白R5，所述的抗原蛋白R5具有来源于活细胞的具有免疫原性的表位；
(2)脂质结合蛋白R1；和
(3)脂质分子R4；
其中，所述的脂质结合蛋白R1围绕所述的脂质分子R4，而所述的脂质分子R4形成脂质层，而所述的抗原蛋白R5嵌入所述的脂质层，并露出所述的具有免疫原性的表位；所述抗原蛋白R5上还含有亲和标签R6，所述亲和标签R6为His-tag，所述的R6与R3是互相作用的或互相结合的，并且所述原生抗原为直接从细胞膜上靶向提取的膜蛋白原生抗原。
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Conformational Chaperones for Structural Studies of Membrane Proteins Using Antibody Phage Display with Nanodiscs;Pawel K.等;《Structure》;20160202;第24卷(第2期);第300-309页 *
Conformational Chaperones for Structural Studies of;Pawel K. Dominik等;《Structure》;20160202;第24卷(第2期);第300-309页，补充材料 *
User Guide EZ-Link NHS-PEG4-Biotin;Thermo;《Thermo Scientific》;20160202;第1-4页 *

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