CN110095557A - 鉴别厚藤的薄层色谱方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种鉴别厚藤的薄层色谱方法，采用硅胶G薄层板，以咖啡酸为对照品，以乙酸乙酯为提取溶媒，以环己烷‑丙酮‑乙酸乙酯‑甲酸为展开系统，以铁氰化钾‑三氯化铁为显色剂。该法系主要参照2015版《中华人民共和国药典》规定的方法进行实验研究，通过对各种影响因素的考察验证而确定。本发明为完善厚藤质量标准提供了科学依据，对该海洋中药的临床应用、质量控制和产品开发等提供了重要参考。

Description

鉴别厚藤的薄层色谱方法

技术领域

本发明属于厚藤药材鉴别技术领域，尤其涉及一种鉴别厚藤的薄层色谱方法。

背景技术

厚藤(Ipomoea pes-caprae(Linn.)Sweet)，又名二叶红薯、马鞍藤，为旋花科番薯属草本植物，主要分布于热带及亚热带沿海地区，植物资源丰富。厚藤不仅是具有绿化、防风固沙、抵御自然灾害、恢复生态等功能的海滩景观植物，也是中国南方沿海的民间常用海洋中药、京族习用植物药。《中华海洋本草》、《中华本草》、《广西药用植物名录》等多部著作中均有该植物药用的记载，中医认为其味辛、苦，性微寒，归肺、肝、胃、大肠经，具祛风除湿、消痈散结、拔毒消肿的功效，民间应用于治疗腰肌劳损、风湿关节痛、腰腿痛及疮疖、痔疮、海蜇引起的皮炎。厚藤在其他多个国家民间医学领域均有悠久的应用历史，如：澳大利亚土著人用于治疗伤口、虫毒引起的皮肤炎症、淋巴结结核、高血压、偏头痛，墨西哥民间用于治疗肾炎，泰国民间用于治疗水母毒素引起的炎症，巴西民间用于治疗疝气、排尿障碍、淋病，巴基斯坦也将其作为代茶饮。现代研究表明，厚藤具有抗肿瘤、抗菌、抗炎镇痛、抗胶原酶、抗氧化、免疫调节等多种药理活性。尽管厚藤具有悠久的传统应用历史和明确的药理活性，且资源丰富易得，但至今未有质量标准。

薄层色谱法(TLC)是将适宜的固定相涂布于支持板(玻璃板、塑料或铝基片等)上，形成一均匀薄层，再以适当的溶剂作为流动相，由于不同化学成分极性不同，经点样、展开后产生不同的比移值，从而对混合样品进行分离，用以进行鉴定、杂质检查、或含量测定的一种色谱分离技术。该法从上世纪50年代发展至今，由于其设备简单、操作方便、直观性强和分离快速等特点，目前仍被《中华人民共和国药典》以及欧、美、日等国药典广泛应用于药品的定性分析。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种专属性强的鉴别厚藤的薄层色谱方法。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

鉴别厚藤的薄层色谱方法，采用硅胶G薄层板，以咖啡酸为对照品，以乙酸乙酯为提取溶媒，以环己烷-丙酮-乙酸乙酯-甲酸为展开系统，以铁氰化钾-三氯化铁为显色剂。

提取溶媒为体积百分数80％的乙酸乙酯水溶液。

展开系统为体积比6:2:1:0.15的环己烷-丙酮-乙酸乙酯-甲酸的混合溶液。

显色剂为铁氰化钾-三氯化铁溶液，其中铁氰化钾的质量浓度为1％，三氯化铁的质量浓度为2％。

该法在温度25℃、湿度50％条件下进行。

该法的供试品溶液按以下操作制备：精密称取厚藤药材粉末约1ɡ，置具塞锥形瓶中，加入提取溶媒80％乙酸乙酯10mL，超声30min，过滤，转移至蒸发皿，经60℃水浴浓缩至干，加入1mL提取溶媒使溶解，即得。

