CN110075287A - 用于结核病的预防或治疗的合成免疫原 - Google Patents

用于结核病的预防或治疗的合成免疫原 Download PDF

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CN110075287A CN201910059295.2A CN201910059295A CN110075287A CN 110075287 A CN110075287 A CN 110075287A CN 201910059295 A CN201910059295 A CN 201910059295A CN 110075287 A CN110075287 A CN 110075287A
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Abstract

本发明涉及用于结核病的预防或治疗的合成免疫原。公开了包含编码TB esat‑6蛋白的核酸分子的组合物。公开了诱导个体的针对TB的免疫应答的方法。公开了治疗已被诊断患有TB的个体的方法。公开了预防个体的TB感染的方法。

Description

用于结核病的预防或治疗的合成免疫原
本申请是申请日为2014年3月17日的题为“用于结核病的预防或治疗的合成免疫原”的中国专利申请第201480012495.8号的分案申请。
技术领域
本发明涉及编码结核病(TB)免疫原(编码免疫原性TB抗原)的多价构建体。每一种构建体编码多个免疫原性TB抗原并且具有被设计用于高水平表达的的编码序列。提供了预防性和治疗性疫苗，以及制造和使用所述疫苗来诱导免疫应答、从而预防TB感染和治疗感染TB病毒的个体的方法。
背景技术
结核病(TB)是在全球具有显著发病率和死亡率的重大传染病。目前唯一得到许可的针对TB的疫苗是卡介苗(Bacillus Calmette-Guerin)(BCG)疫苗。不幸的是，该疫苗赋予弱的抗成人肺TB的保护作用，并且已与不利事件相关联。因此，迫切需要开始诱导抗TB的长效保护作用的新型有效的疫苗。然而，由于多种因素，迄今只研究了少数已被确定为诱导针对TB的T细胞免疫的只有几个抗原。这些抗原包括Ag85A、Ag85B、ESAT6、TB10.4和Mtb39a。一个问题是，存在许多从其选择的TB抗原并且目前用于递送TB抗原的技术是有限的和昂贵的。
仍然存在对可诱导针对免疫原性TB抗原的免疫应答的、保护以免受TB感染和为被TB感染的个体提供有效治疗的经济有效的TB疫苗和方法的需要。还存在对使得能够进行大规模抗TB疫苗接种的具有成本效益的递送系统的需要。
发明内容
提供了包含编码选自以下的氨基酸序列的核酸分子的组合物：SEQ ID NO:2、SEQID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ IDNO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ IDNO:28、其具有至少90％的全长的片段、具有至少95％的同源性的同源序列以及具有至少95％同源性的同源序列的片段，具有至少95％的同源性的同源序列的所述片段具有至少90％的全长。
提供了包含选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ IDNO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ IDNO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:27的核酸分子的组合物。
提供了SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25以及SEQ IDNO:27SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ IDNO:23、SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:27。
提供了包含含有SEQ ID NO:19的质粒、含有SEQ ID NO:21的质粒、含有SEQ IDNO:23的质粒、含有SEQ ID NO:25的质粒和含有SEQ ID NO:27的质粒的组合物。
提供了包含含有V-S-W构建体的质粒、含有D-Q-E构建体的质粒、含有H-A-T构建体的质粒、含有B-C-U构建体的质粒和含有O-R-F构建体的质粒的组合物。
提供了在个体中诱导抗TB的免疫应答的方法。
提供了治疗已被诊断患有TB的个体的方法。
提供了预防个体的TB感染的方法。
附图说明
图1A描绘多价esx疫苗质粒的构建和三价表达载体的体外表达。
图1B提供显示5个esx构建体的抗原表达的数据。
图2A和图2B显示多价TB疫苗构建体的经修饰的氨基酸插入序列。
图3显示响应多价疫苗施用的体液免疫应答。
图4A-图4C提供显示对多价疫苗的细胞免疫应答的柱形图。
图5A和5B描绘pVSW、pBCU、pDQE、pHAT和pORF(pVSW.2、pBCU.2、pDQE.2、pHAT.2和pORF.2)插入物和质粒的新形式的构建并且包括显示所述插入物在用所述质粒转染的哺乳动物细胞中表达的实验结果。
图6A-图6F显示实验设计和来自比较针对质粒的5种新形式(pVSW、pBCU、pDQE、pHAT和pORF的新形式(pVSW.2、pBCU.2、pDQE.2、pHAT.2和pORF.2))的每一种中包含的3种特定esx抗原的每一种诱导的免疫应答的实验的结果。图6A描述实验设计。图6B显示利用质粒pDQE的新形式接种的小鼠中的针对esxD、esxQ和esxE的免疫应答的实验结果。图6C显示利用质粒pVSW的新形式接种的小鼠中的针对esxV、esxS和esxW的免疫应答的实验结果。图6D显示利用质粒pBCU的新形式接种的小鼠中的针对esxB、esxC和esxU的免疫应答的实验结果。图6E显示利用质粒pORF的新形式接种的小鼠中的针对esxO、esxR和esxF的免疫应答的实验结果。
图7A-图7C显示评价利用pVSW、pBCU、pDQE、pHAT和pORF的新形式(pVSW.2、pBCU.2、pDQE.2、pHAT.2和pORF.2)的组合接种后的esx-特异性CD4和CD8T细胞应答的实验的实验结果。图7A显示用于分析对于IFN-和TNF-细胞因子都是阳性的CD4和CD8T细胞的频率的门控策略。图7B显示esx-特异性CD4T细胞免疫应答。图7C显示esx-特异性CD4T细胞免疫应答。
图8A-图8C显示实验设计和来自将利用RSQ-15(每一种pVSW、pBCU、pDQE、pHAT和pORF的新形式(pVSW.2、pBCU.2、pDQE.2、pHAT.2和pORF.2)的混合物)免疫的动物的免疫应答与由TB疫苗BCG诱导的免疫应答相比较的实验的结果。
图9A-图9C显示实验设计和来自比较利用BCG免疫并利用RSQ-15加强一次或两次或无加强的动物的esx-特异性免疫应答的初免加强实验的结果。
图10A-图10C显示利用一种pORF、pHAT或pVSW的新形式(pORF.2、pHAT.2或pVSW.2)诱导的针对亚家族直系同源物成员的免疫应答的交叉反应性。
具体实施方式
提供了安全、有效和经济的TB疫苗，包括应用DNA疫苗技术的实施方案。所述TB疫苗可用于可诱导抗免疫原性TB抗原的免疫应答、抗TB感染的保护作用以及为被TB感染的个体提供有效治疗的方法。DNA疫苗技术可用于给广大的个体群体提供具有成本效益的TB疫苗的递送，从而使得能够进行大规模的预防性TB疫苗接种。
所述疫苗的廉价生产、贮存、运输和施用使得它们对于以具有成本效益的方式用于接种的大群体是理想的。表1显示目前正被研究以用作疫苗的TB抗原。
多价疫苗方法是有吸引力的，因为广泛的免疫应答可通过同时靶向多个抗原来产生。可明显有利的是一次靶向整个家族的基因可限制细菌逃避宿主免疫的能力。在这方面，本文中提供了靶向来自TB的整个家族的基因的第一多价扩展疫苗。所述多价疫苗集中于早期分泌抗原性靶6-kDa(esat-6)蛋白家族，其由23种蛋白质组成。这些蛋白是有吸引力的靶，因为它们是重要的致病因子，潜在地在不同的生理条件下表达；因此如果所有这些成员可被靶向，则它们可能提供针对细菌生命周期中的多个步骤的保护作用。在先前的研究中，仅存在对该家族的仅少数成员作为疫苗免疫原的有限分析。目前没有疫苗靶向超过该基因家族的少数基因。此处，已使用优化的DNA疫苗候选物开发了新型方法，通过肌内注射和体内电穿孔递送，以增加抗原性库和产生针对TB的广泛免疫。已开发了在多价TB疫苗中整合代表所有esx家族成员的全部esx家族基因的合成TB DNA疫苗。此种疫苗代表免疫靶向的指数提高和TB疫苗开发的突破。质粒技术的多项提高促成该开发并且在下文中进行概述。
早期分泌抗原性靶6-kDa(esat-6)蛋白家族为有效的TB疫苗提供免疫原性靶。多价疫苗提供广泛的靶。在23个不同的esat-6蛋白家族成员中，一些esat-6蛋白具有充分的同源性，以使得单一蛋白靶可诱导识别多种TB esat-6蛋白的免疫应答。通过使用DNA疫苗，可将多种免疫原性蛋白质的编码序列包含在单一多价蛋白质中。可将多个不同的构建体组合使用，以诱导针对esat-6家族蛋白的成员的免疫应答。
所述esat-6家族由23种低质量蛋白质(esxA至esxW)组成，并且至少10种可因高序列相关同源性而被进一步分入亚家族。一个亚家族是Mtb9.9家族，其由具有在92-98％的范围内的蛋白质同源性的5个开放阅读框架(ORF)(表2)组成。另一个亚家族为QILSS亚家族，其由在蛋白质水平共享超过98％的个体同一性的5个相邻的ORF组成。
