CN110100638B - 一种提高银杏叶黄酮类化合物含量的方法 - Google Patents

一种提高银杏叶黄酮类化合物含量的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种提高银杏叶黄酮类化合物含量的方法，属于银杏种植技术领域。在银杏苗栽培过程中，定时定量施氮肥，提高银杏叶黄酮类化合物含量；其中，氮肥中氮素形态为铵态氮和硝态氮，铵态氮与硝态氮质量比为1∶3‑3∶1。本发明在施肥后35d时即8月份时叶片中黄酮类化合物含量最高，所以在银杏叶用园栽培措施的长期生产实践中，以氮肥1g/棵并且以硝态氮∶铵态氮为1∶1配比进行施肥处理。氮素的缺失以及过量的施用氮肥后会导致银杏叶黄酮类化合物含量降低。本发明方法和结果为叶用银杏种植栽培施肥管理措施提供了理论依据。

Description

一种提高银杏叶黄酮类化合物含量的方法
技术领域
本发明属于银杏种植技术领域，具体涉及一种提高银杏叶黄酮类化合物含量的方法。
背景技术
银杏叶片中含有多种黄酮类化合物，在医学上对于心血管疾病有显著的治疗效果。银杏中含有的黄酮类化合物具有抗氧化作用，可以保护人体内细胞不受自由基通过脂类和蛋白质的氧化聚合物的影响，从而可以减缓人体衰老，增强身体代谢，延长人的寿命。影响银杏叶黄酮含量的因素有许多，包含内部因素和外部因素。内部因素一般为遗传因素，即品种或品系或优良单株、植株性别；外部因素一般是环境因素，包括气候因素中的温度、光照等和土壤因素中的水分、养分状况等。
在银杏生产中，通过施肥来实现银杏养分的平衡供应对提高叶黄酮含量起到决定性的作用。唐新莲对广西兴安县崔家乡上塘村的8年生银杏进行施肥试验，结果表明，氮、镁对银杏叶黄酮含量有显著的影响。唐新莲认为，在镁缺乏的红土上种植银杏，在合理施用一定氮肥的基础上，增施适量的镁肥，对银杏叶黄酮含量的提高有良好的效果。但大量的研究表明，施肥并不是越多越好，不同的施肥时间，不同的施肥方式和不一样的肥料种类都可能会影响银杏的生理和生长特性。并且关于如何配比不同氮素形态、合理的施肥来提高银杏叶有效成分的产量和品质，充分的发挥银杏叶用林的生产力，是种植过程中需要解决的问题。
发明内容
发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的在于提供一种提高银杏叶黄酮类化合物含量的方法，通过合理培养方式来提高叶片中的黄酮类化合物的含量，满足使用需求。
技术方案：为了解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：
一种提高银杏叶黄酮类化合物含量的方法，在银杏苗栽培过程中，定时定量施氮肥，实现提高银杏叶黄酮类化合物含量；其中，银杏苗栽培在沙壤土中，土壤中铵态氮10～20mg/kg，硝态氮10～20mg/kg，有效磷为25～45mg/kg，pH 5～6。氮肥中氮素形态为铵态氮和硝态氮，铵态氮与硝态氮质量比为1∶3-3∶1；黄酮类化合物为异鼠李素、山奈酚、槲皮素以及类黄酮。
所述的提高银杏叶黄酮类化合物含量的方法，于4月对银杏苗进行栽培，同年7月进行施氮肥处理，施肥量为每棵银杏苗0.5-1.5g，施肥方式为环沟状施肥。
所述的提高银杏叶黄酮类化合物含量的方法，施肥量为每棵银杏苗0.5-1.5g。
所述的提高银杏叶黄酮类化合物含量的方法，对银杏苗进行施氮肥管理，以氮肥1g/棵进行施肥，氮肥中硝态氮与铵态氮的质量比为1∶1。
