CN110108701B - 一种基于荧光比色和微流控技术的铅离子快速检测方法 - Google Patents

一种基于荧光比色和微流控技术的铅离子快速检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于水产品中重金属安全检测技术领域，具体涉及一种基于荧光比色和微流控技术的铅离子快速检测方法；具体步骤为：荧光探针碳量子点‑铜纳米簇溶液的制备、微控流芯片的制备、图像采集平台的搭建，通过暗箱图像采集装置用于采集微流控芯片荧光颜色图像、荧光信息的获取、定量模型的构建和实际样品的检测；本发明将碳量子点‑铜纳米簇纳米复合体系与微流控技术相结合，制备微流控芯片，降低了试剂和样品消耗，大大节约了检测成本，提高了铅离子含量的检测效率；本发明首次将荧光比色、微流控芯片技术和数字图像处理技术相结合，实现水产品中铅离子的快速可视化检测，相比于其他快速检测手段，具有检测准确度高，稳定性强等优点。

Description

一种基于荧光比色和微流控技术的铅离子快速检测方法
技术领域
本发明属于水产品中重金属安全检测技术领域，具体涉及一种基于荧光比色和微流控技术的铅离子快速检测方法。
背景技术
随着社会经济的快速发展，重金属元素被广泛地应用于生产生活中的各个领域，如电子制造、农业和冶金业等。由于重金属元素降解困难，容易在环境中积累并导致生态环境破坏。在自然水体中，重金属元素会通过生物富集作用被水生生物吸收积累，并通过食物链由人体摄入。研究表明，长期摄入过量的重金属会损害肝脏、肾脏和神经系统，危害人体健康。铅离子(铅离子)是水产品中的一种典型重金属污染物，由其造成的重金属污染事件时有发生。目前，铅离子的检测方法主要有原子吸收光谱法(AAS)、电感耦合等离子质谱法(ICP-MS)、电化学法等，这些方法检测灵敏度高，结果准确，但是检测过程繁琐、操作复杂且仪器设备昂贵，需要在实验室条件下进行，难以满足现场快速检测和日常检测的需求。鉴于铅离子对人体造成的危害，以及现有检测方法的不足，开发一种快速便捷检测水产品中铅离子含量的方法对维护食品安全和保障人类健康具有很重要的现实意义。
近年来，基于荧光比色的重金属离子检测法因其简单快速、抗环境干扰能力强等优点而备受关注。如发明专利CN201710370061.0公开了一种方酸染料检测铜离子的比色/荧光探针，可用于含水介质中的铜离子检测，表现出较好的检测灵敏度。然而，现有的荧光比色法检测重金属离子具有两方面的不足：一是荧光传感材料合成过程繁琐，用量大且价格昂贵；二是人为将荧光颜色与标准比色卡比对得到检测结果，虽然检测成本低、操作方便，但准确度低、误差较大。
微流控技术可以在几平方厘米芯片上加工出微米级通道或其他微结构，内部高度集成了生物化学反应的过程，不仅可实现一定浓度范围内重金属离子的快速定量分析，而且可以降低试剂和样品消耗，提高检测准确率，有利于设备的微型化。数据图像处理技术是指将图像信号转换成数字信号并利用计算机对其进行处理的过程，可以无失真的复制，通过有线和无线网络实现快速传输，并被计算机理解和处理等优点。随着现代信息技术的快速发展，数字图像处理技术得到了迅速的发展，并广泛地应用于生物医学工程、工业自动化控制和科学研究等领域。
为了克服现有检测方法的不足，本发明提出结合荧光比色、微流控技术和数字图像处理技术用于水产品中铅离子的检测。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，本发明旨在解决所述问题之一，本发明提供一种快速检测铅离子的方法，结合荧光比色、微流控技术和数字图像处理技术，实现水产品中铅离子的快速可视化检测。
为了实现以上目的，本发明的具体步骤如下：