在本文中公开的疫苗中，来自Mtb9.9亚家族的2个抗原esxO和esxV被选择作为用于诱导广泛的免疫应答的代表性抗原。不使用TB抗原esxI、esxL和esxN，但它们与esxO和esxV的密切结构关系允许esxO和esxV成为MTb9.9家族的抗原的靶。
类似地，从QLISS亚家族选择esxW来代表包括其的亚家族的5个抗原抗原esxJ、esxK、esxM、esxP和esxW。
此外，两个其它esat-6蛋白esxS和esxG共享96％的同源性；因此，esxS将代表两种抗原。
选择这些抗原代表与它们具有高水平的同源性的其它抗原，应当诱导与TB的控制相关的针对所有成员的交叉免疫应答。余下的11个esat-6基因彼此几乎不具有同源性，并且全部已被整合为单一抗原盒。总之，使用总共15种esat-6抗原，并且这15种抗原提供了esat-6家族的所有23个成员的靶。
表3显示可用于可预防TB感染和治疗被TB感染的个体的疫苗的9种构建体。如上文中提及的，esxO、esxV、esxW和esxS被选择用来代表它们本身和抗原呈递中的密切相关的抗原以诱导广泛的免疫应答。
这14个载体的每一个的构建体在每一个的N末端具有IgE信号肽。IgE信号肽是任选的，并且本公开内容旨在被理解为明确地公开在N末端上包含IgE信号肽的序列并且还明确地公开不包含IgE信号肽的不具有用于接受来自另一种蛋白质的信号肽的添加的残基或N末端甲硫氨酸或位点的序列。
类似地，所述序列在每一个序列的C末端上包含HA标签。该结构不是必需的并且在一些实施方案中，是想要的。本公开内容旨在被理解为明确地公开在C末端上包含HA标签的序列并且还明确地公开不包含HA标签的序列。
所述构建体提供费林蛋白酶切割位点。通常存在于接种的个体的细胞中的通过蛋白酶加工的其它蛋白酶切割位点可用于替代费林蛋白酶位点。
如实施例中所指出的，所述蛋白质序列已被修饰来改变它们的糖类的翻译后添加的模式。在一些实施方案中，这些修饰的保留是高度期望的。
所述构建体可通过改变给定的质粒上的抗原的顺序或重排分组来进行重排或另外地改变。
提供了包含在多种质粒上编码编码TB抗原esxV、esxS、esxW、esxD、esxQ、esxE、esxH、esxA、esxT、esxB、esxC、esxU、esxO、esxR、esxF的的核酸序列的疫苗，其中针对C-甘露糖基化突变和N-连接糖基化突变修饰所述蛋白质序列。所述抗原(esxA、esxE、esxF、esxU、esxW)具有突变(N-X-S/T至N-X-A)的N-连接糖基化规范序列位点的氨基酸。C-甘露糖基化规范序列位点上的氨基酸也被突变(W-X-X-W(SEQ ID NO:29)至W-X-X-A(SEQ ID NO:30)或W-X-X-W(SEQ ID NO:29)至A-X-X-W(SEQ ID NO:31))。
在一些实施方案中，提供了包含5种质粒的疫苗，每一种所述质粒具有esx-抗原的编码序列。在一些实施方案中，疫苗是包含如下质粒的组合物：包含V-S-W构建体的质粒、包含D-Q-E构建体的质粒、包含H-A-T构建体的质粒、包含B-C-U构建体的质粒和包含O-R-F构建体的质粒的组合物。在一些此类实施方案中，包含V-S-W构建体的质粒可包含SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:1。在一些此类实施方案中，包含D-Q-E构建体的质粒可包含SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:3。在一些此类实施方案中，包含H-A-T构建体的质粒可包含SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:5。在一些此类实施方案中，包含B-C-U构建体的质粒可包含SEQ ID NO:25或SEQID NO:7。在一些此类实施方案中，包含O-R-F构建体的质粒可包含SEQ ID NO:27或SEQ IDNO:9。在一些实施方案中，疫苗是包含如下质粒的组合物：a)包含SEQ ID NO:19或SEQ IDNO:1的质粒、b)包含SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:3的质粒、c)包含SEQ ID NO:23或SEQ IDNO:5的质粒、d)包含SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:7的质粒和e)包含SEQ ID NO:27或SEQ IDNO:9的质粒。在一些实施方案中，疫苗是包含如下质粒的组合物：a)包含SEQ ID NO:19的质粒、b)包含SEQ ID NO:21的质粒、c)包含SEQ ID NO:23的质粒、d)包含SEQ ID NO:25的质粒和e)包含SEQ ID NO:27的质粒。
1.定义
本文中使用的术语仅为了描述特定的实施方案并且不旨在限制。如本说明书和所附权利要求中所用的，除非上下文明确指出，否则单数形式“一个(a)”、“一种(an)”和“该(the)”包括复数指示物。
对于本文中数值范围的引述，明确地以相同的精度包括其间的每一个中介数。例如，对于6-9的范围，除了6和9外还包括数值7和8，而对于范围6.0-7.0，明确地包括数值6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9和7.0。
a.佐剂
如本文中所用的“佐剂”可意指添加至本文中描述的DNA质粒疫苗以增强一种或多种由DNA质粒和下文中描述的编码核酸序列编码的TB抗原的抗原性的任何分子。
b.抗体
“抗体”可意指种类IgG、IgM、IgA、IgD或IgE或片段的抗体、其片段或其衍生物，包括Fab、F(ab')2、Fd和单链抗体、双抗体、双特异性抗体、双功能抗体及其衍生物。抗体可以是从哺乳动物的血清样品分离的抗体、多克隆抗体、亲和纯化的抗体或其混合物，所述抗体展现足够的对期望的表位或来源于其的序列的结合特异性。
c.编码序列
如本文中所用，“编码序列”或“编码核酸”可意指包含编码蛋白质的核苷酸序列的核酸(RNA或DNA分子)。编码序列还可包括有效地连接于能够在施用了核酸的个体或哺乳动物的细胞中指导表达的调控元件(包括启动子和多聚腺苷酸化信号)的起始和终止信号。
d.互补
如本文中所用，“互补”或“互补的”可意指核酸，可意指核酸分子的核苷酸或核苷酸类似物之间的沃森-克里克(Watson-Crick)(例如，A-T/U和C-G)或Hoogsteen碱基配对。
e.共有或共有序列
如本文中所用，“共有”或“共有序列”可意指基于多个亚型的特定TB抗原的比对的分析构建的合成核酸序列或对应的多肽序列，所述序列可用于诱导针对多个亚型、或血清型或株系的特定TB抗原的广泛免疫。共有TB抗原可包含如本文中所示的esat-6家族的蛋白质的共有氨基酸序列。还提供了编码所述共有氨基酸序列的核苷酸序列。同样地，合成抗原诸如融合蛋白可经操作以包含共有序列(或共有抗原)。
f.恒定电流
如本文中所用，“恒定电流”定义由组织或限定所述组织的细胞在整个递送至相同组织的电脉冲的持续过程中接收或经历的电流。从本文中描述的电穿孔装置递送电脉冲。该电流在电脉冲的整个过程中在所述组织中维持恒定的安培度，因为本文中提供的电穿孔装置具有反馈元件，优选地具有瞬时反馈。反馈元件可测量整个脉冲持续过程中组织(或细胞)的电阻(resistance)，并使电穿孔装置改变其电能输出(例如，提高电压)，这样相同组织中的电流在整个电脉冲(大约数微秒)中以及在脉冲间维持恒定。在一些实施方案中，反馈元件包括控制器。
g.电流反馈或反馈
如本文中所用，“电流反馈”或“反馈”可互换使用，并且可意指提供的电穿孔装置的主动响应，其包括测量组织中电极之间的电流和相应地改变由EP装置递送的能量输出，以将电流维持在恒定水平。该恒定水平由用户在开始脉冲序列或电处理之前预先设定。反馈可由电穿孔组件例如电穿孔装置的控制器来实现，因为其中的电路能够连续监测组织中电极之间的电流并将该监测的电流(或组织内的电流)与预设电流相比较，以及连续进行能量输出调整以将监测的电流维持在预设水平。反馈回路可以是瞬时的，因为其为模拟闭环反馈。
h.分散电流
如本文中所用，“分散电流”可意指从本文中描述的电穿孔装置的各种针电极阵列递送的电流的模式，其中所述模式使待电穿孔的组织的任何区域上的电穿孔相关热应激的发生降至最低或优选消除。
i.电穿孔
如本文中可互换使用的，“电穿孔”、“电-透化”或“电动增强”(“EP”)可指使用跨膜电场脉冲来诱导生物膜中的微观通路(孔)；它们的存在允许生物分子诸如质粒、寡核苷酸、siRNA、药物、离子和水从细胞膜的一侧通过进入另一侧。
j.反馈机制
如本文中所用，“反馈机制”可指通过软件或硬件(或固件)进行的过程，该过程接收期望的组织的阻抗(在递送能量脉冲之前，期间和/或之后)并将其与现有值(优选地当前)相比较，随后调整被递送的能量的脉冲以达到预设值。可通过模拟闭环电路进行反馈机制。
k.片段
“片段”可意指能够在哺乳动物中通过识别特定TB抗原引发抗TB的免疫应答的TB抗原或多蛋白的多肽片段。TB抗原在具有或不具有IgE信号肽的每一种情况下可以是esat-6蛋白家族的23个成员：esxA至esxW以及TB抗原Ag85A和Ag85B之一，在具有或不具有信号肽和/或位置1上的甲硫氨酸的每一种情况下，可以是与本文中所示的共有序列具有98％或更多同源性的蛋白质、与本文中所示的共有序列具有99％或更多同源性的蛋白质以及与本文中所示的共有序列具有100％同一性的蛋白质。片段是指短于这些蛋白质的全长。片段可以例如包含或可以例如不包含连接于信号肽诸如免疫球蛋白信号肽(例如IgE信号肽或IgG信号肽)的TB免疫原的片段。
