CN110093460A - 一种检测猪肝中戊肝病毒的方法 - Google Patents

Abstract

本申请提供了一种检测猪肝中戊肝病毒的方法，具体步骤为：取猪肝样品1～2g并剪碎，加入RNaseOUT，然后加入MS2过程控制对照和TRIZOL溶液，均质器均质；吸取上清，离心，加入三氯甲烷，震荡混匀后吸取上清液，提取病毒RNA；使用75％酒精对RNA提取物进行处理离心、烘干，加入水溶解，得到终产物，随后采用荧光反转录PCR方法进行HEV检测。本发明提供的方法的回收效率高于本领域已有方法；PCR抑制剂去除效果较PCR抑制剂去除试剂盒好，检测所用引物及探针为自行设计，灵敏度高。

Description

一种检测猪肝中戊肝病毒的方法

技术领域

本发明涉及病毒学技术领域，尤其是涉及一种检测猪肝中戊肝病毒的方法。

背景技术

戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus，HEV)是引起人类急性肝炎的主要病原体之一，近年来越来越受到国际社会的关注。HEV的分子结构是单链无包膜RNA病毒，直径27-34nm，属肝炎病毒科正戊肝病毒属，基因组全长6.6-7.3kb左右，包含3个开放阅读框(ORF1-3)，ORF1编码与病毒转录、复制相关的非结构蛋白，ORF2编码病毒衣壳蛋白，ORF3编码一种小分子磷蛋白，与细胞骨架和HEV的特异性免疫反应有关。在亚洲和非洲一些发展中国家表现为流行趋势，发达国家则表现为散发，而我国是该病毒的主要流行国家之一。

HEV可分为五个基因型(I～V)，其中：Ⅰ型和Ⅱ型HEV仅感染人类，在人群中传播可造成戊肝大流行，Ⅲ型和Ⅳ型HEV是人畜共患，其自然宿主包括野猪、家猪和鹿等多种哺乳动物，多引起急性散发性戊肝，Ⅴ型仅发现于禽类。HEV可通过粪-口途径传播，包括因粪便污染生活用水而造成的水源传播，以及摄入感染HEV的动物内脏或肉制品等食源性传播^[9]。已有证据表明生食或食入未煮熟的猪肝可引起HEV感染。

HEV严重影响到了人们的身体健康，因此不仅仅要在生活中注意，及时隔离治疗，从而有效的防止传播；更需要建立一种快速有效的食品中HEV的检测方法，来检测食品中是否存在HEV，从源头上减少含有HEV的食物进入市场，保障食品安全。目前检测HEV的方法主要有免疫学检测和核酸检测。免疫学检测包括：酶联免疫吸附试验(ELISA)、免疫印迹法和胶体金层析法。

免疫学检测法有影响因素复杂，操作步骤要求严格，重复性差，所需时间长，价格昂贵等缺陷。核酸检测包括逆转录－聚合酶链反应(RT-PCR)、反转录环介导等温核酸扩增技术(RT-LAMP)和转录介导的扩增技术(TMA)。HEV核酸检测是急性戊肝和慢性戊肝诊断的“金标准”，该方法特异性强、灵敏度高，但是由于RNA检测具有操作复杂、成本高、易污染等特点，一定程度上限制了其广泛应用。

德国科学家Kathrin Szabo建立了食品中HEV的分离检测方法。该方法使用TRIZOL溶液，获得了最高的细胞破裂效率，同时也抑制了猪肝中相应的酶的活性，利用三氯甲烷进行纯化，提取出的RNA采用反转录荧光PCR方法进行检测。但是该方法提取产物回收率偏低且PCR抑制剂过多，导致PCR结果出现假阴性。

