CN110114076A

CN110114076A - 用于治疗癌症的新型双链寡核苷酸

Info

Publication number: CN110114076A
Application number: CN201780079852.6A
Authority: CN
Inventors: 佛罗伦萨·卡布恩; 希拉里·布鲁科斯; 斯蒂芬妮·德尔马斯; 莫德·许斯奥
Original assignee: Seresel
Current assignee: Seresel
Priority date: 2016-10-27
Filing date: 2017-10-27
Publication date: 2019-08-09
Also published as: US20210292755A1; CA3041630A1; EP3532086A1; WO2018078303A1; JP2020500217A

Abstract

本发明涉及一种双链寡核苷酸，其与引起DNA损伤或防止其修复的治疗联用，用于预防和/或治疗癌症。本发明涉及一种双链寡核苷酸，其用于预防和/或治疗癌症，但雄激素依赖性的前列腺癌除外。

Description

用于治疗癌症的新型双链寡核苷酸

技术领域

本发明涉及一种双特异性、同时靶向雄激素受体和组蛋白H2AX的双链寡核苷酸。

背景技术

我们生物体的细胞每天由于它们的产生例如氧的活性物质的代谢，或者由于它们的环境，特别是由于电离辐射或紫外线、物理因素或包括某些药物的化学因素而会经历大量的DNA损伤(https://en.wikipedia.org/wiki/DNA_damage_(naturally_occurring))。细胞在进化过程中发展了几种验证和修复机制，以维持基因组的完整性。当DNA损伤发生在正常细胞中时，肿瘤抑制蛋白(如p53)会协调安排细胞分裂的阻断和修复机制的激活。大多数病变通常都会得到修复。然而，在超过一定的DNA损伤阈值时，细胞不再存活，进入细胞凋亡并死亡。

在相同的情况下，因为癌细胞的DNA修复机制经常是缺乏的和/或因为它们比正常细胞更能抵抗细胞凋亡，癌细胞积累大量的DNA损伤。在肿瘤细胞中导致细胞死亡的DNA损伤阈值高于在正常细胞中的阈值。

DNA损伤发生在DNA非线性而是被由组蛋白组成的核小体紧密包围的环境中。一些组蛋白，起着结构的作用，其它如H2AX的组蛋白是基因组功能或修复的关键。H2AX是在体内所有细胞中表达的组蛋白。H2AX被例如蛋白质(诸如DNA-PK(DNA依赖性蛋白激酶)，ATM(在共济失调-毛细血管扩张症中突变)或ATR(共济失调性毛细血管扩张症，和Rad3相关)磷酸化后标记为γH2AX，这是在早期DNA修复中的一个重大事件，其允许补充和组装修复病变所需的许多其它蛋白质。γH2AX的检测，特别是通过特异性抗体的检测，经常被用作DNA损伤存在的敏感和定量指标。H2AX也可以在赖氨酸36上通过CBP/P300被乙酰化和在苏氨酸101被乙酰化，并且这两种翻译后修饰允许细胞在离子化辐射中存活，这独立于H2AX的磷酸化。

抑制H2AX在细胞中特别是在癌细胞中的表达，是一种防止DNA损伤修复的方法。然而，由于DNA修复机制的多样性，单独抑制H2AX表达不足以诱导细胞死亡(Yuan和Chen，2010)。

已经研发了通过增加DNA损伤的数量以超过与细胞存活相容的阈值而触发癌细胞的凋亡来治疗癌症的放射治疗或某些化学治疗。这些治疗通过诱导DNA损伤和/或防止癌细胞中存在的损伤的修复而起作用。

放射治疗现在在肿瘤学中是必不可少的，因为它以单独或与手术和/或化学治疗相关的方式被计划在三分之二的治疗方案中。这些治疗诱导DNA损伤，特别是双链断裂(DSB)。

细胞毒性化学治疗旨在阻断癌细胞的分裂和/或诱导其凋亡。这些治疗中的大多数导致细胞中DNA损伤的积累，或者由于它们产生新的病变的作用模式直接导致细胞中DNA损伤的积累，或者通过阻止DNA修复直接导致细胞中DNA损伤的积累，或者通过将细胞保持在修复过程很不活跃的细胞周期阶段中。然而，许多基因组测试和试图修复DNA损伤的修复机制降低了这些化学治疗或放射治疗的有效性。

因此，确实需要对诱导DNA损伤或防止其修复的治疗的有效性进行改善。

通过阻止DNA损伤的修复，H2AX的抑制因此提供了对由诱导DNA损伤或防止其修复的放射治疗或化学治疗治疗诱导的细胞死亡进行增强的手段。

雄激素受体(AR)是一种转录因子，其活性受其配体调节。AR在男性和女性的大多数组织和器官以及造血系统中的许多细胞类型中表达。AR调节例如增殖、迁移、存活、侵袭、生长因子的产生中涉及的非常多基因的表达。

由于这些特性，例如但不限于通过过表达，突变，选择性剪接，翻译后修饰或蛋白质配偶体改变，AR的表达或功能的失调在各种癌，肉瘤，骨髓瘤和白血病的起始，维持和进展中体现，所述癌，肉瘤，骨髓瘤和白血病例如但不限于前列腺癌，乳腺癌，卵巢癌，膀胱癌，肝癌，结肠癌，胃癌，肾上腺和唾液腺癌，胸腺癌，甲状腺癌，子宫癌，腹膜癌，胰腺癌，睾丸癌，肾癌，皮肤癌，脑癌，鼻咽癌，头颈癌，脑膜癌，肺癌，睾丸癌，骨癌(Munoz等，2015)。

防止AR配体的产生并因此阻止AR的转录活性的去势，是一种治疗策略，其功效已在前列腺癌中临床证明。然而，这些治疗的有效性是短暂的，并且患者会全身地复发。因此，针对这些癌症，确实需要对靶向AR信号传导途径的治疗的有效性进行改善。

尽管AR在身体的大多数细胞中表达，并且其表达或功能的失调在许多除前列腺癌之外的癌症中被体现，但对AR信号通路的抑制尚未显示足以治疗除了前列腺癌以外的先前在人类中发展过的癌症。因此，如下文实施例中所示，例如来自乳腺肿瘤，黑素瘤或成胶质细胞瘤(其表达AR从非常低到高的水平)的其它癌细胞的增殖不会受到该途径被抑制而产生的影响。

发明内容

本发明基于本发明人的意外成果，根据该成果，某些特定的双链寡核苷酸是双特异性的，因为它们同时且特异性地抑制组蛋白H2AX和雄激素受体的表达，这有效抑制增殖和细胞的存活。

通过与增加DNA损伤数量或防止其修复的化学治疗或放射治疗相结合，可以增强这种同时抑制AR和H2AX的效果。

微小RNA(miRNA)是由所有真核生物的基因组编码的约20个核苷酸的小双链RNA。转录和成熟后，它们被加载到蛋白质复合物中：RNA诱导沉默复合物(RISC)。在哺乳动物中，两条链中的一条通常与一种或多种称为靶mRNA的信使RNA(mRNA)不完全杂交，它们诱导切割，导致mRNA降解或抑制蛋白质翻译。包括2至8个核苷酸(5’至3’有义的引导链，又称反义链)区域(又称为成核区域或“种子区域”)的微小miRNA与一个或多个mRNA进行杂交对触发RNA干扰机制是尤其重要的。在同一细胞中，miRNA可与几种靶mRNA杂交并调节其稳定性或翻译。计算机或其它工具无法准确预测给定miRNA能够调节的mRNA(Gorski等，2017)。

干扰RNA或小干扰RNA或siRNA是合成的双链寡核糖核苷酸，当被引入细胞时其模拟miRNA的作用，与其靶mRNA杂交，并触发RNA干扰机制。像miRNA一样，它们可以与其它mRNA不完全杂交，并且计算机工具无法准确预测在那些可能的不完全杂交中哪些会干扰mRNA并破坏这些mRNA的功能。这些所谓的脱靶效应通常是不希望的，因为它们可以产生潜在的毒性生物效应，如果该效应是不可预测的话，必须通过实验评估。同时使用多个siRNA可以增加脱靶效应的潜在的数量，因此增加毒性风险。为了选择用于抑制所研究基因的表达的siRNA的序列，采用许多计算机工具。设计这些工具使得所选择的siRNA仅与一种mRNA杂交，以避免脱靶效应。

siRNA的作用机制和药代动力学和药效学特性与任何其它类型的寡核苷酸，如核酶，吗啉反义寡核苷酸，三螺旋寡核苷酸，反义RNA或反义DNA寡核苷酸(ODN)，不具有可比性。

本发明基于本发明人的意外成果，根据该成果，表1中描述的与编码雄激素受体的mRNA完全杂交并抑制其表达的某些特定siRNA是双特异性的，因为这些siRNA也与图1描述的编码H2AX的mRNA部分杂交并特异性地抑制其表达。

本发明的目的是提供一种通过使用双特异性siRNA来同时抑制雄激素受体和H2AX表达的方法。

相对于仅靶向AR的siRNA或仅靶向H2AX的siRNA来说，通过同时抑制在许多癌症过程(特别是增殖和抗凋亡中)非常关键的雄激素受体和在修复DNA损伤中非常关键的组蛋白H2AX，使用双特异性AR-H2AX siRNA来对AR和H2AX进行抑制具有特定优势。

使用单一的双特异性siRNA优于组合使用两种siRNA(一种靶向AR，另一种靶向H2AX)，以限制这种组合的潜在毒性脱靶效应，并促进这个用途的临床和工业应用的发展。

在第一方面，本发明涉及包含至少一种双特异性siRNA的组合物，所述双特异性siRNA限定为与编码雄激素受体的mRNA和编码H2AX的mRNA完全或部分杂交以使得该杂交诱导这些mRNA的降解或抑制这些mRNA的翻译以用于预防和/或治疗癌症，如表1所描述,所述siRNA选自序列号为SEQ ID NO：1以及SEQ ID NO：2的siARH2AX-1，或者SEQ ID NO：3和SEQID NO：4的siARH2AX-1b,其中所述siRNA与导致DNA损伤或防止其修复的治疗组合使用。

部分杂交是指本发明的双特异性siRNA的足够数量的核苷酸与雄激素受体mRNA的序列或与H2AX的序列杂交，以引起与该siRNA杂交的mRNA的裂解或抑制其翻译，这导致mRNA编码的蛋白质的表达降低，这种降低可以通过例如蛋白质免疫印迹测定或间接免疫荧光免疫测定来测量。例如，该杂交可以涉及7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19个核苷酸，或者如果siRNA具有更多核苷酸，则可能涉及更多核苷酸，例如20,21,22或23个核苷酸。例如，在本发明的意义上，杂交的百分比可以在30％和95％之间。