“片段”还可意指编码上文中所示的TB抗原片段的核酸片段。
l.基因构建体
本文中所用的“遗传构建体”是指包含编码蛋白质的核苷酸序列的DNA或RNA分子。所述编码序列包括有效地连接于能够在施用了核酸分子的个体的细胞中指导表达的调控元件(包括启动子和多聚腺苷酸化信号)的起始和终止信号。如本文中所用，术语“可表达的形式”是指基因构建体，所述基因构建体含有有效地连接于编码蛋白质的编码序列的必需调控元件，以便当存在于个体的细胞中时，所述编码序列将被表达。
m.同源性
如本文中所用，"同源性"是指互补性的程度。可存在部分同源性或完全同源性(即，同一性)。至少部分抑制完全互补的序列与靶核酸杂交的部分互补的序列称为使用功能术语“基本上同源的”。当用于指双链核酸序列诸如cDNA或基因组克隆时，如本文使用的，术语“基本上同源的”是指在低严格度条件下可与双链核酸序列的链杂交的探针。当用于指单链核酸序列，如本文中所用，术语“基本上同源的”是指在低严格度条件下可与单链核酸模板序列杂交(即，为其的互补序列)的探针。
n.相同的
如在本文中在两个或更多个核酸或多肽序列的上下文中所用，“相同的”或“同一性”可意指序列具有指定百分比的在指定区域上相同的残基。可通过如下步骤计算百分比：将两条序列最佳地比对，在指定的区域上比较两条序列，测定在两条序列中存在相同残基的位置的数目以得到匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以指定区域中的位置总数，及将结果乘以100来得到序列同一性的百分比。在两条序列具有不同长度或比对产生一个或多个交错末端以及指定的比较区域仅包括单条序列的情况下，将单条序列的残基包括在计算的分母而非分子中。当比较DNA和RNA时，可将胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)认为是等同的。人工或通过使用计算机序列算法诸如BLAST或BLAST 2.0来获得同一性。
o.阻抗
当讨论反馈机制时可使用如本文中所用的“阻抗”，并且可按照欧姆定律将其转换成电流值，从而使得能够与预设电流比较。
p.免疫应答
如本文中所用，“免疫应答”可意指宿主的免疫系统，例如哺乳动物的免疫系统，响应一种或多种TB抗原(经由提供的DNA质粒疫苗)的引入的激活。免疫应答可以以细胞应答或体液应答的形式或这两种形式存在。
q.核酸
如本文中所用，“核酸”或“寡核苷酸”或“多核苷酸”可意指共价连接在一起的至少两个核苷酸。单链的描述也限定了互补链的序列。因此，核酸还包括描述的单链的互补链。核酸的许多变体可出于相同的目的作为给定的核酸使用。因此，核酸还包括基本上相同的核酸和其补体。单链提供可在严格杂交条件下与靶序列杂交的探针。因此，核酸还包括在严格杂交条件下杂交的探针。
核酸可以是单链或双链的，或可含有双链和单链序列的部分。核酸可以是DNA(基因组DNA和cDNA)、RNA或杂交体，其中核酸可含有脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的组合，及碱基(包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、肌苷、黄嘌呤次黄嘌呤、异胞嘧啶和异鸟嘌呤)的组合。核酸可以通过化学合成法或通过重组法获得。
r.有效连接的如本文中所用，“有效连接的”可意指基因的表达在与其空间上连接的启动子的控制下。启动子可位于在其控制下的基因的5'(上游)或3'(下游)。启动子与基因之间的距离可与在所述启动子来源自的基因中该启动子与其控制的基因之间的距离大致相同。如在本领域中是已知的，在不丧失启动子功能的情况下，可接受该距离的变化。
s.启动子
如本文中所用，“启动子”可意指能够赋予、激活或增强核酸在细胞中的表达的合成或天然来源的分子。启动子可包含一个或多个特定的转录调控序列以进一步增强所述序列的表达和/或改变其的空间表达和/或时间表达。启动子还可包含与转录起始位点相距多达数千碱基对的远端增强子或阻遏子元件。启动子可源自包括病毒、细菌、真菌、植物、昆虫和动物的来源。启动子可针对表达发生的细胞、组织或器官或针对表达发生所处的发育阶段，或响应外部刺激(诸如生理应激、病原体、金属离子或诱导剂)而组成型地，或差异地调控基因组分的表达。启动子的代表性实例包括噬菌体T7启动子、噬菌体T3启动子、SP6启动子、lac操纵子-启动子、tac启动子、SV40晚期启动子、SV40早期启动子、RSV-LTR启动子、CMVIE启动子、SV40早期启动子或SV 40晚期启动子和CMV IE启动子。
t.信号肽
“信号肽”和“前导序列”在本文中可互换使用，并且是指可被连接在本文中所示的蛋白质的氨基末端上的氨基酸序列。信号肽/前导序列通常指导蛋白质的定位。本文中使用的信号肽/前导序列优选促进蛋白质从产生其的细胞分泌。在从细胞分泌后，通常从蛋白质的其余部分(通常称为成熟蛋白)切割信号肽/前导序列。信号肽/前导序列连接在蛋白质的N末端上。
u.严格杂交条件
如本文中所用，“严格杂交条件”可意指第一核酸序列(例如，探针)将与第二核酸序列(例如，靶)(诸如在核酸的复杂混合物中)杂交的条件。严格条件是序列依赖性的，并且在不同的情况下是不同的。可选择比特定序列在限定的离子强度、pH下的热熔点(Tm)低约5-10℃作为严格条件。Tm可以是50％的与靶互补的探针在平衡(由于靶序列过量存在，因此在Tm下，50％的探针在平衡时被占据)时与靶序列杂交时的温度(在限定的离子强度、pH和核酸浓度下)。严格条件可以是在pH 7.0至8.3下盐浓度低于约1.0M钠离子，诸如约0.01-1.0M的钠离子浓度(或其它盐)以及温度为至少约30℃(对于短探针(例如，约10-50个核苷酸))和至少约60℃(对于长探针(例如，大于约50个核苷酸)的那些条件。严格条件还可通过添加去稳定剂诸如甲酰胺来实现。对于选择性或特异性杂交，阳性信号可以为至少2至10倍本底杂交。示例性严格杂交条件包括下列条件：50％甲酰胺、5x SSC和1％SDS在42℃下孵育，或者5x SSC、1％SDS在65℃下孵育，在65℃于0.2x SSC和0.1％SDS中洗涤。
v.基本上互补的如本文中所用，“基本上互补的”可意指第一序列与第二序列的补体在8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100或更多个核苷酸或氨基酸的区域上具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％的同一性，或两条序列在严格杂交条件下杂交。
w.基本上相同的如本文中所用，“基本上相同的”可意指如果第一序列与第二序列的补体基本上互补的话则第一与第二序列在8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100或更多个核苷酸或氨基酸的区域上或就核酸而言至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％相同。
x.亚型
“亚型”或“血清型”：如本文中所用，可互换，并且当提及HBV时，意指HBV的遗传性变体，以便一个亚型免疫被系统识别而与不同亚型相区分。
y.变体
本文中针对核酸所用的“变体”可意指(i)参考的核苷酸序列的部分或片段；(ii)参考的核苷酸序列或其部分的补体；(iii)与参考核酸或其互补序列基本上相同的核酸；或(iv)在严格条件下与参考核酸、其补体或与其基本上相同的序列杂交的核酸。
对于肽或多肽，“变体”是指通过氨基酸的插入、缺失或保守取代而在氨基酸序列上相异的，但保留至少一种生物活性的肽或多肽。变体还可意指具有与具有保留至少一种生物活性的氨基酸序列的参考蛋白质基本上相同的氨基酸序列的的蛋白质。氨基酸的保守取代，即利用具有相似性质(例如，疏水性、带电区域的程度和分布)的不同氨基酸替代氨基酸，在本领域中被认为通常包括较小变化。如本领域中所理解的，这些较小变化可部分通过考虑氨基酸的亲疏水性指数(hydropathic index)来鉴定。Kyte等人，J.Mol.Biol.157:105-132(1982)。氨基酸的亲疏水性指数基于对其疏水性和电荷的考虑。在本领域中已知具有相似亲疏水性指数的氨基酸可被取代并且仍然保留蛋白质功能。在一个方面，具有±2的亲疏水性指数的氨基酸被取代。氨基酸的亲水性还可用于显示可导致保留生物功能的蛋白质的取代。在肽的背景中考虑氨基酸的亲水性允许计算该肽的最大局部平均亲水性，这是一种已被报导与抗原性和免疫原性密切相关的有用的度量。美国专利No.4,554,101，通过引用完全并入本文。如本领域中所理解的，具有相似亲水性值的氨基酸的取代可导致保留生物活性例如免疫原性的肽。可利用彼此亲水性值在±2以内的氨基酸进行取代。氨基酸的疏水性指数和亲水性值受该氨基酸的特定侧链影响。与该观察一致，与生物功能相容的氨基酸取代被认为取决于氨基酸，并且具体地那些氨基酸的侧链的相对相似性，如通过疏水性、亲水性、电荷、大小和其它性质显示的。
z.载体
本文中所用的“载体”可意指含有复制起始点的核酸序列。载体可以是质粒、噬菌体、细菌人工染色体或酵母人工染色体。载体可以是DNA或RNA载体。载体可以是自主复制的染色体外载体或整合进宿主基因组的载体。
2.TB抗原和TB抗原的编码序列