我国是HEV的流行国家之一，主要流行基因型为人畜共患型——HEV4，该病毒主要通过粪口途径传播。目前对于粪便和血清中戊肝病毒的检测方法较多，而对食品中戊肝病毒的检测方法较少，这主要是由于食品中的复杂基质会影响PCR检测，因此，如何进行食品样本的前处理，提高病毒提取效率，降低复杂基质的影响是解决问题的关键，同时也要对猪肝中戊肝病毒含量进行分析。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本申请提供了一种检测猪肝中戊肝病毒的方法。

本发明的技术方案如下：

一种检测猪肝中戊肝病毒的方法，具体步骤如下：

(1)取猪肝样品1～2g并剪碎，置于均质袋中，加入2～5μL的RNaseOUT，然后加入10μL的MS2过程控制对照和7mL的TRIZOL溶液，均质器均质5min；

(2)吸取至少5mL上清，在4℃条件下3000rpm离心10min，吸取4mL上清置于新的离心管中，加入1mL三氯甲烷，震荡混匀后在4℃的条件下12000rpm离心15min，吸取140μL上清液，按照病毒RNA提取试剂盒操作说明，提取病毒RNA；

(3)洗脱提取到的病毒RNA中的PCR抑制剂，优选的，使用75％酒精对RNA提取物进行处理，具体方法为在50μL RNA提取物中加入1ml酒精，12000rpm离心10-15min后，弃去上清，重复上述步骤一次后，置于真空烘干箱内50℃烘干20min，加入50μL水溶解，得到终产物，随后采用荧光反转录PCR方法进行HEV检测；

(4)另取步骤(3)的5μL终产物，加入1μL HEV标准对照，同时做水对照，以确定终产物中PCR抑制剂不会造成假阴性。

除样品外，分别设立阳性对照、阴性对照和水对照，其中：

PCR反应体系50μL，其中MS2预混液35μL，酶混合液5μL，模板RNA为10μL；

PCR反应条件：42℃：30min、95℃：5min、95℃：15s、60℃：30s、65℃：30s；后三个温度时间做44个循环。

标准曲线制作方法为：

取10μL的MS2过程控制对照，95℃加热灭活后冷却至室温，按照1:9的比例进行梯度稀释，做3个梯度稀释，共4个浓度，加入到PCR反应体系后，进行荧光反转录PCR，制作标准曲线。

所述采用荧光反转录PCR方法进行HEV检测中，

上游引物：GGTGGTTTCTGGGGTGAC；

下游引物：AGGGGTTGGTTGGATGAA；

探针：FAM-TGATTCTCAGCCCTTCGC-MGB；

PCR总反应体系为50μL，其中2×Reaction Mix为25.0μL，上游引物1.25μL，下游引物2.25μL，探针0.625μL，无RNase水9.875μL，SuperScriptⅢRT/PlatinumTaqMIX为1.0μL，模板RNA为10.0μL；

PCR反应条件为：50℃：30min、95℃：5min、95℃：15s、60℃：30s、65℃：30s；后面三个温度时间做44个循环。

由于猪肝中存在大量的酶及无机物，在RNA提取过程中并不能将其彻底清除，这些残留物会对荧光反转录PCR产生抑制作用，导致结果出现假阴性，因此需设立外加控制对照，确定抑制剂对PCR的影响；所述外加控制对照设立方法为：

分别在每5μL RNA提取物中加入1ul阳性对照样本，另外在5μL纯水中加入1μL阳性样本，进行荧光反转录PCR；

PCR总反应体系为51μL，其中2×Reaction Mix为25.0μL，上游引物1.25μL，下游引物2.25μL，探针0.625μL，无RNase水14.875μL，SuperScriptⅢRT/PlatinumTaqMIX为1.0μL，模板RNA为5.0μL，阳性RNA为1.0μL。回收率的计算公式为：