步骤一：荧光探针的制备；取50～200mg蚕丝置于瓷钵中，加入2～10mL聚乙二醇(分子量为200)和100～300μL浓硫酸(质量分数为98％)，混合搅拌5～15min，微波加热5～20s，得到碳量子点原液；取5～15mL碳量子点溶液，向该溶液中加入2～8mL硝酸铜溶液(10～30mM)，并调节pH值为9-11，磁力搅拌，溶液呈浅紫色，制备得到碳量子点-铜纳米簇溶液；
步骤二：S1、制备微流控芯片，所述微流控芯片包括样品接口、反应池、样品与反应池连接通道、微泵接口、反应池与微泵接口连接通道；所述样品接口的一端通过样品与反应池连接通道与反应池相连通；反应池的另一端通过反应池与微泵接口连接通道与微泵接口连接；
S2、取步骤一制备的碳量子点-铜纳米簇溶液加入反应池，利用真空冷冻干燥机进行脱水处理；
步骤三：搭建暗箱图像采集装置用于采集微流控芯片荧光颜色图像；所述装置包括芯片固定平台、微流控芯片放置区、显色区域、紫外环形光源和图像采集装置；
所述芯片固定平台上表面中部设有凹槽，所述微流控芯片放置区位于芯片固定平台上表面中部的凹槽处；所述显色区域固定在微流控芯片放置区上；所述图像采集装置位于显色区域的正上方；所述紫外环形光源环绕在图像采集装置外围；
步骤四：荧光信息的获取；
S1、首先配置不同浓度的铅离子标准样品，然后分别吸取不同浓度的铅离子标准样品于不同的微流控芯片反应池中，与碳量子点-铜纳米簇溶液混合，得到铅离子标准样品混合液；
S2、打开步骤三所述暗箱图像采集装置的紫外环形光源，预热反应后，通过图像采集装置对微流控芯片反应池中铅离子标准样品混合液的荧光颜色进行图像采集，获得不同铅离子标准样品混合液微控流芯片的RGB图像；
S3、对步骤S2采集的微控流芯片RGB图像通过滤波、形态学运算、RGB转化为Lab颜色模式，其中L亮度，a为红色到绿色的颜色通道，b为黄色到蓝色的颜色通道；然后以Lab颜色模式中的单通道a的平均灰度值做归一化处理，得到归一化处理后的数据值；
步骤五：定量模型的构建；以不同铅离子标准样品的浓度为自变量，以步骤四提取得到的不同浓度铅离子标准样品混合液对应的各单通道a的平均灰度值归一化处理后的数据值为因变量，线性拟合构建标准曲线；
步骤六、样品的检测；首先对样品预处理得到消化液；接下来按照步骤四进行操作，区别是将铅离子标准样品替换为消化液，得到单通道a的平均灰度值的归一化处理数据，带入步骤五构建的标准曲线中，实现未知样品中铅离子含量的检测。
优选的，步骤二的S1中所述微流控芯片采用聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)材质。
优选的，步骤二的S2中所述碳量子点-铜纳米簇溶液的用量为100～400μL；所述脱水处理的时间为24～48h。
优选的，步骤三中所述图像采集装置位于显色区域的正上方5-10cm；所述紫外环形光源是半径为5-8cm的环形灯管。
优选的，步骤四的(1)中所述铅离子标准样品的浓度为0～50μM；所述铅离子标准样品与碳量子点-铜纳米簇溶液的体积比为1:3。
优选的，步骤四的(2)中所述预热反应的时间为3～6min。
优选的，步骤四的(3)中所述归一化处理公式为：
Figure BDA0002036110300000031
其中Xnorm为归一化后的数据，X为原始数据，Xmax、Xmin分别为原始数据集的最大值和最小值。
本发明的有益效果在于：
(1)本发明采用碳量子点-铜纳米簇纳米复合体系为荧光传感材料，相比于传统的有机染料，提高了传感材料的选择性和光稳定性。
(2)本发明将碳量子点-铜纳米簇纳米复合体系与微流控技术相结合，制备微流控芯片，降低了试剂和样品消耗，大大节约了检测成本，提高了铅离子含量的检测效率。