提供了14种多价构建体，每一个多价构建体编码两个或更多个TB抗原的融合蛋白。编码序列可编码包含在SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ IDNO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ IDNO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:28中所示的氨基酸序列中的TB抗原。
SEQ ID NO:2包括具有3个TB抗原esxV、esxS和esxW的氨基酸序列的单个多肽。SEQID NO:2包括N末端上的任选的IgE前导序列序列。该构建体意欲被认为是两种供选方案：一种供选方案如所显示的具有IgE前导序列并且另一种供选方案不具有所述IgE前导序列。在后一种情况下，可提供起始密码子来代替编码IgE前导序列的序列。SEQ ID NO:1提供被设计用于高表达水平的编码SEQ ID NO:2的特定编码序列。构建体可被称为pVSW。SEQ ID NO:1为V-S-W编码序列。
SEQ ID NO:4包括具有3个TB抗原esxD、esxQ和esxE的氨基酸序列的单个多蛋白。SEQ ID NO:4在N末端包含任选的IgE前导序列。该构建体意欲被认为是两种供选方案：一种供选方案如所显示的具有IgE前导序列并且另一种供选方案不具有所述IgE前导序列。在后一种情况下，可提供起始密码子来代替编码IgE前导序列的序列。SEQ ID NO:3提供被设计用于高表达水平的编码SEQ ID NO:4的特定编码序列。构建体可被称为pDQE。SEQ ID NO:3为D-Q-E编码序列。
SEQ ID NO:6包括具有3个TB抗原esxH、esxA和esxT的氨基酸序列的单个多蛋白。SEQ ID NO:6在N末端包含任选的IgE前导序列。该构建体意欲被认为是两种供选方案：一种供选方案如所显示的具有IgE前导序列并且另一种供选方案不具有所述IgE前导序列。在后一种情况下，可提供起始密码子来代替编码IgE前导序列的序列。SEQ ID NO:5提供被设计用于高表达水平的编码SEQ ID NO:6的特定编码序列。构建体可被称为pHAT。SEQ ID NO:5为H-A-T编码序列。
SEQ ID NO:8包括具有3个TB抗原esxB、esxC和esxU的氨基酸序列的单个多蛋白。SEQ ID NO:8在N末端包含任选的IgE前导序列。该构建体意欲被认为是两种供选方案：一种供选方案如所显示的具有IgE前导序列并且另一种供选方案不具有所述IgE前导序列。在后一种情况下，可提供起始密码子来代替编码IgE前导序列的序列。SEQ ID NO:7提供被设计用于高表达水平的编码SEQ ID NO:8的特定编码序列。构建体可被称为pBCU。SEQ ID NO:7为B-C-U编码序列。
SEQ ID NO:10包括具有3个TB抗原esxO、esxR和esxF的氨基酸序列的单个多蛋白。SEQ ID NO:10在N末端包含任选的IgE前导序列。该构建体意欲被认为是两种供选方案：一种供选方案如所显示的具有IgE前导序列并且另一种供选方案不具有所述IgE前导序列。在后一种情况下，可提供起始密码子来代替编码IgE前导序列的序列。SEQ ID NO:9提供被设计用于高表达水平的编码SEQ ID NO:10的特定编码序列。构建体可被称为pORF。SEQ IDNO:9为O-R-F编码序列。
SEQ ID NO:12包括具有3个拷贝的TB抗原esx-A的单个多蛋白。编码esxA、esxA和esxA的SEQ ID NO:12在N末端包含任选的IgE前导序列。该构建体意欲被认为是两种供选方案：一种供选方案如所显示的具有IgE前导序列并且另一种供选方案不具有所述IgE前导序列。在后一种情况下，可提供起始密码子来代替编码IgE前导序列的序列。SEQ ID NO:12提供被设计用于高表达水平的编码SEQ ID NO:11的特定编码序列。构建体可被称为TE6。
SEQ ID NO:14包括具有2个TB抗原Ag85A和esxA的氨基酸序列的单个多蛋白。SEQID NO:14在N末端包含任选的IgE前导序列。该构建体意欲被认为是两种供选方案：一种供选方案如所显示的具有IgE前导序列并且另一种供选方案不具有所述IgE前导序列。在后一种情况下，可提供起始密码子来代替编码IgE前导序列的序列。SEQ ID NO:13提供被设计用于高表达水平的编码SEQ ID NO:14的特定编码序列。构建体可被称为AE6。
SEQ ID NO:16包括具有2个TB抗原Ag85B和esxA的氨基酸序列的单个多蛋白。SEQID NO:16在N末端包含任选的IgE前导序列。该构建体意欲被认为是两种供选方案：一种供选方案如所显示的具有IgE前导序列并且另一种供选方案不具有所述IgE前导序列。在后一种情况下，可提供起始密码子来代替编码IgE前导序列的序列。SEQ ID NO:15提供被设计用于高表达水平的编码SEQ ID NO:16的特定编码序列。构建体可被称为BE6。
SEQ ID NO:18包括具有6个TB抗原esxH、esxA、esxU、esxS、esxD和esxV的氨基酸序列的单个多蛋白。SEQ ID NO:18在N末端包含任选的IgE前导序列。该构建体意欲被认为是两种供选方案：一种供选方案如所显示的具有IgE前导序列并且另一种供选方案不具有所述IgE前导序列。在后一种情况下，可提供起始密码子来代替编码IgE前导序列的序列。SEQID NO:17提供被设计用于高表达水平的编码SEQ ID NO:18的特定编码序列。构建体可被称为phDV。
SEQ ID NO:20包括具有3个TB抗原esxV、esxS和esxW的氨基酸序列的单个多蛋白。SEQ ID NO:20在N末端包含任选的IgE前导序列。SEQ ID NO:20还在C末端包含任选的HA-标签序列。该构建体意欲被认为是供选方案：构建体可具有或可以不具有IgE前导序列并且独立地构建可具有或可以不具有HA-标签。在不具有IgE前导序列的这些实施方案的情况下，可提供起始密码子来代替编码IgE前导序列的序列。SEQ ID NO:19提供被设计用于高表达水平的编码SEQ ID NO:20的特定编码序列。SEQ ID NO:19是包含编码esx抗原esxV、esxS和esxW的序列的编码序列的pVSW(1005bp)经优化的序列的新形式的核酸序列。所述构建体被称为pORF的新形式(pORF.2)。SEQ ID NO:19为V-S-W编码序列。
SEQ ID NO:22包括具有3个TB抗原esxD、esxQ和esxE的氨基酸序列的单个多蛋白。SEQ ID NO:22在N末端包含任选的IgE前导序列。SEQ ID NO:22还在C末端包含任选的HA-标签序列。该构建体意欲被认为是供选方案：构建体可具有或可以不具有IgE前导序列并且独立地构建可具有或可以不具有HA-标签。在不具有IgE前导序列的这些实施方案的情况下，可提供起始密码子来代替编码IgE前导序列的序列。SEQ ID NO:21提供被设计用于高表达水平的编码SEQ ID NO:22的特定编码序列。SEQ ID NO:21是包含编码esx抗原esxD、esxQ和esxE的序列的编码序列的pDQE(1089bp)经优化的序列的新形式的核酸序列。所述构建体被称为pDQE的新形式(pDQE.2)。SEQ ID NO:21为D-Q-E编码序列。
SEQ ID NO:24包括具有3个TB抗原esxH、esxA和esxT的氨基酸序列的单个多蛋白。SEQ ID NO:24在N末端包含任选的IgE前导序列。SEQ ID NO:24还在C末端包含任选的TA-标签序列。该构建体意欲被认为是供选方案：构建体可具有或可以不具有Ige前导序列并且独立地构建可具有或可以不具有HA-标签。在不具有IgE前导序列的这些实施方案的情况下，可提供起始密码子来代替编码IgE前导序列的序列。SEQ ID NO:23提供被设计用于高表达水平的编码SEQ ID NO:24的特定编码序列。SEQ ID NO:23是包含编码esx抗原esxH、esxA和esxT的序列的编码序列的pHAT(1011bp)经优化的序列的新形式的核酸序列。所述构建体被称为pHAT的新形式(pHAT.2)。SEQ ID NO:23为H-A-T编码序列。
SEQ ID NO:26包括具有3个TB抗原esxB、esxC和esxU的氨基酸序列的单个多蛋白。SEQ ID NO:26在N末端包含任选的IgE前导序列。SEQ ID NO:26还在C末端包含任选的HA-标签序列。该构建体意欲被认为是供选方案：构建体可具有或可以不具有Ige前导序列并且独立地构建可具有或可以不具有HA-标签。在不具有IgE前导序列的这些实施方案的情况下，可提供起始密码子来代替编码IgE前导序列的序列。SEQ ID NO:25提供被设计用于高表达水平的编码SEQ ID NO:26的特定编码序列。SEQ ID NO:25是包含编码esx抗原esxB、esxC和esxU的序列的编码序列的pBCU(1098bp)经优化的序列的新形式的核酸序列。所述构建体被称为pBCU的新形式(pBCU.2)。SEQ ID NO:25为B-C-U编码序列。
SEQ ID NO:28包括具有3个TB抗原esxO、esxR和esxF的氨基酸序列的单个多蛋白。SEQ ID NO:28在N末端包含任选的IgE前导序列。SEQ ID NO:28还在C末端包含任选的HA-标签序列。该构建体意欲被认为是供选方案：构建体可具有或可以不具有Ige前导序列并且独特地构建可具有或可以不具有HA-标签。在不具有IgE前导序列的这些实施方案的情况下，可提供起始密码子来代替编码IgE前导序列的序列。SEQ ID NO:27提供被设计用于高表达水平的编码SEQ ID NO:28的特定编码序列。SEQ ID NO:27是包含编码esx抗原esxO、esxR和esxF的序列的pORF(1017bp)经优化的序列的新形式的核酸序列。所述构建体被称为pORF的新形式(pORF.2)。SEQ ID NO:27为O-R-F编码序列。
