CN110088590B - 用于破裂组织的装置 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及适于使用机械分离破裂组织的装置;以及所述装置针对所述目的的应用。该装置包括具有螺纹的细长轴和具有至少一个孔口的非移动套管。
Description
技术领域
本发明涉及适于使用机械提取来破裂来自样本的组织的装置;以及所述装置针对所述目的的应用。
背景技术
可用于当今使用的许多细胞疗法包括诸如干细胞的特定组织类型的使用。这些细胞用于若干技术中,但在个体化或再生医学中特别重要。这些细胞的使用通常需要它们与较大的样本、或器官、或器官的一部分分离。在传统上使用酶消化分离组织时,这可能是缓慢、攻击性且不加区别的。例如,已知使用胶原酶或其他离解酶来分解细胞外基质,然后进行离心分离,以分离提取物的成分。然而,标定胶原酶的量使得刚好足以用于在保留目标组织完整和全功能的同时破裂细胞外基质更大程度上是一门艺术而不是科学,并且受被治疗的组织的年龄及其结构成分和这些成分的相对量影响。而且,任务由于以下事实而更复杂:离解酶的活性随着时间的过去甚至从批次到批次劣化,因此每当执行酶消化时,需要进行活性酶的仔细预标定。由于所有这些变数,诊断结果经常多变是不足为奇的。
细胞可以与若干组织类型分离,例如,胰岛可以与胰腺分离,来自心脏的肌细胞可以与来自骨髓的干细胞分离,口腔黏膜可以与脂肪组织分离,仅举几个例子。然而,必须确保分离的细胞类型保持它们的固有功能,该功能在干细胞的情况下是增殖并产生诸如骨骼、软骨、肌肉、神经、内分泌、上皮细胞以及内皮的多个组织类型的能力。另外,干细胞或祖细胞的源也用于产生诱导多能性干细胞。
因此,如果细胞的分离要成功,则它们必须产生功能提取物,因此,防止细胞损伤的分离方法受到青睐。为此,我们在这里提出了一种有利于功能细胞类型的分离且特别有利于干细胞或祖细胞的分离的机械提取的形式。
发明内容
因此,根据本发明的第一方面,提供了一种用于破裂组织的装置,其中,所述装置包括:第一移动部,该第一移动部为细长轴的形式,该细长轴附接有或关联有至少一个连续或不连续的螺旋带/螺纹;和第二非移动部,该第二非移动部为套管的形式,该套管适于安装在所述轴上,并且具有至少一个细长孔口,该至少一个细长孔口与所述轴的纵轴线对齐,并且在远离组织接触端的端部处更宽。
在本发明的优选实施方式中,所述移动部包括马达,理想地包括转子。更优选地,所述移动部包括手柄或座架,所述装置能够在操作的同时经由手柄或座架保持。
仍然更优选地,设置多于一个所述带/螺纹:第一带/螺纹和第二带/螺纹,并且它们源于所述套管的相对部分,通常它们关于所述套管的直径180°隔开,并且它们沿着所述轴的下部在同一方向延伸,但在一些实施方式中,两个带/螺纹可以源于所述轴上的不同位置且实际上终止在不同位置处。
在这里被称为螺旋带的组成部分借助于规律隔开的杆连接到中心轴,例如本发明当前每90°转的螺纹具有一个连接杆,但对于一些构造,可以优选其他间隔。这里被称为螺纹的组成部分通常被塑造或挖掘为轴的结构。
在又一个实施方式中,在所述轴的上部设置第三带/螺纹,并且其旋转方向与其他第一和/或第二带/螺纹的旋转方向相反。由此,理想地,关于所述装置的使用,所述轴的下部或下半部设置有至少一个第一螺旋带/螺纹,并且在一些实施方式中为设置有第二螺旋带/螺纹,并且在设置第三螺旋带/螺纹的情况下,它附接到或形成在所述轴的上部或上半部上。