根据本发明，所述预防和/或所述治疗在人类患者或哺乳动物中进行。

表1中显示了本发明的siRNA序列。表1中“与序列至少75％同源性”的表述意指75％，76％，77％，78％，79％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％和100％的同源性，特别是79％，81％，84％，86％，90％，95％和99％的同源性。

序列与表1中所示的siRNA的序列具有100％同源性的所有siRNA与编码雄性激素的mRNA的从外显子1转录的区域100％杂交。因此，所有这些siRNA抑制癌细胞中剪接表达的雄激素受体的所有形式的表达，包括从配体结合结构域部分或完全缺失的那些，例如在一些癌症中表达的受体的AR-V7变体。

有利地，siRNA引导链成核区域siARH2AX-1和siARH2AX-1b也与编码H2AX的mRNA完全互补。

化学修饰

根据本发明及其所有方面，所述双特异性AR-H2AX siRNA可以在一条和/或另一条链上、位于3'或5'末端的一个或多个核苷酸上和/或构成内部骨架的一个或多个核苷酸上具有化学修饰。例如，所述化学修饰位于核糖和/或碱基和/或磷酸上。所述化学修饰包括，例如，用2'-O-甲基RNA(2'OMe)或2'-O-甲氧基乙基(2'MOE)或2'-氟(2'F)或2'-氟-阿拉伯糖核苷酸(FANA)基团对核糖的2'-OH基团取代至少一次，将2'中的氧烷基化成氨基乙基-、胍基乙基-、氰基乙基-或烯丙基，用硫代磷酸酯代替磷酸二酯基团，将寡核苷酸的一个或多个核苷酸的烷基化或二硫化，用脱氧核糖核苷酸取代核糖核苷酸，或用锁核酸(LNA)取代核苷酸。

在一个特定方面，所述双特异性AR-H2AX siRNA缺乏化学修饰。

在一个特定方面，所述siRNA缺乏化学修饰，并且包含在3'末端突出(overflow)的两个脱氧核苷酸，特别是两个脱氧胸苷。

在另一个特定方面，所述siRNA缺乏化学修饰，并且不包含在3'末端突出的两个脱氧核苷酸，特别是不包含两个脱氧胸苷。

根据本发明及其所有方面，所述双特异性AR-H2AX siRNA配制在允许其渗透到肿瘤细胞中的组合物中。

载体化试剂和定位分子(addressing molecule)

在一个特定方面，所述组合物含有载体化试剂。根据本发明，载体化试剂是促进siRNA渗入生物体细胞的试剂。该试剂可以与siRNA的任一个链化学缀合，或与siRNA非共价缔合。这些包括例如脂质，聚合物，肽，树枝状大分子，简糖或复合糖，聚乙烯亚胺衍生物，纳米颗粒，磁球或无机或有机纳米结构。

在一个特定方面，所述组合物含有定位分子。根据本发明，定位分子是将siRNA定位到诸如内皮细胞或癌细胞的特定类型细胞的分子。定位分子不是为了帮助siRNA穿透到细胞内或用siRNA穿透细胞，而是为了增加siRNA在目标细胞的外膜的浓度。定位分子的非限制性例子可以是适体，抗体，转铁蛋白，RGD肽，受体的配体，该定位分子与在靶细胞表面表达的分子相互作用或结合，所述表达的分子的非限制性例子是受体、整联蛋白、膜抗原，例如前列腺特异性膜抗原(PSMA)或CD36受体。

在本发明的一个特定方面，该靶向分子是CD36受体配体，例如氧化的LDL(低密度脂蛋白)，或海沙瑞林肽或长链脂肪酸(超过16个碳)，或这些组分中两种或三种的混合物。

在本发明的一个优选方面，上述组合物含有氧化LDL，其与siRNA的重量：重量比为1个siRNA：0.01至10个氧化LDL，优选0.1至1个氧化LDL，或含有海沙瑞林胺，其与siRNA的重量：重量比为1个siRNA：0.01至10个海沙瑞林肽(hexarelin peptide)，优选0.1至1个海沙瑞林。

定位分子可以与siRNA无共价键缔合，或与siRNA的任一链共价偶联，或被掺入含有siRNA的诸如纳米颗粒或是脂质体的载体化试剂，以便将载体化试剂定位到靶细胞或组织。

在一个特定方面，所述组合物既不含有载体化试剂也不含有定位分子。

在一个特定方面，所述组合物含有载体化试剂但不含有定位分子。

在一个特定方面，所述组合物含有定位分子但不含有载体化试剂。定位分子特别是CD36配体，更特别是氧化的LDL或海沙瑞林。

在一个特定方面，所述组合物含有载体化试剂和定位分子。定位分子特别是CD36配体，更特别是氧化的LDL或海沙瑞林。

局部，局部区域或全身给药

根据本发明及其所有方面，含有所述双特异性AR-H2AX siRNA的所述组合物被配制成局部或以局部区域方式给药，特别是通过单剂量或通过重复注射在肿瘤内给药，通过使用外部或可植入的泵，或任何其它装置，或允许组合物在附近或待治疗的肿瘤中(肿瘤内给药)缓慢和连续释放的可生物降解的化合物来间歇或连续给药。

根据本发明，连续给药模式旨在siRNA的整个给药期间，如果是局部或局部区域给药则在组织中保持siRNA的浓度基本恒定，或者如果是全身给药则在血液和外周组织中保持siRNA的浓度基本恒定。“保持基本恒定”的表述是指血液和外周组织中siRNA的浓度可以根据接受所述组合物的个体的代谢而略微变化。

连续是指组合物的不中断给药，持续1天至几个月，例如持续1天，2天，3天，4天，5天，6天，7天，8天，9天，10天，11天，12天，13天，14天，15天，3周，1个月，2个月，3个月，4个月，5个月，6个月，9个月，1年，2年。

在本发明的一个优选方面，在连续给药模式中给药的siRNA在不中断的情况下给药的时间段大于或等于2天。

在本发明的一个优选方面，根据连续给药模式给药的siRNA中断的时间不超过再填充或置换给药siRNA的装置所需的时间(例如4小时)，其给药持续时间范围为2天至1年，例如持续2天，3天，4天，5天，6天，7天，8天，9天，10天，11天，12天，13天，14天，15天，3周，1个月，2个月，3个月，4个月，5个月，6个月，9个月，1年。

在本发明的一个优选方面，以连续给药模式给药的siRNA以相继循环的形式进行给药，不治疗的中断时间超过24小时至数周，每个循环限定为连续给药而没有超过再填充或置换给药siRNA的装置所需的例如4小时的时间的中断，并且给药持续时间为2天至1个月。

根据本发明，间歇给药是指以任何给药模式，其中在产品的给药时间段(例如，10秒，1分钟，1小时，2小时，4小时......)之后是一段不对产品进行给药的时间段(例如，1小时，2小时，6小时，24小时，1周......)。例如但不限于，给药可以是输注给药，以单次进行或随时间重复进行或在几小时的时间内缓慢输注进行，使得随着时间推移组织或生物体中产品的浓度具有显著变化。

癌症死亡率通常是由于癌细胞向二级位点的传播，形成转移。因此，双特异性siRNA siARH2AX的全身给药将siARH2AX分布在几种组织和器官中，这对于治疗转移的癌症或可能转移的癌症是有利的。在下文中，全身是指siRNA在体内被传递以在距其给药的位置相距一段距离起作用，这与局部或局部区域给药相反，特别是与肿瘤内给药相反。含有siRNA的化合物由摄取(口服)、或注射(肠胃外)或通过皮肤或粘膜摄取，该siRNA在体内的全身分布是由通过诸如血液，淋巴或脑脊液的任何细胞外液体来传递siRNA的方法而获得的。全身给药可以通过给药单独剂量或重复剂量的所述组合物而进行，所述给药是间歇性的，或通过使用外部或可植入的泵，或任何其它装置，或允许缓慢和连续释放所述组合物的可生物降解的化合物来进行，使得双特异性siRNA siARH2AX通过生物体内的细胞外液体在全身中运输。在一个特定的方面，所述全身给药模式选自皮下，静脉内，腹膜内，肌肉内，皮内，鼻内，阴道内，直肠内，舌下，鞘内，脑内，口服给药模式，尤其是皮下给药。

在一个优选的方面，所述给药模式是连续的皮下给药。

缓冲液和阳离子

在一个特定的方面，根据本发明的siARH2AX通过配制在酸性pH的缓冲溶液中来进行全身或局部给药。

根据本发明的缓冲溶液提供siRNA稀释溶液的pH稳定性。表3中给出了这种缓冲剂的例子。

在本发明的一个优选方面，缓冲溶液的pH是酸，范围是pH3至pH7，优选范围是pH5至pH6.5，更优选为pH6。

在本发明的一个优选方面，缓冲溶液是pH6的柠檬酸盐或组氨酸缓冲液。

在一个特定的方面，根据本发明的siRNA siARH2AX在补充有衍生自无机或有机盐的阳离子的酸性pH缓冲溶液中被全身或局部地给药。在本发明的角度上，这些阳离子不是缓冲溶液的组分，它们不是为了确保缓冲效果，而是被另外添加到该缓冲溶液中的。这些阳离子例如是但不限于尤其是腐胺、和/或亚精胺、和/或精胺的多胺，，和/或其阳离子选自例如Zn²⁺，Co²⁺，Cu²⁺，Mn²⁺，Ca²⁺，Mg²⁺，Fe²⁺的金属阳离子的盐，平衡离子具有任何性质，例如氯离子，硝酸根，硫酸根离子或碳酸根离子。在本发明的一个优选方面，缓冲溶液含有MgCl₂，ZnCl₂，MnCl₂，或这些盐中的两种的混合物，或三种盐的混合物。

在一个特定的方面，无论是单独使用还是组合使用，每种阳离子的浓度为0.02mM至200mM，优选0.05至100mM，优选1至50mM。

在本发明的一个优选方面，将阳离子加入到缓冲溶液中，该缓冲溶液是柠檬酸盐缓冲液或组氨酸缓冲液。在本发明的一个优选方面，该溶液的pH为6。

剂量

在一个特定的方面，所述组合物被配制用于以治疗有效剂量的双特异性siRNAsiARH2AX进行给药的模式，特别是以0.005mg/kg/天至30mg/kg/天的剂量给药，尤其是以0.01mg/kg/天至10毫克/千克/天的剂量给药。“0.005mg/kg/天至30mg/kg/天”是指范围是0.005mg/kg/天至30mg/kg/天的所有剂量，例如，剂量是0.008；0.01；0.05；0.1；0.5；1.0；1.5；10.0；10.5；14.0；14.5；20；20.5；25；25.5；