肝脏中MS2回＝{{SQcopies/μL×50μL×1g/[(1g/7mL)×140μL}/(1copiy/μl×10μL)〕}×100％

结果判定方法：外加控制对照结果判定：Ct(样本+阳性)-Ct(水+阳性)平均＜2，表明结果有效。

结果判定标准：在满足水对照和阴性对照Ct值>40、阳性对照Ct值<35和过程控制对照MS2的回收率≥1％的条件下，样本Ct值<35，结果判断为阳性；35≤Ct值≤40，需重新检测；Ct值>40，需参考过程控制对照，若Ct(样本+阳性)-Ct(水+阳性)平均＜2，则判定为阴性，若Ct(样本+阳性)-Ct(水+阳性)平均＞2，说明抑制剂影响过大，需重新提取，或想办法去除抑制剂。

过程控制有效性判断标准：样本中添加的MS2回收率≥1％，扩增效率E在90-110％之间，标准曲线斜率S在-3.1～-3.6之间，表明实验结果有效，可忽略提取过程中RNA的损失；若回收率小于1％需重新提取病毒RNA。

本发明有益的技术效果在于：

(1)本发明提供的方法的回收效率高于本领域已有方法；

(2)PCR抑制剂去除效果较PCR抑制剂去除试剂盒好；

(3)本研究中检测所用引物及探针为自行设计。

附图说明

图1、图2为实施例1测试得到的标准曲线；

图3为实施例1测试得到的猪肝回收率荧光PCR结果。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明进行具体描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。本发明部分试剂的型号及生产厂家如表1所示。

表1

其中75％酒精配制方法为：75mL酒精+25mL水。

实施例1：猪肝中RNA提取方法

(1)取猪肝样品1g并剪碎，置于均质袋中，加入2μL的RNaseOUT，然后加入10μL的MS2过程控制对照和7mL的TRIZOL溶液，均质器均质5min；

(2)吸取至少5mL上清，在4℃条件下3000rpm离心10min，吸取4mL上清置于新的离心管中，加入1mL三氯甲烷，震荡混匀后在4℃的条件下12000rpm离心15min，吸取140μL上清液，按照病毒RNA提取试剂盒操作说明，提取病毒RNA；

(3)将1ml 75％酒精加入到50μL RNA提取物中，混匀后，12000rpm离心15min，弃去上清后，置于真空干燥箱中，50℃，真空干燥20min，之后加入50μL水溶解产物。取5μL终产物，加入1μl HEV标准对照，同时做水对照，以确定终产物中PCR抑制剂不会造成假阴性。

其中，提取病毒RNA的具体操作如下：

在560ul buffer AVL中加入140ul上清液，震荡30s，室温放置10min，加入560μL无水乙醇，震荡30s，8000rpm离心1min；吸取630ul离心后的液体加入柱子(已装入到2mL收集管中)中，注意不要碰到柱子的边缘，盖上盖子，8000rpm离心1min，将柱子放入新的2mL收集管中，弃去旧的收集管；将1.5mLEP管中的液体加入柱子中，重复上步；小心的打开柱子的盖子，加入500μL buffer AW1，盖上盖子，8000rpm离心1min，将柱子放入新的2mL收集管中，弃去旧的收集管；小心的打开柱子的盖子，加入500μL buffer AW2，盖上盖子，13000rpm离心3min，将柱子放入新的2mL收集管中，弃去旧的收集管；将柱子盖上盖子，13000rpm离心1min，去除buffer AW2残留；将柱子放在1.5mL收集管中，弃去旧的收集管，小心的打开柱子的盖子，加入50μL buffer AVE，室温放置5min，8000rpm离心1min，获得RNA，放入-80℃保存。

除样品外，分别设立阳性对照阴性对照和水对照。

PCR反应条件

(4)标准曲线制作

取10μL MS2过程控制对照，95℃加热灭活后冷却至室温，按照1:9的比例进行梯度稀释，做3个梯度稀释，共4个浓度，加入到PCR反应体系后，进行荧光反转录PCR，制作标准曲线。