所述的提高银杏叶黄酮类化合物含量的方法，于4月对银杏苗进行栽培培养，同年7月进行施氮肥处理，施肥量为每棵银杏苗0.5-1.5g，氮肥中氮素形态铵态氮与硝态氮的质量比为1∶1，施肥方式为环沟状施肥，银杏苗栽培中的土壤为沙壤土。
所述的提高银杏叶黄酮类化合物含量的方法，氮肥中铵态氮是氯化铵，硝态氮是硝酸钠。
有益效果：与现有的技术相比，本发明的提高银杏叶黄酮类化合物含量的方法，试验证实，在以氮肥1g/棵，并且以硝态氮：铵态氮为1∶1配比进行施肥处理时，施肥后35d时，叶片中黄酮类化合物含量最高，该方法为叶用银杏种植栽培施肥方法提供了可靠的依据，具有很好的实用性。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
铵态氮是氯化铵，硝态氮是硝酸钠，都是分析纯试剂。
银杏叶片黄酮类化合物各组分含量的测定：采集各处理下幼苗当年生新梢中上部3-8片完全展开叶片，置60℃干燥箱烘至恒重，研磨过40目筛，并用万分之一电子天平准确称取1g，备用。采用《中华人民共和国药典》中有关银杏叶黄酮的提取和测定的方法高效液相色谱(HPLC)进行相关指标的测定。
(1)对照品溶液的制备：分别准确称取经五氧化二磷干燥过夜的槲皮素对照品、山奈酚对照品、异鼠李素对照品，加甲醇制成每1mL分别含30μg、30μg、20μg对照品的混合溶液，即得。
(2)高效液相色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-0.4％磷酸溶液(50∶50)为流动相，检测波长为360nm。理论板数按槲皮素峰计算应不低于2500。
(3)供试品溶液的制备：准确称量叶片粉末1g，置索氏提取器中，加三氯甲烷回流提取2h，弃去溶剂，药渣挥干，加甲醇回流提取4h，提取液蒸干，残渣加甲醇-25％盐酸溶液(4∶1)混合液25mL，加热回流30min，冷却，转移至50mL容量瓶中，并加甲醇至刻度，摇匀，即得。
(4)测定法：分别准确吸取对照品溶液和供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，分别计算槲皮素、山奈酚和异鼠李素的含量，按下式换算成黄酮类化合物的含量。类黄酮含量＝黄酮类化合物的含量＝(槲皮素含量+山奈酚含量+异鼠李素含量)×2.51。
实施例1
银杏苗栽培在南京林业大学白马基地的温室内，选用来自于江苏省邳州市的1年生、规格一致的银杏实生苗，苗木生长基本一致，无病虫害。盆栽容器为上口径35cm，下口径25cm，高35cm的聚乙烯塑料盆，每盆2棵，盆栽中的土壤为沙壤土，每盆沙壤土12kg。土壤理化性质为：铵态氮16.2mg/kg，硝态氮15.5mg/kg，有效磷34.0mg/kg，pH值为5.25，对银杏苗进行一致的管理。
栽培过程中，于每周二和周五下午16:00对银杏苗进行定量浇水，以浇透水为准。于2017年4月对银杏进行盆栽培养，同年7月进行施氮肥处理，氮肥中的氮素形态全为铵态氮，施肥量为1g/棵。施肥方式为环沟状施肥，在盆边距离茎干距离的1/2-2/3之间进行施肥。并于施肥处理后第15天起对银杏苗进行取样测定，取样时间分别为施肥后15、25、35、45和55d，共采样5次。采样时选择采摘新梢叶片，采样的时间选择为傍晚17:00，采样后迅速装入冰盒，用蒸馏水和酒精擦拭干净，带回放入-70℃超低温冰箱中保存待用。对采样后的银杏叶中的异鼠李素、山奈酚和槲皮素以及类黄酮含量进行分析。结果如表1所示。
