CN110106217A

CN110106217A - 一种淀粉酶在高盐浓度条件下水解淀粉的应用和方法

Info

Publication number: CN110106217A
Application number: CN201910456638.9A
Authority: CN
Inventors: 张桂敏; 胡鑫霖; 毛良伟; 蒋思婧; 马延和
Original assignee: Hubei University
Current assignee: Hubei University
Priority date: 2019-05-29
Filing date: 2019-05-29
Publication date: 2019-08-09
Anticipated expiration: 2039-05-29
Also published as: CN110106217B

Abstract

本发明提供了一种淀粉酶在高盐浓度条件下水解淀粉的应用和方法，所述的高盐浓度为1.5‑4.0M，所述的淀粉酶具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。本发明淀粉酶具有耐受高盐(NaCl)环境、pH耐受性好等优点，具有在2M以上的高盐浓度条件下活性高的特性，可以广泛应用于可溶性淀粉，土豆直链淀粉和玉米支链淀粉的酶解。

Description

一种淀粉酶在高盐浓度条件下水解淀粉的应用和方法

技术领域

本发明属于酶工程技术领域，具体而言，涉及一种淀粉酶在高盐浓度条件下水解淀粉的应用和方法。

背景技术

淀粉酶是水解淀粉的一类复杂的酶的总称。淀粉酶来源非常广泛，在动物、植物、微生物中普遍存在。淀粉酶的分类依据多种多样，根据淀粉水解产物异头碳的α构型或者β构型，淀粉酶可以分为α-淀粉酶或者β-淀粉酶；根据水解方式的不同，可以分为内切型淀粉酶和外切型淀粉酶；根据水解产物分子的大小又可以分为糊精酶、低聚糖酶；根据酶学性质分为酸性淀粉酶、碱性淀粉酶、低温淀粉酶、高温淀粉酶、嗜盐淀粉酶等；根据淀粉酶的用途分为液化酶和糖化酶等。

目前，已报道的淀粉酶虽然非常繁多，但是能在高盐环境下表现出较高酶解活性的淀粉酶却少之又少，这极大限制了淀粉酶在工业生产中的应用。由于嗜盐淀粉酶在高盐条件下的高活性、广泛的底物特异性和良好的稳定性，越来越多的注意力已经转向在高盐环境中以嗜盐淀粉酶作为催化剂，使得它们在生物燃料生产、纺织品加工、废物处理以及作为洗涤剂添加剂等领域具有应用潜力。

例如，在现阶段的绿色造纸工业中，由于要在高碱条件下处理纤维，而后进行中和并水洗来调节pH和降低盐浓度，以达到酶制剂可以使用的条件进行后续退浆。然而，这种做法不仅在水洗过程中会使用大量清洁的水，而且会加大后期废水处理的量，导致造纸成本的大幅提高。

尽管具有巨大的工业应用潜力，但人们对嗜盐淀粉酶的研究成果却非常有限。到目前为止，已经从嗜盐菌、细菌和真菌中纯化和鉴定的嗜盐淀粉酶不超过20种，并且这些嗜盐淀粉酶在2M高盐浓度下的酶解活性不够理想。

发明内容

鉴于现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种新的嗜盐淀粉酶及其在高盐浓度条件下水解淀粉的应用和方法。该嗜盐淀粉酶在高盐环境中能保持较高的酶活，而且维持稳定，能极大减少造纸等行业水洗过程中水的用量，也能减少后期的废水处理量。

为了实现本发明的目的，发明人通过大量试验研究并不懈努力，最终获得了如下技术方案：

一种淀粉酶在高盐浓度条件下水解淀粉的应用，所述的高盐浓度为1.5-4.0M，所述的淀粉酶具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。

需要说明的是，本发明所提供的嗜盐淀粉酶基因来源于嗜盐芽孢杆菌(Halobacillushalophilic),根据其来源文献所述，最适菌体生长NaCl浓度为0.51-0.85M，淀粉酶的嗜盐特性与菌种来源无明显联系。

嗜盐杆菌(H.halophilic)的参考文献：D.Claus,F.Fahmy,H.J.Rolf,N.Tosunoglu,Sporosarcina halophila sp.nov.,an Obligate,Slightly HalophilicBacterium from Salt Marsh Soils,Systematic and Applied Microbiology 4(4)(1983)496-506.