TB抗原在具有或不具有IgE信号肽的每一种情况下可以是esat-6蛋白家族的23个成员：esxA至esxW以及TB抗原Ag85A和Ag85B之一，在具有或不具有信号肽和/或位置1上的甲硫氨酸的每一种情况下，可以是与本文中所示的共有序列具有98％或更多同源性的蛋白质、与本文中所示的共有序列具有99％或更多同源性的蛋白质以及与本文中所示的共有序列具有100％同一性的蛋白质。片段可以例如包含或可以例如不包含连接于信号肽诸如免疫球蛋白信号肽(例如IgE信号肽或IgG信号肽)的TB免疫原的片段。
TB抗原可包含在每一种情况下不包含任何IgE信号肽的SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26或SEQ IDNO:28、或SEQ ID NO:2中的单个抗原esxV、esxS和esxW的任一个、或SEQ ID NO:4中的单个抗原esxD、esxQ和esxE的任一个、或SEQ ID NO:6中的单个抗原esxH、esxA和esxT的任一个、或SEQ ID NO:8中的单个抗原esxB、esxC和esxU的任一个、或SEQ ID NO:10中的单个抗原esxO、esxR和esxF中的任一个、或SEQ ID NO:12中的抗原esxA、或SEQ ID NO:14中的单个抗原Ag85A和esxA的任一个、或SEQ ID NO:16中的单个抗原Ag85B和esxA的任一个、或SEQ IDNO:18中的单个抗原esxH、esxA、esxU、esxS、esxD和esx-V的任一个、或SEQ ID NO:20中的单个抗原esxV、esxS和esxW的任一个、或SEQ ID NO:22中的单个抗原esxD、esxQ和esxE的任一个、或SEQ ID NO:24中的单个抗原esxH、esxA和esxT的任一个、或SEQ ID NO:26中的单个抗原esxB、esxC和esxU的任一个、或EQ ID NO:28中的单个抗原抗原esxO、esxR和esxF的任一个。
TB蛋白的同源蛋白可以与不包含IgE信号肽的SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ IDNO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:28，以及与如下在每一种情况下不包含任何IgE信号肽的抗原具有95％或更多、96％或更多、97％或更多、98％或更多或99％或更多的同源性的蛋白质具有95％或更多、96％或更多、97％或更多、98％或更多或99％或更多的同源性：SEQ ID NO:2中的单个抗原esxV、esxS和esxW的任一个、或SEQ ID NO:4中的单个抗原esxD、esxQ和esxE的任一个、或SEQ ID NO:6中的单个抗原esxH、esxA和esxT的任一个、SEQ ID NO:8中的单个抗原esxB、esxC和esxU的任一个、SEQID NO:10中的单个抗原esxO、esxR和esxF中的任一个、SEQ ID NO:12中的抗原esxA、SEQ IDNO:14中的单个抗原Ag85A和esxA的任一个、SEQ ID NO:16中的单个抗原Ag85B和esxA的任一个、SEQ ID NO:18中的单个抗原esxH、esxA、esxU、esxS、esxD和esx-V的任一个、SEQ IDNO:20中的单个抗原esxV、esxS和esxW的任一个、SEQ ID NO:22中的单个抗原esxD、esxQ和esxE的任一个、SEQ ID NO:24中的单个抗原esxH、esxA和esxT的任一个、SEQ ID NO:26中的单个抗原esxB、esxC和esxU的任一个、EQ ID NO:28中的单个抗原抗原esxO、esxR和esxF的任一个。
TB蛋白的片段可包含20％或更多、25％或更多、30％或更多、35％或更多、40％或更多、45％或更多、50％或更多、55％或更多、60％或更多、65％或更多、70％或更多、75％或更多、80％或更多、85％或更多、90％或更多、91％或更多、92％或更多、93％或更多、94％或更多、95％或更多、96％或更多、97％或更多、98％或更多、99％或更多百分比的不包含IgE信号肽的SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ IDNO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ IDNO:24、SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:28。片段还可包含20％或更多、25％或更多、30％或更多、35％或更多、40％或更多、45％或更多、50％或更多、55％或更多、60％或更多、65％或更多、70％或更多、75％或更多、80％或更多、85％或更多、90％或更多、91％或更多、92％或更多、93％或更多、94％或更多、95％或更多、96％或更多、97％或更多、98％或更多、99％或更多百分比的如下在每一种情况下不包含任何IgE信号肽的抗原：SEQ ID NO:2中的单个抗原esxV、esxS和esxW的任一个、SEQ ID NO:4中的单个抗原esxD、esxQ和esxE的任一个、SEQ IDNO:6中的单个抗原esxH、esxA和esxT的任一个、SEQ ID NO:8中的单个抗原esxB、esxC和esxU的任一个、SEQ ID NO:10中的单个抗原esxO、esxR和esxF中的任一个、SEQ ID NO:12中的抗原esxA、SEQ ID NO:14中的单个抗原Ag85A和esxA的任一个、SEQ ID NO:16中的单个抗原Ag85B和esxA的任一个、SEQ ID NO:18中的单个抗原esxH、esxA、esxU、esxS、esxD和esx-V的任一个、SEQ ID NO:20中的单个抗原esxV、esxS和esxW的任一个、SEQ ID NO:22中的单个抗原esxD、esxQ和esxE的任一个、SEQ ID NO:24中的单个抗原esxH、esxA和esxT的任一个、SEQ ID NO:26中的单个抗原esxB、esxC和esxU的任一个、EQ ID NO:28中的单个抗原抗原esxO、esxR和esxF的任一个。
TB蛋白的片段可以是同源蛋白的片段。此类片段包含20％或更多、25％或更多、30％或更多、35％或更多、40％或更多、45％或更多、50％或更多、55％或更多、60％或更多、65％或更多、70％或更多、75％或更多、80％或更多、85％或更多、90％或更多、91％或更多、92％或更多、93％或更多、94％或更多、95％或更多、96％或更多、97％或更多、98％或更多、99％或更多百分比的与不包含IgE信号肽的SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:28的任一个具有95％或更多、96％或更多、97％或更多、98％或更多或99％或更多的同源性的蛋白质。TB蛋白的片段可包含20％或更多、25％或更多、30％或更多、35％或更多、40％或更多、45％或更多、50％或更多、55％或更多、60％或更多、65％或更多、70％或更多、75％或更多、80％或更多、85％或更多、90％或更多、91％或更多、92％或更多、93％或更多、94％或更多、95％或更多、96％或更多、97％或更多、98％或更多、99％或更多百分比的与如下在每一种情况下不包含任何IgE信号肽的抗原具有95％或更多、96％或更多、97％或更多、98％或更多或99％或更多的同源性的蛋白质：SEQ ID NO:2中的单个抗原esxV、esxS和esxW的任一个、SEQ ID NO:4中的单个抗原esxD、esxQ和esxE的任一个、SEQ ID NO:6中的单个抗原esxH、esxA和esxT的任一个、SEQ ID NO:8中的单个抗原esxB、esxC和esxU的任一个、SEQ ID NO:10中的单个抗原esxO、esxR和esxF中的任一个、SEQ ID NO:12中的抗原esxA、SEQ ID NO:14中的单个抗原Ag85A和esxA的任一个、SEQ ID NO:16中的单个抗原Ag85B和esxA的任一个、SEQ ID NO:18中的单个抗原esxH、esxA、esxU、esxS、esxD和esx-V的任一个、SEQ ID NO:20中的单个抗原esxV、esxS和esxW的任一个、SEQ ID NO:22中的单个抗原esxD、esxQ和esxE的任一个、SEQID NO:24中的单个抗原esxH、esxA和esxT的任一个、SEQ ID NO:26中的单个抗原esxB、esxC和esxU的任一个、EQ ID NO:28中的单个抗原抗原esxO、esxR和esxF的任一个。