29.5mg/kg/天。

与诱导DNA损伤或预防其修复的治疗的联合

在本发明的一个特定的方面，所述组合物与诱导DNA损伤或预防其修复的治疗组合使用，并且所述治疗选自放射治疗和/或化学治疗。

放射治疗是指使用放射线通过阻断癌症细胞增殖的能力来破坏癌细胞的局部区域治疗癌症的方法。根据癌症和患者来调整放射治疗的技术和方式，特别是输送的放射剂量。有三种主要的放射治疗技术：外部放射治疗，镭治疗和载体代谢放射治疗(vectormetabolic radiotherapy)。根据肿瘤类型及其位置，每个治疗都有其适应症。

-外部放射治疗是最著名和最常用的。在患者体外的辐射源产生高能X射线束和电子束。

-镭治疗,也称为近距离放射治疗，是通过植入放射性颗粒或针头进行局部放射治疗。这种治疗尤其用于治疗前列腺癌。

-载体代谢放射治疗是基于标记有放射性元素的放射性药剂的口服给药或注射的放射治疗技术。放射性同位素将优先结合患病的靶细胞。例如，碘131会与甲状腺结合。因此可以例如通过注射钐153，用锶894标记的液体氯化锶或氯化物-镭223来治疗转移性骨痛。

化学治疗是指针对癌症的药物治疗(细胞抑制和抗肿瘤化学治疗剂)。

在一个特定的方面，导致DNA损伤或防止其修复的所述化学治疗是使用选自以下的化学治疗剂的至少一种而进行的：烷化剂，抗代谢剂，细胞毒性抗生素，拓扑异构酶I抑制剂，拓扑异构酶II抑制剂，抗肿瘤抗生素，遗传毒性剂，PARP抑制剂(聚(ADP-核糖)聚合酶)，微管形成和解离抑制剂，如长春花生物碱，紫杉烷类或埃坡霉素类。

在一个特定的方面，化学治疗剂特别选自：阿糖胞嘧啶，博来霉素，白消安，卡培他滨，卡铂，卡莫司汀，苯丁酸氮芥，顺铂，克拉屈滨，环磷酰胺，达卡巴嗪，柔红霉素，阿霉素，表阿霉素，依托泊苷，氟尿苷，氟达拉滨，特别是5-氟尿嘧啶的氟尿嘧啶，吉西他滨，羟基脲，伊达比星(Idarubicin)，异环磷酰胺，3-硝基-4-碘苯甲酰胺(BSI-201，Iniparib)，伊立替康，洛莫司汀，氮芥，米尔法兰(Melphalan)，特别是6-巯基嘌呤的巯基嘌呤，甲氨蝶呤，丝裂霉素C，盐酸米托蒽醌，莫司汀(Mustine)，尼拉帕尼(Niraparib)，奥拉帕尼(Olaparib)，奥沙利铂，甲苄肼，鲁比替康，卢卡帕尼(Rucaparib)，链脲霉素，他唑来膦(Talazoparib)，特别是6-硫鸟嘌呤的硫鸟嘌呤，拓扑替康，维利帕尼(Veliparib)，放线菌素D，安吖啶，蒽环类药物，喜树碱，表鬼臼毒素，普卡酶素，替莫唑胺，长春新碱，长春碱，长春瑞滨，紫杉醇，多西紫杉醇，卡巴他赛，紫杉烷类，埃坡霉素类。

在一个特定的方面，所述导致DNA损伤或预防其修复的治疗和用含有至少一种siAR-H2AX双特异性siRNA的所述组合物的给药是同时或相继的。根据本发明，术语“相继的”应理解为“分开的，并随时间延伸”。

在一个特定的方面，本发明还涉及一种组合产品，其包含：

-选自siARH2AX-1、siARH2AX-1b的siRNA，和

-至少一种引起DNA损伤或阻止其修复的化学治疗剂，

以用于同时或依次用于预防和/或治疗癌症。

在一个方面，本发明还涉及一种组合产品，其包含：

-选自siARH2AX-1、siARH2AX-1b的siRNA，和

-至少一种引起DNA损伤的放射性药剂，

以用于同时或依次用于预防和/或治疗癌症。

在一个方面，本发明还涉及配制用于间歇或连续地进行局部给药的组合产品，其包含：

-选自siARH2AX-1、siARH2AX-1b的siRNA，和

-导致DNA损伤的镭治疗，

以用于同时或依次用于预防和/或治疗癌症。

在一个特定的方面，癌症是原发性肿瘤或原发性肿瘤的转移。

在一个特定的方面，癌症是肾上腺皮质癌，食道癌，胃癌，基底细胞癌，甲状腺或子宫癌，星形细胞瘤，胶质母细胞瘤，少突神经胶质瘤，脑膜瘤，胸腺瘤，淋巴瘤，黑素瘤或非黑素瘤皮肤癌，白血病，间皮瘤，胆管癌，骨髓瘤，胃肠癌，膀胱癌，乳腺癌，宫颈癌，头颈癌，非小细胞肺癌，卵巢癌，胰腺癌，前列腺癌，睾丸癌，胸腺癌，肾癌，唾液腺癌，子宫内膜癌，肛门癌，结肠癌，阑尾癌，口腔癌，支气管癌和/或上呼吸道癌，胆管癌，鼻腔和鼻窦癌，脑癌，心脏癌，胃癌，肝癌，喉癌，舌癌，唇癌，鼻咽癌，食道癌，骨癌，甲状旁腺癌，阴茎癌，胸膜癌，肺癌，直肠癌，肾上腺癌，尿道癌，阴道癌，胆囊癌，外阴癌，结肠腺癌，直肠癌，硬纤维瘤，鼻咽纤维瘤，肉瘤，骨肉瘤，平滑肌肉瘤，软骨肉瘤，脂肪肉瘤，横纹肌肉瘤，嗜铬细胞瘤或其它器官发生的这些癌症的转移。

在本发明的另一个方面，所述组合物包含至少一种双特异性siRNA，所述siRNA完全或部分地与编码雄激素受体的mRNA和编码H2AX的mRNA杂交，使得所述杂交诱导这些mRNA的降解或抑制它们的翻译，所述siRNA选自如表1所述的SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的siRNA siARH2AX-1或SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4的siARH2AX-1b，所述siRNA被单独使用以用于预防和/或治疗癌症，特别是肾上腺皮质癌，食道癌，胃癌，基底细胞癌，甲状腺癌或子宫癌，星形细胞瘤，胶质母细胞瘤，少突神经胶质瘤，脑膜瘤，胸腺瘤，淋巴瘤，黑色素瘤或非黑色素瘤皮肤癌，白血病，间皮瘤，胆管癌，骨髓瘤，胃肠癌，膀胱癌，乳腺癌，宫颈癌，头颈癌，非小细胞肺癌，卵巢癌，胰腺癌，前列腺癌，睾丸癌，胸腺癌，肾癌，唾液腺癌，子宫内膜癌，肛门癌，结肠癌，阑尾癌，口腔癌，支气管炎和/或上呼吸道癌，胆管癌，鼻腔和鼻窦癌，脑癌，心癌，胃癌，肝癌，喉癌，舌癌，唇癌，鼻咽癌，食道癌，骨癌，甲状旁腺癌，阴茎癌，胸膜癌，肺癌，直肠癌，肾上腺癌，尿道癌，阴道癌，胆囊癌，外阴癌，结肠腺癌，直肠癌，硬纤维瘤，鼻咽纤维瘤，肉瘤，骨肉瘤，平滑肌肉瘤，软骨肉瘤，脂肪肉瘤，横纹肌肉瘤，嗜铬细胞瘤或这些癌症在其它器官中发生转移。

在一个特定的方面，所述双特异性AR-H2AX siRNA可以在一条和/或另一条链上、位于3'或5'末端的一个或多个核苷酸上和/或构成内部骨架的一个或多个核苷酸上具有化学修饰。化学修饰的例子可以在标题为“化学修饰”的部分找到。

在一个特定方面，所述双特异性AR-H2AX siRNA缺乏化学修饰。

在一个特定方面，所述双特异性AR-H2AX siRNA缺乏化学修饰，并且包含在3'末端突出的两个脱氧核苷酸，特别是两个脱氧胸苷。

在一个特定方面，所述双特异性AR-H2AX siRNA缺乏化学修饰，并且不包含在3'末端突出的两个脱氧核苷酸，特别是两个脱氧胸苷。

在一个特定的方面，所述组合物既不含载体化试剂也不含定位分子，或含有载体化试剂但不含定位分子，或含有定位分子但不含载体化试剂，或含有载体化试剂和定位分子。定位试剂的例子可以在标题为“载体化试剂和定位分子”的部分中找到。

在一个特定的方面，所述含有双特异性siRNA siARH2AX的组合物被配制用于以单剂量或重复地、间歇或连续地在全身，局部或局部区域进行给药。

在一个特定的方面，根据本发明的siARH2AX通过配制在酸性pH的缓冲溶液中来进行全身或局部给药。表3中给出了这种缓冲剂的例子。

在一个特定方面，缓冲溶液是柠檬酸盐或组氨酸缓冲液。

在一个优选的方面，酸性pH缓冲溶液补充有或不补充有来自无机或有机盐的阳离子。阳离子的例子可在标题为“缓冲液和阳离子”的部分中找到。

每种阳离子的浓度为0.02mM至200mM，优选0.05至100mM，优选1至50mM。

在本发明的一个优选方面，将阳离子加入到缓冲溶液中，该缓冲溶液是柠檬酸盐缓冲液或组氨酸缓冲液。

在一个特定的方面，所述组合物被配制用于以治疗有效剂量的双特异性siRNA进行给药的模式，特别是以0.005mg/kg/天至30mg/kg/天的剂量给药，尤其是以0.01mg/kg/天至10mg/kg/天的剂量给药。“0.005mg/kg/天至30mg/kg/天”是指范围是0.005mg/kg/天至30mg/kg/天的所有剂量，例如，剂量是0.008；0.01；0.05；0.1；0.5；1.0；1.5；10.0；10.5；14.0；14.5；20；20.5；25；25.5；29.5mg/kg/天。

另一方面，本发明还涉及含有选自下列siRNA的至少一种的组合物：如表1所示的SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的siARH2AX-1，或SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4的siARH2AX-1b，所述siRNA处于酸性pH缓冲溶液中。表3中给出了这种缓冲剂的例子。

在一个特定的方面，所述组合物被配制用于以单剂量或重复地，间歇或连续地在全身，局部或局部区域的给药模式。

在一个特定方面，缓冲溶液是柠檬酸盐或组氨酸缓冲液。

在一个特定方面，本发明还涉及含有选自下列siRNA的至少一种的组合物：SEQ IDNO：1和SEQ ID NO：2的siARH2AX-1，或SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4的siARH2AX-1b，所述siRNA处于酸性pH缓冲溶液中，所述缓冲溶液特别是柠檬酸盐或组氨酸缓冲液，所述缓冲溶液补充有源自无机或有机盐的阳离子，所述盐的阳离子特别是选自多胺，特别是选自精胺、亚精胺或腐胺，或者所述盐的阳离子特别是选自金属阳离子，所述盐特别是选自锌盐、钴盐、铜盐、锰盐、钙盐、镁盐或铁盐，特别是锰盐、锌盐、镁盐的单独形式或两种或三种的组合。