由此,在本发明的优选结构中,具有3个螺旋带或螺纹:沿同一方向延伸但起源相隔180°的两个下螺旋带或螺纹、和沿相反方向延伸的一个上螺旋带或螺纹。
仍然更理想地,所述带或螺纹是连续的,由此,第一或第二带/螺纹沿第一方向连续或不间断地旋转,并且第三带/螺纹沿第二方向连续或不间断地旋转。
仍然更优选地,螺旋带/螺纹的角结构如从水平面测量的在20°至88°的范围内。优选角结构在40°至80°的范围内,仍然更优选地,角结构在50°至60°的范围内。
仍然更有利地,带/螺纹的深度小于套管直径的40%,并且更优选地为小于套管直径的30%。
仍然更优选地,所述套管包括多个孔口。通常但不唯一地,每个套管圆周包括2至12个孔口,仍然更理想地,每近似4cm的套管包括4个孔口,但本领域技术人员将理解,孔口的数量可以根据要求而变化,此外,理想地,所述孔口围绕所述套管均匀隔开。
在优选实施方式中,所述或每个孔口包括狭缝,该狭缝的尺寸在远离所述组织接触端的端部处扩张,理想地,以形成部分圆形形状。
然而,在其他实施方式中,所述孔口包括尺寸在远离所述组织接触端的所述端部处扩张的不连续的狭缝。
优选地,所述孔口的扩张部分与所述第一和/或第二螺纹的上端部对齐,或与所述第一与第三螺纹之间的接合点对齐。
仍然更优选地,所述马达和/或转子设置在套管内。
在特别优选的实施方式中,细长轴的下或组织接触区域没有任何附接或关联的螺纹,并且通常为托架的细长构件设置在所述轴或所述套管二者之一上,借此,细长轴自由旋转但由所述托架相对横向限制,从而,维持第一移动部在组织离解过程期间相对于装置的第二非移动部的对齐。更理想地,套管的下或组织接触端包括具有孔口的托架,该孔口与细长轴的纵轴线对齐或同心,并且被构造为容纳细长轴的末端部区域。在该实施方式中,提高组织离解过程的再现性和装置的性能。在备选实施方式中,细长轴的所述下或组织接触区域没有任何附接或关联的螺纹,并且托架或裙构件设置在该区域上,具有尺寸和形状,使得在它与套管之间设置间隙,从而,细长轴自由旋转,但受在所述托架或裙构件和所述套管之间设置的间隙相对横向限制。
在应用中,装置手动或通过使用传统座架保持稳定,并且启动转子,从而,轴由此经由其螺纹旋转,产生破裂组织连接的搅拌器。进一步地,有孔口的外套管的使用确保沿着所述第一和/或带/螺纹行进或上升的已破裂组织经由所述一个或多个孔口且理想地在其扩张端部处从所述装置喷射。相对于所述第一和/或第二带/螺纹沿相反方向旋转且终止于所述孔口的所述扩张部分处或附近的第三可选上带/螺纹的使用确保已破裂组织不沿着所述轴的整个长度行进,而是被引导为离开通常与所述孔口的扩张部分对齐的、两个相对缠绕的第一/第三螺纹相遇的位置。
根据本发明的第二方面,提供了一种用于破裂组织的方法,该方法包括组成部分要机械分离的所选组织样本和前述装置的使用。
在优选方法中,所述组织悬浮在具有或没有添加剂的生物相容性流体(例如,生理盐水、具有或没有钙和镁的汉克(Hank)平衡盐溶液、具有或没有钙和镁的磷酸盐缓冲盐溶液、林格(Ringer)溶液、乳酸盐林格溶液、哈特曼(Hartmann)溶液)中,这些添加剂是生物相容性的/临床批准的赋形剂/试剂,包括但不限于:聚乙二醇、聚乙烯醇、蔗糖、白蛋白、氨基酸、丙酮酸(单独或组合),以便增加所获得的完整活细胞的数量。