并且需要说明的是，本发明所提供的嗜盐淀粉酶属于糖苷水解酶13家族。试验显示，在高于1.5M NaCl盐溶液中，该淀粉酶能作用于可溶性淀粉、土豆直链淀粉和玉米支链淀粉，随机断裂α-1,4糖苷键，产生糊精、低聚糖等。SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列由903个氨基酸残基组成。

为了使上述嗜盐淀粉酶蛋白质便于纯化，可在上述的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1标签的序列

标签	残基	氨基酸序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述淀粉酶蛋白质可以人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述中的嗜盐淀粉酶蛋白质的编码基因可通过将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列中，缺失、置换、插入或添加一个至几个并保持原有酶活性，或者连上表1所示的标签的编码序列得到。

进一步优选地，上述淀粉酶的编码基因为SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的DNA分子，SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列由2709个核苷酸组成。

进一步优选地，上述淀粉酶在高盐浓度条件下水解淀粉的应用中的高盐浓度为2.0-4.0M；再进一步优选高盐浓度为2.5-3.0M。

进一步优选地，上述淀粉酶在高盐浓度条件下水解淀粉的应用中，所述的淀粉选自如下任一种或两种以上：支链淀粉、直链淀粉和可溶性淀粉。

另外，本发明还提供了一种在高盐环境下水解淀粉的方法，该方法采用的淀粉酶具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，包括以下步骤：以支链淀粉、直链淀粉或/和可溶性淀粉为底物，在pH 6.5-8.0、温度为40-55℃、NaCl浓度2.0-4.0M的条件下进行酶解，切断底物中α-1,4糖苷键，产生糊精、低聚糖。

进一步优选地，上述在高盐环境下水解淀粉的方法中，所述的NaCl浓度为2.5-3.5M。

本发明的嗜盐淀粉酶对可溶性淀粉有很好的酶活，实验表明：本发明提供的嗜盐淀粉酶，以可溶性淀粉为底物，在50℃、pH为7.0、2.5M NaCl的条件下具有最高的酶活性，为85.7U/mg蛋白；该酶在40-55℃温度范围内，酶活均较高；在pH 6.5至pH 8.0的pH值范围内，酶活均较高；而该酶在低于1.5M NaCl的盐浓度环境下只能检测到极低酶活，在1.5-4MNaCl的范围酶活大幅度提高，最适NaCl浓度为2.5M，这种情况在淀粉酶类大家族中极为少见。

与现有技术相比，本发明提供的淀粉酶属于嗜盐淀粉酶，能在高浓度NaCl条件下，作用于可溶性淀粉、土豆直链淀粉和玉米支链淀粉，完成糖苷键的裂解，产生糊精和低聚糖。并且该淀粉酶与其他已表征的淀粉酶的氨基酸序列相比，相似性小于60％。本发明所述嗜盐淀粉酶最适天然底物为可溶性淀粉，且具有在2M以上的高盐浓度条件下活性高的特性。

附图说明

图1为嗜盐淀粉酶HaAmy蛋白纯化前后的SDS-PAGE电泳图。

图2为实施例1制备的嗜盐淀粉酶的活性随NaCl浓度变化的结果。

图3为实施例1制备的嗜盐淀粉酶的活性随温度变化的结果。

图4为实施例1制备的嗜盐淀粉酶的活性随pH变化的结果。

图5为实施例1制备的嗜盐淀粉酶对不同底物的活性结果。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

1、人工合成SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列来源于中度嗜盐芽孢杆菌H.halophilus DSM2266，其全基因组序列已经收录在GenBank(NC_017668.1)。

中度嗜盐芽孢杆菌H.halophilus DSM 2266的信息参考文献：Stephan H.Saum,Friedhelm Pfeiffer,Peter Palm,Markus Rampp,Stephan C.Schuster,Volker Müller*and Dieter Oesterhelt,Chloride and organic osmolytes:a hybrid strategy tocope with elevated salinities by the moderately halophilic,chloride-dependentbacterium Halobacillus halophilus，Environmental Microbiology(2013)15(5),1619–1633.