针对目前海洋中药厚藤质量标准欠缺的问题，发明人建立了一种鉴别厚藤的薄层色谱方法，采用硅胶G薄层板，以咖啡酸为对照品，以乙酸乙酯为提取溶媒，以环己烷-丙酮-乙酸乙酯-甲酸为展开系统，以铁氰化钾-三氯化铁为显色剂。该法系主要参照2015版《中华人民共和国药典》规定的方法进行实验研究，通过对各种影响因素的考察验证而确定。本发明为完善厚藤质量标准提供了科学依据，对该海洋中药的临床应用、质量控制和产品开发等提供了重要参考。

附图说明

图1是鉴别厚藤的薄层色谱方法中提取溶媒选择的实验结果图，图中：a为咖啡酸的显色斑点，1.50％乙酸乙酯提取物，2.甲醇提取物，3.无水乙醇提取物，4.100％乙酸乙酯提取物，5.80％乙酸乙酯提取物，6.咖啡酸对照品溶液。

图2是鉴别厚藤的薄层色谱方法中显色剂选择的实验结果图，图中：2-1 1％铁氰化钾-2％三氯化铁显色结果，2-2 1％香草醛溶液显色结果，2-3 10％硫酸乙醇溶液显色结果；a为咖啡酸的显色斑点，1.80％乙酸乙酯提取物，2.80％乙酸乙酯提取物，3.80％乙酸乙酯提取物，4.咖啡酸对照品溶液。

图3是鉴别厚藤的薄层色谱方法中展开剂选择的实验结果图，图中：3-1石油醚-乙酸乙酯-氯仿-甲醇(4:1:1:0.3)展开剂展开结果，3-2正己烷-氯仿-正丁醇(4:1:1)展开剂展开结果，3-3环己烷-丙酮-乙酸乙酯-甲酸(6:2:1:0.15)展开剂展开结果；a为咖啡酸的显色斑点，1.80％乙酸乙酯提取物，2.80％乙酸乙酯提取物，3.80％乙酸乙酯提取物，4.咖啡酸对照品溶液。

图4是鉴别厚藤的薄层色谱方法中湿度选择的实验结果图，图中：4-1温度25℃，湿度70％薄层结果；4-2温度25℃，湿度50％薄层结果；a为咖啡酸的显色斑点，1.80％乙酸乙酯提取物，2.80％乙酸乙酯提取物，3.80％乙酸乙酯提取物，4.咖啡酸对照品溶液。

图5是鉴别厚藤的薄层色谱方法中温度选择的实验结果图，图中：5-1温度10℃、湿度50％薄层结果；5-2温度25℃、湿度50％薄层结果；5-3温度30℃、湿度50％薄层结果；a为咖啡酸的显色斑点，1.80％乙酸乙酯提取物，2.80％乙酸乙酯提取物，3.80％乙酸乙酯提取物，4.咖啡酸对照品溶液。

图6是应用本发明鉴别厚藤的薄层色谱方法的10批厚藤的薄层色谱图，图中：1，7，13为咖啡酸对照品，a为咖啡酸的显色斑点，2～6、7～12分别为第1～10批厚藤的样品溶液。

具体实施方式

1.仪器和试药

1.1仪器

万分之一电子分析天平(赛多利斯科学仪器(北京)有限公司，型号：CPA225D)；超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司，型号：KQ5200B)；双槽展开缸(型号：200×100mm)；1mL容量瓶；点样毛细管(泰州市兆华贸易有限公司，型号：0.3×100mm)；硅胶G薄层板(青岛海洋化工集团，型号：100×100mm)。

1.2试药

咖啡酸(上海融禾医药科技发展有限公司，批号:160803)；香草醛(天津市大茂化学试剂厂，批号：20160711)；铁氰化钾(成都金山化学试剂有限公司，批号：20160110)；六水三氯化铁(成都金山化学试剂有限公司，批号：20160316)；甲醇、95％乙醇、无水乙醇、乙酸乙酯等(成都市科龙化工试剂厂，均为分析纯)；石油醚(60-90℃，成都市科龙化工试剂厂，均为分析纯)；厚藤药材(采集于广西防城港市防城区，批号：20160326)