在优选方法中,所述装置的转速在100至10000转每分钟的范围内。而且,旋转的持续时间在从10秒至10分钟的范围内。
在本发明的附接的权利要求中以及在之前的描述中,除了上下文由于表述语言或必要含义而需要其它含义之外,词语“包括”或变体被在包括的意义上使用(即,被用于指定所陈述特征的存在,但不排除在本发明各种实施方式中的另外特征的存在或增加)。
本发明的各方面的优选特征可以关于其他方面中的任意一个来描述。
本发明的其他特征将从以下示例变得明显。一般而言,本发明扩展到本说明书(包括所附权利要求和附图)中公开的特征的任意新型特征或任意新型组合。由此,关于本发明的特定方面、实施方式或示例描述的特征、整数、特性、化合物或化学部分应被理解为适于这里描述的任意其他方面、实施方式或示例,除非与其不可兼容。
此外,除非另外陈述,否则这里公开的任意特征可以被服务相同或类似目的的另选特征代替。
附图说明
现在将仅参照附图用示例的方式来描述本发明的实施方式,附图中:
图1示出了根据本发明的第一移动部的侧视图;
图2示出了根据本发明的第一移动部的倾斜侧视图;
图3示出了根据本发明的第一移动部的底视图,该第一移动部具有第一和第二螺纹;
图4示出了根据本发明的优选实施方式的第一移动部的侧视图,该第一移动部具有第一、第二以及第三螺纹,其中,第一(下)螺纹和第二(下)螺纹的旋转方向与第三螺纹的旋转方向相反;
图5示出了图4所示的第一移动部的倾斜侧视图;
图6示出了根据本发明的一个实施方式的第二非移动部或套管的倾斜侧视图;
图7示出了图6所示的套管的直立侧视图;
图8示出了图6和图7所示的套管的底视图和顶视图;
图9示出了根据本发明的优选实施方式的第一移动部的侧视图,该第一移动部具有第一、第二以及第三螺纹,其中,第一(下)螺纹和第二(下)螺纹的旋转方向与第三(上)螺纹的旋转方向相反,并且其中,细长轴的下或组织接触末端部区域没有任何附接或关联螺纹;
图10示出了适于结合图9所示的第一移动部使用的套管的直立侧视图,其中,套管的下或组织接触端还包括具有开口的托架,该开口与细长轴的纵轴线对齐或同心,并且被构造为容纳细长轴的末端部区域;以及
图11是图10所示的套管的倾斜侧视图。
具体实施方式
首先参照图1,示出了装置的分解图,其中,已经从其外套管去除内移动部。附接到中心轴或与其一体的,设置了至少一个第一螺旋带,该至少一个第一螺旋带沿着所述轴的一部分缠绕,理想地,它沿着近似构成所述轴的长度的一半的下部缠绕。螺纹在制造期间使用横撑/杆连接到所述轴或与其一体制成。撑杆有规律地隔开,例如,我们当前每90°转动的带具有一个连接撑杆/杆。如从水平面测量的,螺旋的角结构范围从20°至88°(理想地为40°至80°或50°至60°)的。螺旋带的通道深度小于下面描述的外静态套管的直径的40%,理想地小于30%。在特定实施方式中,设置第二下螺旋带,并且它理想地与所述第一螺旋带隔开180°,即,它考虑到所述第一螺旋带而起源于所述套管的相对侧上,但它沿相同方向延伸。
这里被称为螺旋带的组成部分可以采取在中心轴中形成的螺纹的形式。
在图4中,示出了包括第三螺旋带的可选特征,该第三螺旋带也附接到中心轴或与其一体。第三螺旋带也沿着所述轴的一部分缠绕,理想地,它沿着构成所述轴的长度的近似一半的上部缠绕。该螺旋带也在制造期间使用横撑/杆连接到所述轴或与其一体制成。第三或上螺旋带的转动方向与第一或下螺旋带的转动方向相反。而且,第三或上螺旋带的周期性趋向于小于地下螺旋带的周期性。这是因为下螺旋带主要执行破裂功能,而上螺旋带执行定向功能,这确保已离解组织在适当地点处离开所述装置。