由表1可知，在相同施肥量条件下，银杏叶中的山奈酚和槲皮素以及类黄酮含量的变化趋势均在15-35d时呈上升趋势，在35-55d时呈下降趋势，在施肥后35d时类黄酮含量达最高，类黄酮含量最高为5.56mg·g-1。
表1.银杏苗叶黄酮类化合物主要成分含量结果
Figure BDA0002070374070000031
Figure BDA0002070374070000041
实施例2
银杏苗栽培在南京林业大学白马基地的温室内，选用来自于江苏省邳州市的1年生、规格一致的银杏实生苗，苗木生长基本一致，无病虫害。盆栽容器为上口径35cm，下口径25cm，高35cm的聚乙烯塑料盆，每盆2棵，每盆含土壤12kg。土壤理化性质为：铵态氮18.2mg/kg，硝态氮18.8mg/kg，有效磷40.6mg/kg，pH为5.50，对银杏苗进行一致的管理。
栽培过程中，于每周二和周五下午16:00对银杏苗进行定量浇水，以浇透水为准。于4月对银杏进行盆栽培养，同年7月进行施氮肥处理，其中铵态氮为0.25g/棵，硝态氮为0.75g/棵。施肥方式为环沟状施肥，在盆边与茎干之间距离的1/2-2/3之间进行施肥。并于施肥处理后第15天起对银杏树苗进行取样测定，取样时间分别为施肥后15、25、35、45和55d，共采样5次。采样时选择采摘新梢叶片，采样的时间选择为傍晚17:00，采样后迅速装入冰盒，用蒸馏水和酒精擦拭干净，带回放入-70℃超低温冰箱中保存待用。对采样后的银杏叶中的异鼠李素、山奈酚和槲皮素以及类黄酮含量进行分析。结果如表2所示。
由表2可知，在相同施肥量条件下，银杏叶中的异鼠李素、山奈酚和槲皮素以及类黄酮含量的变化趋势均在15-35d时呈上升趋势，在35-55d时呈下降趋势，在施肥后35d时类黄酮含量达最高为6.13mg·g-1。
表2.银杏苗叶黄酮类化合物主要成分含量结果
取样时间/d 15 25 35 45 55
异鼠李素/mg·g<sup>-1</sup> 0.097 0.081 0.082 0.092 0.081
山奈酚/mg·g<sup>-1</sup> 0.72 0.85 1.18 0.79 0.60
槲皮素/mg·g<sup>-1</sup> 0.96 1.11 1.42 1.33 0.66
类黄酮/mg·g<sup>-1</sup> 4.35 5.05 6.83 4.48 3.35
实施例3
银杏苗栽培在南京林业大学白马基地的温室内，选用来自于江苏省邳州市的1年生、规格一致的银杏实生苗，苗木生长基本一致，无病虫害。银杏苗直接栽培到沙壤土中，土壤理化性质为：铵态氮18.5mg/kg，硝态氮19.3mg/kg，有效磷40.9mg/kg，pH为5.54，对银杏苗进行一致的管理。
栽培过程中，于每周二和周五下午16:00对银杏苗进行定量浇水，以浇透水为准。于4月对银杏进行栽培培养，同年7月进行施氮肥处理，其中铵态氮为0.75g/棵，硝态氮为0.75g/棵。施肥方式为环沟状施肥，在盆边与茎干之间距离的1/2-2/3之间进行施肥。并于施肥处理后第15天起对银杏树苗进行取样测定，取样时间分别为施肥后15、25、35、45和55d，共采样5次。采样时选择采摘新梢叶片，采样的时间选择为傍晚17:00，采样后迅速装入冰盒，用蒸馏水和酒精擦拭干净，带回放入-70℃超低温冰箱中保存待用。对采样后的银杏叶中的异鼠李素、山奈酚和槲皮素以及类黄酮含量进行分析。结果如表3所示。
由表3可知，在相同施肥量条件下，银杏叶中的异鼠李素、山奈酚和槲皮素以及类黄酮含量的总体变化趋势均在15-35d时呈上升趋势，在35-55d时呈下降趋势，在施肥后35d时类黄酮含量达最高6.00mg·g-1。