根据SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列设计引物对如下：

正向引物：5′-GCTGGATCCCAACCGTTTGCACAAAACGC-3′

反向引物：5′-GTACTCGAGCTATGAAGCTTTTCCGAGATTAGCTG-3′

正向引物的下划线部分为BamH I的酶切位点，反向引物的下划线部分为Xho I酶切位点。

以人工合成SEQ ID NO.2所示的DNA为模板，用设计的引物对进行PCR扩增。

PCR反应体系：

PCR反应条件：98℃预变性30s，然后98℃变性10s，55℃退火5s，72℃延伸30s，25个循环，最后72℃延伸5min。

PCR产物用质量分数为0.7％的琼脂糖凝胶电泳检测产量和特异性，并用DNA纯化试剂盒(超薄离心柱型，天根公司生产)纯化并将其命名为Haamy DNA片段。

2、重组表达载体的构建

1)将上述测序正确的PCR产物用BamH I和Xho I双酶切，琼脂糖电泳回收酶切产物。

2)将质粒Pet28a(Cat.N0 69864-3,Novogen)用BamH I和Xho I双酶切，琼脂糖电泳回收酶切产物。

3)将步骤1)的酶切产物和步骤2)的酶切产物进行连接，连接产物电击转化大肠杆菌DH5α后涂布于含有50μg/mL卡那霉素的LB平板，37℃过夜培养，将得到的转化子用上述的正向引物和反向引物进行菌落PCR，筛选到含有Haamy基因的重组菌，提取重组菌的质粒，进行测序验证，结果表明，在pET28a的BamH I和XhoI酶切位点之间插入了Haamy DNA片段，该片段包括SEQ ID NO.2的自5′端起第1至2706位的核苷酸，插入方向正确，将该重组质粒命名为pET28a-Haamy。

3、工程菌的制备

将质粒pET28a-Haamy电击转化大肠杆菌BL21(DE3)(Cat.N0 CD601,全式金公司)后涂布于含有50μg/mL卡那霉素的LB平板，37℃过夜培养，得到含有质粒pET28a-Haamy的工程菌，记作BL21/pET28a-Haamy。

用pET28a代替pET28a-amy117，转化大肠杆菌BL21(DE3)，步骤同上，得到含有pET28a的重组菌，作为对照菌。将pET28a成功转入BL21(DE3)的阳性重组菌记作BL21/pET28a。

4、嗜盐淀粉酶的制备和纯化

His60 Ni Superflow resin纯化柱购自TaKaRa公司，产品目录号为635660。

GE HiTrap Desalting纯化柱购自GE Healthcare公司，产品目录号分别为17-1408-01。

将上述步骤3制备的阳性重组菌BL21/pET28a-Haamy培养于含有50μg/mL卡那霉素的LB培养基中，37℃培养3h；OD₆₀₀＝0.8时，加入IPTG至其在LB培养基中的终浓度0.5mM，转至18℃继续培养16h。

在3800rpm、15min条件下离心收集菌体，悬浮于50mM Tris-HCl，pH7.4，0.5M NaCl的溶液中，于冰浴中超声破碎(60w，10min；超声1s，停止2s)，之后12000rpm离心10min除去细胞碎片，取上清液；将上清液过His60 Ni Superflow resin纯化柱，用5mL超纯水冲洗，再用10mL溶液A(50mM Tris-HCl，pH7.0，25mM咪唑)漂洗，最后用5mL溶液B(50mM Tris-HCl，pH7.0，500mM咪唑)洗脱，收集洗脱液。然后将洗脱液用脱盐柱GE HiTrap Desalting进行脱咪唑处理，用溶液C(50mM Tris-HCl，pH7.0，2.5M NCl)进行洗脱，得到HaAmy纯酶液。

将步骤3制备的对照菌采用相同的步骤进行培养和纯化，得到的溶液作为对照酶液。

SDS-PAGE电泳显示纯化的HaAmy蛋白的分子量约为130kDa。结果如图1所示，图1中，泳道M表示蛋白分子量标准(170,130,100,70,55,40kDa)；泳道1表示大肠杆菌BL21/pET28a-Haamy的破菌上清液；泳道2表示GE Desalting脱盐柱纯化后的HaAmy蛋白。可以看出已经获得了纯化的HaAmy蛋白。同时进行了对照组的实验，但对照组并没有得到目的蛋白。