由此,在本发明的优选实施方式中,具有3个螺旋带或螺纹:沿同一方向延伸但起源相隔180°的两个下螺旋带或螺纹、和沿相反方向延伸的一个上螺旋带或螺纹。
虽然在图5中,两个带被示出为连接或连续(它们的周期性确定它们的轮廓),但两个带可以不连接或不连续。
在图6中,示出了外套管,这是从内轴去除外非移动部的装置的分解图。
套管包括被定尺并成形为围绕移动部安装的中空圆柱。在其下端部(安装在第一/第二下螺纹上方的端部)处,它包括至少一个且通常为多个开口或狭缝,该开口或狭缝可以与套管的下边缘隔开或与其连续。在所示的实施方式中,孔口与套管的下端部隔开。孔口是与套管的纵轴线或套管安装在上面的轴对齐的狭缝,并且通常均匀地分布在套管的圆周轴线周围。通常,孔的数量在每个套管圆周2至12个的范围内,并且在所示的实施方式中,为每4cm套管圆周4个。
虽然未示出,但转子放置在套管内且操作地耦合到移动部和电源,以使得转子能够在定子内旋转。
在图9中,示出了具有上述特征的本发明的另外实施方式,然而在该实施方式中,细长轴终止于无螺纹区域,即,没有任何螺纹的中心轴。而且,图10和图11所示的、用于该实施方式的对应套管除了具有前述特征之外,还具有端托架,该端托架包括具有中心孔口的若干(在该实施方式中为三个)互连延伸部。该孔口与细长轴的纵轴线对齐或同心,并且被定尺并成形为以以下方式容纳细长轴:提供间隙,使得细长轴可以相对于所述套管旋转,但鉴于它可以经受的横向移动的量而受约束。虽然该特征使用延伸托架来例示,但可以采用其他传统装置来限制旋转轴相对于套管的横向移动的程度。
在应用中,将移动部插入套管中,并且启动转子,以使得轴转动。在与组织样本接触时,可选地组织样本悬浮在缓冲溶液中,该旋转运动使组织破裂,并且组织的片段/成分沿着第一/第二螺纹朝向孔口的扩张部分行进,它们从孔口排出。相对缠绕的上返回螺纹的存在确保破裂组织不在出孔口上方行进。通常,所述装置的转速在从100至10000转每分钟的范围内。而且,旋转的持续时间在从10秒至10分钟的范围内。
示例1
现在将仅用示例的方式描述使用装置来从脂肪组织获得干细胞。
装置/搅拌器对于脂肪组织离解的应用
1.将套管/定子及其内的转子/轴放入包含要离解的脂肪组织的器皿中。
a.装置/搅拌器机械离解脂肪组织,使得可以获得包括完整活细胞的基质血管成分(SVF)。
流体和添加剂的说明
1.所用流体是生物相容性流体,包括但不限于:生理盐水、具有或没有钙和镁的汉克平衡盐溶液、具有或没有钙和镁的磷酸盐缓冲盐溶液、林格溶液、乳酸盐林格溶液、或哈特曼溶液。
a.流体添加到脂肪组织将在其中离解的器皿。
b.所添加的流体的体积是要在器皿中离解的脂肪组织体积的10%至200%。
2.流体可以包含添加剂,这些添加剂是生物相容性的/临床批准的赋形剂/试剂,这些赋形剂/试剂包括但不限于:聚乙二醇、聚乙烯醇、蔗糖、葡萄糖、白蛋白、氨基酸、丙酮酸(单独或组合)。
3.流体支持哺乳动物细胞的生存力。
4.添加剂帮助增加所获的完整活基质血管成分细胞的数量,和/或在培养细胞时帮助这些细胞的生长。
脂肪组织和脂肪组织储存的说明
脂肪组织以以下形式来获得,并且在离解之前可以储存。
1.作为脂肪组织提取物或精细切碎片。