(3)本发明借助数字图像处理技术，实现了铅离子的智能化检测，相比传统人工比色检测，具有准确、稳定等优点，解决了人工判断主观性强。准确性差的缺陷。
(4)本发明首次将荧光比色、微流控芯片技术和数字图像处理技术相结合，实现水产品中铅离子的快速可视化检测，相比于其他快速检测手段，具有检测准确度高，稳定性强等优点。
附图说明
图1为微流控芯片结构示意图。
图2为暗箱图像采集装置结构示意图。
图3为实施例1中添加不同浓度铅离子时的单通道图像。
图4为实施例1中平均灰度归一化值与铅离子浓度在0-50μM内的线性关系。
其中，1-样品接口、2-反应池、3-样品与反应池连接通道、4-微泵接口、5-反应池与微泵接口连接通道，6-芯片固定平台、7-微流控芯片放置区、8-显色区域、9-紫外环形光源和10-图像采集装置。
具体实施方式：
下面结合具体实施例对本发明进行详细描述。
实施例1：
步骤一：荧光探针的制备；取100mg蚕丝置于10mL瓷钵中，加入6mL的聚乙二醇(PEG200)和200μL质量分数为98％的浓H2SO4，混合搅拌10min，微波加热15s，微波炉功率为900W，溶液由无色变为金黄色即表示碳量子点(碳量子点)的成功制备；所制备的碳量子点表面修饰有活性基团，具有还原性；然后取5mL碳量子点溶液于15mL烧杯中，向该溶液中加入5mL Cu(NO3)2溶液(20mM)，并调节pH至10，磁力搅拌12h，溶液呈浅紫色，制备得到碳量子点-铜纳米簇溶液，该体系在365nm激发波长下具有双发射荧光特性，荧光峰为440nm和550nm，分别对应铜纳米簇和碳量子点；
步骤二：S1、制备微流控芯片，所述微流控芯片包括样品接口1、反应池2、样品与反应池连接通道3、微泵接口4、反应池与微泵接口连接通道5；所述样品接口1的一端通过样品与反应池连接通道3与反应池2相连通；反应池2的另一端通过反应池与微泵接口连接通道5与微泵接口4连接；所述微流控芯片采用聚甲基丙烯酸甲酯材质，其整体厚度为4mm；反应池2为圆形，深度为1～3mm；
S2、将300μL碳量子点-铜纳米簇溶液加入反应池2，利用真空冷冻干燥机冷冻干燥24h，做脱水处理；
步骤三：搭建暗箱图像采集装置用于采集微流控芯片荧光颜色图像；所述装置包括芯片固定平台6、微流控芯片放置区7、显色区域8、紫外环形光源9和图像采集装置10；
所述芯片固定平台6上表面中部设有凹槽，所述微流控芯片放置区7位于芯片固定平台6上表面中部的凹槽处；所述显色区域8固定在微流控芯片放置区7上；所述图像采集装置10位于显色区域8的正上方5～8cm处；所述紫外环形光源9环绕在图像采集装置10外围，环形半径为6cm，紫外激发波长为365nm，以保证紫外光源的均一性；
步骤四：荧光信息的获取；
S1、配置8个铅离子浓度分别为0、2.0、5.0、10.0、20.0、30.0、40.0、50.0μM的铅离子标准样品；然后利用微泵分别定量吸取100μL的8个铅离子标准样品于8个微流控芯片反应池中，分别与反应池2中的碳量子点-铜纳米簇溶液混合，得到铅离子标准样品混合液；
S2、打开紫外环形光源，预热反应5min后，利用图像采集装置10对含有不同浓度的铅离子标准样品的微流控芯片反应池2中铅离子标准样品混合液的荧光颜色进行采集，获得浓度为0、2.0、5.0、10.0、20.0、30.0、40.0、50.0μM的铅离子标准样品混合液对应的微控流芯片的RGB图像；
S3、获得的8个微控流芯片RGB图像通过滤波和形态学算法(中值滤波和开闭运算)对背景区域和反应池进行分割，然后转化为Lab颜色模式(其中L亮度，a为红色到绿色的颜色通道，b为黄色到蓝色的颜色通道)，并利用通道分离函数提取单通道a图像，如图3，为添加不同浓度铅离子后提取得到a通道图像，利用get2d函数得到上述单通道图像像素的灰度值并做归一化处理。
其中归一化公式为：