在一个特定方面，所述双特异性AR-H2AX siRNA缺乏化学修饰。

在一个特定的方面，所述组合物与诱导DNA损伤或预防其修复的治疗组合使用，并且所述治疗选自放射治疗和/或化学治疗。放射治疗或化学治疗的试剂的例子可在标题为“与诱导DNA损伤或预防其修复的治疗联合”的部分中找到。

在一个特定的方面，所述组合物被配制用于以治疗有效剂量的双特异性siRNA进行给药的模式，特别是以0.005mg/kg/天至30mg/kg/天的剂量给药，尤其是以0.01mg/kg/天至10毫克/千克/天的剂量给药。“0.005mg/kg/天至30mg/kg/天”是指范围是0.005mg/kg/天至30mg/kg/天的所有剂量，例如，剂量是0.008；0.01；0.05；0.1；0.5；1.0；1.5；10.0；10.5；14.0；14.5；20；20.5；25；25.5；29.5mg/kg/天。

表1

对于表1中标号(SEQ ID NO：)为1至4的每个序列:

-第一列表示siRNA的名字。

-第二列表示siRNA的组成，由1型寡核苷酸链(分别为1和1b)或其序列与该1型寡核苷酸链(分别为1和1b)具有至少75％同源性的寡核苷酸，以及2型寡核苷酸链(分别为2和2b)或其序列与该2型寡核苷酸链(分别为2和2b)具有至少75％的同源性的寡核苷酸的组合构成。

-第三列表示所提交的寡核苷酸的编号。

-第四列表示5'至3'方向的序列。符号[dT][dT]用于表示存在两个突出的脱氧胸苷。

当表1中所示的siRNA由序列与表中所示的序列具有100％同源性的两个单链寡核苷酸组成时，这些siRNA的靶序列(即mRNA的由siRNA引导链与之杂交的序列)存在于人体中所有编码雄激素受体的mRNA中，无论该受体是否是野生型的，即该受体表现出剪接变异从而导致激素结合结构域的部分或全部缺失(例如变体AR-V7)，或者是具有前列腺癌中描述的突变之一。

表2

对于每个例子中采用的细胞系，第二列表示细胞的来源器官，编码AR的mRNA的水平通过在这些细胞系中进行RT-qPCR来测量，并且通过编码亲环蛋白A的mRNA的水平(ΔCT方法)来归一化。在第三列中示出的结果以任意单位表示，在22RV1细胞中测量的水平被认为是100,000。

表3主要缓冲剂

参考文献

Gorski,S.A.,J.Vogel,and J.A.Doudna.2017.RNA-based recognition andtargeting:sowing the seeds of specificity.Nat Rev Mol Cell Biol 18:215-228.

Munoz,J.,J.J.Wheler,and R.Kurzrock.2015.Androgen receptors beyondprostate cancer:an old marker as a new target.Oncotarget6:592-603.

Yuan,J.,and J.Chen.2010.MRE11-RAD50-NBS1complex dictates DNA repairindependent of H2AX.J Biol Chem 285:1097-1104.

通过以下实施例和附图将更好地说明本发明。以下实施例旨在阐明本发明的目的并说明有利的实施方案，但决不是要限制本发明的范围。

附图说明

图1：用RT-qPCR来对siRNA进行定量的方法的示意图。参考范围的示例。

图2：比较本发明的siRNA序列和siRNA siAR2与人类中编码雄激素受体的mRNA和编码H2AX的mRNA的互补性。所示位置分别对应于人类中人雄激素受体的mRNA(AR，登录号：NM_00044.3，SEQ ID NO：5)和H2AX的mRNA(登录号：NM_002105.2，SEQ ID NO：6)的那些位置。具有下划线的碱基是那些与所示siRNA的引导链的碱基完全互补的碱基。所示的siRNA由与表1中描述的寡核苷酸具有100％同源性的寡核苷酸组成。灰色框表示成核区域(种子区域)，即2至8个核苷酸，包括siRNA引导链(5'到3′的方向)，以及它们与编码H2AX的mRNA的互补性。

图3：将对照siRNA(Cont，黑色条)，siAR2(灰色条)或siARH2AX-1(白色条)转染到C4-2细胞48小时后，通过RT-qPCR定量编码AR和编码H2AX的mRNA。每种mRNA的表达水平以相对于转染有对照siRNA的细胞中测量的水平的方式表示。

图4：将对照siRNA(Cont，黑色条)，siAR7(深灰色条)或siARH2AX-1(白色条)转染到LNCaP或C4-2细胞72小时后，通过RT-qPCR定量编码AR、编码PSA和编码H2AX的mRNA。每种mRNA的表达水平以相对于转染有对照siRNA的细胞中测量的水平的方式表示。

图5：将对照siRNA(Cont，黑色条)，SiH2AX(深灰色条)，siARh(浅灰色条)或siARH2AX-1(白色条)转染到LNCaP或MDA MB-453细胞72小时后，通过RT-qPCR定量编码AR和编码H2AX的mRNA。对于每种细胞类型，每种mRNA的表达水平以相对于转染有对照siRNA的细胞中测量的水平的方式表示。

图6：通过对用以下siRNA之一转染C4-2细胞72小时后的AR和H2AX表达进行蛋白质免疫印迹而实现的免疫检测：对照组(Cont)，siARH2AX-1，siRNA，siH2AX，或siRNA siH2AX和siARh的混合物。

图7：通过对用以下siRNA之一转染PC3细胞72小时后的AR、H2AX和γH2AX表达进行蛋白质免疫印迹而实现的免疫检测：对照组(Cont),siAR7或siARH2AX-1。

图8：对C4-2细胞中的γH2AX(第一列)和53BP1(第二列)的免疫检测，所述细胞在被对照siRNA(Cont)，siAR7siRNA或siARH2AX-1转染72小时后用博莱霉素(10μl)或加入载体处理6小时。

图9：用siAR2(灰色条)、siARH2AX-1(白色条)或对照siRNA(黑色条)转染90小时后，通过MDA MB231或C4-2细胞的WST1测试测量的细胞活力。测量值与在对照条件(对照siRNA，载体)中测量的值的平均值相关。

图10：左图：用对照siRNA(Cont)，siARh，siH2AX或siARH2AX转染72小时后，通过WST1测试测量的22RV1，MDA MB-453，U87，WM266-4和MDA MB231细胞的活力。右图：在用对照(Cont)，siAR7或siARH2AX的siRNA转染72小时后通过WST1测试测量LNCaP或C4-2细胞的活力。对于每个细胞系，结果与对照条件下的细胞活力相关。

图11：用对照siRNA(黑色条)，siAR2(灰色条)或siARH2AX-1(白色条)转染细胞48小时后，在含有10μM博来霉素或10μM依托泊苷或载体的培养基中培养48小时，用WST1测试测量C4-2细胞的细胞活力。测量值与在对照条件(对照siRNA，载体)中测量的值的平均值相关。

图12：用对照siRNA(Cont)或siARH2AX-1转染细胞24小时后，随后用10μM博来霉素处理48小时或加入载体处理48小时后，通过WST1代谢测试测量的LNCaP或C4-2细胞的活力。不同样品的活力测量值与在对照条件(没有博来霉素的siRNA对照)下培养的细胞中测量的值的平均值相关，所述平均值被认为是100％。

图13：用对照siRNA(Cont，黑色条)，siH2AX siRNA(深灰色条)，siARh siRNA(浅灰色条)或siARH2AX-1(白色条)转染细胞24小时后，用40μM依托泊苷处理48小时或加入载体处理48小时后，通过WST1代谢测试来测量的MDA MB231和WM266-4细胞的活力。不同样品的活力测量值与在对照条件(没有博来霉素的siRNA对照)下培养的细胞中测量的值的平均值相关，所述平均值被认为是100％。

图14：通过连续全身给药siARH2AX-1抑制前列腺癌的骨转移。左图：在用载体(154mM NaCl，黑色条)或用在该载体中稀释的siARH2AX-1(灰色条)连续皮下给药3周的小鼠中携带22RV1人前列腺肿瘤的裸鼠胫骨中的人AR mRNA的表达水平(平均值±SEM，n＝7，各值相对于NaCl组的平均值)。右图：通过两组动物中人HPRT的mRNA的表达来测量骨中的转移量。每个条形代表小鼠的骨转移量。“0”表示在该动物中未检测到HPRT的mRNA。

图15：通过RT-qPCR，对已皮下连续给药3天siARH2AX-1的小鼠的血清，不同器官和肿瘤中的siARH2AX-1进行定量，所给药的siARH2AX-1在154mM的NaCl溶液(灰色条)或含有10mM的MgCl₂的pH6的柠檬酸盐缓冲液中稀释(黑色条)(平均值±SEM，n＝4，各值对应于血清中NaCl组的平均值)。

图16：包含siRNA siH2AX-1和CD36受体配体的组合物作为单剂量给药对体内的siRNA分布的效果。在以0.12mg/kg配制于生理盐水溶液(154mM的NaCl)或配制于包含海沙瑞林(siAR-1:海沙瑞林的重量比是1:1)或氧化LDL(siAR-1:LDL的重量比是1:0.1)的pH6的10mM的柠檬酸盐缓冲液的单剂量的siARH2AX-1进行皮下给药10分钟后，用RT-qPCR来对在血清(图A)中或不同器官(图B)中的siARH2AX-1进行定量。每组的平均值(每组3只小鼠)报告为NaCl组的平均值。

图17：包含siRNA siH2AX-1和CD36受体配体的组合物的连续全身皮下给药对体内siRNA的分布的效果。将siRNA siARH2AX-1以2mg/kg/天连续递送3天的渗透泵皮下植入携带人前列腺肿瘤22RV1的小鼠中。将siRNA配制在生理盐水溶液(154mM NaCl，灰色条)中或含有1μM MgCl₂并补充有氧化LDL(siARH2AX-1：氧化LDL的重量比为1：0.1)的pH6的10mM柠檬酸盐缓冲液(黑色条)中。在治疗3天结束时通过RT-qPCR定量siARH2AX-1。每组的平均值(每组3只小鼠)与NaCl组血清中的平均值相关。坐标轴表示相对于在接受稀释于NaCl溶液中的siRNA的小鼠的血清中测量的siARH2AX-1的浓度。