2.脂肪组织在离解之前可以储存0小时至72小时。
a.储存温度在从4℃至18℃的范围内。
b.脂肪组织的储存可以与或不与流体一起,并且与或不与如上所述的添加剂一起。
离解过程的说明
1.如果储存,并且如果外观上为固体,则在离解之前在室温或在37℃下解冻脂肪组织,或直到脂肪组织重新获得半固体外观为止。
2.将被解冻的脂肪组织放置在用于离解的器皿中。
3.向器皿中的已解冻脂肪组织添加具有或没有添加剂的流体。
a.所添加的流体的体积是器皿中的脂肪组织体积的10%至200%。
4.将套管/定子和轴/转子放置在包含脂肪组织和流体的器皿内。
5.在旋转或不旋转定子的情况下由转子的旋转离解组织。
a.转速在从100至10000转每分钟的范围内。
b.旋转的持续时间在从10秒至10分钟的范围内。
SVF分离、冷冻保存以及细胞培养的说明
在如上所述的离解之后,通过执行以下顺序步骤将SVF与脂肪细胞和油分离。
1.在50至1000倍(50x-1000x)相对离心力(RCF)之间离心分离已离解的脂肪组织,以将已离解的脂肪组织离解成油和脂肪组织层、以及包含SVF的水层。
a.SVF可以是或可以不是水层中的细胞团块的形式。
2.将油和脂肪组织层与水层和SVF分离。
3.如果SVF是细胞团块的形式,则使其轻柔地重新悬浮在水层中,以获得细胞悬浮液。
4.借助具有40至250μm的孔尺寸的过滤器过滤细胞悬浮液。
5.在50x至1000xRCF之间离心分离已过滤的细胞悬浮液,以获得SVF,作为细胞团块。
6.去除大部分流体,仅留下SVF团块和少量的流体。
a.流体弯液面的底部应靠近细胞团块的顶部或离该顶部小于5mm。
7.由轻柔摇动或轻敲将SVF重新悬浮在剩余的流体中,以获得浓缩的细胞悬浮液。
8.该步骤和内部所包含的程序是可选的且可以跳过。
i.大量红细胞(RBC)可以通过以每来自100cc的脂肪组织的SVF量添加0.5ml至10ml的RBC裂解液来可选地去除。
ii.在添加RBC裂解液的10秒至60秒内,添加RBC裂解液体积1至10倍的体积的生物相容性流体。
iii.从50x至1000xRCF离心分离细胞悬浮液,以获得SVF,作为细胞团块。
iv.与步骤6中相同,去除大部分流体,仅留下SVF团块和少量的流体。
v.通过轻柔摇动将SVF重新悬浮在剩余流体中。
9.为了培养SVF,向已浓缩的细胞悬浮液添加培养基(例如,包含15%FBS、1xNEAA、5ng/ml碱性FGF、以及100U/ml青霉素/链霉素的DMEM、或适当的市售培养基)。活细胞可以在平面培养之前用血球计或自动化细胞计数器计数。
a.将细胞添加到适当器皿中并在标准37℃、5%CO2加湿培养箱中培养。
b.第二天,去除培养基,并且用缓冲剂(例如,HBSS)轻柔地冲洗附着细胞并用新鲜培养基培养。
c.酌情更换培养基,并且在显微镜下观察细胞生长和形态。
10.为了冷冻保存SVF,可以在向已浓缩细胞悬浮液添加冷冻保存介质(例如,包含50%FBS和10%DMSO的DMEM、或适当的市售冷冻保存剂)之前首先用血球计或自动化细胞计数器对活细胞计数。添加冷冻保存介质,以获得处于用于冷冻的期望细胞密度(例如,1-2x106/ml)的细胞,并且轻柔地使细胞重新悬浮。
a.将细胞悬浮液等分到适当器皿(例如,1ml冷冻管)中并在受控速率冷冻下冷冻在-80℃。
b.在受控速率冷冻之后,可以将器皿转移到液氮长期储存。