表3.银杏苗叶黄酮类化合物主要成分含量结果
取样时间/d 15 25 35 45 55
异鼠李素/mg·g<sup>-1</sup> 0.103 0.104 0.106 0.103 0.110
山奈酚/mg·g<sup>-1</sup> 0.78 0.87 1.06 0.78 0.49
槲皮素/mg·g<sup>-1</sup> 0.92 1.18 1.21 1.02 0.99
类黄酮/mg·g<sup>-1</sup> 4.50 5.25 6.00 4.80 3.75
实施例4
银杏苗栽培在南京林业大学白马基地的温室内，选用来自于江苏省邳州市的1年生、规格一致的银杏实生苗，苗木生长基本一致，无病虫害。银杏苗直接栽培到沙壤土土壤中，土壤理化性质为：铵态氮16.2mg/kg，硝态氮15.5mg/kg，有效磷34.0mg/kg，pH为5.25，对银杏苗进行一致的管理。
栽培过程中，于每周二和周五下午16:00对银杏苗进行定量浇水，以浇透水为准。于4月对银杏进行盆栽培养，同年7月进行施氮肥处理，其中铵态氮为0.75g/棵，硝态氮为0.25g/棵。施肥方式为环沟状施肥，在盆边与茎干之间距离的1/2-2/3之间进行施肥。并于施肥处理后第15天起对银杏苗进行取样测定，取样时间分别为施肥后15、25、35、45和55d，共采样5次。采样时选择采摘新梢叶片，采样的时间选择为傍晚17:00，采样后迅速装入冰盒，用蒸馏水和酒精擦拭干净，带回放入-70℃超低温冰箱中保存待用。对采样后的银杏叶中的异鼠李素、山奈酚、槲皮素以及类黄酮含量进行分析。结果如表4所示。
由表4可知，在相同施肥量条件下，银杏叶黄酮类苷元异鼠李素、山奈酚和槲皮素以及类黄酮含量的变化趋势在15-35d时呈上升趋势，在35-55d时呈下降趋势，在施肥后35d时类黄酮含量达最高6.00mg·g-1。
表4.银杏苗叶黄酮类化合物主要成分含量结果
取样时间/d 15 25 35 45 55
异鼠李素/mg·g<sup>-1</sup> 0.106 0.117 0.118 0.120 0.117
山奈酚/mg·g<sup>-1</sup> 0.61 0.91 1.03 0.76 0.63
槲皮素/mg·g<sup>-1</sup> 0.78 0.99 1.23 1.00 0.85
类黄酮/mg·g<sup>-1</sup> 3.75 5.01 6.00 4.65 4.01
实施例5
银杏苗栽培在南京林业大学白马基地的温室内，选用来自于江苏省邳州市的1年生、规格一致的银杏实生苗，苗木生长基本一致，无病虫害。盆栽容器为上口径35cm，下口径25cm，高35cm的聚乙烯塑料盆，每盆2棵，盆栽中的土壤为沙壤土，每盆沙壤土12kg。土壤理化性质为：铵态氮17.2mg/kg，硝态氮18.5mg/kg，有效磷39.0mg/kg，pH为5.50，对银杏苗进行一致的管理。
栽培过程中，于每周二和周五下午16:00对银杏苗进行定量浇水，以浇透水为准。于4月对银杏进行盆栽培养，同年7月进行施氮肥处理，氮肥中的氮素形态全为硝态氮，施肥量为1g/棵。施肥方式为环沟状施肥，在盆边与茎干之间距离的1/2-2/3之间进行施肥。并于施肥处理后第15天起对银杏树苗进行取样测定，取样时间分别为施肥后15、25、35、45和55d，共采样5次。采样时选择采摘新梢叶片，采样的时间选择为傍晚17:00，采样后迅速装入冰盒，用蒸馏水和酒精擦拭干净，带回放入-70℃超低温冰箱中保存待用。对采样后的银杏叶片中的异鼠李素、山奈酚和槲皮素以及类黄酮含量进行分析。结果如表5所示。