图18：裸鼠产生的C4-2肿瘤发展的体积与时间的关系，对于所述裸鼠，用载体(DMSO)(黑色菱形)，剂量为5mg/kg的依托泊苷(浅灰色菱形)或剂量为10mg/kg的依托泊苷(深灰色菱形)每周给药三次，或单独连续皮下给药siRNA siARH2AX-1(白色三角形)每周三次，或与剂量为5mg/kg依托泊苷(浅灰色三角形)或剂量为10mg/kg的依托泊苷(深灰色三角形)联合给药每周三次。

具体实施方式

实施例1：方法

1-所采用的siRNA

采用不与任何已知mRNA杂交的siRNA(siRNA对照)。该siRNA由以下两种寡核苷酸组成：

SEQ ID NO：7：5’UAGCAAUGACGAAUGCGUA[dT][dT]，

SEQ ID NO：8：5’UACGCAUUCGUCAUUGCUA[dT][dT]。

四个抑制AR的siRNA被采用：

-由如表1示出的SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的两种寡核苷酸构成的siRNA siARH2AX。

-在申请PCT/FR2002/003843中描述的siAR2siRNA,其由下列两种寡核苷酸构成：

SEQ ID NO：9：GACUCAGCUGCCCCAUCCACG[dT][dT]，

SEQ ID NO：10：CGUGGAUGGGGCAGCUGAGUC[dT][dT]。

还采用其它两种与AR的mRNA杂交但不与H2AX的mRNA杂交的siRNA。siARh与AR的第一外显子序列杂交，siAR7与AR的第7外显子序列杂交。这些siRNA由下列两种寡核苷酸构成：

siARh:

SEQ ID NO：11：UCCCCAAGCCCAUCGUAGA[dT][dT]，

SEQ ID NO：12：UCUACGAUGGGCUUGGGGA[dT][dT]；

siAR7

SEQ ID NO：13：AAUGAUACGAUCGAGUUCC[dT][dT]，

SEQ ID NO：14：GGAACUCGAUCGUAUCAUU[dT][dT]。

siH2AX是一种与H2AX的mRNA杂交但不与AR的mRNA杂交的siRNA。该siRNA由下列两种寡核苷酸构成：

siH2AX：

SEQ ID NO：15：CUGGAAUUCUGCAGCUAAC[dT][dT]

SEQ ID NO：16：GUUAGCUGCAGAAUUCCAG[dT][dT]。

2-细胞系，培养和转染条件，基因表达测量

在下列例子中所采用的所有细胞均为人类细胞并表达H2AX。

表2显示了细胞系的起源和AR mRNA的相对表达水平，通过RT-qPCR测量，用亲环蛋白-A的表达归一化并以任意单位表示(22RV1＝100,000)。

将细胞在补充有10％胎牛血清的DMEM或RPMI中培养，或按照ATCC的推荐进行培养。如果需要，使用脂质体(Life Technologies)按照供应商的方案用siRNA转染这些细胞。根据供应商的指示(Roche)通过WST1测试测量细胞的代谢活性，以量化指定处理后的活细胞数量。

测量了siRNA转染和/或不同化学治疗剂对基因表达的影响：

-通过对用常规苯酚-氯仿法(Trizol)提取的mRNA进行RT-qPCR定量。通过测量不受AR调节的编码亲环蛋白A的mRNA(deltaCT法)来归一化RNA的量。

-通过蛋白质免疫印迹法检测蛋白质提取物。所采用的抗体是：AR:Santacruz的N-20sc-816；H2AX:Merck Millipore的参考编号07-627；微管蛋白:Sigma的T6199；肌动蛋白:Merck Millipore的MAB 1501；γH2AX:Merck Millipore的05-636。

微管蛋白或肌动蛋白的免疫检测用于确保在不同条件下分析可比较量的蛋白质。

-通过对玻璃盖玻片上培养并固定的细胞进行间接免疫荧光检测。使用的抗体如下：γH2AX：Merck Millipore的05-636；53BP1:Novus的NB 100-304。

3-通过改良的RT-PCR定量方法定量siRNA

为了量化生物样品中的siRNA，本发明人开发了逆转录方法，随后进行定量PCR(RT-qPCR)。对于每个siRNA,合成具有8个突出核甘酸的特定茎环引物,这8个核苷酸与siRNA引导(反义)链的3'末端的8个核苷酸互补。在逆转录步骤之后，使用两种引物通过PCR扩增获得的产物，其中一种引物与对应于逆转录引物环的区域杂交。第二引物3'的12个核苷酸具有对应于siRNA引导链逆转录后新合成的cDNA的5'末端的12个核苷酸的DNA序列。通过Taqman荧光探针的降解或通过掺入SybrGreen连续进行扩增检测。

制备一系列双链siRNA，在室温反应中具有10³至10⁹个拷贝，在水中稀释，并与样品一起通过RT-qPCR处理。图1示意性地显示了RT-qPCR方法和示例性范围，其显示了反应中存在的拷贝数与获得的CT(循环阈值或扩增阈值)之间的关系。

其中定量siRNA的生物样品是从假定含有siRNA的已知重量的组织片段中提取的血清或总RNA。这些RNA通过常规方法提取，例如通过酚-氯仿法(trizol提取)。在提取后，用水稀释。

将每个样品获得的CT值与该范围获得的CT值进行比较。这使得可以计算测定样品中存在的siRNA拷贝数。然后首先将这些值报告为总逆转录RNA的量，然后报告提取RNA的组织重量或血清体积，考虑到所有组织的密度为1g/cm³，最终结果以摩尔/L(M)表示。

4-小鼠肿瘤细胞移植

通过将肿瘤细胞皮下注射到裸鼠的侧腹来获得肿瘤。仅将发现肿瘤的动物包括在研究中并随机化以接受治疗或对照治疗。

当指出时，将在DMSO中稀释然后在154mM NaCl溶液中调节至所需浓度的依托泊苷以指定剂量腹膜内注射，每周3次。

将所有siRNA在含有154mM NaCl的水中或在指定的缓冲液中稀释。

当指出时，通过在小鼠背部皮下植入Alzet渗透泵进行siRNA的连续给药，当小鼠佩戴时，该渗透泵在肿瘤的相反侧。考虑到制造商指示的泵流速，调节泵中siRNA的浓度来以mg/kg/天的指示量进行输送。

通过用卡尺测量肿瘤的最大直径(D)，最小直径(d)和它们的高度(h)来估计皮下肿瘤体积。体积通过式子V＝DxdxhxPi/6计算。

在实验结束时，处死动物并解剖来获得血清，肿瘤和不同组织，定量提取的RNA和存在于这些RNA中的siRNA。

所有使用的实验方案均已得到法国伦理委员会和监管机构的验证。这些实验方案以限制使用的动物数量并避免不必要的痛苦的方式实施。

实施例2：本发明的siRNA siARH2AX-1和siARH2AX-1b是双特异性的

图2显示的比对示出了19个siARH2AX-1碱基和21个siAR2碱基与AR的mRNA完全互补。该图也示出了siARH2AX-1的19个碱基中的17个和siAR2的21个碱基中的17个与编码H2AX的mRNA的碱基杂交。这些siRNA中两个突出的脱氧胸苷的存在对这些siRNA的杂交没有影响。

siRNA siARH2AX-1和siARH2AX-1b的成核区，即其引导链的5’至3’序列中包含的2至8个核苷酸(图1中的灰色框)与H2AX的mRNA是完全互补的(7个中的7个碱基，即100％互补)。然而，这种互补性仅是部分的，对于siAR2来说，7个中的5个碱基是互补的，互补性仅为71％，siAR2的2和3位核苷酸不与H2AX mRNA互补。如图3所示，该差异导致了siARH2AX-1和siAR2在功能上的差异。在该实验中，用以下siRNA转染C4-2肿瘤细胞：对照组,siARH2AX-1或siAR2。转染48小时后，观察到siRNA siARH2AX-1和siAR2以类似方式抑制AR表达。不同的是，其成核区域仅与H2AX mRNA部分(71％)互补的siRNA siAR2在抑制H2AX表达方面的效力远低于其成核区域与H2AX mRNA完全互补的siRNA siARH2AX-1。

在图4,5,6和7中，分别用siARH2AX-1，和靶向AR的外显子1(siARh)或外显子7(siAR7)的序列但不靶向H2AX的另外两种siRNA或甚至是用针对H2AX而非AR的siRNA来转染不同的细胞系。

在图4示出了该实验，用以下siRNA转染LNCaP或C4-2肿瘤细胞：对照组,siAR7或siARH2AX-1。转染72小时后，对编码AR、编码抗原特异性前列腺或编码PSA(一种由雄激素受体调节的基因)的mRNA和编码H2AX的mRNA的分析表明，在两个系中，siAR7和siARH2AX-1抑制AR和PSA的表达，但只有siARH2AX-1也抑制H2AX的表达，并且抑制率超过90％。

类似地，在图5示出了该实验，用以下siRNA转染LNCaP或MDA MB-453肿瘤细胞：对照组,siH2AX,siARh,siARH2AX-1。在两个细胞系中，siARh抑制AR但不抑制H2AX，siH2AX抑制H2AX但不抑制AR。siRNA siARH2AX-1独自抑制了编码AR和编码H2AX两个mRNA的表达。

在图6示出的实验中，AR和H2AX的蛋白质表达在将C4-2细胞用以下siRNA转染72小时后检测：Cont,siARH2AX-1,siARh,siH2AX,和siRNA siARh与siH2AX的混合物(1:1混合)，siARh抑制AR但不抑制H2AX，siH2AX抑制H2AX但不抑制AR，两种siRNA的混合物抑制AR和H2AX。siRNA siARH2AX-1独自抑制了编码AR和编码H2AX两个mRNA的表达。

在图7示出了该实验，用以下siRNA转染PC3肿瘤细胞，在该细胞中弱表达有AR：对照组,siAR7或siARH2AX-1。转染72小时后，检测AR和H2AX蛋白的表达。观察到H2AX的表达被siARH2AX-1抑制，但没有被siAR7抑制。H2AX的抑制伴随着其磷酸化形式γH2AX的抑制。

总之，这些结果表明只有siRNA siARH2AX-1具有同时抑制AR和H2AX的能力。siRNAsiARH2AX-1在抑制H2AX表达方面比siRNA siAR2更有效。这两种siRNA在成核区域中的两个碱基的差异显著地改变了它们抑制H2AX的能力。

