CN110106180A - 一种lncRNA分子及其在胶质瘤治疗/预后评估中的应用 - Google Patents

一种lncRNA分子及其在胶质瘤治疗/预后评估中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种lncRNA分子及其在胶质瘤辅助诊断中的应用。该lncRNA分子名称为linc01023，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。linc01023在胶质瘤组织中的表达量明显高于正常脑组织，其可作为胶质瘤分子标志物或分子靶点，应用于胶质瘤患者预后判断或靶向治疗，并有利于进一步阐明胶质瘤的发生发展的分子机制及信号通路等，具有较高的应用前景和理论研究价值。

Description

一种lncRNA分子及其在胶质瘤治疗/预后评估中的应用
技术领域
本发明属于分子生物学和肿瘤学领域，具体涉及一种lncRNA分子及其在胶质瘤临床治疗、预后评估或科学研究中的应用。
背景技术
胶质瘤(glioma)是中枢神经系统最常见的原发性恶性肿瘤，约占所有颅内原发肿瘤45％。尽管随着科技的发展，针对胶质瘤的治疗出现了手术治疗、放疗、化疗、基因治疗、生物治疗、中医中药、免疫治疗等多种治疗手段，但患者的预后仍然较差。近年来，胶质瘤的发病率逐渐升高，但患者预后却没有明显改善。据统计，间变型胶质瘤经传统手术及术后辅助标准放化疗的中位生存期仅2-5年，而胶质母细胞瘤(glioblastoma，GBM)的中位生存期仅12-14个月。目前针对胶质瘤预后判断的分子主要包括IDH1、1p19q、TERT突变等。由于异质性的存在，上述分子标志物无法完全预测胶质瘤患者预后。因此，进一步寻找胶质瘤相关分子标志物，以进一步明确其发病机制，并开发出可应用于临床早期诊断、治疗和预后评估的试剂或产品，对改善胶质瘤患者的预后具有重要意义。
长链非编码RNA(Long Noncoding RNA,lncRNA)，是一类转录本长度超过200nt的不编码蛋白的RNA分子。在基因水平，转录水平，转录后水平，翻译水平，翻译后水平等多个层面，lncRNA通过介导信号转导、作为分子阻断剂、与蛋白结合、提供中心平台等方式来发挥分子功能，并与肿瘤的发生、发展密切相关。然而，linc01023对胶质瘤患者预后的影响尚无文献报道。
发明内容
为了解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供上述lncRNA分子在胶质瘤治疗或预后评估中应用。
本发明的另一个目的在于提供上述lncRNA分子在制备胶质瘤治疗药物中的应用。
本发明所采取的技术方案是：
一种在胶质瘤组织中高表达的lncRNA分子，名称为linc01023，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
lncRNA分子linc01023在胶质瘤治疗/预后评估中的应用。
lncRNA分子linc01023在制备胶质瘤治疗/预后评估试剂或试剂盒中的应用。
用于检测lncRNA分子linc01023的试剂在制备胶质瘤治疗/预后评估试剂或试剂盒中的应用。
所述用于检测lncRNA分子linc01023的试剂包括用于扩增所述lncRNA分子的特异性引物对。
所述用于扩增lncRNA分子linc01023的特异性引物对，序列如下所示：
F：5’-GAAAACCAGGAGAGCATGGAGCT-3’(SEQ ID NO.4)；
R：5’-TTTTTTCGCGTTCATTATCTCAT-3’(SEQ ID NO.5)。
lncRNA分子linc01023作为胶质瘤治疗靶点的应用。
lncRNA分子linc01023在制备治疗胶质瘤药物中的应用。
一种用于胶质瘤预后评估的试剂盒，其中包括：
(1)用于扩增lncRNA分子linc01023的特异性引物对；
(2)标准DNA模板；
(3)PCR反应液。
一种检测lncRNA的方法，包括如下步骤：
(1)提取样品总RNA；
(2)制备样品cDNA
(3)定量扩增lncRNA；
所述lncRNA为ENST00000606054述。
本发明的有益效果是：
本发明成功筛选出胶质瘤组织中高表达的lncRNA分子，其可作为胶质瘤分子标志物或靶点，应用于胶质瘤临床预后判断或靶向治疗，并有利于进一步阐明胶质瘤发病的分子机制，极具应用前景和理论价值。
附图说明
图1为检索TCGA数据库(GSE GSE4290)发现linc01023在胶质瘤组织中表达上调，且高级别胶质瘤中表达高于低级别胶质瘤组织图。
图2为qRT-PCR检测linc01023在胶质瘤组织中表达升高散点图。
图3为GSPIA数据库分析linc01023低表达组胶质瘤患者平均生存时间长于高表达组图。
图4为linc01023低表达组胶质瘤患者和高表达组胶质瘤患者的生存曲线图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。以下实施例中所采用的分子生物学实验技术包括PCR扩增、质粒提取、质粒转化、DNA片段连接、酶切、凝胶电泳等，如无特殊说明，通常按照常规方法操作，具体可参见《分子克隆实验指南》(第三版)(Sambrook J,Russell DW，Janssen K,Argentine J.黄培堂等译，2002，北京：科学出版社)，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1胶质瘤相关lncRNA分子的筛选。
利用TCGA数据库，分析胶质瘤中差异表达的lncRNA分子。
TCGA(肿瘤基因图谱)是由美国NCI(National Cancer Institute)联合启动的项目，主要是利用大规模测序技术，完成与癌症基因组改变相关的图谱。目前已对来源11000患者的33种肿瘤进行实验。
利用cbioportal在线工具对TCGA数据库种数据进行分析，发现linc01023在胶质瘤组织种表达上调(图1所示)，且与不良预后相关(图3所示)。
实施例2大样本验证筛选出的差异表达基因。
1、样本收集。