实施例2：以可溶性淀粉为底物验证蛋白功能

酶活单位定义为在测定条件下，每分钟释放1μmol还原糖所需要的酶量作为一个酶活单位U。

(一)最适NaCl浓度

如下各组中的稀释酶液均是用各组中的缓冲液稀释实施例1的步骤4中的HaAmy纯酶液得到的。

实验组：活性测定反应体系为0.55mL，分别由0.5mL溶液A(A1、A2、A3、A4、A5、A6、A7、A8和A9)和0.05mL稀释酶液组成。

溶液A1的组成：50mM，pH7.0 Tris-HCl缓冲液和底物可溶性淀粉；可溶性淀粉在溶液A1中的浓度为1g/100mL(质量分数1％)。

溶液A2的组成：与溶液A1的组成相同，不同的是溶液A2额外加入NaCl并调整浓度至0.5M。

溶液A3的组成：与溶液A1的组成相同，不同的是溶液A3额外加入NaCl并调整浓度至1.0M。

溶液A4的组成：与溶液A1的组成相同，不同的是溶液A4额外加入NaCl并调整浓度至1.5M。

溶液A5的组成：与溶液A1的组成相同，不同的是溶液A5额外加入NaCl并调整浓度至2.0M。

溶液A6的组成：与溶液A1的组成相同，不同的是溶液A6额外加入NaCl并调整浓度至2.5M。

溶液A7的组成：与溶液A1的组成相同，不同的是溶液A7额外加入NaCl并调整浓度至3.0M。

溶液A8的组成：与溶液A1的组成相同，不同的是溶液A8额外加入NaCl并调整浓度至3.5M。

溶液A9的组成：与溶液A1的组成相同，不同的是溶液A9额外加入NaCl并调整浓度至4.0M。

将反应体系在50℃温育10min后，加入0.7mL二硝基水杨酸溶液(DNS)终止反应，然后沸水浴10min，迅速冷却后测定OD₅₄₀。

实验设三次重复。

结果如图2所示。嗜盐淀粉酶HaAmy在1.5-4M NaCl之间的条件下均具有水解可溶性淀粉的活性；在低于1.5M NaCl的条件下基本不能检测出酶活。

图2表明嗜盐淀粉酶HaAmy在2.5M NaCl条件下具有最高酶活性。以此最高酶活性体系的吸光值作为相对活性100％，其它反应体系的吸光值与此最高酶活性体系的吸光值的比值作为各自的相对活性。在NaCl浓度为2.0-4.0的范围内具有60％以上的酶活，相对于低浓度NaCl条件下，酶活大幅度提高。

对照组：以对照菌BL21/pET28a获得的蛋白(记作对照酶液)进行上述实验，结果不管在哪个NaCl浓度下，对照酶液都没有降解可溶性淀粉的活性。

实验设3次重复，结果一致。

(二)最适温度

用pH7.0的50mM Tris-HCl缓冲液稀释实施例1的步骤4中的HaAmy纯酶液，用稀释后的酶液进行酶活测定。将稀释后的酶液记作稀释酶液。

溶液B组成：由50mM，pH7.0 Tris-HCl缓冲液、2.5M NaCl和可溶性淀粉溶液组成；底物可溶性淀粉在溶液B中的浓度为1g/100mL(量分数1％)。

实验组：活性测定反应体系为0.55mL，由0.5mL溶液B和0.05mL稀释酶液；反应体系的pH值为7.0；反应体系在特定温度范围(25-60℃)内温育10min后，加入0.7mL二硝基水杨酸溶液(DNS)终止反应，然后沸水浴10min，迅速冷却后测定OD₅₄₀。

结果如图3所示。图3表明，嗜盐淀粉酶HaAmy具有降解可溶性淀粉的活性。在50℃条件下，嗜盐淀粉酶HaAmy具有最高的酶活性，为85.7U/mg蛋白；将此温度下的酶活反应体系的吸光值作为相对活性100％，其他温度下酶活反应体系的吸光值与此最高酶活体系的吸光值的比值作为相对活性。在40-55℃条件下均具有60％以上的活性。

对照组：以对照菌BL21/pET28a获得的蛋白(记作对照酶液)进行上述实验，结果不管在哪个温度条件下，对照酶液都没有降解可溶性淀粉的活性。

实验设3次重复，结果一致。

(三)最适pH

实验组：活性测定反应体系为0.55mL，分别由0.5mL溶液C(C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10、C11和C12)和0.05mL稀释酶液组成。

溶液C1的组成：50mM Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液、2.5M NaCl和底物可溶性淀粉；可溶性淀粉在溶液C1中的浓度为1g/100mL(质量分数1％)；溶液C1的pH值为5.5。