由siARH2AX-1引起的H2AX的抑制发生在强烈(LNCaP,C4-2)、适中(MDA MB253)、微弱(PC3)地表达AR的细胞中。

实施例3：H2AX的抑制阻止53BP1在被博来霉素诱导而具有DNA损伤的细胞上的募集并降低细胞活力。

在图8示出的实验中，用对照或siRNA siARH2AX-1转染C4-2细胞。转染72小时后，然后用10μl博来霉素或相应的载体处理细胞6小时。

观察到在对照条件下(Cont siRNA，没有博来霉素)，可检测到γH2AX但是被弱表达，而53BP1的表达主要是弥散的。博来霉素强烈地增加了γH2AX的表达，而53BP1标记变为点状，表示53BP1的募集是在由博来霉素诱导的DNA损伤上经由γH2AX而进行的。

在转染siAR7的细胞中，博来霉素诱导γH2AX标记的增加以及53BP1的募集。

在被siARH2AX-1转染的细胞中，与对照条件相比，H2AX的表达非常小，而53BP1的表达则是相当的。用博来霉素处理后，siARH2AX-1转染的细胞未显示出在修复DNA损伤的聚焦点有增加的H2AX或53BP1的募集。

从该实验得出结论，siRNA siARH2AX抑制DNA的修复。

实施例4：无论AR表达水平如何，siRNA siARH2AX-1均可降低细胞活力

在图9中描述的实验中，转染MDA MB231(弱表达AR)细胞90小时后或在转染C4-2细胞90小时后观察到，受siRNA siARH2AX转染的细胞的活力在两个细胞系中显著降低，而在受siRNA siAR2转染的细胞中活力仅略微降低。

在图10所示的实验中，在左图中，用对照(Cont)，siH2AX，siARh或siARH2AX-1的siRNA转染细胞，在右图中用对照，siAR7或siARH2AX-1的siRNA转染细胞。siARh和siAR7siRNA抑制强烈表达AR的细胞(22RV1，C4-2，LNCaP)的增殖，但不抑制中等或低水平表达AR的其它细胞系(MDA MB 453，MDA MB 231，WM 266-4，U87)的增殖。

相比之下，siRNA siARH2AX-1抑制所有细胞系的增殖，无论AR表达水平如何，并且不论不抑制H2AX的siRNA siARh对AR抑制对细胞增殖的影响，而仅抑制H2AX而不影响AR表达的siRNA siH2AX对细胞增殖几乎没有影响，无论谱系如何。

从这些实验得出结论，siRNA siARH2AX-1独自抑制细胞增殖，无论它是否取决于AR表达，并且无论AR在这些细胞中的表达水平是相当强或是在中间水平还是相当弱。

实施例5：无论AR表达水平如何，siRNA siARH2AX-1和DNA损伤诱导剂的作用都会增强

在图11中描述的实验中，用对照，siAR2或siARH2AX-1的siRNA转染C4-2细胞48小时后，用载体或诸如依托泊苷(10μM)或博来霉素(10μM)的诱导DNA损伤的化学治疗剂处理细胞。在加入化学治疗剂48小时后，观察到siRNA siAR2与这些药剂中的一种或另一种的组合不会产生比单独用化学治疗剂测量的显著更大的活力抑制效果。相反，siARH2AX-1和任一种化学治疗剂的作用增强了对于细胞活力的抑制。

在图12中描述的实验中，用对照或siARH2AX-1的siRNA转染C4-2细胞48小时后，用载体或博来霉素(10μM)处理细胞。在LNCaP细胞中观察到用siARH2AX-1与博来霉素的组合处理产生的效果大约是用两种单独处理来抑制细胞存活率的预期效果的两倍，显示出这两种处理的相互增强作用。

在图13所示的实验中，用对照(Cont)，siH2AX，siARh或siARH2AX-1的siRNA转染AR弱表达的MDA MB 231或WM266-4细胞。转染24小时后，用40μl依托泊苷或载体处理细胞，48小时后通过WST1试验测量相对于受控条件下细胞的细胞存活率。据观察，在两种细胞系中，依托泊苷抑制细胞增殖。当该依托泊苷的处理与siH2AX对H2AX的抑制或与siRNA siARh对AR的抑制相联合时，没有放大依托泊苷对增殖的影响。另一方面，当依托泊苷和siARH2AX-1组合时，其处理效果增强。

从这些实验可以得出结论，将诱导DNA损伤的治疗与siARH2AX-1组合对于抑制肿瘤细胞(包括在表达低水平AR的细胞中)增殖是有利的。siRNA siRH2AX-1(包括在表达低AR的细胞中)在抑制H2AX表达和细胞活力方面比siRNA siAR2更有效。此外，siARH2AX-1，但不是siAR2，可增强化学疗法对细胞活力产生的抑制作用。

实施例6：给携带肿瘤的小鼠给药siARH2AX-1可抑制转移性扩散。

在图14所示的实验中，将22RV1细胞植入裸鼠中。一旦检测到肿瘤，将Alzet泵植入3周，用所述Alzet泵按0.2mg/kg/天给药在生理盐水(154mM NaCl)中配制的siRNAsiARH2AX-1，或仅给药载体。在治疗结束时，回收骨(胫骨)以量化siARH2AX-1和人源的编码雄性激素受体和编码HPRT的mRNA。

对具有人前列腺肿瘤22RV1的小鼠用siRNA siARH2AX-1连续皮下给药，以抑制小鼠骨中雄激素受体的表达(图14左图)。通过细胞中人mRNA(HRPT)的表达水平评估，这种抑制伴随着小鼠这些肿瘤自发发生骨转移的数量的减少和这些肿瘤大小的减少(图14右图)。

siRNA siARH2AX-1的连续皮下全身给药允许其输送到骨中发展的癌症的转移中，以抑制靶siRNA基因在骨中的表达并限制转移的移植和/或发展。

实施例7：通过siRNA的配方改善siRNA的分布

在图15所示的实验中，渗透泵皮下植入具有肿瘤的小鼠，以2mg/kg/天的剂量连续输送siARH2AX-1，所述siARH2AX-1用生理盐水溶液(154mM NaCl)或含有10mM MgCl₂的pH6的柠檬酸盐缓冲液(柠檬酸盐/Mg)稀释。3天后，通过RT-qPCR,在血清、各种器官和肿瘤中定量siARH2AX-1。发现与生理盐水制剂相比，补充有10mM的MgCl₂的pH6的柠檬酸盐缓冲液制剂显著增加组织和肿瘤中siARH2AX-1的浓度。

CD36受体在许多肿瘤细胞和如巨噬细胞的其它细胞类型的内皮细胞的外膜上表达。该CD36受体结合不同类别的配体，例如氧化的LDL或海沙瑞林肽。

在图16所示的实验中，剂量为0.12mg/kg的siRNA siARH2AX-1在154mM的NaCl溶液(对照组，表示为NaCl)或pH6的10mM柠檬酸盐缓冲液中配制，添加0.02mM海沙瑞林肽(Cit/Hexarelin)或30nM氧化的LDL(Cit/LDL)以作为推注，对成年小鼠组皮下注射给药。注射后20分钟，相对于对照组的平均值，在这些不同组小鼠(每组4只小鼠)的血清(图A)或组织(图B)中测量siRNA的平均浓度，表明添加的海沙瑞林或氧化的LDL增加了血清和组织中siRNA的浓度。

在图17所示的实验中，对携带22RV1人前列腺肿瘤的小鼠使用渗透泵以siRNAsiARH2AX-1的2mg/kg/天的剂量皮下和连续给药3天。将siRNA配制在154mM的NaCl溶液中，或配制在含有氧化LDL(siARH2AX-1：LDLox的比率为1：0.1，重量：重量)的10mM柠檬酸盐缓冲液pH6中。在血清，不同器官和肿瘤中处理3天后测量siARH2AX-1的浓度。发现添加氧化的LDL增加了血清、不同器官和肿瘤中siARH2AX-1的浓度。

实施例8：siARH2AX-1和DNA损伤诱导剂的组合增强了单独给药的这些治疗中的每一种对肿瘤发展的影响。

在图18所示的实验中，将渗透泵植入携带有22RV1人前列腺肿瘤的小鼠中用于皮下和连续给药22天，从第1天开始以2mg/kg/天为剂量给药siRNA siARH2AX-1，所述siRNAsiARH2AX-1用含有10mM的MgCl₂的pH6的10mM柠檬酸盐缓冲液配制，或仅给药载体。植入泵后两天，小鼠接受剂量为5或15mg/kg的依托泊苷或载体的腹膜内注射，并且每周重复该治疗两次直至处死小鼠。观察到5mg/kg的依托泊苷仅轻微抑制肿瘤发展。依托泊苷15mg/kg的剂量产生抑制作用，但伴随有接受治疗的几只动物出现体重减轻，这表示该治疗的毒性。siRNA siARH2AX-1与高剂量的依托泊苷一样有效，但不会导致体重减轻。

用依托泊苷和siARH2AX-1治疗的组合增强了这两种分开进行的治疗的效果。

从该实验得出结论，siRNA siARH2AX-1有效抑制肿瘤发展，对动物没有显著的毒性作用，并且该治疗与低或无毒剂量的诱导DNA的药剂的组合能够增强对肿瘤生长的抑制。

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<110> 瑟莱塞尔(SELEXEL)

<120> 用于治疗癌症的新型双链寡核苷酸

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<223> n是突出的脱氧胸苷

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agaggaggcg acagagggaa aaagggccga gctagccgct ccagtgctgt acaggagccg 120