收集于2008年10月-2017年10月就诊于中国医科大学附属盛京医院行手术治疗，且术后病理证实为胶质瘤的病例169例。排除行辅助放化疗病例及复发胶质瘤病例及肿瘤活检病例。另外收集30例因外伤行手术治疗的病例作为对照。排除合并其他肿瘤病人，其中男91例，女78例。样本临床资料详见表1-1，试验中标本采集均已取得病人知情同意，并从中国医科大学附属盛京医院伦理委员会得到认可授权。
表1-1收集169例胶质瘤病例的相关临床参数
2、样本采集。
1)首先准备好用于保存组织的冻存管，且用黑色油性记号笔在冻存管上标明样本编号、收集日期等信息；
2)术中切取胶质瘤组织(具有5年以上操作手术经验的神经外科医师操作)；
3)将切除的胶质瘤组织标本均分成2份，其中1份送病理，另1份放入备好的冻存管中并拧紧，迅速投入液氮罐中冻存；
4)填写标本登记单,写明样本编号、分组、来源患者名称、病案号、样本收集日期及样本处理过程等情况；
5)待病理性质确诊后取出标本开展下一步研究。
3、总RNA样品制备、纯化及质检
(1)TRIZOL法提取RNA样品；
(2)采用RNeasy柱对总RNA样品进行纯化；
(3)RNA定量和质量控制(采用Nanodrop ND 1000紫外可见分光光度计确定样品总RNA浓度和质量)。
Nanodrop分光光度计对胶质瘤及癌旁组织总RNA测定结果如表1-2所示。
表1-2 Nanodrop分光光度计对胶质瘤及正常脑组织总RNA测定
*对于分光光度计中，O.D.A260/A280比值应接近2.0为纯的RNA(1.8和2.1之间的比值是可接受的)。在O.D.A260/A230比值应大于1.8。
(1)引物设计。
依据实时定量荧光PCR引物设计原则,使用Primer5.0软件设计实时定量荧光PCR引物。本研究使用的引物全部由上海生工生物技术有限公司合成，其中GAPDH为内参校准基因。
引物详细序列见表1-3：
表1-3实时定量荧光PCR引物
(2)染料一步法qRT-PCR检测linc01023的表达。
PCR(反应体系如表1-4)。
表1-4 PCR反应体系
反应条件：42℃5min，95℃10S，之后[95℃3S，60℃30S]40个循环。
测定CT值，以GAPDH为内参。
(3)qRT-PCR结果与计算。
各样品的目的基因和管家基因分别进行qRT-PCR反应。根据绘制的梯度稀释DNA标准曲线，各样品目的基因和管家基因的浓度结果直接由机器生成。每个样品的目的基因浓度除以其管家基因的浓度，即为此样品此基因的校正后的相对含量。统计软件SPSS 20.0进行数据分析。用，以2-△△Ct表示各样本的表示linc01023的相对表达量。数据符合正态分布时釆用两组独立样本的t检验，不符合正态分布时用两组独立样本的秩和检验，P<0.05时具有统计学意义。
qRT-PCR结果的散点图如图2所示，可以看到：以GAPDH作为参照，胶质瘤组织中的linc01023与正常组织比较，表达上调(P<0.001)。
2病例随访
检索GEPIA数据库，比较linc01023高表达及低表达组胶质瘤的生存曲线，发现linc01023高表达组患者预后更差(如图3所示)。
对入组病例进行随访，每月电话随访患者生存情况，直至患者死亡或随访超过5年。若患者死于胶质瘤及相关并发症，择标记为1，否则标记为0。根据PCR中linc01023的相对表达量进行排序，得到linc01023的中位表达量。将表达量大于中位表达量的定义为高表达，否则定义为低表达。使用K-M法计算高表达及低表达组患者的生存曲线。
如图4所示，linc01023低表达组胶质瘤患者的平均生存时间明显长于linc01023高表达组。
以上实验表明，linc01023在胶质瘤组织中的表达明显上调，且linc01023高表达组患者生存期更短，极有可能成为分子标志物或靶点，在胶质瘤临床早期诊断、预后判断或靶向治疗等方向上具有广阔的应用前景。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国医科大学附属盛京医院
<120> 一种lncRNA分子及其在胶质瘤治疗/预后评估中的应用
<130>
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 457
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 1
gaaaaccagg agagcatgga gctttttcgc tggtccggcg cggtctcttg cgttcctgtg 60
gcgggcacct gactccccat gcccgagtac tgtcctcagg cggaacggcg tctgcagcga 120
ggagcggggt tccagcaggc tcggctgacg cggtccctgg catttcccgt gctggccctg 180
ggtcgccctc gatgctgctt cccgctggga gcctccttct gacggcggaa aggagcttca 240
cctggggcgg ccggcgggga acggagaaga atccaccggg gaagtggacg gggctggctc 300
ccgggcctgg cgctgcggct ctcgggccgt cagacctccc gcgggttgcg tcactttcct 360
cggttttcta gacagcagtt gtggggttga atccttgccg tggttttgta agaattaaat 420
gagataatga acgcgaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaa 457
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tgcaccaccaactgcttagc 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ggcatgcactgtggtcatgag 20
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gaaaaccaggagagcatggagct 23
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
ttttttcgcgttcattatctcat 23