溶液C2的组成：与溶液C1的组成相同，不同的是溶液C2的pH值为6.0。

溶液C3的组成：与溶液C1的组成相同，不同的是溶液C3的pH值为6.5。

溶液C4的组成：与溶液C1的组成相同，不同的是溶液C4的pH值为7.0。

溶液C5的组成：与溶液C1的组成相同，不同的是溶液C5的pH值为7.5。

溶液C6的组成：与溶液C1的组成相同，不同的是溶液C6的pH值为8.0。

溶液C7的组成：与溶液C1的组成相同，不同的是将50mM Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液替换为50mM Tris-HCl缓冲液。溶液C7的pH值为8.0。

溶液C8的组成：与溶液C1的组成相同，不同的是将50mM Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液替换为50mM Tris-HCl缓冲液。溶液C8的pH值为8.5。

溶液C9的组成：与溶液C1的组成相同，不同的是将50mM Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液替换为50mM Tris-HCl缓冲液。溶液C9的pH值为9.0。

溶液C10的组成：与溶液C1的组成相同，不同的是将50mM Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液替换为50mM glycine-NaOH缓冲液。溶液C10的pH值为9.0。

溶液C11的组成：与溶液C1的组成相同，不同的是将50mM Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液替换为50mM glycine-NaOH缓冲液。溶液C11的pH值为9.5。

溶液C12的组成：与溶液C1的组成相同，不同的是将50mM Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液替换为50mM glycine-NaOH缓冲液。溶液C12的pH值为10.0。

实验设三次重复。

结果如图4所示。嗜盐淀粉酶HaAmy在pH为6.5至9.0之间的条件下均具有水解可溶性淀粉的活性。

图4表明嗜盐淀粉酶HaAmy在pH7.0条件下具有最高酶活性。以此最高酶活性体系的吸光值作为相对活性100％，其它反应体系的吸光值与此最高酶活性体系的吸光值的比值作为各自的相对活性。在pH为6.5-8.0的范围内具有60％以上的酶活。

对照组：以对照菌BL21/pET28a获得的蛋白(记作对照酶液)进行上述实验，结果不管在哪个pH条件下，对照酶液都没有降解可溶性淀粉的活性。

实验设3次重复，结果一致。

(4)底物特异性

将稀释酶液分别在相同浓度(质量分数为1％)的不同底物条件下进行酶活测定，底物分别为可溶性淀粉，土豆直链淀粉，玉米支链淀粉和普鲁兰糖。

结果如图5所示，以可溶性淀粉为底物测得酶活为参比(100％)，对普鲁兰糖没有酶活性。对于土豆直链淀粉，玉米支链淀粉酶活比较高。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 湖北大学

<120> 一种淀粉酶在高盐浓度条件下水解淀粉的应用和方法

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 903

<212> PRT

<213> 中度嗜盐芽孢杆菌(H.halophilus DSM 2266)

