CN110092784A - 一种腙类化合物及其中间体，及其制备方法、药物组合物和应用 - Google Patents

一种腙类化合物及其中间体，及其制备方法、药物组合物和应用 Download PDF

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李浩妍
牛春意
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Abstract

本发明公开了一种腙类衍生物(I)、其中间体、制备方法、药物组合物和应用。本发明的腙类化合物对cIAP1蛋白的泛素化活性具有很好的抑制作用，并在细胞水平促进致癌蛋白c‑MYC的降解，抑制肿瘤细胞的生长，具有广阔的药物开发前景。

Description

一种腙类化合物及其中间体，及其制备方法、药物组合物和 应用
技术领域
本发明涉及一种腙类化合物、其中间体、制备方法、药物组合物和应用。
背景技术
原癌基因c-MYC，通过易位，重排和扩增等方式在肺癌，乳腺癌等多种肿瘤中异常高表达。c-MYC是非常重要的转录因子，调控细胞的生长、增殖、分化和代谢等重要生理过程。在肿瘤细胞中，c-MYC高表达会导致生理调节异常，并通过影响靶基因的转录调节细胞增殖，生存和代谢等，最终导致肿瘤的发生和转移。
c-MYC是MYC/MAX/MAD转录因子家族中的一员，该蛋白家族属于碱性螺旋-环-螺旋-亮氨酸拉链类(bHLH-LZ)转录因子,c-MYC通过bHLH-LZ结构域与MAX结合形成异二聚体，结合于靶基因的E-box(CACGTG)序列，促进靶基因的转录和表达。MAD1(由MXD1基因编码)也是MYC/MAX/MAD网络家族中的一员，MAD1能够和c-MYC竞争结合MAX，作用于靶基因的E-Box序列，但是抑制靶基因的转录，因此，MAD1是c-MYC的拮抗剂，并抑制肿瘤细胞的生长。在肿瘤细胞中，MAD1蛋白被E3连接酶cIAP1泛素化并被蛋白酶体识别和降解，使MAD1蛋白水平下降。
细胞凋亡抑制蛋白(IAPs)以存在一个或者多个杆状病毒IAP重复序列(BIRs)而命名，细胞凋亡抑制蛋白通过抑制caspase的激活来抑制细胞凋亡。细胞凋亡抑制蛋白在人类多种肿瘤中高表达，而且在肿瘤的发生过程中起到重要作用，所以可以通过靶向细胞凋亡抑制蛋白来治疗肿瘤。例如，Smac类似物能够和cIAP1/2的BIR2-3结构域结合，并激活cIAP1/2的E3连接酶活性从而促进cIAP1/2的泛素化降解。许多Smac类似物已经进行临床实验阶段，然而Smac类似物作为单一疗法在肿瘤患者中的疗效仍有待验证。
一部分IAP家族成员，包括cIAP1和cIAP2，具有RING结构域，赋予其泛素连接酶活性。cIAP1通过它的RING结构域二聚化来赋予cIAP1E3连接酶活性。cIAP1通过降解MAD1蛋白，而与c-MYC协同促进肿瘤的发生。目前并没有cIAP1泛素连接酶抑制剂的报道。
综上所述，本领域尚需要开发能够抑制cIAP1和cIAP2泛素连接酶活性的抑制剂。
发明内容
本发明首次发现了一种腙类化合物为cIAP1和cIAP2泛素化酶抑制剂。该类化合物在体外和细胞水平抑制cIAP1和cIAP2的泛素化活性，并能够提高MAD1的蛋白水平，降低c-MYC的蛋白水平，对肿瘤细胞具有很好的抑制活性，具有广阔的药物开发前景。
本发明的第一方面，提供了一种如下式I所示的化合物，及其外消旋体、R-异构体、S-异构体、可药用的盐或它们混合物：
其中，
环A为取代或未取代的5-12元的芳环，或取代或未取代的5-12元的杂芳环；
环B为取代或未取代的5-12元的杂芳环；
R1选自下组：H、C1-C4烷基；
所述的芳环或杂芳环的取代基选自下组：-OH、卤素、或取代或未取代的选自下组的基团：C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、C2-C6烯基、C1-C6烷氧基、-O-(C1-C6烷基)-C1-C6烷氧基、C2-C6炔基、C3-C10环烷基、C3-C10环烯基、(C2-10)烷氧羰基、(C3-12)环烷基、3-12元杂环基、芳基(C1-10)烷基、(C9-12)双环芳基、杂(C4-12)双环芳基、羰基(C1-3)烷基、硫代羰基(C1-3)烷基、磺酰基(C1-3)烷基、亚磺酰基(C1-3)烷基、亚氨基(C1-3)烷基、氨基、氰基、C6-C12芳基、3-12元杂芳基、C6-C12芳氧基、3-12元杂芳氧基、磺酰基、亚磺酰基、-NHCOR、或-CONHR；或分别连接于相邻环原子的两个取代基与其相连的环原子共同构成取代或未取代的选自下组的环：C3-C8碳环，或5-8元杂环；
所述的取代指基团上的一个或多个氢原子被选自下组的取代基取代：氨基、氰基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、卤素、C1-C6卤代烷基、羰基(C2-10)烷氧基、羰基(C7-10)芳氧基、酰胺基(C2-10)烷基、未取代或被1-3个选自下组的取代基取代的C6-C12芳基或3-12元杂环基：卤素、未取代或卤代的C1-C6烷基、C1-C6烷氧基；
且所述的化合物不为以下结构：
在另一优选例中，所述的环A为取代或未取代的7-12元的芳环，或取代或未取代的7-12元的杂芳环。
在另一优选例中，所述的环B为取代或未取代的7-12元的芳环，或取代或未取代的7-12元的杂芳环。
在另一优选例中，所述的式I化合物具有以下结构：
其中为5-12元的杂芳环，其中，M选自下组：O、S、NH、CH2；且所述的为未取代或进一步被取代的；
在另一优选例中，所述的为7-12元的杂芳环。
在另一优选例中，所述的环A为取代或未取代的选自下组的基团：苯基、吡啶基、嘧啶基、哒嗪基、四嗪基、吡咯基、噻吩基、呋喃基、三氮唑基、咪唑基、噻唑基、恶唑基、吡唑基、异噻唑基、异恶唑基、恶二唑基、噻二唑基、萘基、吲哚基、吲唑基、喹啉基、异喹啉基、苯并呋喃基、苯并噻吩基、苯并咪唑基、苯并恶唑基、苯并噻唑基、苯并异噻唑基、苯并异恶唑基、苯并三氮唑基。
在另一优选例中，所述的为取代或未取代的选自下组的基团：吡啶基、嘧啶基、三氮唑基、咪唑基、噻唑基、恶唑基、吡唑基、异噻唑基、异恶唑基、恶二唑基、噻二唑基、吲哚基、吲唑基、喹啉基、异喹啉基、苯并咪唑基、苯并恶唑基、苯并噻唑基、苯并异噻唑基、苯并异恶唑基、苯并三氮唑基。
在另一优选例中，所述的式I化合物具有如下式II所示的结构：
其中，A1、A2、A3、A4、A5、A6、B1、B2、B3、B4、B5、B6各自独立地选自下组：C(R)2、CR、C、NR、N、O或S；
R选自下组：H、-OH、卤素、或取代或未取代的选自下组的基团：C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、C2-C6烯基、C1-C6烷氧基、-O-(C1-C6烷基)-C1-C6烷氧基、C2-C6炔基、C3-C10环烷基、C3-C10环烯基、(C2-10)烷氧羰基、(C3-12)环烷基、3-12元杂环基、芳基(C1-10)烷基、(C9-12)双环芳基、杂(C4-12)双环芳基、羰基(C1-3)烷基、硫代羰基(C1-3)烷基、磺酰基(C1-3)烷基、亚磺酰基(C1-3)烷基、亚氨基(C1-3)烷基、氨基、氰基、C6-C12芳基、3-12元杂芳基、C6-C12芳氧基、3-12元杂芳氧基、磺酰基、亚磺酰基、-NHCOR、或-CONHR；或分别连接于相邻环原子的两个R与其相连的环原子共同构成取代或未取代的选自下组的环：C3-C8碳环，或5-8元杂环；