TB抗原编码序列可包含不包含IgE信号肽的编码序列的SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:27。TB抗原编码序列还可包含编码如下在每一种情况下不包含任何IgE信号肽的抗原的核酸序列：SEQ ID NO:2中的单个抗原esxV、esxS和esxW的任一个、SEQ ID NO:4中的单个抗原esxD、esxQ和esxE的任一个、SEQ ID NO:6中的单个抗原esxH、esxA和esxT的任一个、SEQ IDNO:8中的单个抗原esxB、esxC和esxU的任一个、SEQ ID NO:10中的单个抗原esxO、esxR和esxF中的任一个、SEQ ID NO:12中的抗原esxA、或SEQ ID NO:14中的单个抗原Ag85A和esxA的任一个、或SEQ ID NO:16中的单个抗原Ag85B和esxA的任一个、或SEQ ID NO:18中的单个抗原esxH、esxA、esxU、esxS、esxD和esx-V的任一个、SEQ ID NO:20中的单个抗原esxV、esxS和esxW的任一个、SEQ ID NO:22中的单个抗原esxD、esxQ和esxE的任一个、或SEQ ID NO:24中的单个抗原esxH、esxA和esxT的任一个、或SEQ ID NO:26中的单个抗原esxB、esxC和esxU的任一个、或SEQ ID NO:28中的单个抗原抗原esxO、esxR和esxF的任一个。
与编码TB抗原的编码序列同源的编码序列可与不包含IgE信号肽的编码序列的SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQID NO:25和SEQ ID NO:27具有95％或更多、96％或更多、97％或更多、98％或更多或99％或更多的同源性。与编码TB抗原的编码序列同源的编码序列还可以是与如下编码序列(在每一种情况下不包含编码任何IgE信号肽的编码序列)具有95％或更多、96％或更多、97％或更多、98％或更多或99％或更多的同源性的编码序列：SEQ ID NO:1中的单个抗原esxV、esxS和esxW中的任一个的编码序列、SEQ ID NO:3中的单个抗原esxD、esxQ和esxE的任一个的编码序列、SEQ ID NO:5中的单个抗原esxH、esxA和esxT的任一个的编码序列、SEQ IDNO:7中的单个抗原esxB、esxC和esxU的任一个的编码序列、SEQ ID NO:9中的单个抗原esxO、esxR和esxF的任一个的编码序列、SEQ ID NO:11中的抗原esx-A、或SEQ ID NO:13中的单个抗原抗原Ag85A和esxA的任一个的编码序列、SEQ ID NO:15中的单个抗原抗原Ag85B和esxA的任一个的编码序列、SEQ ID NO:17中的单个抗原esxH、esxA、esxU、esxS、esxD和esx-V的任一个的编码序列、SEQ ID NO:19中的单个抗原esxV、esxS和esxW的任一个的编码序列、SEQ ID NO:21中的单个抗原esxD、esxQ和esxE的任一个的编码序列、SEQ ID NO:23中的单个抗原esxH、esxA和esxT的任一个的编码序列、SEQ ID NO:25中的单个抗原esxB、esxC和esxU的任一个的编码序列、和SEQ ID NO:27中的单个抗原esxO、esxR和esxF的任一个的编码序列。
TB抗原编码序列的片段可包含为20％或更多、25％或更多、30％或更多、35％或更多、40％或更多、45％或更多、50％或更多、55％或更多、60％或更多、65％或更多、70％或更多、75％或更多、80％或更多、85％或更多、90％或更多、91％或更多、92％或更多、93％或更多、94％或更多、95％或更多、96％或更多、97％或更多、98％或更多、99％或更多百分比的特定全长TB抗原编码序列的编码序列长度的全长编码序列的片段。TB抗原编码序列的片段可包含编码20％或更多、25％或更多、30％或更多、35％或更多、40％或更多、45％或更多、50％或更多、55％或更多、60％或更多、65％或更多、70％或更多、75％或更多、80％或更多、85％或更多、90％或更多、91％或更多、92％或更多、93％或更多、94％或更多、95％或更多、96％或更多、97％或更多、98％或更多、99％或更多的如下在每一种情况下不包含任何IgE信号肽的抗原的核酸序列：SEQ ID NO:2中的单个抗原esxV、esxS和esxW的任一个、SEQ IDNO:4中的单个抗原esxD、esxQ和esxE的任一个、SEQ ID NO:6中的单个抗原esxH、esxA和esxT的任一个、SEQ ID NO:8中的单个抗原esxB、esxC和esxU的任一个、SEQ ID NO:10中的单个抗原esxO、esxR和esxF中的任一个、SEQ ID NO:12中的抗原esxA、SEQ ID NO:14中的单个抗原Ag85A和esxA的任一个、SEQ ID NO:16中的单个抗原Ag85B和esxA的任一个、SEQ IDNO:18中的单个抗原esxH、esxA、esxU、esxS、esxD和esx-V的任一个、SEQ ID NO:20中的单个抗原esxV、esxS和esxW的任一个、SEQ ID NO:22中的单个抗原esxD、esxQ和esxE的任一个、SEQ ID NO:24中的单个抗原esxH、esxA和esxT的任一个、SEQ ID NO:26中的单个抗原esxB、esxC和esxU的任一个、SEQ ID NO:28中的单个抗原抗原esxO、esxR和esxF的任一个。
与TB抗原编码序列同源的编码序列的片段可包含20％或更多、25％或更多、30％或更多、35％或更多、40％或更多、45％或更多、50％或更多、55％或更多、60％或更多、65％或更多、70％或更多、75％或更多、80％或更多、85％或更多、90％或更多、91％或更多、92％或更多、93％或更多、94％或更多、95％或更多、96％或更多、97％或更多、98％或更多、99％或更多百分比的可与不包含IgE信号肽的SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ IDNO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:28具有95％或更多、96％或更多、97％或更多、98％或更多或99％或更多的同源性的编码序列的长度。
与TB抗原编码序列同源的编码序列片段可包含20％或更多、25％或更多、30％或更多、35％或更多、40％或更多、45％或更多、50％或更多、55％或更多、60％或更多、65％或更多、70％或更多、75％或更多、80％或更多、85％或更多、90％或更多、91％或更多、92％或更多、93％或更多、94％或更多、95％或更多、96％或更多、97％或更多、98％或更多、99％或更多的可与如下在每一种情况下不包含任何IgE信号肽的抗原具有95％或更多、96％或更多、97％或更多、98％或更多或99％或更多的同源性的编码序列：SEQ ID NO:2中的单个抗原esxV、esxS和esxW的任一个、SEQ ID NO:4中的单个抗原esxD、esxQ和esxE的任一个、SEQID NO:6中的单个抗原esxH、esxA和esxT的任一个、SEQ ID NO:8中的单个抗原esxB、esxC和esxU的任一个、SEQ ID NO:10中的单个抗原esxO、esxR和esxF中的任一个、SEQ ID NO:12中的抗原esxA、SEQ ID NO:14中的单个抗原Ag85A和esxA的任一个、SEQ ID NO:16中的单个抗原Ag85B和esxA的任一个、SEQ ID NO:18中的单个抗原esxH、esxA、esxU、esxS、esxD和esx-V的任一个、SEQ ID NO:20中的单个抗原esxV、esxS和esxW的任一个、SEQ ID NO:22中的单个抗原esxD、esxQ和esxE的任一个、SEQ ID NO:24中的单个抗原esxH、esxA和esxT的任一个、SEQ ID NO:26中的单个抗原esxB、esxC和esxU的任一个、SEQ ID NO:28中的单个抗原抗原esxO、esxR和esxF的任一个。
基因构建体可包含用于核酸的编码序列的基因表达的调控元件。调控元件可以是启动子、增强子、起始密码子、终止密码子或多腺苷酸化信号。
核酸序列可组成可以是载体的基因构建体。载体可以能够以有效地在哺乳动物中引发免疫应答的量在哺乳动物的细胞中表达抗原。载体可以是重组体。载体可包含编码抗原的异源核酸。载体可以是质粒。载体对于用编码抗原的核酸转染细胞可以是有用的，将所述转化的宿主细胞在其中抗原的表达发生的条件下培养和维持。
可针对稳定性和高水平的表达优化编码序列。在一些情况下，选择密码子以减少RNA的二级结构(诸如因分子间键合而形成的二级结构)形成。
3.质粒
本文中提供了能够以有效地在哺乳动物中引发免疫应答的量在哺乳动物的细胞中表达多价TB构建体的载体。所述载体可包含编码一种或多种TB抗原的异源核酸。所述载体可以是质粒。所述质粒对于用编码TB抗原的核酸转染细胞可以是有用，将所述转染的宿主细胞在其中TB抗原的表达发生的条件下进行培养和维持。