2.方法与结果

2.1供试品溶液的制备

精密称取厚藤药材粉末约1ɡ(晒干后粉碎并过50目筛)，置具塞锥形瓶中，加入提取溶媒80％乙酸乙酯10mL，超声30min，过滤，转移至蒸发皿，经60℃水浴浓缩至干，加入1mL提取溶媒使溶解，作为供试品溶液。

2.2对照品溶液的制备

精密称取咖啡酸对照品2.2110mɡ，加入甲醇定容于5mL容量瓶，配制成0.4422mɡ/mL的对照品溶液。

2.3提取溶媒的优选

精密称取厚藤药材粉末约1ɡ，共计五份，依据“2.1”项下的制备方法，制备为以50％乙酸乙酯、80％乙酸乙酯、乙酸乙酯、乙醇、甲醇为提取溶媒的供试品溶液，在温度25℃，湿度50％的环境中，吸取上述供试品溶液、咖啡酸对照品溶液各5uL，点于100×100mm的硅胶G薄层板上，以环己烷-乙酸乙酯-丙酮-甲酸(6:1:2:0.15)为展开剂，在双槽展开缸内预饱和30min，展开，取出薄层板晾干，浸泡于1％铁氰化钾-2％三氯化铁显色剂中，取出，吹风机吹干，日光下检视。结果如图1，80％乙酸乙酯提取得到的样品，TLC色谱图斑点数量多，且与咖啡酸对照品色谱图相同位置呈现蓝色斑点，斑点颜色深且不拖尾，所以，后续试验将提取溶媒定为80％乙酸乙酯。

2.4薄层色谱条件的考察

2.4.1显色剂的考察

依据“2.1”项下的制备方法，制成80％乙酸乙酯为提取溶媒的供试品溶液。在温度25℃、湿度50％的环境中，吸取上述供试品、咖啡酸对照品溶液各5uL，点于100×100mm的硅胶G薄层板上，以环己烷-乙酸乙酯-丙酮-甲酸(6:1:2:0.15)为展开剂，在双槽展开缸内预饱和30min，展开，取出薄层板晾干，分别使用1％铁氰化钾-2％三氯化铁、1％香草醛溶液、10％硫酸乙醇溶液显色，取出吹风机吹干，在日光下检视。结果如图2所示，咖啡酸在1％铁氰化钾-2％三氯化铁作用下显色灵敏，且厚藤药材TLC色谱图斑点较多。所以，后续试验选用1％铁氰化甲-2％三氯化铁作为显色剂。

2.4.2展开剂的选择

依据“2.1”项下的制备方法，制成以80％乙酸乙酯为提取溶媒的供试品溶液。在温度25℃、湿度50％的环境中，吸取上述供试品、咖啡酸对照品溶液各5uL，点于100×100mm的硅胶G薄层板上，分别以石油醚-乙酸乙酯-氯仿-甲醇(4:1:1:0.3)，正己烷-氯仿-正丁醇(4:1:1)，环己烷-丙酮-乙酸乙酯-甲酸(6：2:1:0.15)三种展开系统展开，取出薄层板晾干，喷以1％铁氰化钾-2％三氯化铁显色，吹干，日光下检视。结果如图3所示，3-3斑点数量多且清晰，后续试验选用环己烷-丙酮-乙酸乙酯-甲酸(6:2:1:0.15)作为展开剂。

2.4.3不同湿度的考察

依据“2.1”项下的制备方法，制成以80％乙酸乙酯为提取溶媒的供试品溶液。在温度25℃、湿度70％及温度25℃、湿度50％的环境中，吸取上述供试品、咖啡酸对照品溶液各5uL，点于100×100mm的硅胶G薄层板上，以环己烷-丙酮-乙酸乙酯-甲酸(6：2:1:0.15)为展开系统，预饱和30min，展开，取出薄层板晾干，喷1％铁氰化钾-2％三氯化铁显色，吹干，日光下检视。结果如图4所示，当温度25℃时，50％湿度比70％湿度条件下显色的斑点多且清晰。所以应该选择湿度为50％作为最佳湿度。