aagggacgca ccacgccagc cccagcccgg ctccagcgac agccaacgcc tcttgcagcg 180

cggcggcttc gaagccgccg cccggagctg ccctttcctc ttcggtgaag tttttaaaag 240

ctgctaaaga ctcggaggaa gcaaggaaag tgcctggtag gactgacggc tgcctttgtc 300

ctcctcctct ccaccccgcc tccccccacc ctgccttccc cccctccccc gtcttctctc 360

ccgcagctgc ctcagtcggc tactctcagc caacccccct caccaccctt ctccccaccc 420

gcccccccgc ccccgtcggc ccagcgctgc cagcccgagt ttgcagagag gtaactccct 480

ttggctgcga gcgggcgagc tagctgcaca ttgcaaagaa ggctcttagg agccaggcga 540

ctggggagcg gcttcagcac tgcagccacg acccgcctgg ttaggctgca cgcggagaga 600

accctctgtt ttcccccact ctctctccac ctcctcctgc cttccccacc ccgagtgcgg 660

agccagagat caaaagatga aaaggcagtc aggtcttcag tagccaaaaa acaaaacaaa 720

caaaaacaaa aaagccgaaa taaaagaaaa agataataac tcagttctta tttgcaccta 780

cttcagtgga cactgaattt ggaaggtgga ggattttgtt tttttctttt aagatctggg 840

catcttttga atctaccctt caagtattaa gagacagact gtgagcctag cagggcagat 900

cttgtccacc gtgtgtcttc ttctgcacga gactttgagg ctgtcagagc gctttttgcg 960

tggttgctcc cgcaagtttc cttctctgga gcttcccgca ggtgggcagc tagctgcagc 1020

gactaccgca tcatcacagc ctgttgaact cttctgagca agagaagggg aggcggggta 1080

agggaagtag gtggaagatt cagccaagct caaggatgga agtgcagtta gggctgggaa 1140

gggtctaccc tcggccgccg tccaagacct accgaggagc tttccagaat ctgttccaga 1200

gcgtgcgcga agtgatccag aacccgggcc ccaggcaccc agaggccgcg agcgcagcac 1260

ctcccggcgc cagtttgctg ctgctgcagc agcagcagca gcagcagcag cagcagcagc 1320

agcagcagca gcagcagcag cagcagcagc agcaagagac tagccccagg cagcagcagc 1380

agcagcaggg tgaggatggt tctccccaag cccatcgtag aggccccaca ggctacctgg 1440

tcctggatga ggaacagcaa ccttcacagc cgcagtcggc cctggagtgc caccccgaga 1500

gaggttgcgt cccagagcct ggagccgccg tggccgccag caaggggctg ccgcagcagc 1560

tgccagcacc tccggacgag gatgactcag ctgccccatc cacgttgtcc ctgctgggcc 1620

ccactttccc cggcttaagc agctgctccg ctgaccttaa agacatcctg agcgaggcca 1680

gcaccatgca actccttcag caacagcagc aggaagcagt atccgaaggc agcagcagcg 1740

ggagagcgag ggaggcctcg ggggctccca cttcctccaa ggacaattac ttagggggca 1800

cttcgaccat ttctgacaac gccaaggagt tgtgtaaggc agtgtcggtg tccatgggcc 1860

tgggtgtgga ggcgttggag catctgagtc caggggaaca gcttcggggg gattgcatgt 1920

acgccccact tttgggagtt ccacccgctg tgcgtcccac tccttgtgcc ccattggccg 1980

aatgcaaagg ttctctgcta gacgacagcg caggcaagag cactgaagat actgctgagt 2040

attccccttt caagggaggt tacaccaaag ggctagaagg cgagagccta ggctgctctg 2100

gcagcgctgc agcagggagc tccgggacac ttgaactgcc gtctaccctg tctctctaca 2160

agtccggagc actggacgag gcagctgcgt accagagtcg cgactactac aactttccac 2220

tggctctggc cggaccgccg ccccctccgc cgcctcccca tccccacgct cgcatcaagc 2280

tggagaaccc gctggactac ggcagcgcct gggcggctgc ggcggcgcag tgccgctatg 2340

gggacctggc gagcctgcat ggcgcgggtg cagcgggacc cggttctggg tcaccctcag 2400

ccgccgcttc ctcatcctgg cacactctct tcacagccga agaaggccag ttgtatggac 2460

cgtgtggtgg tggtgggggt ggtggcggcg gcggcggcgg cggcggcggc ggcggcggcg 2520

gcggcggcgg cggcgaggcg ggagctgtag ccccctacgg ctacactcgg ccccctcagg 2580

ggctggcggg ccaggaaagc gacttcaccg cacctgatgt gtggtaccct ggcggcatgg 2640

tgagcagagt gccctatccc agtcccactt gtgtcaaaag cgaaatgggc ccctggatgg 2700

atagctactc cggaccttac ggggacatgc gtttggagac tgccagggac catgttttgc 2760

ccattgacta ttactttcca ccccagaaga cctgcctgat ctgtggagat gaagcttctg 2820

ggtgtcacta tggagctctc acatgtggaa gctgcaaggt cttcttcaaa agagccgctg 2880

aagggaaaca gaagtacctg tgcgccagca gaaatgattg cactattgat aaattccgaa 2940

ggaaaaattg tccatcttgt cgtcttcgga aatgttatga agcagggatg actctgggag 3000

cccggaagct gaagaaactt ggtaatctga aactacagga ggaaggagag gcttccagca 3060

ccaccagccc cactgaggag acaacccaga agctgacagt gtcacacatt gaaggctatg 3120

aatgtcagcc catctttctg aatgtcctgg aagccattga gccaggtgta gtgtgtgctg 3180

gacacgacaa caaccagccc gactcctttg cagccttgct ctctagcctc aatgaactgg 3240

gagagagaca gcttgtacac gtggtcaagt gggccaaggc cttgcctggc ttccgcaact 3300

tacacgtgga cgaccagatg gctgtcattc agtactcctg gatggggctc atggtgtttg 3360

ccatgggctg gcgatccttc accaatgtca actccaggat gctctacttc gcccctgatc 3420

tggttttcaa tgagtaccgc atgcacaagt cccggatgta cagccagtgt gtccgaatga 3480

ggcacctctc tcaagagttt ggatggctcc aaatcacccc ccaggaattc ctgtgcatga 3540

aagcactgct actcttcagc attattccag tggatgggct gaaaaatcaa aaattctttg 3600

atgaacttcg aatgaactac atcaaggaac tcgatcgtat cattgcatgc aaaagaaaaa 3660

atcccacatc ctgctcaaga cgcttctacc agctcaccaa gctcctggac tccgtgcagc 3720

ctattgcgag agagctgcat cagttcactt ttgacctgct aatcaagtca cacatggtga 3780

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ctgggaaagt caagcccatc tatttccaca cccagtgaag cattggaaac cctatttccc 3900

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ctgcagtgcc ttggggaatt tcctctattg atgtacagtc tgtcatgaac atgttcctga 4020

attctatttg ctgggctttt tttttctctt tctctccttt ctttttcttc ttccctccct 4080

atctaaccct cccatggcac cttcagactt tgcttcccat tgtggctcct atctgtgttt 4140

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tgcttgttta cagcactact ctgtgccagc cacacaaacg tttacttatc ttatgccacg 4260

ggaagtttag agagctaaga ttatctgggg aaatcaaaac aaaaacaagc aaacaaaaaa 4320

aaaaagcaaa aacaaaacaa aaaataagcc aaaaaacctt gctagtgttt tttcctcaaa 4380

aataaataaa taaataaata aatacgtaca tacatacaca catacataca aacatataga 4440

aatccccaaa gaggccaata gtgacgagaa ggtgaaaatt gcaggcccat ggggagttac 4500

tgattttttc atctcctccc tccacgggag actttatttt ctgccaatgg ctattgccat 4560

tagagggcag agtgacccca gagctgagtt gggcaggggg gtggacagag aggagaggac 4620

aaggagggca atggagcatc agtacctgcc cacagccttg gtccctgggg gctagactgc 4680

tcaactgtgg agcaattcat tatactgaaa atgtgcttgt tgttgaaaat ttgtctgcat 4740

gttaatgcct cacccccaaa cccttttctc tctcactctc tgcctccaac ttcagattga 4800

ctttcaatag tttttctaag acctttgaac tgaatgttct cttcagccaa aacttggcga 4860

cttccacaga aaagtctgac cactgagaag aaggagagca gagatttaac cctttgtaag 4920

gccccatttg gatccaggtc tgctttctca tgtgtgagtc agggaggagc tggagccaga 4980

ggagaagaaa atgatagctt ggctgttctc ctgcttagga cactgactga atagttaaac 5040

tctcactgcc actacctttt ccccaccttt aaaagacctg aatgaagttt tctgccaaac 5100

tccgtgaagc cacaagcacc ttatgtcctc ccttcagtgt tttgtgggcc tgaatttcat 5160

cacactgcat ttcagccatg gtcatcaagc ctgtttgctt cttttgggca tgttcacaga 5220

ttctctgtta agagccccca ccaccaagaa ggttagcagg ccaacagctc tgacatctat 5280

ctgtagatgc cagtagtcac aaagatttct taccaactct cagatcgctg gagcccttag 5340

acaaactgga aagaaggcat caaagggatc aggcaagctg ggcgtcttgc ccttgtcccc 5400

cagagatgat accctcccag caagtggaga agttctcact tccttcttta gagcagctaa 5460

aggggctacc cagatcaggg ttgaagagaa aactcaatta ccagggtggg aagaatgaag 5520

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cggcaaagcc taaagccaga tggacaccat ctggtgagtt tactcatcat cctcctctgc 5700

tgctgattct gggctctgac attgcccata ctcactcaga ttccccacct ttgttgctgc 5760

ctcttagtca gagggaggcc aaaccattga gactttctac agaaccatgg cttctttcgg 5820

aaaggtctgg ttggtgtggc tccaatactt tgccacccat gaactcaggg tgtgccctgg 5880

gacactggtt ttatatagtc ttttggcaca cctgtgttct gttgacttcg ttcttcaagc 5940

ccaagtgcaa gggaaaatgt ccacctactt tctcatcttg gcctctgcct ccttacttag 6000

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aaataacaag ggagagggga acctaagatg agtaatatgc caatccaaga ctgctggaga 6240

aaactaaagc tgacaggttc cctttttggg gtgggataga catgttctgg ttttctttat 6300

tattacacaa tctggctcat gtacaggatc acttttagct gttttaaaca gaaaaaaata 6360

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gaatgatttt catcttttgt gatacacaga ttgaattata tcattttcat atctctcctt 6480

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ccaattgtga ctcttgtctt catgaatata tgtttttcat ttgcaaaagc caaaaatcag 6600

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gaacaaagga gattttagct tggctctgtt ctcccatgga tgaaaggagg aggatttttt 6780

ttttcttttg gccattgatg ttctagccaa tgtaattgac agaagtctca ttttgcatgc 6840

gctctgctct acaaacagag ttggtatggt tggtatactg tactcacctg tgagggactg 6900

gccactcaga cccacttagc tggtgagcta gaagatgagg atcactcact ggaaaagtca 6960

caaggaccat ctccaaacaa gttggcagtg ctcgatgtgg acgaagagtg aggaagagaa 7020

aaagaaggag caccagggag aaggctccgt ctgtgctggg cagcagacag ctgccaggat 7080

cacgaactct gtagtcaaag aaaagagtcg tgtggcagtt tcagctctcg ttcattgggc 7140

agctcgccta ggcccagcct ctgagctgac atgggagttg ttggattctt tgtttcatag 7200

ctttttctat gccataggca atattgttgt tcttggaaag tttattattt ttttaactcc 7260

cttactctga gaaagggata ttttgaagga ctgtcatata tctttgaaaa aagaaaatct 7320

gtaatacata tatttttatg tatgttcact ggcactaaaa aatatagaga gcttcattct 7380

gtcctttggg tagttgctga ggtaattgtc caggttgaaa aataatgtgc tgatgctaga 7440

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tgaatatttg tatccatgtt tcaaaattga aatatatata tatatatata tatatatata 8640

tatatatata tagtgtgtgt gtgtgttctg atagctttaa ctttctctgc atctttatat 8700

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ttaatttgtt aaaacataaa gaaatctaaa atttcaaaaa a 10661