R1选自下组：H、C1-C4烷基；
所述的取代指基团上的一个或多个氢原子被选自下组的取代基取代：氨基、氰基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、卤素、C1-C6卤代烷基、羰基(C2-10)烷氧基、羰基(C7-10)芳氧基、酰胺基(C2-10)烷基、未取代或被1-3个选自下组的取代基取代的C6-C12芳基或3-12元杂环基：卤素、未取代或卤代的C1-C6烷基、C1-C6烷氧基。
在另一优选例中，所述的式II化合物具有以下结构：
在另一优选例中，所述的A5、B6各自独立地选自NR、O或S；A6、B5各自独立地选自CR或N。
在另一优选例中，所述的R选自下组：C1-C4烷基、C1-C4烷氧基、C1-C4卤代烷基、C1-C4卤代烷氧基、取代或未取代的5-8元杂环基；或分别连接于相邻环原子的两个R与其相连的环原子共同构成取代或未取代的选自下组的环：C3-C8碳环，或5-8元杂环。
在另一优选例中，所述的A5、B6各自独立地为S；且所述的A6、B5各自独立地选自CR或N；其中，所述的R选自下组：-OH、C1-C4烷氧基。
在另一优选例中，所述的式I化合物具有如下式所示的结构：
在另一优选例中，所述的化合物选自下组：
本发明的第二方面，提供了一种药物组合物，所述的药物组合物包括：(a)如本发明第一方面所述的式I化合物，或其外消旋体、R-异构体、S-异构体、可药用的盐或它们混合物，和(b)药学上可接受的载体。
在另一优选例中，所述的药物组合物还包括(c)第二放疗或化疗药物。
在另一优选例中，所述的药物组合物用于治疗或预防肿瘤。
本发明的第三方面，提供了一种如下式I所述的化合物，及其外消旋体、R-异构体、S-异构体、可药用的盐或它们混合物的用途：
其中，
环A为取代或未取代的5-12元的芳环，或取代或未取代的5-12元的杂芳环；
环B为取代或未取代的5-12元的杂芳环；
除非特别说明，所述的取代指基团上的一个或多个氢原子被选自下组的取代基取代：-OH、卤素、或取代或未取代的选自下组的基团：C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、C2-C6烯基、C1-C6烷氧基、-O-(C1-C6烷基)-C1-C6烷氧基、C2-C6炔基、C3-C10环烷基、C3-C10环烯基、(C2-10)烷氧羰基、(C3-12)环烷基、3-12元杂环基、芳基(C1-10)烷基、(C9-12)双环芳基、杂(C4-12)双环芳基、羰基(C1-3)烷基、硫代羰基(C1-3)烷基、磺酰基(C1-3)烷基、亚磺酰基(C1-3)烷基、亚氨基(C1-3)烷基、氨基、氰基、C6-C12芳基、3-12元杂芳基、C6-C12芳氧基、3-12元杂芳氧基、磺酰基、亚磺酰基、-NHCOR、或-CONHR；或分别连接于相邻环原子的两个取代基与其相连的环原子共同构成取代或未取代的选自下组的环：C3-C8碳环，或5-8元杂环；
所述的取代指基团上的一个或多个氢原子被选自下组的取代基取代：氨基、氰基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、卤素、C1-C6卤代烷基、羰基(C2-10)烷氧基、羰基(C7-10)芳氧基、酰胺基(C2-10)烷基、未取代或被1-3个选自下组的取代基取代的C6-C12芳基或3-12元杂环基：卤素、未取代或卤代的C1-C6烷基、C1-C6烷氧基；
其特征在于，用于：(1)制备治疗或预防肿瘤的药物组合物；(2)制备cIAP1抑制剂；(3)制备c-MYC的泛素化降解促进剂。
在另一优选例中，所述的药物组合物用于结合于cIAP1的RING结构域。
在另一优选例中，所述的药物组合物用于调控MYC/MAX/MAD网络蛋白水平。
在另一优选例中，所述的药物组合物用于抑制cIAP1调控的MAD1的泛素化降解。
在另一优选例中，所述的药物组合物用于抑制c-MYC/cIAP1协同诱发的细胞克隆的形成。
在另一优选例中，所述的药物组合物用于抑制细胞周期过程中DNA合成。
在另一优选例中，所述的药物组合物用于下调肿瘤细胞中c-MYC蛋白水平。
在另一优选例中，所述的药物组合物用于治疗或预防选自下组的肿瘤：乳腺癌、肺癌、肝癌、胃癌、胰腺癌、结肠癌、前列腺癌、头颈癌、血液肿瘤(优选为c-MYC或cIAP1/2基因高表达的肿瘤以及对受体酪氨酸激酶(包括EGFR、FGFR、PDGFR、VEGFR等)抑制剂、RAF抑制剂、ERK抑制剂、PI3K抑制剂等靶点药物耐受的肿瘤)。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了不同浓度的D19对于cIAP1体外泛素化的作用；
图2显示了D19类似物的抑制率筛选实验Western blot结果；
图3显示了不同浓度的D19对GST、UbcH5b和cIAP1-ΔBIR1/2的Tm值影响结果；
图4显示了不同浓度的D19对于cIAP1-RING的作用结果；
图5显示了不同浓度的D19对于MYC/MAX/MAD网络蛋白水平的调控结果；
图6显示了不同浓度的D19处理对于c-MYC蛋白水平和泛素化水平的影响；
图7显示了不同浓度的D19处理对于cIAP1调控的MAD1的泛素化降解的影响；
图8显示了不同浓度的D19处理对于细胞克隆的形成的影响；
图9显示了不同浓度的D19对于细胞嵌入EdU的比例的影响；
图10显示了D19与D19-14下调肿瘤细胞中c-MYC蛋白水平的活性比较；
图11显示了D19与D19-14对于肿瘤细胞的增殖抑制活性比较；
图12显示了在小鼠模型中，D19-14处理肿瘤的结果。
具体实施方式
本发明人基于长期而深入的研究，对于cIAP1的泛素化酶活性进行化合物筛选并发现苗头化合物D19，该化合物可以在体外和细胞水平抑制cIAP1的泛素化功能，并能够促进c-MYC蛋白的降解，抑制肿瘤细胞的生长。在D19的基础上进行结构改造，发现了一类结构新颖的腙类化合物，能够抑制cIAP1泛素化功能，降低细胞中c-MYC的蛋白水平，抑制肿瘤细胞的增殖。基于上述发现，发明人完成了本发明。
术语
在本发明中，术语“C1-C6烷基”是指具有1至6个碳原子的直链或支链烷基，非限制性地包括甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基和已基等；优选乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基和叔丁基。
术语“C1-C6烷氧基”是指具有1至6个碳原子的直链或支链烷氧基，非限制性地包括甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基和丁氧基等。
术语“C6-C12芳基”是指在环上不含杂原子的具有6至12个碳原子的芳香族环基，如苯基、萘基等。术语“C6-C10芳基”具有类似的含义。
术语“3-12元杂环基”是指在环上含有1～3个选自氧、硫和氮中的杂原子的饱和或不饱和的3-12元环基，例如二氧杂环戊基等。术语“3-7元杂环基”具有类似的含义。