<400> 1

Gln Pro Phe Ala Gln Asn Ala Phe Ala Asp Asp Lys Val Tyr Asp Thr

1 5 10 15

Val Val Leu Arg Gly Ser Ala Ala Ser Leu Asp Trp Ser Ser Asn Asp

20 25 30

His Pro Leu Ala Tyr Asp Ala Glu Glu Gly Val Trp Lys Ser Asp Pro

35 40 45

Val Ala Leu Glu Gly Gly Asn Glu Val Glu Phe Lys Tyr Val Tyr Asp

50 55 60

Gly Ser Trp Met Glu Gly Ala Asn Leu Thr Tyr Thr Pro Pro Gln Asp

65 70 75 80

Gly Asp Tyr Thr Phe Val Phe Tyr Pro Glu Asn Glu Arg Thr Val Asp

85 90 95

Val Arg Ser Ala Asn Thr Ser Ser Gly Ser Val Thr Leu Glu Leu Thr

100 105 110

Val Pro Glu Ala Thr Pro Asp Trp Val Val Pro Thr Leu Ala Ser Asn

115 120 125

Met Asn Asp Phe Asn Tyr Lys Val Ser Pro Leu Ser Lys Val Asp Glu

130 135 140

Arg Thr Tyr Gln Ile Gln Val Asn Gly Glu Ser Gly Glu Thr Leu Ser

145 150 155 160

Tyr Phe Tyr Ser Leu Asp Gly Glu Pro Tyr Lys Glu Val Arg Glu Glu

165 170 175

Pro Arg Ser Val Val Phe Thr Glu Asp Thr His Val Gln Lys Asp Thr

180 185 190

Val Thr Glu Trp Glu Thr Ile Pro Val Ala Gln Asp Val Thr His Asp

195 200 205

Phe Asn His Glu Pro Tyr Thr Pro Asp Lys Lys Asp Asn Val Val Val

210 215 220

Glu Val Thr Val Asp His Tyr Gly Pro Ile Asp Glu Gly Ala Val Tyr

225 230 235 240

Tyr Thr Thr Asp Gly Ser Ser Pro Val Gly Lys Arg Gly Glu Val Glu

245 250 255

Asn Gly Lys Thr Ala Asp Leu Gln Val Thr Glu Thr Thr Thr Gln Asn

260 265 270

Asn Gly Leu Lys Thr Ser Ile Leu Thr Gly Thr Ile Pro Asn Gln Lys

275 280 285

Asn Glu Thr Arg Val Lys Tyr Lys Ile Asp Val Trp His Ser Glu Ser

290 295 300

Lys Gly Ser Gln Phe Ala Asp Asn Asn Ala Leu Thr Ser Glu Asn Ala

305 310 315 320

Thr Glu Phe Ala Tyr Tyr Val Glu Asp Tyr Gln Ser Pro Asp Trp Ala

325 330 335

Lys Glu Ala Ile Ile Tyr Gln Val Phe Val Asp Arg Phe Arg Asp Gly

340 345 350

Thr Asp Ser Asn Asn Thr Ser Val Asp Pro Ser Leu Pro Tyr Asp Glu

355 360 365

Gln Leu Lys Gly Cys Met Gly Gly Asp Ile Gln Gly Val Leu Glu Lys

370 375 380

Leu Asp Tyr Ile Asp Ser Leu Gly Val Asn Thr Ile Trp Ile Ser Pro

385 390 395 400

Ile Tyr Glu Gly Pro Tyr Ser His Gly Tyr His Pro Ala Asp Phe Met

405 410 415

Asn Ile Asp Pro Arg Phe Gly Ser Asn Glu Leu Met Lys Glu Leu Val

420 425 430

Lys Lys Ala His Lys Arg Asn Ile Lys Val Val Tyr Asp Leu Val Pro

435 440 445

Asn His Thr Ser Asn Gln His Pro Phe Phe Gln Asp Ala Val Glu Lys