<210> 6

<211> 1651

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<300>

<308> NM_002105.2

<309> 2017-10-09

<313> (1)..(1651)

<400> 6

acagcagtta cactgcggcg ggcgtctgtt ctagtgtttg agccgtcgtg cttcaccggt 60

ctacctcgct agcatgtcgg gccgcggcaa gactggcggc aaggcccgcg ccaaggccaa 120

gtcgcgctcg tcgcgcgccg gcctccagtt cccagtgggc cgtgtacacc ggctgctgcg 180

gaagggccac tacgccgagc gcgttggcgc cggcgcgcca gtgtacctgg cggcagtgct 240

ggagtacctc accgctgaga tcctggagct ggcgggcaat gcggcccgcg acaacaagaa 300

gacgcgaatc atcccccgcc acctgcagct ggccatccgc aacgacgagg agctcaacaa 360

gctgctgggc ggcgtgacga tcgcccaggg aggcgtcctg cccaacatcc aggccgtgct 420

gctgcccaag aagaccagcg ccaccgtggg gccgaaggcg ccctcgggcg gcaagaaggc 480

cacccaggcc tcccaggagt actaagaggg cccgcgccgc ggccggccgc caggcctccc 540

catgccacca caaaggccct tttaagggcc accaccgccc tcatggaaag agctgagccg 600

cttcagactg cggggcaagc gggccgcggc tcccttcccc tcccctcccc tcgcccgcct 660

tcgccgcccg gcctcgagtc cccgcccgcc cccgctcccg tcccgcaccg cctgccgcgt 720

cggcctcggg ccctgccctg tccgccgtcc gccctccggt agggttcggg ccttccggat 780

gcggcttggg cgctcttcgg ggacctccgt ggcgcggaag acccgagcct gccgggggga 840

ggccggcggc gccgcacctg cccgcctcgg cgttcgtgac tcagccgccc catcccgagt 900

cgctaagggg ctgcggggag gccgcagcac cttctggaag acttggcctt ccgctctgac 960

gcagggccga ggtgggcagt ccaggccgag aggccggcgg ccctgaaggt gagtgaggcc 1020

ctcggcagct gcagccgggg tgtctggtac ccccccggcg tggtgcttag cccaggactt 1080

tcagacgcgg ccgctggccg ggaggctttg gtgggagaga cgcgatcgcc gatttcggtc 1140

tggcgcccct tctgcggccg ggacccaggc ctttcacatc agctctccct ccatcttcat 1200

tcataggtct gcgctggggc cgggacgaag cacttggtaa caggcacatc ttcctcccga 1260

gtgactgcct cctaggagga catttagggg agggcagagg cctgcagttt ggcttcacgg 1320

ctggctatgt ggacagcaag agtcgttttc gcggaagccg actggcagcc aggcctgtcg 1380

ggccccccga cgccgcccca tttcccttcc agcaaactca actcggcaat ccaagcacct 1440

agataccagc acaagtcggt taatccctgt ctggactgag cctccgttgg cttctgaact 1500

ggaattctgc agctaaccct tccacgacta gaaccttagg cattggggag ttttagatgg 1560

actaatttta ttaaaggatt gttttttttt taaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1620

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa a 1651

<210> 7

<211> 21

<212> RNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<222> (20)..(21)

<223> n是突出的脱氧胸苷

<400> 7

uagcaaugac gaaugcguan n 21

<210> 8

<211> 21

<212> RNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<222> (20)..(21)

<223> n是突出的脱氧胸苷

<400> 8

uacgcauucg ucauugcuan n 21

<210> 9

<211> 23

<212> RNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<222> (22)..(23)

<223> n是突出的脱氧胸苷

<400> 9

gacucagcug ccccauccac gnn 23

<210> 10

<211> 23

<212> RNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<222> (22)..(23)

<223> n是突出的脱氧胸苷

<400> 10

cguggauggg gcagcugagu cnn 23

<210> 11

<211> 21

<212> RNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<222> (20)..(21)

<223> n是突出的脱氧胸苷

<400> 11

uccccaagcc caucguagan n 21

<210> 12

<211> 21

<212> RNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<222> (20)..(21)

<223> n是突出的脱氧胸苷

<400> 12

ucuacgaugg gcuuggggan n 21

<210> 13

<211> 21

<212> RNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<222> (20)..(21)

<223> n是突出的脱氧胸苷

<400> 13

aaugauacga ucgaguuccn n 21

<210> 14

<211> 21

<212> RNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<222> (20)..(21)

<223> n是突出的脱氧胸苷

<400> 14

ggaacucgau cguaucauun n 21

<210> 15

<211> 21

<212> RNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<222> (20)..(21)

<223> n是突出的脱氧胸苷

<400> 15

cuggaauucu gcagcuaacn n 21

<210> 16

<211> 21

<212> RNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<222> (20)..(21)

<223> n是突出的脱氧胸苷

<400> 16

guuagcugca gaauuccagn n 21

Claims

1.一种组合物，其包括至少一种双特异性的siRNA，所述siRNA与编码雄激素受体的mRNA和编码H2AX的mRNA部分或全部杂交,使得这样的杂交诱导这些mRNA的降解或抑制它们的翻译，所述siRNA选自下列siRNA:SEQ ID NO：1和2的siARH2AX-1或SEQ ID NO：3和4的siARH2AX-lb,

所述组合物用于预防和/或治疗癌症，其中所述siRNA与导致DNA损伤或阻止DNA修复的治疗联合使用。

2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述导致DNA损伤的治疗选自放射治疗和/或化学治疗。

3.根据权利要求2所述的组合物，其中导致DNA损伤或阻止DNA修复的所述化学治疗采用至少一种选自以下的化学剂进行：烷化剂，抗代谢剂，细胞毒性抗生素，拓扑异构酶I抑制剂，拓扑异构酶II抑制剂，抗肿瘤抗生素，遗传毒性剂，PARP抑制剂，并且所述制剂尤其选自：阿糖胞嘧啶，博来霉素，白消安，卡培他滨，卡铂，卡莫司汀，苯丁酸氮芥，顺铂，克拉屈滨，环磷酰胺，达卡巴嗪，柔红霉素，阿霉素，表阿霉素，依托泊苷，氟尿苷，氟达拉滨，特别是5-氟尿嘧啶的氟尿嘧啶，吉西他滨，羟基脲，伊达比星(Idarubicin)，异环磷酰胺，3-硝基-4-碘苯甲酰胺(BSI-201，Iniparib)，伊立替康，洛莫司汀，氮芥，米尔法兰(Melphalan)，特别是6-巯基嘌呤的巯基嘌呤，甲氨蝶呤，丝裂霉素C，盐酸米托蒽醌，莫司汀(Mustine)，尼拉帕尼(Niraparib)，奥拉帕尼(Olaparib)，奥沙利铂，甲苄肼，鲁比替康，卢卡帕尼(Rucaparib)，链脲霉素，他唑来膦(Talazoparib)，特别是6-硫鸟嘌呤的硫鸟嘌呤，拓扑替康，维利帕尼(Veliparib)，放线菌素D，安吖啶，蒽环类药物，喜树碱，表鬼臼毒素，普卡酶素，替莫唑胺，长春新碱，长春碱，长春瑞滨，紫杉醇，多西紫杉醇，卡巴他赛，紫杉烷类，埃坡霉素类。

4.根据前述任一项权利要求所述的组合物，其中所述癌症是肾上腺皮质癌，食道癌，胃癌，基底细胞癌，甲状腺或子宫癌，星形细胞瘤，胶质母细胞瘤，少突神经胶质瘤，脑膜瘤，胸腺瘤，淋巴瘤，黑素瘤或非黑素瘤皮肤癌，白血病，间皮瘤，胆管癌，骨髓瘤，胃肠癌，膀胱癌，乳腺癌，宫颈癌，头颈癌，非小细胞肺癌，卵巢癌，胰腺癌，前列腺癌，睾丸癌，胸腺癌，肾癌，唾液腺癌，子宫内膜癌，肛门癌，结肠癌，阑尾癌，口腔癌，支气管癌和/或上呼吸道癌，胆管癌，鼻腔和鼻窦癌，脑癌，心脏癌，胃癌，肝癌，喉癌，舌癌，唇癌，鼻咽癌，食道癌，骨癌，甲状旁腺癌，阴茎癌，胸膜癌，肺癌，直肠癌，肾上腺癌，尿道癌，阴道癌，胆囊癌，外阴癌，结肠腺癌，直肠癌，硬纤维瘤，鼻咽纤维瘤，肉瘤，骨肉瘤，平滑肌肉瘤，软骨肉瘤，脂肪肉瘤，横纹肌肉瘤，嗜铬细胞瘤或其它器官发生的这些癌症的转移。

5.根据前述任一项权利要求所述的组合物，将其配制成用于局部、尤其是肿瘤内的局部区域或全身给药模式，

以单剂量或重复剂量，间歇性或连续性地给药，特别是所述全身给药模式选自以下模式给药：皮下，静脉内，腹膜内，肌肉内，皮内，透皮，鼻内，阴道内，直肠内，舌下，鞘内，脑内和口服，尤其是连续和皮下给药模式。

6.根据前述任一项权利要求所述的组合物，其中所述双特异性siRNA在酸性pH的缓冲溶液中，尤其是在柠檬酸盐或组氨酸缓冲液中。

7.根据权利要求6所述的组合物，其中所述双特异性siRNA在添加有无机或有机盐的酸性pH的缓冲溶液中，所述盐的阳历子特别选自多胺，特别是选自精胺，亚精胺或腐胺，或所述盐特别是选自金属阳离子的盐，特别是选自锌，钴，铜，锰，钙，镁或铁的盐，特别是锰，锌,镁的单独的或两种组合或三种组合的盐。

8.根据前述任一项权利要求所述的组合物，其以治疗有效剂量配制以用于siRNA给药模式，特别是以0.005mg/kg/天至30mg/kg/天的剂量配制，更特别是0.01mg/kg/天至10mg/kg/天的剂量配制。

9.根据前述任一项权利要求所述的组合物，其中所述组合物不包含载体化试剂或定位分子。

10.根据前述任一项权利要求所述的组合物，其中所述组合物不包含载体化试剂而包含定位分子，特别是包含CD36配体，特别是包含氧化的LDL或海沙瑞林。

11.根据前述任一项权利要求所述的组合物，其中所述组合物包含载体化试剂而不包含定位分子。

12.根据前述任一项权利要求所述的组合物，其中所述组合物包含载体化试剂并包含定位分子，特别是包含CD36配体，特别是包含氧化的LDL或海沙瑞林。

13.根据前述任一项权利要求所述的组合物，其中至少一种的所述双特异性siRNA缺乏化学修饰或具有化学修饰。