质粒可包含编码具有或不具有IgE前导序列的SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ IDNO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:28的编码序列的质粒。质粒可包含编码如下在每一种情都不包含任何IgE信号肽的抗原的编码序列：SEQ ID NO:2中的单个抗原esxV、esxS和esxW的任一个、或SEQ ID NO:4中的单个抗原esxD、esxQ和esxE的任一个、或SEQ ID NO:6中的单个抗原esxH、esxA和esxT的任一个、或SEQ IDNO:8中的单个抗原esxB、esxC和esxU的任一个、SEQ ID NO:10中的单个抗原esxO、esxR和esxF中的任一个、SEQ ID NO:12中的抗原esxA、或SEQ ID NO:14中的单个抗原Ag85A和esxA的任一个、或SEQ ID NO:16中的单个抗原Ag85B和esxA的任一个、或SEQ ID NO:18中的单个抗原esxH、esxA、esxU、esxS、esxD和esx-V的任一个、或SEQ ID NO:20中的单个抗原esxV、esxS和esxW的任一个、或SEQ ID NO:22中的单个抗原esxD、esxQ和esxE的任一个、或SEQ IDNO:24中的单个抗原esxH、esxA和esxT的任一个、或SEQ ID NO:26中的单个抗原esxB、esxC和esxU的任一个、SEQ ID NO:28中的单个抗原esxO、esxR和esxF的任一个。
质粒可包含编码可与具有或不具有IgE前导序列的SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:28具有95％或更多、96％或更多、97％或更多、98％或更多或99％或更多的同源性的蛋白质的编码序列。质粒可包含编码可与如下在每一种情况下不包含任何IgE的信号肽的抗原具有95％或更多、96％或更多、97％或更多、98％或更多或99％或更多的同源性的蛋白质的编码序列：SEQ ID NO:2中的单个抗原esxV、esxS和esxW的任一个、SEQ ID NO:4中的单个抗原esxD、esxQ和esxE的任一个、SEQ ID NO:6中的单个抗原esxH、esxA和esxT的任一个、SEQ IDNO:8中的单个抗原esxB、esxC和esxU的任一个、SEQ ID NO:10中的单个抗原esxO、esxR和esxF中的任一个、SEQ ID NO:12中的抗原esxA、SEQ ID NO:14中的单个抗原Ag85A和esxA的任一个、SEQ ID NO:16中的单个抗原Ag85B和esxA的任一个、SEQ ID NO:18中的单个抗原esxH、esxA、esxU、esxS、esxD和esx-V的任一个、SEQ ID NO:20中的单个抗原esxV、esxS和esxW的任一个、SEQ ID NO:22中的单个抗原esxD、esxQ和esxE的任一个、SEQ ID NO:24中的单个抗原esxH、esxA和esxT的任一个、SEQ ID NO:26中的单个抗原esxB、esxC和esxU的任一个、SEQ ID NO:28中的单个抗原抗原esxO、esxR和esxF的任一个。
质粒可包含编码20％或更多、25％或更多、30％或更多、35％或更多、40％或更多、45％或更多、50％或更多、55％或更多、60％或更多、65％或更多、70％或更多、75％或更多、80％或更多、85％或更多、90％或更多、91％或更多、92％或更多、93％或更多、94％或更多、95％或更多、96％或更多、97％或更多、98％或更多、99％或更多的具有或不具有IgE前导序列的SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ IDNO:24、SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:28的编码序列的的编码序列。质粒可包含编码20％或更多、25％或更多、30％或更多、35％或更多、40％或更多、45％或更多、50％或更多、55％或更多、60％或更多、65％或更多、70％或更多、75％或更多、80％或更多、85％或更多、90％或更多、91％或更多、92％或更多、93％或更多、94％或更多、95％或更多、96％或更多、97％或更多、98％或更多、99％或更多的编码在如下每一种情况下不包含任何IgE信号肽的抗原的编码序列的编码序列：SEQ ID NO:2中的单个抗原esxV、esxS和esxW的任一个、或SEQ ID NO:4中的单个抗原esxD、esxQ和esxE的任一个、或SEQ ID NO:6中的单个抗原esxH、esxA和esxT的任一个、或SEQ ID NO:8中的单个抗原esxB、esxC和esxU的任一个、或SEQ ID NO:10中的单个抗原esxO、esxR和esxF中的任一个、或SEQ ID NO:12中的抗原esxA、或SEQ ID NO:14中的单个抗原Ag85A和esxA的任一个、或SEQ ID NO:16中的单个抗原Ag85B和esxA的任一个、或SEQ ID NO:18中的单个抗原esxH、esxA、esxU、esxS、esxD和esx-V的任一个、SEQ ID NO:20中的单个抗原esxV、esxS和esxW的任一个、或SEQ ID NO:22中的单个抗原esxD、esxQ和esxE的任一个、或SEQ ID NO:24中的单个抗原esxH、esxA和esxT的任一个、或SEQ ID NO:26中的单个抗原esxB、esxC和esxU的任一个、或SEQ ID NO:28中的单个抗原抗原esxO、esxR和esxF的任一个。
质粒可包含编码20％或更多、25％或更多、30％或更多、35％或更多、40％或更多、45％或更多、50％或更多、55％或更多、60％或更多、65％或更多、70％或更多、75％或更多、80％或更多、85％或更多、90％或更多、91％或更多、92％或更多、93％或更多、94％或更多、95％或更多、96％或更多、97％或更多、98％或更多、99％或更多的可与具有或不具有IgE前导序列的SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ IDNO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ IDNO:24、SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:28具有95％或更多、96％或更多、97％或更多、98％或更多或99％或更多的同源性的编码序列的编码序列。质粒可包含编码20％或更多、25％或更多、30％或更多、35％或更多、40％或更多、45％或更多、50％或更多、55％或更多、60％或更多、65％或更多、70％或更多、75％或更多、80％或更多、85％或更多、90％或更多、91％或更多、92％或更多、93％或更多、94％或更多、95％或更多、96％或更多、97％或更多、98％或更多、99％或更多的编码可与如下在每一种情况下不包含任何IgE信号肽的抗原具有95％或更多、96％或更多、97％或更多、98％或更多或99％或更多的同源性的蛋白质的编码序列的编码序列：SEQ ID NO:2中的单个抗原esxV、esxS和esxW的任一个、SEQ ID NO:4中的单个抗原esxD、esxQ和esxE的任一个、SEQ ID NO:6中的单个抗原esxH、esxA和esxT的任一个、SEQID NO:8中的单个抗原esxB、esxC和esxU的任一个、SEQ ID NO:10中的单个抗原esxO、esxR和esxF中的任一个、SEQ ID NO:12中的抗原esxA、SEQ ID NO:14中的单个抗原Ag85A和esxA的任一个、SEQ ID NO:16中的单个抗原Ag85B和esxA的任一个、SEQ ID NO:18中的单个抗原esxH、esxA、esxU、esxS、esxD和esx-V的任一个、SEQ ID NO:20中的单个抗原esxV、esxS和esxW的任一个、SEQ ID NO:22中的单个抗原esxD、esxQ和esxE的任一个、SEQ ID NO:24中的单个抗原esxH、esxA和esxT的任一个、SEQ ID NO:26中的单个抗原esxB、esxC和esxU的任一个、SEQ ID NO:28中的单个抗原抗原esxO、esxR和esxF的任一个。
质粒可包含具有或不具有IgE前导序列的SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:27。质粒可包含编码如下在每一种情况下不包含任何IgE信号肽的抗原的编码序列：SEQ ID NO:1中的单个抗原esxV、esxS和esxW中的任一个、或SEQ ID NO:3中的单个抗原esxD、esxQ和esxE的任一个、或SEQ ID NO:5中的单个抗原esxH、esxA和esxT的任一个、或SEQ ID NO:7中的单个抗原esxB、esxC和esxU的任一个、或SEQ ID NO:9中的单个抗原esxO、esxR和esxF的任一个、或SEQ ID NO:11中的抗原esxA、或SEQ ID NO:13中的单个抗原抗原Ag85A和esxA的任一个、或SEQ ID NO:15中的单个抗原抗原Ag85B和esxA的任一个、或SEQ ID NO:17中的单个抗原esxH、esxA、esxU、esxS、esxD和esx-V的任一个、或SEQ ID NO:19中的单个抗原esxV、esxS和esxW的任一个、或SEQ ID NO:21中的单个抗原esxD、esxQ和esxE的任一个、或SEQ ID NO:23中的单个抗原esxH、esxA和esxT的任一个、或SEQ ID NO:25中的单个抗原esxB、esxC和esxU的任一个、或SEQ ID NO:25中的单个抗原esxO、esxR和esxF的任一个。