450 455 460

Gly Glu Asp Ser Pro Tyr Tyr Asp Trp Tyr Ser Phe Thr Asn Trp Pro

465 470 475 480

Asn Glu Tyr Glu Thr Phe Tyr Asp Val Gln Glu Leu Pro Glu Leu Asn

485 490 495

Asn Asp Asn Pro Glu Thr Arg Glu Tyr Met Leu Asp Glu Val Val Pro

500 505 510

Phe Trp Met Glu Glu Ile Gly Val Asp Gly Phe Arg Leu Asp Tyr Ala

515 520 525

Lys Gly Pro Ser Gln Ser Phe Trp Val Asp Phe Arg His Lys Val Lys

530 535 540

Glu Leu Asp Ser Asn Ala Phe Ile Phe Gly Glu Val Trp Asp Asn Leu

545 550 555 560

Asp Thr Ile Thr Ser Tyr Thr Gly Lys Leu Asp Gly Ala Ile Asp Phe

565 570 575

Glu Thr Gln Ser Ala Ile Gln Asn Ala Phe Ile Asn Asp Gly Ser Met

580 585 590

Asn Gln Leu Ala Ser Ser Leu Thr Thr Ile His Asn Ala Tyr Ser Glu

595 600 605

Glu Phe Val Pro Ala Thr Phe Leu Asp Ser His Asp Val Pro Arg Phe

610 615 620

Leu Tyr Glu Ala Asp Gly Asn Thr Gln Thr Leu Lys Asn Ala Ala Ser

625 630 635 640

Leu Gln Phe Thr Leu Pro Gly Ala Pro Val Ile Tyr Tyr Gly Asp Glu

645 650 655

Val Gly Leu Ser Gln Ser Gly Asp His Asn Ala Val Asp Glu Trp Lys

660 665 670

Asp Arg Tyr Tyr Arg Glu Met Met Pro Trp Lys Pro Ser Glu Gln Asp

675 680 685

Gln Asp Val Lys Ala His Tyr Lys Lys Leu Ile Asp Ile Arg Gln Glu

690 695 700

His Glu Ala Leu Thr Asp Gly Asp Leu Glu Met Val Tyr Tyr Asp Asp

705 710 715 720

Asp Leu Leu Val Phe Glu Arg Lys Leu Pro Gln Asp Gln Val Val Val

725 730 735

Val Ile Asn Lys Gly Asp Ser Gln His Gln Phe Asp Leu Ile Asp Leu

740 745 750

Tyr Asn Gln Lys Thr Pro Asn Arg Val Lys Leu Thr Ser Leu Thr Asp

755 760 765

Gly Lys Lys Leu Lys Ser His Lys Gly Ser Leu Glu Leu Lys Ser Glu

770 775 780

Ala His Ser Val Ser Ile Tyr Glu Val Lys Gly Lys Leu Arg Leu Glu

785 790 795 800

Thr Pro Asp Glu Tyr Lys Lys Tyr Ser Lys Val Ala Ile Arg Gly Ser

805 810 815

Glu Pro Leu Asp Trp Glu Ser Asp Ala Asn Leu Leu Ser Tyr Asp Asp

820 825 830

Ser Asn His Val Trp Lys Ser Asp Pro Leu Glu Leu Lys Ala Asp Glu

835 840 845

Thr Ile Glu Phe Lys Tyr Val Arg Asp Gly Glu Trp Leu Glu Gly Asp

850 855 860

Asn Leu Thr Phe Thr Pro Glu Ile Asp Gly Asp Tyr Ile Phe Ile Phe

865 870 875 880

Asn Pro Gln Asp Gln Tyr Arg Ile Thr Val Leu Pro Tyr Ser Glu Ser

885 890 895

Ala Asn Leu Gly Lys Ala Ser

900

<210> 2

<211> 2709

<212> DNA

<213> 中度嗜盐芽孢杆菌(H.halophilus DSM 2266)