由表5可知，山奈酚、槲皮素和类黄酮含量呈现先上升后下降的变化趋势，但是在不同的时间出现最大值，山奈酚在25d时达到最大值0.90mg.g-1，槲皮素和类黄酮的含量在35d时达到最大值分别为1.12mg·g-1和5.21mg·g-1，说明是氮肥施肥量和氮素形态的不同，以及银杏苗培养环境的变化对银杏叶中各种物质的含量具有不同的影响。
表5.银杏苗叶黄酮类化合物主要成分含量结果
取样时间/d 15 25 35 45 55
异鼠李素/mg·g<sup>-1</sup> 0.143 0.103 0.105 0.118 0.08
山奈酚/mg·g<sup>-1</sup> 0.63 0.90 0.88 0.69 0.64
槲皮素/mg·g<sup>-1</sup> 0.80 0.91 1.12 0.81 0.74
类黄酮/mg·g<sup>-1</sup> 4.00 4.78 5.26 4.04 3.65
实施例6
银杏苗栽培在南京林业大学白马基地的温室内，选用来自于江苏省邳州市的1年生、规格一致的银杏实生苗，苗木生长基本一致，无病虫害。盆栽容器为上口径35cm，下口径25cm，高35cm的聚乙烯塑料盆，每盆2棵，盆栽中的土壤为沙壤土，每盆沙壤土12kg。土壤理化性质为：铵态氮18.9mg/kg，硝态氮16.6mg/kg，有效磷29.0mg/kg，pH为5.55，对银杏苗进行一致的管理。
栽培过程中，于每周二和周五下午16:00对银杏苗进行定量浇水，以浇透水为准。于4月对银杏进行盆栽培养，同年7月进行施氮肥处理，氮肥中的氮素形态全为铵态氮0.25g/棵，硝态氮0.25g/棵。施肥方式为环沟状施肥，在盆边与茎干之间距离的1/2-2/3之间进行施肥。并于施肥处理后第15天起对银杏树苗进行取样测定，取样时间分别为施肥后15、25、35、45和55d，共采样5次。采样时选择采摘新梢叶片，采样的时间选择为傍晚17:00，采样后迅速装入冰盒，用蒸馏水和酒精擦拭干净，带回放入-70℃超低温冰箱中保存待用。对采样后的银杏叶片中的异鼠李素、山奈酚、槲皮素以及类黄酮含量进行分析。结果如表6所示。
由表6可知，山奈酚、槲皮素和类黄酮含量呈现先上升后下降的变化趋势，并且均在35d时出现最大值，山奈酚在35d时达到最大值0.91mg·g-1，槲皮素和类黄酮的含量在35d时达到最大值分别为1.12mg·g-1和5.20mg·g-1，说明是氮肥施肥量和氮素形态的不同，以及银杏苗培养环境的变化对银杏叶中各种物质的含量具有不同的影响。
表6.银杏苗叶黄酮类化合物主要成分含量结果
取样时间/d 15 25 35 45 55
异鼠李素/mg·g<sup>-1</sup> 0.090 0.095 0.084 0.076 0.098
山奈酚/mg·g<sup>-1</sup> 0.61 0.62 0.91 0.62 0.58
槲皮素/mg·g<sup>-1</sup> 0.78 0.98 1.12 0.90 0.52
类黄酮/mg·g<sup>-1</sup> 3.85 4.09 5.20 4.01 2.98
实施例7
银杏苗栽培在南京林业大学白马基地的温室内，选用来自于江苏省邳州市的1年生、规格一致的银杏实生苗，苗木生长基本一致，无病虫害。采用盆栽栽培的培养方式，盆栽容器为上口径35cm，下口径25cm，高35cm的聚乙烯塑料盆，每盆2棵，盆栽中的土壤为沙壤土，每盆沙壤土12kg。土壤理化性质为：铵态氮16.9mg/kg，硝态氮17.5mg/kg，有效磷38.0mg/kg，pH为5.29，对银杏苗进行一致的管理。