如本文所用，当采用“Cx-Cy”或类似表述时，指所述的基团可以具有x-y个碳原子，例如，“C1-C6”代表基团有1个、2个、3个、4个、5个或6个碳原子，“C2-C6”代表基团有2个、3个、4个、5个或6个碳原子，“C9-12”代表基团有9个、10个、11个或12个碳原子。
式I化合物
基于上述目的，本发明提供了一种具有如下通式I所示结构的化合物：
本发明的第一方面，提供了一种如下式I所示的化合物，及其外消旋体、R-异构体、S-异构体、可药用的盐或它们混合物：
其中，各基团的定义如上所述。
在本发明的优选实施方式中，式I化合物的结构如下表中所示。
所述化合物具有与苗头化合物D19类似的活性，可以在体外和细胞水平抑制cIAP1的泛素化功能，并能够促进c-MYC蛋白的降解，抑制肿瘤细胞的生长。
药物组合物
由于本发明化合物具有良好的cIAP1/2泛素化功能的干扰活性，因此本发明化合物及其各种晶型，药学上可接受的无机或有机盐，水合物或溶剂合物，以及含有本发明化合物为主要活性成分的药物组合物可用于治疗、预防以及缓解与肿瘤细胞增生相关的疾病。根据现有技术，本发明化合物可用于治疗以下疾病：癌症等，包括乳腺癌、肺癌、肝癌、胃癌、胰腺癌、结肠癌、前列腺癌、头颈癌、血液肿瘤(优选为c-MYC或cIAP1/2基因高表达的肿瘤以及对受体酪氨酸激酶(包括EGFR、FGFR、PDGFR、VEGFR等)抑制剂、RAF抑制剂、ERK抑制剂、PI3K抑制剂等靶点药物耐受的肿瘤)。
本发明的药物组合物包含安全有效量范围内的本发明化合物或其药理上可接受的盐及药理上可以接受的赋形剂或载体。其中“安全有效量”指的是：化合物的量足以明显改善病情，而不至于产生严重的副作用。通常，药物组合物含有1-2000mg本发明化合物/剂，更佳地，含有10-1000mg本发明化合物/剂。较佳地，所述的“一剂”为一个胶囊或药片。
“药学上可以接受的载体”指的是：一种或多种相容性固体或液体填料或凝胶物质，它们适合于人使用，而且必须有足够的纯度和足够低的毒性。“相容性”在此指的是组合物中各组份能和本发明的化合物以及它们之间相互掺和，而不明显降低化合物的药效。药学上可以接受的载体部分例子有纤维素及其衍生物(如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素钠、纤维素乙酸酯等)、明胶、滑石、固体润滑剂(如硬脂酸、硬脂酸镁)、硫酸钙、植物油(如豆油、芝麻油、花生油、橄榄油等)、多元醇(如丙二醇、甘油、甘露醇、山梨醇等)、乳化剂(如)、润湿剂(如十二烷基硫酸钠)、着色剂、调味剂、稳定剂、抗氧化剂、防腐剂、无热原水等。
本发明化合物或药物组合物的施用方式没有特别限制，代表性的施用方式包括(但并不限于)：口服、瘤内、直肠、肠胃外(静脉内、肌肉内或皮下)、和局部给药。
用于口服给药的固体剂型包括胶囊剂、片剂、丸剂、散剂和颗粒剂。在这些固体剂型中，活性化合物与至少一种常规惰性赋形剂(或载体)混合，如柠檬酸钠或磷酸二钙，或与下述成分混合：(a)填料或增容剂，例如，淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸；(b)粘合剂，例如，羟甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯基吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶；(c)保湿剂，例如，甘油；(d)崩解剂，例如，琼脂、碳酸钙、马铃薯淀粉或木薯淀粉、藻酸、某些复合硅酸盐、和碳酸钠；(e)缓溶剂，例如石蜡；(f)吸收加速剂，例如，季胺化合物；(g)润湿剂，例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯；(h)吸附剂，例如，高岭土；和(i)润滑剂，例如，滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠，或其混合物。胶囊剂、片剂和丸剂中，剂型也可包含缓冲剂。
固体剂型如片剂、糖丸、胶囊剂、丸剂和颗粒剂可采用包衣和壳材制备，如肠衣和其它本领域公知的材料。它们可包含不透明剂，并且，这种组合物中活性化合物或化合物的释放可以延迟的方式在消化道内的某一部分中释放。可采用的包埋组分的实例是聚合物质和蜡类物质。必要时，活性化合物也可与上述赋形剂中的一种或多种形成微胶囊形式。
用于口服给药的液体剂型包括药学上可接受的乳液、溶液、悬浮液、糖浆或酊剂。除了活性化合物外，液体剂型可包含本领域中常规采用的惰性稀释剂，如水或其它溶剂，增溶剂和乳化剂，例知，乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺以及油，特别是棉籽油、花生油、玉米胚油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油或这些物质的混合物等。
除了这些惰性稀释剂外，组合物也可包含助剂，如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、矫味剂和香料。
除了活性化合物外，悬浮液可包含悬浮剂，例如，乙氧基化异十八烷醇、聚氧乙烯山梨醇和脱水山梨醇酯、微晶纤维素、甲醇铝和琼脂或这些物质的混合物等。
用于肠胃外注射的组合物可包含生理上可接受的无菌含水或无水溶液、分散液、悬浮液或乳液，和用于重新溶解成无菌的可注射溶液或分散液的无菌粉末。适宜的含水和非水载体、稀释剂、溶剂或赋形剂包括水、乙醇、多元醇及其适宜的混合物。
用于局部给药的本发明化合物的剂型包括软膏剂、散剂、贴剂、喷射剂和吸入剂。活性成分在无菌条件下与生理上可接受的载体及任何防腐剂、缓冲剂，或必要时可能需要的推进剂一起混合。
本发明化合物可以单独给药，或者与其他药学上可接受的化合物联合给药。
使用药物组合物时，是将安全有效量的本发明化合物适用于需要治疗的哺乳动物(如人)，其中施用时剂量为药学上认为的有效给药剂量，对于60kg体重的人而言，日给药剂量通常为1～2000mg，优选50～1000mg。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
I.化学部分
实施例1 D19-14的合成
(1)S1的合成
将硫代水杨酸甲酯(1.0mmol)和溴乙酸甲酯(1.0mmol)加入到25ml干燥的茄形瓶中，抽换氮气三次使整个体系至于氮气环境，加入4ml干燥的四氢呋喃使其混合均匀。将整个反应体系放置在冰水浴中冷却至0℃，后缓慢加入叔丁醇钠(6.0mmol)，超过2分钟。加完后，放置室温反应15min，TLC跟踪至原料转化完毕，加水淬灭后，用2M稀盐酸调至PH＝2。用乙酸乙酯萃取三次，将有机相合并后用饱和食盐水洗，后用无水硫酸钠干燥有机相。减压浓缩，得到粗品后柱层析分离纯化(石油醚：乙酸乙酯＝100:1→石油醚：乙酸乙酯＝50:1)，得到白色固体S1(产率90％)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.57(s,1H),7.94(d,J＝8.1Hz,2H),7.57(t,J＝8.2Hz,1H),7.46(t,J＝7.5Hz,1H),3.86(s,3H).