(5)回收率的计算

肝脏中MS2回收率＝{{SQcopies/μL×50μL×1g/[(1g/7mL)×140μL}/(1copiy/μl×10μL)〕}×100％

(6)HEV检测方法

采用荧光反转录PCR方法进行HEV检测

上游引物：GGTGGTTTCTGGGGTGAC

下游引物：AGGGGTTGGTTGGATGAA

探针：FAM-TGATTCTCAGCCCTTCGC-MGB

PCR反应条件

(7)外加控制对照设立

由于猪肝中存在大量的酶及无机物，在RNA提取过程中并不能将其彻底清除，这些残留物会对荧光反转录PCR产生抑制作用，导致结果出现假阴性，因此需设立外加控制对照，确定抑制剂对PCR的影响。

外加控制对照设立：分别在每5μL RNA提取物中加入1ul阳性对照样本，另外在5μL纯水中加入1μL阳性样本，进行荧光反转录PCR。

PCR总反应体系为51μL

外加控制对照结果判定：Ct(样本+阳性)-Ct(水+阳性)平均＜2，表明结果有效。

(8)结果判定方法

结果判定标准：在满足水对照和阴性对照Ct值>40、阳性对照Ct值<35和过程控制对照MS2的回收率≥1％的条件下，样本Ct值<35，结果判断为阳性；35≤Ct值≤40，需重新检测；Ct值>40，需参考过程控制对照，若Ct(样本+阳性)-Ct(水+阳性)平均＜2，则判定为阴性，若Ct(样本+阳性)-Ct(水+阳性)平均＞2，说明抑制剂影响过大，需重新提取，或想办法去除抑制剂。

过程控制有效性判断标准：样本中添加的MS2回收率≥1％，扩增效率E在90-110％之间，标准曲线斜率S在-3.1～-3.6之间，表明实验结果有效，可忽略提取过程中RNA的损失；若回收率小于1％需重新提取病毒RNA。

上述方法测试得到的标准曲线如图1、图2所示。扩增效率E在90-110％之间，标准曲线斜率S在-3.1～-3.6之间。按照肝中MS2回收率计算公式，回收率均大于1％，符合要求。部分猪肝回收率荧光PCR结果见图3。

在提取的RNA中加入外加控制对照，通过结果发现Ct(样本+阳性)-Ct(水+阳性)平均＜2，表明抑制剂对PCR反应的抑制率低于75％，符合结果判定要求。

实施例2：改变检测参数

将实施例1的步骤(1)改为加入5μL的RNaseOUT。

测试例：

实施例1和2分别向样本中加入RNaseOUT 2μL和5μL，结果对照如表2所示。

表2

样本名称	添加量	Ct值	SQ值	回收率
					C01	2μL	34.50	4.708×10<sup>-5</sup>	1.18％
C02	2μL	34,26	8.516×10<sup>-5</sup>	2.13％
					C05	2μL	34.59	6.349×10<sup>-5</sup>	1.59％
C04	5μL	34.73	5.835×10<sup>-5</sup>	1.46％
					C07	5μL	34.57	6.443×10<sup>-5</sup>	1.61％
C08	5μL	34.55	6.556×10<sup>-5</sup>	1.64％

对比例1：改变消除PCR抑制剂的方法

RNA提取物直接进行PCR，由于含有大量抑制剂，导致PCR反应被抑制，因此需要对RNA提取物进行处理，以去除PCR抑制剂的影响。本对比例将实施例(1)中使用的75％酒精替换为PCR抑制剂去除试剂盒(OneStep^TMPCR Inhibitor Removal Kit，品牌ZYMO RESEARCH，货号D6030)，对RNA提取物进行处理，之后在每5μL RNA提取物中加入1μL HEV标准品，同时进行水对照进行PCR观察处理效果，结果见表3。

表3

结果表明：对于肝脏样品，75％酒精洗涤效果优于PCR抑制剂去除试剂盒，使用75％酒精洗脱Ct(75％酒精处理)-Ct(水)比使用试剂盒洗脱Ct(试剂盒处理)-Ct(水)的差要小，并且Ct(75％酒精处理)-Ct(水)＜2，符合要求，所以选择使用75％酒精进行洗脱。

对比例2：采用德国Kathrin Szabo的方法进行比对

采用德国原方法取1g猪肝进行添加回收实验室，发现回收率低于1％，且采用原方法进行PCR时，PCR抑制效率明显高于75％，因此对纯化方法进行优化。

备注：德国Kathrin Szabo的方法来自于：Kathrin Szabo,Eva Trojnar,HelenaAnheyer-Behmenburg,et al.Detection of hepatitis E virus RNA in raw sausagesand liver sausages from retail in Germany using an optimized method[J].International Journal of Food Microbiology,2015,215:149-156.