栽培过程中，于每周二和周五下午16:00对银杏苗进行定量浇水，以浇透水为准。于4月对银杏进行盆栽培养，同年7月进行施氮肥处理，其中铵态氮为0.5g/棵，硝态氮为0.5g/棵，施肥量共为1g/棵。施肥方式为环沟状施肥，在盆边与茎干之间距离的1/2-2/3之间进行施肥。并于施肥处理后第15天起对银杏树苗进行取样测定，取样时间分别为施肥后15、25、35、45和55d，共采样5次。采样时选择采摘新梢叶片，采样的时间选择为傍晚17:00，采样后迅速装入冰盒，用蒸馏水和酒精擦拭干净，带回放入-70℃超低温冰箱中保存待用。对采样后的银杏叶异鼠李素、山奈酚、槲皮素以及类黄酮含量进行分析。结果如表7所示。
由表7可知，在相同施肥量条件下，类黄酮含量的总体变化趋势均在15-35d时呈上升趋势，在35-55d时呈下降趋势，在施肥后35d时类黄酮含量达最高6.25mg·g-1。与上述实施例1-6中的测试结果相比，类黄酮的含量达到最大值，并且从银杏苗近两个月的生长期来看，类黄酮的含量变化不是很大，在施肥后15d后类黄酮的含量即达到了5.20mg·g-1，因此以氮肥1g/棵并且以硝态氮：铵态氮为1∶1配比进行施肥处理，类黄酮含量最高。
表7.银杏苗叶黄酮类化合物主要成分含量结果
Figure BDA0002070374070000081
Figure BDA0002070374070000091

Claims (5)

1.一种提高银杏叶黄酮类化合物含量的方法，其特征在于，在银杏苗栽培过程中，定时定量施氮肥，提高银杏叶黄酮类化合物含量；其中，银杏苗栽培在沙壤土中，土壤中铵态氮10~20mg/kg，硝态氮10~20mg/kg，有效磷为25~45mg/kg，pH 5~6，氮肥中氮素形态为铵态氮和硝态氮，铵态氮与硝态氮质量比为1:3-3:1；黄酮类化合物主要为异鼠李素、山奈酚、槲皮素以及类黄酮；所述氮肥中铵态氮是氯化铵，硝态氮是硝酸钠。
2.根据权利要求1所述的提高银杏叶黄酮类化合物含量的方法，其特征在于，于4月对银杏苗进行栽培，同年7月进行施氮肥处理，施肥量为每棵银杏苗0.5-1.5g，施肥方式为环沟状施肥。
3.根据权利要求1所述的提高银杏叶黄酮类化合物含量的方法，其特征在于，施肥量为每棵银杏苗0.5-1.5 g。
4.根据权利要求1或2所述的提高银杏叶黄酮类化合物含量的方法，其特征在于，对银杏苗进行施氮肥管理，以氮肥1g/棵进行施肥，氮肥中硝态氮与铵态氮的质量比为1:1。
5.根据权利要求1所述的提高银杏叶黄酮类化合物含量的方法，其特征在于，于4月对银杏苗进行栽培培养，同年7月进行施氮肥处理，施肥量为每棵银杏苗0.5-1.5 g，氮肥中氮素形态铵态氮与硝态氮的质量比为1:1，施肥方式为环沟状施肥，银杏苗栽培中的土壤为沙壤土。
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Assignor: NANJING FORESTRY University

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Denomination of invention: A method for increasing the content of flavonoids in Ginkgo biloba leaves

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