(2)S2的合成
将S1(1.0mmol)以及碳酸铯(1.5mmol)加入到25ml干燥的茄形瓶中，抽换氮气三次使整个体系至于氮气环境，加入4ml干燥的DMF使其溶解，后逐滴加入碘甲烷(1.5mmol),于室温继续反应2h，TLC跟踪至原料转化完毕，加水淬灭后用乙酸乙酯萃取将有机相合并后用饱和食盐水洗，后用无水硫酸钠干燥有机相。减压浓缩，得到粗品后柱层析分离纯化(石油醚：乙酸乙酯＝100:1→石油醚：乙酸乙酯＝50:1)得到白色固体S2(产率95％)
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.99(dt,J＝8.2,0.9Hz,1H),7.90(dt,J＝8.1,1.0Hz,1H),7.58(ddd,J＝8.2,7.0,1.3Hz,1H),7.49(ddd,J＝8.1,7.1,1.1Hz,1H),4.09(s,3H),3.86(s,3H).
(3)S3的合成
将S2(1.0mmol)加入到25ml干燥的茄形瓶中，抽换氮气三次使整个体系至于氮气环境，加入4ml干燥的四氢呋喃使其溶解，后将整个体系置于冰水浴中冷却至0℃。后逐滴加入2.5M的氢化锂铝的四氢呋喃溶液(3.0mmol)，于0℃继续反应0.5h，用TLC检测反应物转化完全。逐滴加入冰水淬灭至不再产生沉淀，后加入2M的稀盐酸至沉淀不再消失。用乙酸乙酯萃取三次，后将有机相合并，将有机相用饱和食盐水洗，后用无水硫酸钠干燥。减压浓缩，直接投下一步。第二步将上一步新制得的醇加入到25ml干燥的茄形瓶中,后加入5ml干燥的二氯甲烷使其溶解，再加入活化的二氧化锰(10.0mmol)，于室温过夜反应，用TLC检测反应物转化完全。将反应液用硅藻土过滤除去二氧化锰，后将滤液减压浓缩得到粗品后柱层析分离纯化(石油醚：乙酸乙酯＝20:1→石油醚：乙酸乙酯＝10:1)，得到淡黄色固体S3(产率72％)
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ10.37(s,1H),7.91(d,J＝8.1Hz,3H),7.76(d,J＝8.2Hz,3H),7.50(ddd,J＝8.2,7.2,1.2Hz,3H),7.39(ddd,3H),4.34(s,8H).
(4)S4的合成
加S4(1.0mmol)于干燥的25ml茄形瓶，抽换氮气三次使整个体系至于氮气环境，后加入4ml无水二氯甲烷使其溶解，将整个反应体系置于干冰丙酮浴中冷却至-78℃。逐滴加入1M的三溴化硼的二氯甲烷溶液(3.0mmol)，在-78℃反应20min后，于室温过夜反应，用TLC检测反应物转化完全。将反应液倒入冰水中至不再冒烟，后用二氯甲烷萃取三次，合并有机相。将有机相用饱和食盐水洗，后用无水硫酸钠干燥。减压浓缩，得到粗品后柱层析分离纯化(石油醚：乙酸乙酯＝10:1)得到淡黄色固体S4(产率81％)
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.76(s,1H),8.03(d,J＝8.0Hz,1H),7.78(d,J＝8.2Hz,1H),7.57(ddd,J＝8.3,7.1,1.2Hz,1H),7.47–7.42(m,1H).
(5)S5的合成
将2-氟-5-硝基苯甲醚(1.0mmol)和N-甲基-哌嗪(1.0mmol)加到25ml干燥的茄形瓶中，加入4ml干燥的二甲基亚砜使其溶解后。接着加入碳酸钾(2.0mmol)，加热至120℃反应18h，用TLC检测反应物转化完全。冷却至室温后加水，用乙酸乙酯萃取三次，合并有机相。将有机相用饱和食盐水洗，后用无水硫酸钠干燥。减压浓缩，得到粗品后柱层析分离纯化(二氯甲烷:甲醇＝100：1→二氯甲烷:甲醇＝50：1)，得到黄色固体S5(产率93％)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.86(dd,J＝8.8,2.5Hz,1H),7.71(d,J＝2.5Hz,1H),6.90(d,J＝8.8Hz,1H),3.95(s,3H),3.33–3.25(m,4H),2.69–2.64(m,4H),2.40(s,3H).
(6)S6的合成
将S5(1.0mmol)以及5％的钯碳(0.05g)加入到25ml干燥的茄形瓶中，加入10ml无水乙醇后，加热至85℃回流，再逐滴加入80％水合肼(2.34ml)，继续在85℃反应3h，用TLC检测反应物转化完全。将反应液冷却至室温，后用硅藻土过滤，将滤液中的乙醇减压蒸干。加水后用乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，将有机相用饱和食盐水洗，后用无水硫酸钠干燥。减压浓缩，得到粗品后柱层析分离纯化(二氯甲烷:甲醇＝50：1→二氯甲烷:甲醇＝20：1),得到白色固体S6(产率83％)
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ6.60(d,J＝8.3Hz,1H),6.22(d,J＝2.3Hz,1H),6.07(dd,J＝8.3,2.4Hz,1H),4.70(s,2H),3.67(s,3H),2.79(s,4H),2.42(s,3H),2.20(s,3H).
(7)S7的合成
将S6(1.0mmol)和硫氰酸钾(4.0mmol)加入到25ml干燥的茄形瓶中，加入2ml乙酸，于35℃搅拌1h使其完全溶解，后逐滴加入液溴(1.0mmol)，于是室温反应3h，TLC跟踪至原料转化完毕，停止反应。再将反应体系放入冰水浴中，逐滴加入冰氨水至PH＝10，过滤得到黄色固体S7(产率57％)
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.18(s,3H),6.93(s,1H),3.77(s,3H),2.90(s,4H),2.47(s,4H),2.23(s,3H).
(8)S8的合成
将80％水合肼(4.0mmol)加入到干燥的25ml茄形瓶中，将反应体系放置冰水浴中冷却至0℃，后逐滴加入浓盐酸(2.0mmol)，并于0℃反应10分钟后至不再产生白烟。加入2ml乙二醇以及S7(1.0mmol)，加热至150℃反应4h，用TLC检测反应物转化完全，后冷却至室温，加水有大量的淡绿色固体析出，过滤，将滤饼烘干，得到淡绿色固体S8(产率76％)
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.72(s,1H),7.21(s,1H),6.93(s,1H),4.90(s,2H),3.77(s,3H),2.90(s,4H),2.44(s,4H),2.21(s,3H).