Figure BDA0002036110300000051
其中Xnorm为归一化后的数据，X为原始数据，Xmax、Xmin分别为原始数据集的最大值和最小值。
得到归一化数据分别为0.2951，0.3099，003671，0.4191，0.5331，0.6871，0.7911，0.9051。
步骤五：定量模型的构建；以浓度为0、2.0、5.0、10.0、20.0、30.0、40.0、50.0μM的铅离子标准样品为自变量，以步骤四提取得到的对应8个铅离子标准样品混合液对应的的各单通道a的平均灰度值归一化值为因变量，建立铅离子检测定量模型；并采用线性拟合构建标准曲线。如图4所示，平均灰度归一化值与铅离子在0-50μM浓度范围内具有良好的线性关系，线性方程为：y＝0.0123x+0.2956，R2＝0.9989，表明利用本发明所建立的方法可实现铅离子在一定浓度范围内的定量检测。
步骤六：实际样品的检测；
(1)将所制备的微流控芯片应用于螃蟹中铅离子浓度的检测；
首先对螃蟹样品进行预处理，洗去螃蟹体表面污垢，并擦拭干净，打开胸甲进行解剖，取肝胰腺、性腺和肌肉，均充分研磨混匀，于冰箱中冷冻保存；取样品1.0g，放入聚四氟乙烯消解罐，并加入4mL硝酸，然后加入2mL过氧化氢，静置过夜，将消解罐置于微波消解仪中，完成消解及赶酸程序，得到螃蟹消化液；
然后采用加标回收的方法对铅离子进行检测研究，将不同浓度的铅离子(分别为5.0、10.0和15.0μM)标准溶液，分别加入到预处理后的螃蟹消化液中，得到加标样品；接下来按照步骤四进行操作，区别是将铅离子标准样品替换为加标样品，采用微流控芯片和数据图像处理技术对加标样品进行荧光比色分析，每组实验结果取三次平行实验的平均值，将单通道a的平均灰度值的归一化数据带入线性方程：y＝0.0123x+0.2956，所得结果如表1所示。
表1螃蟹中铅离子的测定及回收率实验结果
Figure BDA0002036110300000061
由表1可知，所得回收率为98.8％～104.6％，对铅离子的检测率较高，表明本发明建立的比色体系可以用于螃蟹样品中铅离子的定量检测。
(2)螃蟹样品中铅离子的检测；
A、首先对螃蟹样品进行预处理，洗去螃蟹体表面污垢，并擦拭干净，打开胸甲进行解剖，取肝胰腺、性腺和肌肉，均充分研磨混匀，于冰箱中冷冻保存；取样品1.0g，放入聚四氟乙烯消解罐，并加入4mL硝酸，然后加入2mL过氧化氢，静置过夜，将消解罐置于微波消解仪中，完成消解及赶酸程序，得到螃蟹消化液；
接下来按照步骤四进行操作，区别是将铅离子标准样品替换为螃蟹消化液，采用微流控芯片和数据图像处理技术对加标样品进行荧光比色分析，每组实验结果取三次平行实验的平均值，将单通道a的平均灰度值的归一化数据带入线性方程：y＝0.0123x+0.2956，所得结果如表2所示。
B、取步骤A中的螃蟹消化液按照食品安全国家标准GB5009.268-2016中电感耦合等离子质谱法(ICP-MS)对螃蟹样品中铅离子含量检测，所得结果如表2所示。
表2螃蟹中铅离子的测定实验结果及相对误差
Figure BDA0002036110300000062
由表2可知，对比本发明与国标法的检测结果，所得相对误差为3.01％～6.90％，在合理范围之内，表明本发明建立的比色体系可以用于螃蟹样品中铅离子的定量检测，且具有较高的检测效率和准确率。
说明：以上实施例仅用以说明本发明而并非限制本发明所描述的技术方案；因此，尽管本说明书参照上述的各个实施例对本发明已进行了详细的说明，但是本领域的普通技术人员应当理解，仍然可以对本发明进行修改或等同替换；而一切不脱离本发明的精神和范围的技术方案及其改进，其均应涵盖在本发明的权利要求范围内。

Claims (6)