11.对于临床应用,可以首先用血球计或自动化细胞计数器对活细胞计数。在计数之后,用适当的临床流体将细胞悬浮液稀释至期望的细胞浓度。
Claims (24)
1.一种用于破裂组织的装置,其中,所述装置包括:第一移动部,该第一移动部为细长轴的形式,该细长轴附接有或关联有至少两个连续或不连续的螺纹;和第二非移动部,该第二非移动部为套管的形式,该套管适于安装在所述轴上方,并且具有至少一个细长孔口,该至少一个细长孔口与所述轴的纵轴线对齐并且在远离组织接触端的端部处更宽,其中,至少一个下螺纹设置在所述轴的下部或下半部上,并且至少一个上螺纹设置在所述轴的上部或上半部上,并且一个螺纹的旋转方向与另一个螺纹相反。
2.根据权利要求1所述的装置,其中,所述移动部包括马达和转子。
3.根据权利要求1所述的装置,其中,所述移动部包括手柄或座架,所述装置能够在操作的同时经由所述手柄或座架保持。
4.根据权利要求1所述的装置,其中,所述螺纹是连续的。
5.根据权利要求1所述的装置,其中,所述螺纹是不连续的。
6.根据权利要求1所述的装置,其中,所述螺纹的角结构为从水平面测量的20°-88°。
7.根据权利要求1所述的装置,其中,所述螺纹的角结构为从水平面测量的40°-80°。
8.根据权利要求1所述的装置,其中,所述螺纹的角结构为从水平面测量的40°-50°。
9.根据权利要求1所述的装置,其中,所述螺纹的深度小于所述套管的直径的40%。
10.根据权利要求1所述的装置,其中,所述螺纹的深度小于所述套管的直径的30%。
11.根据权利要求1所述的装置,其中,所述套管包括多个孔口。
12.根据权利要求11所述的装置,其中,每个套管圆周存在2至12个孔口。
13.根据权利要求11所述的装置,其中,每4.5cm的套管存在4个孔口。
14.根据权利要求11所述的装置,其中,所述孔口围绕所述套管均匀隔开。
15.根据权利要求1所述的装置,其中,所述孔口包括尺寸在远离所述装置的所述组织接触端的端部处扩张的狭缝。
16.根据权利要求1所述的装置,其中,所述孔口包括尺寸在远离所述组织接触端的所述端部处扩张的不连续的狭缝。
17.根据权利要求15所述的装置,其中,所述孔口的所述扩张部分形成至少部分圆形形状。
18.根据权利要求15所述的装置,其中,所述孔口的所述扩张部分与所述下螺纹的上端部对齐或与所述下螺纹和上螺纹之间的接合点对齐。
19.根据权利要求1所述的装置,其中,所述细长轴的下端部区域或组织接触区域终止于无螺纹区域,并且其中,所述套管或所述轴的所述下端或组织接触端还包括约束构件,使得在应用中,所述细长轴自由旋转但横向受限。
20.一种用于破裂组织的方法,该方法包括组成部分要机械分离的所选组织样本和根据权利要求1至19中任意一项所述的装置的应用。
21.根据权利要求20所述的方法,其中,所述组织悬浮在具有或没有添加剂的生物相容性流体中,所述添加剂是生物相容性的/临床批准的赋形剂/试剂。
22.根据权利要求21所述的方法,其中,所述添加剂选自单独或组合的聚乙二醇、聚乙烯醇、蔗糖、白蛋白、氨基酸、丙酮酸。
23.根据权利要求20所述的方法,其中,所述装置以在100至10000转每分钟范围内的速度旋转。
24.根据权利要求23所述的方法,其中,旋转的持续时间在从10秒至10分钟的范围内。
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