(9)D19-14的合成
加S4(1.0mmol)和S8(1.0mmol)于25ml干燥的茄形瓶中，加入5ml无水甲醇，使其混合均匀后，在40℃加热反应5h，用TLC检测反应物转化完全。冷却至室温后，过滤得粗品，用柱层析分离(二氯甲烷:甲醇＝50：1→二氯甲烷:甲醇＝20：1)，得到黄色固体D19-14(340.2mg，产率75％)
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.65(s,1H),9.61(s,1H),8.51(s,1H),
7.88–7.80(m,2H),7.43–7.35(m,3H),7.06(s,1H),3.84(s,3H),3.55–3.39(m,4H),3.22(q,J＝10.1Hz,2H),2.96–2.85(m,5H).
实施例2 D19-20的合成
(1)S9的合成
将氢化钠(1.1mmol)加入到25ml干燥的茄形瓶中，抽换氮气三次使整个体系至于氮气环境，加入1ml干燥的DMF使其溶解。将2-氯烟酸乙酯(1.0mmol)溶解于1ml干燥的DMF中,将混合溶液逐滴加入到茄形瓶当中，再逐滴加入巯基乙酸甲酯(1.0mmol),加热至65℃反应3h,TLC跟踪至原料转化完毕，加水淬灭后用乙酸乙酯萃取将有机相合并后用饱和食盐水洗，后用无水硫酸钠干燥有机相。减压浓缩，得到粗品后柱层析分离纯化(石油醚：乙酸乙酯＝20:1→石油醚：乙酸乙酯＝10:1)得到S9(产率65％)
1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ8.52(dd,J＝4.7,1.8Hz,1H),8.25(dd,J＝7.8,1.8Hz,1H),7.09(dd,J＝7.8,4.7Hz,1H),4.41(q,J＝7.2Hz,2H),3.93(s,2H),3.73(s,3H),1.42(td,J＝7.1,2.9Hz,3H).
(2)S10的合成
将S9(1mmol)加入到25ml干燥的茄形瓶中，抽换氮气三次使整个体系至于氮气环境，加入5ml无水甲醇使其溶解。后加入甲醇钠(5mmol)，加热至65℃反应1h,TLC跟踪至原料转化完毕，冷却至室温，加水淬灭。后用乙酸乙酯萃取将有机相合并后用饱和食盐水洗，后用无水硫酸钠干燥有机相。减压浓缩，得到粗品后柱层析分离纯化(石油醚：乙酸乙酯＝10:1)，得到S10(产率81％)
1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ10.19(s,1H),8.73(dd,J＝4.6,1.7Hz,1H),8.22(dd,J＝8.1,1.7Hz,1H),7.37(dd,J＝8.1,4.6Hz,1H),3.98(s,3H).
(3)S11的合成
将S10(1.0mmol)以及碳酸铯(1.5mmol)加入到25ml干燥的茄形瓶中，抽换氮气三次使整个体系至于氮气环境，加入4ml干燥的DMF使其溶解，后逐滴加入碘甲烷(1.5mmol),于室温继续反应3h,TLC跟踪至原料转化完毕，加水淬灭后用乙酸乙酯萃取将有机相合并后用饱和食盐水洗，后用无水硫酸钠干燥有机相。减压浓缩，得到粗品后柱层析分离纯化(石油醚：乙酸乙酯＝10:1)得到S11(产率95％)。
(4)S12的合成
将S11(1.0mmol)加入到25ml干燥的茄形瓶中，抽换氮气三次使整个体系至于氮气环境，加入4ml干燥的四氢呋喃使其溶解，后将整个体系置于冰水浴中冷却至0℃。后逐滴加入2.5M的氢化锂铝的四氢呋喃溶液(3.0mmol)，于0℃继续反应0.5h，用TLC检测反应物转化完全,逐滴加入冰水淬灭至不再产生沉淀，直接过滤后将滤液用无水硫酸钠干燥后，减压浓缩，直接投下一步。第二步将上一步新制得的醇加入到25ml干燥的茄形瓶中,后加入5ml干燥的二氯甲烷使其溶解，再加入活化的二氧化锰(10.0mmol)，于室温过夜反应，用TLC检测反应物转化完全。将反应液用硅藻土过滤除去二氧化锰，后将滤液减压浓缩得到粗品后柱层析分离纯化(石油醚：乙酸乙酯＝4:1)，得到淡黄色固体S12(产率72％)
1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ10.42(s,1H),8.72(dd,J＝4.6,1.7Hz,1H),8.19(dd,J＝8.2,1.7Hz,1H),7.36(dd,J＝8.2,4.6Hz,1H),4.36(s,3H).
(5)S13的合成
加S12(1.0mmol)于干燥的25ml茄形瓶，抽换氮气三次使整个体系至于氮气环境，后加入4ml无水二氯甲烷使其溶解，将整个反应体系置于干冰丙酮浴中冷却至-78℃。逐滴加入1M的三溴化硼的二氯甲烷溶液(3.0mmol)，在-78℃反应20min后，于室温过夜反应，用TLC检测反应物转化完全。将反应液倒入冰水中至不再冒烟，后用二氯甲烷萃取三次，合并有机相。将有机相用饱和食盐水洗，后用无水硫酸钠干燥。减压浓缩，得到粗品后柱层析分离纯化(石油醚：乙酸乙酯＝10:1)得到淡黄色固体S13(产率76％)
(6)S14的合成
将80％水合肼(4.0mmol)加入到干燥的25ml茄形瓶中，将反应体系放置冰水浴中冷却至0℃，后逐滴加入浓盐酸(2.0mmol)，并于0℃反应10分钟后至不再产生白烟。加入2ml乙二醇以及2-氨基苯并噻唑(1.0mmol)，加热至150℃反应4h，用TLC检测反应物转化完全，后冷却至室温，加水有大量的白色固体析出，过滤，将滤饼烘干，得到白色固体S14(82％)
1H NMR(400MHz,DMSO)δ8.99(s,1H),8.99(s,1H),7.67(d,J＝7.7Hz,1H),7.31(d,J＝7.9Hz,1H),7.20(m,1H),6.98(t,J＝7.5Hz,1H),5.01(s,2H).
(7)D19-20的合成
加S13(1.0mmol)和S14(1.0mmol)于25ml干燥的茄形瓶中，加入5ml无水甲醇，使其混合均匀后，在40℃加热反应5h，用TLC检测反应物转化完全。冷却至室温后，过滤得粗品，用柱层析分离(二氯甲烷:甲醇＝100：1)，得到黄色固体D19-20(产率86％)
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.41(s,1H),10.98(s,1H),8.56(dd,J＝4.7,1.6Hz,1H),8.22(dd,J＝8.1,1.6Hz,1H),7.77(s,1H),7.42(dd,J＝8.1,4.7Hz,1H),7.30(d,J＝7.7Hz,1H),7.10(s,1H).