<400> 2

caaccgtttg cacaaaacgc ttttgctgat gacaaagtct atgatacggt cgtactccga 60

ggaagcgctg cttcacttga ttggagttct aatgatcacc cactggctta tgatgcagaa 120

gaaggcgtgt ggaaaagtga tcctgtcgca ctagaaggcg gaaatgaagt cgaatttaaa 180

tacgtatatg acggaagctg gatggaagga gcaaacttaa cttatacacc gcctcaagat 240

ggtgattata cgttcgtttt ttatcccgaa aatgaacgta cagtagacgt acgttcagca 300

aacacgtctt ctggaagtgt aacgttagag ttaactgtac ctgaggcgac tccagattgg 360

gtggtgccta cccttgcttc taatatgaat gacttcaatt ataaggtaag ccccctcagt 420

aaagttgacg aacgtactta ccaaattcaa gtgaatggag aatccgggga aacactatcc 480

tacttctaca gtttagacgg cgagccttat aaagaagtgc gcgaagaacc ccgttcagtt 540

gtgtttacag aagatactca cgttcaaaaa gataccgtta cggaatggga aacaatcccc 600

gtagcccagg atgttacgca cgatttcaac cacgagcctt atacacctga caaaaaagat 660

aacgtagtcg tagaagtaac ggtagatcat tatggaccga ttgatgaagg agctgtctac 720

tatacgacag acgggtccag ccctgttgga aaaagaggag aggttgaaaa cggaaaaaca 780

gctgaccttc aagtaaccga aaccacaaca cagaataacg gtttaaaaac ttctatactt 840

acagggacaa taccgaacca aaaaaatgaa acacgggtta agtataaaat tgatgtgtgg 900

cattctgaga gtaaaggctc acaattcgcc gataacaatg cactcacgtc agagaatgcc 960

acggaatttg cttattatgt agaggattat caatcgccgg actgggcgaa agaagcgatc 1020

atatatcaag tctttgtaga ccgcttccgt gatggcaccg atagcaacaa tacatccgtg 1080

gacccttccc ttccttacga cgaacaacta aaaggttgta tgggcggcga cattcaggga 1140

gtattagaaa agctggatta catcgatagt ctgggtgtaa ataccatctg gatttcccct 1200

atttacgaag gtccttactc tcatggttat catccagcag attttatgaa tatcgaccca 1260

cgcttcggca gcaacgaatt aatgaaagaa ctggtgaaaa aagcacataa acgtaatatt 1320

aaagttgttt atgatttagt tccgaatcat acatcaaatc aacatccatt ctttcaagat 1380

gcagtagaaa aaggagaaga cagcccttac tatgattggt attcattcac taactggcca 1440

aacgaatatg aaacattcta tgatgttcag gaattgcctg aacttaacaa tgacaatcca 1500

gaaaccagag aatatatgtt agatgaagtt gtcccattct ggatggaaga gattggggta 1560

gacgggttcc ggctggatta tgctaaaggc ccgagccaga gtttctgggt ggactttcgt 1620

cataaagtaa aggaattgga ttcgaacgct ttcattttcg gcgaagtatg ggataatctc 1680

gatacgatta catcctatac aggaaaactg gacggagcga tcgattttga aactcagtcc 1740

gccatccaga atgcttttat taatgatggc agcatgaacc agctggcttc ttccttaaca 1800

acgattcata atgcctatag tgaagaattt gtaccggcta ctttcttaga cagtcatgat 1860

gtaccgcgct tcttatatga agcagatggc aacacgcaga ctctgaaaaa tgcggcatct 1920

ctacagttca cactgcccgg ggctccggtc atttactatg gagatgaagt gggcctttcg 1980

cagagtgggg atcacaatgc cgttgatgaa tggaaggacc gctattaccg tgaaatgatg 2040

ccttggaaac catcagagca ggaccaggat gtgaaagctc attataaaaa gctcattgat 2100

attcgacagg aacatgaagc attgaccgat ggagacctgg aaatggttta ttacgatgat 2160

gatcttcttg tattcgaaag aaagcttcct caagatcagg tcgttgtcgt gatcaataaa 2220

ggagacagtc agcaccagtt tgatcttatt gatctgtaca accagaaaac accgaatcgt 2280

gttaagctga cctcattaac agatggtaaa aaactgaaga gtcacaaggg ttcgcttgaa 2340

ttgaagagtg aggctcattc tgtttccatc tatgaagtca aaggaaagct ccgcttggag 2400

acccctgacg agtataagaa gtattcaaaa gtggctatac ggggatctga accgcttgat 2460

tgggaatccg atgccaattt gttatcctat gatgacagta atcatgtctg gaaaagtgac 2520

cccctggaat taaaggcgga tgaaaccatc gaatttaaat atgtacgaga tggagaatgg 2580

ctggaagggg acaatctaac attcactccc gaaatagacg gagactatat attcatattc 2640

aatcctcaag atcaatatcg gataaccgtc ctcccttatt ctgaatcagc taatctcgga 2700

aaagcttca 2709

Claims

1.一种淀粉酶在高盐浓度条件下水解淀粉的应用，所述的高盐浓度为1.5-4.0M，所述的淀粉酶具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，或所述的淀粉酶是在SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列基础上缺失、替换、插入或/和添加一个至几个氨基酸的保守性突变而获得的保守性变异体。

2.根据权利要求1所述淀粉酶在高盐浓度条件下水解淀粉的应用，其特征在于，所述的高盐浓度为2.0-4.0M。

3.根据权利要求1所述淀粉酶在高盐浓度条件下水解淀粉的应用，其特征在于，所述的高盐浓度为2.5-3.0M。

4.根据权利要求1-3任一项所述淀粉酶在高盐浓度条件下水解淀粉的应用，其特征在于，所述的盐为NaCl。

5.根据权利要求1-3任一项所述淀粉酶在高盐浓度条件下水解淀粉的应用，其特征在于，所述的淀粉选自如下任一种或两种以上：支链淀粉、直链淀粉和可溶性淀粉。

6.一种在高盐环境下水解淀粉的方法，其特征在于，该方法采用的淀粉酶具有SEQ IDNO.1所示的氨基酸序列，包括以下步骤：以支链淀粉、直链淀粉或/和可溶性淀粉为底物，在pH6.5-8.0、温度为40-55℃、NaCl浓度2.0-4.0M的条件下进行酶解，切断底物中α-1,4糖苷键，产生糊精、低聚糖。

7.根据权利要求6所述在高盐环境下水解淀粉的方法，其特征在于，所述的NaCl浓度为2.5-3.5M。