1.一种基于荧光比色和微流控技术的铅离子快速检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一：制备得到碳量子点-铜纳米簇溶液，作为荧光探针；
步骤二：S1、制备微流控芯片，所述微流控芯片包括样品接口(1)、反应池(2)、样品与反应池连接通道(3)、微泵接口(4)、反应池与微泵接口连接通道(5)；所述样品接口(1)的一端通过样品与反应池连接通道(3)与反应池(2)相连通；反应池(2)的另一端通过反应池与微泵接口连接通道(5)与微泵接口(4)连接；
S2、取步骤一制备的碳量子点-铜纳米簇溶液加入反应池(2)，利用真空冷冻干燥机进行脱水处理；
步骤三：搭建暗箱图像采集装置用于采集微流控芯片荧光颜色图像；所述装置包括芯片固定平台(6)、微流控芯片放置区(7)、显色区域(8)、紫外环形光源(9)和图像采集装置(10)；
所述芯片固定平台(6)上表面中部设有凹槽，所述微流控芯片放置区(7)嵌入芯片固定平台(6)上表面中部的凹槽处；所述显色区域(8)固定在微流控芯片放置区(7)上；所述图像采集装置(10)位于显色区域(8)的正上方；所述紫外环形光源(9)环绕在图像采集装置(10)外围；
所述图像采集装置(10)位于显色区域(8)的正上方5-10cm处；所述紫外环形光源(9)是半径为5-8cm的环形灯管；
步骤四：S1、首先配置不同浓度的铅离子标准样品，然后分别吸取不同浓度的铅离子标准样品于不同的微流控芯片反应池(2)中，与反应池(2)中的碳量子点-铜纳米簇溶液混合，得到铅离子标准样品混合液；所述铅离子标准样品与碳量子点-铜纳米簇溶液的体积比为1:3；
S2、打开步骤三所述暗箱图像采集装置的紫外环形光源(9)，预热反应后，通过图像采集装置(10)对微流控芯片反应池(2)中铅离子标准样品混合液的荧光颜色进行图像采集，获得不同浓度的铅离子标准样品混合液对应的微控流芯片的RGB图像；
S3、对步骤S2采集的微控流芯片RGB图像通过滤波、形态学运算、RGB转化为Lab颜色模式，其中L为亮度，a为红色到绿色的颜色通道，b为黄色到蓝色的颜色通道；然后以Lab颜色模式中的单通道a的平均灰度值做归一化处理，得到归一化处理后的数据值；
步骤五：以不同铅离子标准样品的浓度为自变量，以步骤四提取得到的不同浓度铅离子标准样品混合液对应的各单通道a的平均灰度值归一化处理后的数据值为因变量，线性拟合构建标准曲线；
步骤六：首先对样品预处理得到消化液，接下来按照步骤四进行操作，区别是将铅离子标准样品替换为消化液，得到单通道a的平均灰度值的归一化处理数据，带入步骤五构建的标准曲线中，实现未知样品中铅离子含量的检测。
2.根据权利要求1所述的一种基于荧光比色和微流控技术的铅离子快速检测方法，其特征在于，步骤二的S1中所述微流控芯片采用聚甲基丙烯酸甲酯材质。
3.根据权利要求1所述的一种基于荧光比色和微流控技术的铅离子快速检测方法，其特征在于，步骤二的S2中所述脱水处理的时间为24～48h。
4.根据权利要求1所述的一种基于荧光比色和微流控技术的铅离子快速检测方法，其特征在于，步骤四的S1中所述铅离子标准样品的浓度为0～50μM。
5.根据权利要求1所述的一种基于荧光比色和微流控技术的铅离子快速检测方法，其特征在于，步骤四的S2中所述预热反应的时间为3～6min。
6.根据权利要求1所述的一种基于荧光比色和微流控技术的铅离子快速检测方法，其特征在于，步骤四的S3中所述归一化处理公式为：
Xnorm＝(X-Xmin)/(Xmax-Xmin)
其中Xnorm为归一化后的数据，X为原始数据，Xmax、Xmin分别为原始数据集的最大值和最小值。
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