实施例3 D19-21的合成
(1)S15的合成
将3-氨基-2-氯吡啶(1.0mmol)加入到25ml干燥的三颈瓶中，抽换氮气三次使整个体系至于氮气环境，加入浓盐酸(1.28ml)，再加入硫腈酸钾(2.0mmol)，将反应体系加热至100℃反应4h，TLC跟踪至原料转化完毕。冷却后加入饱和碳酸氢钠水溶液，调PH至8。有固体析出，过滤并将滤饼用水洗3次，烘干得到黄色固体S15(产率92％)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.08(dd,J＝4.8,1.5Hz,1H),7.79(s,2H),7.61(dd,J＝8.0,1.5Hz,1H),7.23(dd,J＝8.0,4.8Hz,1H).
(2)S16的合成
将80％水合肼(4.0mmol)加入到干燥的25ml茄形瓶中，将反应体系放置冰水浴中冷却至0℃，后逐滴加入浓盐酸(2.0mmol)，并于0℃反应10分钟后至不再产生白烟。加入2ml乙二醇以及S15(1.0mmol)，加热至150℃反应4h，用TLC检测反应物转化完全，后冷却至室温，加水有大量的灰的固体析出，过滤，将滤饼烘干，得到S16(产率76％)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.34(s,1H),8.06(dd,J＝4.7,1.5Hz,1H),7.58(dd,J＝8.1,1.5Hz,1H),7.22(dd,J＝8.1,4.8Hz,1H),5.13(s,2H).
(3)D19-21的合成
加S4(1.0mmol)和S16(1.0mmol)于25ml干燥的茄形瓶中，加入5ml无水甲醇，使其混合均匀后，在40℃加热反应5h，用TLC检测反应物转化完全。冷却至室温后，过滤得粗品，用柱层析分离(二氯甲烷:甲醇＝100：1)，得到黄色固体D19-21(产率94％)
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.56(s,1H),10.79(s,1H),8.59(s,1H),8.20(s,1H),7.98–7.70(m,2H),7.53–7.27(m,4H).
实施例4 D19-30的合成
(1)S17的合成
将2-氯-苯并噻唑(1.0mmol)加入到干燥的25ml茄形瓶中，加入2ml无水乙醇，后逐滴加40％甲基肼(4.0mmol)，置换成N2环境后，于75℃反应4h后，用TLC检测反应完全，冷却至室温后加水后用乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，将有机相用饱和食盐水洗，后用无水硫酸钠干燥。减压浓缩，得到粗品后柱层析分离纯化(石油醚：乙酸乙酯＝4:1)得白色固体S17(产率82％)
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.66(dd,J＝7.8,1.4Hz,1H),7.36(dd,J＝8.1,1.1Hz,1H),7.20(ddd,J＝8.1,7.2,1.3Hz,1H),6.98(td,J＝7.5,1.2Hz,1H),5.39(s,2H),3.31(s,3H).
(2)D19-30的合成
加S4(1.0mmol)和S17(1.0mmol)于25ml干燥的茄形瓶中，加入5ml无水甲醇，使其混合均匀后，在40℃加热反应5h，用TLC检测反应物转化完全。冷却至室温后，过滤得粗品，用柱层析分离(二氯甲烷:甲醇＝200：1)，得到淡黄色固体D19-30(产率85％)
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.78(s,1H),8.41(s,1H),7.84(d,J＝7.6Hz,3H),7.58(d,J＝8.0Hz,1H),7.50–7.28(m,3H),7.15(t,J＝7.6Hz,1H),3.72(s,3H).
下表中化合物采用相应的起始原料，通过与实施例1-5中类似的方法合成。抑制率通过生物实验(b)中描述的方法进行，得各个化合物的抑制率如下表：
Ⅱ.生物学实验
(a)35S同位素标记cIAP1体外泛素化实验
使用Quick Coupled Transcription/Translation Systems(Promega)试剂盒得到了35S-标记的cIAP1。将1μL的35S-cIAP1与2μg的GST-cIAP1蛋白稀释于反应缓冲液(50mM Tris-HCl[pH 7.4],5mM MgCl2,2mM NaF,2mM ATP,and 0.6mMDTT)中，在与不同浓度的化合物D19在室温孵育30分钟后，在反应体系中加入E1(50ng),UbcH5b(250ng),ub(6μg)继续反应1小时，通过SDS-PAGE检测cIAP1泛素化水平。实验结果如图1中所述，结果表明，随着D19作用浓度的升高，cIAP1自泛素化水平逐渐降低，证明了D19能够有效的抑制cIAP1做为E3连接酶调节的泛素化过程。
(b)通过免疫印迹考察化合物对于cIAP1泛素化的抑制
通过药物化学的方法对D19进行优化，我们得到了一系列D19类似物。我们通过考察化合物对于cIAP1泛素化的抑制情况分析化合物的活性。我们将GST-cIAP 1△BIR1△BIR2蛋白(1μg)稀释于反应缓冲液(50mM Tris-HCl[pH 7.4],5mM MgCl2，2mM NaF，2mMATP，and 0.6mM DTT)中，并将其与化合物(50μM)孵育30分钟，随后在反应体系中加入E1(25ng)，UbcH5b(125ng)，ub(3μg)于37℃反应30分钟。于反应体系中加入loading buffer来终止反应，通过SDS-PAGE电泳分离产物后，并转至PVDF膜(Millipore,Bedford,MA,USA)。膜用5％脱脂奶粉室温封闭一小时后，与Ubiquitin antibody(#3933,CST)于4℃过夜孵育。与二抗孵育后，利用ECL Western Blotting Substrate(31206，Pierce)显影，并用Image J分析数据，通过分析化合物对cIAP 1△BIR1△BIR2自泛素化过程的抑制率，筛选高效的D19类似物。部分测试结果如图2中所述，各个化合物在50μM下对于cIAP1泛素化的抑制率如上表中所述。
(c)差示扫描荧光(differential scanning fluorimetry,DSF)实验
差示扫描荧光(differential scanning fluorimetry,DSF)广泛用于研究蛋白质和配体相互作用。在大肠杆菌体系中表达和纯化纯化蛋白GST，GST-UbcH5b，GST-cIAP1-ΔBIR1/2。用analysis buffer(150mM NaCl,100mTris,pH 7.5)分别稀释反应体系各组分，加入96孔板中，并在每孔加入相应蛋白(5μM),10X SYPROorange Protein Gel Stain(S6650,Invitrogen)和不同浓度的化合物，每组实验三个重复。在RT-PCR仪上，先25℃维持2min，再以1℃/min的速率升温至95℃，最后于95℃维持10min。通过Protein Thermal Shiftsoftware(Thermo Fisher)来分析化合物处理对蛋白质Tm的影响。结果如图3中所示，实验表明，D19对GST和UbcH5b的Tm值没有显著影响，但是会明显提高cIAP1-ΔBIR1/2的Tm值，且其ΔTm变化依赖于D19作用浓度，说明D19能够和cIAP1直接结合。
(d)BLI(BioLayer Interferometry)实验