Claims (9)

1.一种在胶质瘤组织中高表达的lncRNA分子，名称为linc01023，其核苷酸序列如SEQID NO .1所示。
2.如权利要求1所述lncRNA分子linc01023在胶质瘤治疗/预后评估中的应用。
3.如权利要求1所述lncRNA分子linc01023在制备胶质瘤治疗/预后评估试剂或试剂盒中的应用。
4.用于检测lncRNA分子linc01023的试剂在制备胶质瘤治疗/预后评估试剂或试剂盒中的应用。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述用于检测lncRNA分子linc01023的试剂包括用于扩增所述lncRNA分子的特异性引物对。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述用于扩增lncRNA分子linc01023的特异性引物对，序列如下所示：
F：5’- GAAAACCAGGAGAGCATGGAGCT -3’ (SEQ ID NO.4)；
R：5’- TTTTTTCGCGTTCATTATCTCAT -3’ (SEQ ID NO.5)。
7.如权利要求1所述lncRNA分子linc01023作为胶质瘤治疗靶点的应用。
8.如权利要求1所述lncRNA分子linc01023在制备治疗胶质瘤药物中的应用。
9.一种用于胶质瘤预后评估的试剂盒，其中包括：
(1)用于扩增lncRNA分子linc01023的特异性引物对；
(2)标准DNA模板；
(3)PCR反应液。
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