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，对于本领域的普通技术人员而言，在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。

Claims (6)

1.一种检测猪肝中戊肝病毒的方法，其特征在于具体步骤如下：

(1)取猪肝样品1～2g并剪碎，置于均质袋中，加入2～5μL的RNaseOUT，然后加入10μL的MS2过程控制对照和7mL的TRIZOL溶液，均质器均质5min；

(2)吸取至少5mL上清，在4℃条件下3000rpm离心10min，吸取4mL上清置于新的离心管中，加入1mL三氯甲烷，震荡混匀后在4℃的条件下12000rpm离心15min，吸取140μL上清液，按照病毒RNA提取试剂盒操作说明，提取病毒RNA；

(3)洗脱提取到的病毒RNA中的PCR抑制剂，置于真空烘干箱内50℃烘干，加入50μL水溶解，得到终产物，随后采用荧光反转录PCR方法进行HEV检测；

(4)另取步骤(3)的5μL终产物，加入1μL HEV标准对照，同时做水对照，以确定终产物中PCR抑制剂不会造成假阴性。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于除样品外，分别设立阳性对照、阴性对照和水对照，其中：

PCR反应体系50μL，其中MS2预混液35μL，酶混合液5μL，模板RNA为10μL；

PCR反应条件：42℃：30min、95℃：5min、95℃：15s、60℃：30s、65℃：30s；后三个温度时间做44个循环。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于标准曲线制作方法为：

取10μL的MS2过程控制对照，95℃加热灭活后冷却至室温，按照1:9的比例进行梯度稀释，做3个梯度稀释，共4个浓度，加入到PCR反应体系后，进行荧光反转录PCR，制作标准曲线。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述采用荧光反转录PCR方法进行HEV检测中，

上游引物：GGTGGTTTCTGGGGTGAC；

下游引物：AGGGGTTGGTTGGATGAA；

探针：FAM-TGATTCTCAGCCCTTCGC-MGB；

PCR总反应体系为50μL，其中2×Reaction Mix为25.0μL，上游引物1.25μL，下游引物2.25μL，探针0.625μL，无RNase水9.875μL，SuperScriptⅢRT/PlatinumTaqMIX为1.0μL，模板RNA为10.0μL；

PCR反应条件为：50℃：30min、95℃：5min、95℃：15s、60℃：30s、65℃：30s；后面三个温度时间做44个循环。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于由于猪肝中存在大量的酶及无机物，在RNA提取过程中并不能将其彻底清除，这些残留物会对荧光反转录PCR产生抑制作用，导致结果出现假阴性，因此需设立外加控制对照，确定抑制剂对PCR的影响；所述外加控制对照设立方法为：

分别在每5μL RNA提取物中加入1ul阳性对照样本，另外在5μL纯水中加入1μL阳性样本，进行荧光反转录PCR；

PCR总反应体系为51μL，其中2×Reaction Mix为25.0μL，上游引物1.25μL，下游引物2.25μL，探针0.625μL，无RNase水14.875μL，SuperScriptⅢRT/PlatinumTaqMIX为1.0μL，模板RNA为5.0μL，阳性RNA为1.0μL。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(3)所述洗脱的方法为使用75％酒精对RNA提取物进行处理，具体方法为在50μL RNA提取物中加入1ml酒精，12000rpm离心10-15min后，弃去上清；重复上述步骤后，进行烘干。