基于光纤生物传感器的生物膜层光学干涉技术(BLI,BioLayer Interferometry)广泛用于分析生物分子之间的相互作用和药物筛选。将Streptavidin biosensors浸泡在assay buffer(PBS，0.1％DMSO)中浸润，再用assay buffer和PBS分别稀释蛋白和化合物，并于96孔板中每孔分别加入200ul生物素化的cIAP1-RING蛋白(50μg/mL)，assay buffer和不同浓度的D19(48μM,24μM,12μM,6μM,3μM,1.5μM)，最后将96孔板放入BLI Octet RED96(Menlo Park,CA)仪器中反应，设置反应程序：Streptavidin biosensors先与蛋白孵育6min，作为对照，一组Streptavidin biosensors与assay buffer孵育；之后与D19结合200秒，最后解离240秒。通过OctetRED analysissoftware分析数据，结果如图4中所示。结果显示随着D19作用浓度的升高，cIAP1-RING和D19结合增强，表明D19结合于cIAP1的RING结构域。
(e)D19对MYC/MAX/MAD网络蛋白水平的影响
用不同浓度的D19(0μM,5μM,10μM,25μM,50μM)处理H1299细胞4小时，随后用RIPA裂解液(P0013B,Beyotime)裂解细胞,离心收集上清并通过SDS-PAGE分离蛋白，并转至PVDF(Millipore,Bedford,MA,USA)膜，膜用5％(m/v)脱脂奶粉于室温封闭1小时，然后加入相应的一抗4℃过夜孵育，所用的抗体为c-MYC(sc-40,Santa Cruz)，MAD1(ab80259,Abcam)，MAX(sc-197,Santa Cruz)和GAPDH(60004-1-Ig,Proteintech)，二抗孵育后，利用ECL WesternBlotting Substrate(31206，Pierce)显影。结果如图5中所示，实验结果表明随着D19作用浓度的升高，c-MYC蛋白水平下降，MAD1蛋白水平上升，而MAX蛋白水平不变，证明D19调控MYC/MAX/MAD网络蛋白水平。
(f)D19促进c-MYC的泛素化降解
H1299细胞用MG132(20μM)或DMSO(作为对照)处理2小时后，再分别用D19(0μM,25μM,50μM)继续处理4小时。按照DynabeadsTMProtein G for Immunoprecipitation Kit(10003D,Invitrogen)说明书，将anti-c-MYC(ab56,Abcam)抗体与Protein G偶联。用celllysis buffer for Western and IP(P0013J,Beyotime)裂解细胞，收集并离心收上清。取部分上清加入loading buffer做为细胞裂解液，其余上清与已偶联抗体的Protein G于4℃孵育3小时后，用裂解液洗去未结合的杂蛋白，然后加入loading buffer得到免疫沉淀样品。细胞裂解液和免疫沉淀样品通过western blotting分析化合物处理后c-MYC蛋白水平和泛素化水平。结果如图6中所示，结果表明，D19处理后，c-MYC蛋白水平下降，泛素化程度升高，证明了D19促进c-MYC的泛素化降解。
(g)D19抑制cIAP1调控的MAD1的泛素化降解
用D19(25μM)或者DMSO处理过表达Flag-MAD1和Myc-cIAP1或cIAP1-H588A的HEK293细胞12小时，然后加入MG132(10μM)继续处理4小时。用cell lysis buffer forWestern and IP(P0013J,Beyotime)裂解细胞，收集并离心收上清。取部分上清加入loading buffer制得细胞裂解液，其余上清与M2 Affinity Gel(A2220,Sigma-Aldrich)孵育3小时后，用裂解液洗去未结合的杂蛋白，然后加入loading buffer得到免疫沉淀样品。细胞裂解液和免疫沉淀样品通过western blotting分析化合物处理后MAD1蛋白水平和泛素化水平。结果如图7中所示，结果表明D19处理后，MAD1蛋白水平提高，且cIAP1调控的MAD1泛素化程度下降。证明了D19抑制cIAP1调控的MAD1的泛素化降解。
(h)细胞克隆形成实验
构建了稳定表达MYC/cIAP1的NIH3T3细胞系，对照为稳定表达空载体的NIH3T3细胞系。我们在6孔板每孔加入2ml含有1％琼脂的培养基，待其凝固后，将细胞重悬于含有0.35％琼脂以及不同浓度D19(0μM,5μM,10μM,20μM)的培养基中，在每个孔中加入5×103个细胞，然后将孔板置于细胞培养箱中生长3周，并每两天补充含有不同浓度化合物的培养基，通过结晶紫染色以及Gel Imager(Bio-Rad)拍照观察细胞克隆形成情况。结果如图8中所示，结果表明，随着D19作用浓度的升高，实验组和对照组克隆数目逐渐减少，证明了抑制c-MYC/cIAP1协同诱发的细胞克隆的形成，且依赖于D19作用浓度。
(i)EdU嵌入实验
用DMSO或D19(20μM,40μM)分别处理H1299细胞，24小时后,使用Click-iTTMEdUAlexa FluorTM488Flow Cytometry Assay Kit(C10425,Invitrogen)试剂盒染色，并用显微镜观察拍照分析D19对细胞周期的影响。结果如图9中所示，实验结果表明随着D19作用浓度的升高，嵌入EdU的细胞比例逐渐降低，证明D19抑制细胞周期过程中DNA合成。
(j)D19-14促进肿瘤细胞中c-MYC蛋白水平下降
用不同浓度的D19或者D19-14(0μM,5μM,10μM,25μM,50μM)处理EOL1,MOLM13,MOLT4,MV4；11细胞4小时.用RIPA裂解液(P0013B,Beyotime)裂解细胞,离心收集上清并通过SDS-PAGE分离蛋白，并转至PVDF(Millipore,Bedford,MA,USA)膜。膜用5％(m/v)脱脂奶粉于室温封闭1小时，然后加入相应的一抗4℃过夜孵育。所用的抗体为c-MYC(sc-40,SantaCruz)和GAPDH(60004-1-Ig,Proteintech)。实验结果如图10中所示，结果表明，与D19相比，D19-14在较低的浓度就能有效的下调肿瘤细胞中c-MYC蛋白水平，证明了D19-14有较好的活性。
(k)细胞存活实验
我们将EOL1和MOLT4细胞(3000cells/孔，100μL培养基/孔)种于96孔板(Coming,Cat#3903)，细胞过夜生长后，我们不同浓度的D19或者D19-14(100μM,50μM,25μM,12.5μM,6.25μM,3.12μM,1.56μM,0.78μM,0.39μM)处理细胞48小时，随后通过CellTitler-Glo(promega)读取荧光值检测细胞活性。每组实验3个重复，数据通过GraphPad Prism5软件进行分析。实验结果如图11中所示，结果表明，与D19相比，D19-14能够更好的抑制肿瘤细胞的增殖，证明了D19-14有较好的活性。
(l)小鼠肿瘤模型实验
从LCanimal facility购买6-8周的雌性Balb/c裸鼠。收集EOL1细胞并重悬于0.1ml matrigel basement membrane matrix(BD Biosciences)/PBS(1:1)中，以5×106cells/mouse的密度皮下接种到雌性Balb/c裸鼠。将D19-14溶解于实验缓冲液(PEG300:Solutol HS 15:pH4.65acetate buffer(10:10:80))中。当小鼠的肿瘤体积达到195mm3时，被随机分配并腹腔注射D19-14(50mg/kg,10ml/kg bodyweight)(n＝10)或者缓冲液中(n＝10)。每周检测两次肿瘤体积，通过公式肿瘤体积＝(长×宽×宽)/2来计算肿瘤体积。其中T/C表示处理组和对照组平均肿瘤体积大小的比值。实验结果如图12所示，结果表明，D19-14处理组肿瘤的体积明显小于对照组，证明了D19-14能有效的抑制肿瘤的生长。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种如下式I所示的化合物，及其外消旋体、R-异构体、S-异构体、可药用的盐或它们混合物：