2.4.4不同温度的考察

依据“2.1”项下的制备方法，制成以80％乙酸乙酯为提取溶媒的供试品溶液。在温度10℃、湿度50％；温度25℃、湿度50％；温度30℃、湿度50％的环境中，吸取上述供试品、咖啡酸对照品溶液各5ul，点于100×100mm的硅胶G薄层板上，以环己烷-丙酮-乙酸乙酯-甲酸(6：2:1:0.15)为展开系统，预饱和30min，展开，取出薄层板晾干，喷1％铁氰化钾-2％三氯化铁混合显色剂显色，吹干，在日光下检视。结果如图5所示，图5-2的TLC色谱图的样品斑点多，厚藤的薄层色谱图分离度好，所以，后续试验将常温25℃作为最佳环境温度。

2.5厚藤药材的薄层色谱鉴别

照《中国药典》2015年版第四部薄层色谱法(通则0502)，依据“2.1”项下的制备方法分别制备10批厚藤的样品溶液，分别点于同一硅胶G薄层板上，以咖啡酸为对照品，以环己烷-丙酮-乙酸乙酯-甲酸(6:2:1:0.15)为展开系统，以1％铁氰化钾-2％三氯化铁为显色剂，温度25℃，湿度50％，对厚藤进行薄层鉴别，结果10批厚藤供试品溶液与对照品溶液色谱相应的位置上均显相同颜色的斑点，该薄层色谱鉴别法具有较好的适用性，可适用于厚藤药材的鉴别。(见图6)。

3.讨论与小结

本发明对不同提取溶媒、提取溶媒的不同浓度、显色剂、展开剂、温度、湿度等影响因素进行了考察，观察各因素对薄层色谱的影响。结果表明，以咖啡酸为对照品，以80％乙酸乙酯为提取溶媒，以环己烷-丙酮-乙酸乙酯-甲酸(6:2:1:0.15)为展开系统，以1％铁氰化钾-2％三氯化铁为显色剂，温度25℃，湿度50％，对厚藤进行薄层鉴别，厚藤薄层色谱图斑点颜色清晰，分离度好，专属性强。

Claims (6)

1.一种鉴别厚藤的薄层色谱方法，其特征在于采用硅胶G薄层板，以咖啡酸为对照品，以乙酸乙酯为提取溶媒，以环己烷-丙酮-乙酸乙酯-甲酸为展开系统，以铁氰化钾-三氯化铁为显色剂。

2.根据权利要求1所述的鉴别厚藤的薄层色谱方法，其特征在于：所述提取溶媒为体积百分数80％的乙酸乙酯水溶液。

3.根据权利要求1所述的鉴别厚藤的薄层色谱方法，其特征在于：所述展开系统为体积比6:2:1:0.15的环己烷-丙酮-乙酸乙酯-甲酸的混合溶液。

4.根据权利要求1所述的鉴别厚藤的薄层色谱方法，其特征在于：所述显色剂为铁氰化钾-三氯化铁溶液，其中铁氰化钾的质量浓度为1％，三氯化铁的质量浓度为2％。

5.根据权利要求1所述的鉴别厚藤的薄层色谱方法，其特征在于该法在温度25℃、湿度50％条件下进行。

6.根据权利要求1所述的鉴别厚藤的薄层色谱方法，其特征在于该法的供试品溶液按以下操作制备：精密称取厚藤药材粉末约1ɡ，置具塞锥形瓶中，加入提取溶媒80％乙酸乙酯10mL，超声30min，过滤，转移至蒸发皿，经60℃水浴浓缩至干，加入1mL提取溶媒使溶解，即得。