其中，
环A为取代或未取代的5-12元的芳环，或取代或未取代的5-12元的杂芳环；
环B为取代或未取代的5-12元的杂芳环；
R1选自下组：H、C1-C4烷基；
所述的芳环或杂芳环的取代基选自下组：-OH、卤素、或取代或未取代的选自下组的基团：C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、C2-C6烯基、C1-C6烷氧基、-O-(C1-C6烷基)-C1-C6烷氧基、C2-C6炔基、C3-C10环烷基、C3-C10环烯基、(C2-10)烷氧羰基、(C3-12)环烷基、3-12元杂环基、芳基(C1-10)烷基、(C9-12)双环芳基、杂(C4-12)双环芳基、羰基(C1-3)烷基、硫代羰基(C1-3)烷基、磺酰基(C1-3)烷基、亚磺酰基(C1-3)烷基、亚氨基(C1-3)烷基、氨基、氰基、C6-C12芳基、3-12元杂芳基、C6-C12芳氧基、3-12元杂芳氧基、磺酰基、亚磺酰基、-NHCOR、或-CONHR；或分别连接于相邻环原子的两个取代基与其相连的环原子共同构成取代或未取代的选自下组的环：C3-C8碳环，或5-8元杂环；
所述的取代指基团上的一个或多个氢原子被选自下组的取代基取代：氨基、氰基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、卤素、C1-C6卤代烷基、羰基(C2-10)烷氧基、羰基(C7-10)芳氧基、酰胺基(C2-10)烷基、未取代或被1-3个选自下组的取代基取代的C6-C12芳基或3-12元杂环基：卤素、未取代或卤代的C1-C6烷基、C1-C6烷氧基；
且所述的化合物不为以下结构：
2.如权利要求1所述的化合物，及其外消旋体、R-异构体、S-异构体、可药用的盐或它们混合物，其特征在于，所述的式I化合物具有如下式II所示的结构：
其中，A1、A2、A3、A4、A5、A6、B1、B2、B3、B4、B5、B6各自独立地选自下组：C(R)2、CR、C、NR、N、O或S；
R选自下组：H、-OH、卤素、或取代或未取代的选自下组的基团：C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、C2-C6烯基、C1-C6烷氧基、-O-(C1-C6烷基)-C1-C6烷氧基、C2-C6炔基、C3-C10环烷基、C3-C10环烯基、(C2-10)烷氧羰基、(C3-12)环烷基、3-12元杂环基、芳基(C1-10)烷基、(C9-12)双环芳基、杂(C4-12)双环芳基、羰基(C1-3)烷基、硫代羰基(C1-3)烷基、磺酰基(C1-3)烷基、亚磺酰基(C1-3)烷基、亚氨基(C1-3)烷基、氨基、氰基、C6-C12芳基、3-12元杂芳基、C6-C12芳氧基、3-12元杂芳氧基、磺酰基、亚磺酰基、-NHCOR、或-CONHR；或分别连接于相邻环原子的两个R与其相连的环原子共同构成取代或未取代的选自下组的环：C3-C8碳环，或5-8元杂环；
R1选自下组：H、C1-C4烷基；
所述的取代指基团上的一个或多个氢原子被选自下组的取代基取代：氨基、氰基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、卤素、C1-C6卤代烷基、羰基(C2-10)烷氧基、羰基(C7-10)芳氧基、酰胺基(C2-10)烷基、未取代或被1-3个选自下组的取代基取代的C6-C12芳基或3-12元杂环基：卤素、未取代或卤代的C1-C6烷基、C1-C6烷氧基。
3.如权利要求1所述的化合物，及其外消旋体、R-异构体、S-异构体、可药用的盐或它们混合物，其特征在于，所述的A5、B6各自独立地选自NR、O或S；A6、B5各自独立地选自CR或N。
4.如权利要求1所述的化合物，及其外消旋体、R-异构体、S-异构体、可药用的盐或它们混合物，其特征在于，所述的式I化合物具有如下式所示的结构：
5.如权利要求1所述的化合物，及其外消旋体、R-异构体、S-异构体、可药用的盐或它们混合物，其特征在于，所述的化合物选自下组：
6.一种药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物包括：(a)如权利要求1-5任一所述的式I化合物，或其外消旋体、R-异构体、S-异构体、可药用的盐或它们混合物，和(b)药学上可接受的载体。
7.如权利要求6所述的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物还包括(c)第二放疗或化疗药物。
8.如权利要求6所述的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物用于治疗或预防肿瘤。
9.一种如下式I所述的化合物，及其外消旋体、R-异构体、S-异构体、可药用的盐或它们混合物的用途：
其中，
环A为取代或未取代的5-12元的芳环，或取代或未取代的5-12元的杂芳环；
环B为取代或未取代的5-12元的杂芳环；
除非特别说明，所述的取代指基团上的一个或多个氢原子被选自下组的取代基取代：-OH、卤素、或取代或未取代的选自下组的基团：C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、C2-C6烯基、C1-C6烷氧基、-O-(C1-C6烷基)-C1-C6烷氧基、C2-C6炔基、C3-C10环烷基、C3-C10环烯基、(C2-10)烷氧羰基、(C3-12)环烷基、3-12元杂环基、芳基(C1-10)烷基、(C9-12)双环芳基、杂(C4-12)双环芳基、羰基(C1-3)烷基、硫代羰基(C1-3)烷基、磺酰基(C1-3)烷基、亚磺酰基(C1-3)烷基、亚氨基(C1-3)烷基、氨基、氰基、C6-C12芳基、3-12元杂芳基、C6-C12芳氧基、3-12元杂芳氧基、磺酰基、亚磺酰基、-NHCOR、或-CONHR；或分别连接于相邻环原子的两个取代基与其相连的环原子共同构成取代或未取代的选自下组的环：C3-C8碳环，或5-8元杂环；
所述的取代指基团上的一个或多个氢原子被选自下组的取代基取代：氨基、氰基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、卤素、C1-C6卤代烷基、羰基(C2-10)烷氧基、羰基(C7-10)芳氧基、酰胺基(C2-10)烷基、未取代或被1-3个选自下组的取代基取代的C6-C12芳基或3-12元杂环基：卤素、未取代或卤代的C1-C6烷基、C1-C6烷氧基；
其特征在于，用于：(1)制备治疗或预防肿瘤的药物组合物；(2)制备cIAP1抑制剂；(3)制备c-MYC的泛素化降解促进剂。
10.如权利要求9所述的用途，其特征在于，所述的药物组合物用于治疗或预防选自下组的肿瘤：乳腺癌、肺癌、肝癌、胃癌、胰腺癌、结肠癌、前列腺癌、头颈癌、血液肿瘤(优选为c-MYC或cIAP1/2基因高表达的肿瘤以及对受体酪氨酸激酶(包括EGFR、FGFR、PDGFR、VEGFR等)抑制剂、RAF抑制剂、ERK抑制剂、PI3K抑制剂等靶点药物耐受的肿瘤)。
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