质粒可包含编码可与具有或不具有IgE前导序列的SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:27具有95％或更多、96％或更多、97％或更多、98％或更多或99％或更多的同源性的蛋白质的编码序列。质粒可包含编码可与如下在每一种情况下不包含任何IgE信号肽的抗原具有95％或更多、96％或更多、97％或更多、98％或更多或99％或更多的同源性的蛋白质的编码序列：SEQ ID NO:1中的单个抗原esxV、esxS和esxW中的任一个、SEQ ID NO:3中的单个抗原esxD、esxQ和esxE的任一个、SEQ ID NO:5中的单个抗原esxH、esxA和esxT的任一个、SEQ IDNO:7中的单个抗原esxB、esxC和esxU的任一个、SEQ ID NO:9中的单个抗原esxO、esxR和esxF的任一个、SEQ ID NO:11中的抗原esxA、SEQ ID NO:13中的单个抗原抗原Ag85A和esxA的任一个、SEQ ID NO:15中的单个抗原抗原Ag85B和esxA的任一个、SEQ ID NO:17中的单个抗原esxH、esxA、esxU、esxS、esxD和esx-V的任一个。
质粒可包含编码20％或更多、25％或更多、30％或更多、35％或更多、40％或更多、45％或更多、50％或更多、55％或更多、60％或更多、65％或更多、70％或更多、75％或更多、80％或更多、85％或更多、90％或更多、91％或更多、92％或更多、93％或更多、94％或更多、95％或更多、96％或更多、97％或更多、98％或更多、99％或更多的具有或不具有IgE前导序列的SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:27的编码序列的编码序列。质粒可包含编码20％或更多、25％或更多、30％或更多、35％或更多、40％或更多、45％或更多、50％或更多、55％或更多、60％或更多、65％或更多、70％或更多、75％或更多、80％或更多、85％或更多、90％或更多、91％或更多、92％或更多、93％或更多、94％或更多、95％或更多、96％或更多、97％或更多、98％或更多、99％或更多的编码如下在每一种情况下不包含任何IgE信号肽的抗原的编码序列的编码序列：SEQ ID NO:1中的单个抗原esxV、esxS和esxW中的任一个、或SEQ ID NO:3中的单个抗原esxD、esxQ和esxE的任一个、SEQ ID NO:5中的单个抗原esxH、esxA和esxT的任一个、或SEQ ID NO:7中的单个抗原esxB、esxC和esxU的任一个、或SEQ ID NO:9中的单个抗原esxO、esxR和esxF的任一个、或SEQ ID NO:11中的抗原esxA、或SEQ ID NO:13中的单个抗原抗原Ag85A和esxA的任一个、或SEQ ID NO:15中的单个抗原抗原Ag85B和esxA的任一个、或SEQ ID NO:17中的单个抗原esxH、esxA、esxU、esxS、esxD和esx-V的任一个、或SEQ IDNO:19中的单个抗原esxV、esxS和esxW的任一个、或SEQ ID NO:21中的单个抗原esxD、esxQ和esxE的任一个、或SEQ ID NO:23中的单个抗原esxH、esxA和esxT的任一个、或SEQ ID NO:25中的单个抗原esxB、esxC和esxU的任一个、或SEQ ID NO:27中的单个抗原esxO、esxR和esxF的任一个。
质粒可包含编码20％或更多、25％或更多、30％或更多、35％或更多、40％或更多、45％或更多、50％或更多、55％或更多、60％或更多、65％或更多、70％或更多、75％或更多、80％或更多、85％或更多、90％或更多、91％或更多、92％或更多、93％或更多、94％或更多、95％或更多、96％或更多、97％或更多、98％或更多、99％或更多的可与具有或不具有IgE前导序列的SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ IDNO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ IDNO:23、SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:27具有95％或更多、96％或更多、97％或更多、98％或更多或99％或更多的同源性的编码序列的编码序列。质粒可包含编码20％或更多、25％或更多、30％或更多、35％或更多、40％或更多、45％或更多、50％或更多、55％或更多、60％或更多、65％或更多、70％或更多、75％或更多、80％或更多、85％或更多、90％或更多、91％或更多、92％或更多、93％或更多、94％或更多、95％或更多、96％或更多、97％或更多、98％或更多、99％或更多的编码可与如下在每一种情况下不包含任何IgE信号肽的抗原具有95％或更多、96％或更多、97％或更多、98％或更多或99％或更多的同源性的蛋白质的编码序列的编码序列：SEQ ID NO:1中的单个抗原esxV、esxS和esxW中的任一个、SEQ ID NO:3中的单个抗原esxD、esxQ和esxE的任一个、SEQ ID NO:5中的单个抗原esxH、esxA和esxT的任一个、SEQ ID NO:7中的单个抗原esxB、esxC和esxU的任一个、SEQ ID NO:9中的单个抗原esxO、esxR和esxF的任一个、SEQ ID NO:11中的抗原esxA、SEQ ID NO:13中的单个抗原抗原Ag85A和esxA的任一个、SEQ ID NO:15中的单个抗原抗原Ag85B和esxA的任一个、SEQ ID NO:17中的单个抗原esxH、esxA、esxU、esxS、esxD和esx-V的任一个、SEQ ID NO:19中的单个抗原esxV、esxS和esxW的任一个、SEQ ID NO:21中的单个抗原esxD、esxQ和esxE的任一个、SEQID NO:23中的单个抗原esxH、esxA和esxT的任一个、SEQ ID NO:25中的单个抗原esxB、esxC和esxU的任一个、SEQ ID NO:27中的单个抗原esxO、esxR和esxF的任一个。
本文中公开的实施方案由包含30种蛋白质的编码序列的9种质粒组成。存在一些重复，但仍然存在由9种质粒编码的30种蛋白质。在一些实施方案中，存在6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18种质粒。编码序列可以以不同的顺序存在。编码序列可存在于不同的质粒上，包含在具有指定在本文中公开的实施方案中的其它质粒上的编码序列的质粒上。
质粒还可包含可在编码序列的上游的起始密码子，和可在编码序列的下游的终止密码子。所述起始和终止密码子可在具有编码序列的框内。
所述质粒还可包含有效地连接于编码序列的启动子。有效地连接于编码序列的启动子可以是来自猿猴病毒40(SV40)的启动子、小鼠乳房肿瘤病毒(MMTV)启动子、人免疫缺陷病毒(HIV)启动子诸如牛免疫缺陷病毒(BIV)长末端重复(LTR)启动子、莫洛尼病毒(Moloney virus)启动子、禽类白血病病毒(ALV)启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子诸如CMV立即早期启动子、爱泼斯坦-巴尔病毒(Epstein Barr virus、EBV)启动子或劳斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus、RSV)启动子。所述启动子还可以是来自人基因诸如人肌动蛋白、人肌球蛋白、人血红蛋白、人肌肉肌酸或人金属硫蛋白的启动子。所述启动子还可以是组织特异性启动子，诸如肌肉或皮肤特异性启动子(天然或合成的)。此类启动子的实例描述于美国专利申请公开no.US20040175727中，其内容以其整体并入本文。
所述质粒还可包含多腺苷酸化信号，其可位于编码序列的下游。所述多聚腺苷酸化信号可以是SV40多聚腺苷酸化信号、LTR多聚腺苷酸化信号、牛生长激素(bGH)多聚腺苷酸化信号、人生长激素(hGH)多聚腺苷酸化信号或人β-珠蛋白多聚腺苷酸化信号。所述SV40多聚腺苷酸化信号可以是来自pCEP4质粒(Invitrogen，San Diego，CA)的多聚腺苷酸化信号。
所述质粒还可包含在编码序列的上游增强子。所述增强子可以是人肌动蛋白、人肌球蛋白、人血红蛋白、人肌肉肌酸或病毒增强子，诸如来自CMV、FMDV、RSV或EBV的增强子。多核苷酸功能增强子描述于美国专利No.5,593,972、5,962,428和WO94/016737中，其各自的内容通过引用完全并入。
所述质粒还可包含哺乳动物复制起始点以在染色体外维持质粒并在细胞中产生多个拷贝的质粒。所述质粒可以是来自Invitrogen(San Diego，CA)的pVAXI、pCEP4或pREP4，所述质粒可包含爱泼斯坦-巴尔病毒复制起始点和细胞核抗原EBNA-1编码区，其可产生高拷贝附加型复制而无需整合。
载体可以是pVAX1或具有变化的pVax1诸如本文中描述的变异质粒。变异pVax1质粒为主链载体质粒pVAX1的2998个碱基对的变体(Invitrogen，Carlsbad CA)。CMV启动子位于碱基137-724。T7启动子/引发位点位于碱基664-683。多克隆位点位于碱基696-811。牛GH多腺苷酸化信号位于碱基829-1053。卡那霉素抗性基因位于碱基1226-2020。pUC起始点位于碱基2320-2993。
基于可从Invitrogen获得的pVAX1的序列，在用作本文中所示的质粒1-6的主链的pVAX1的序列中发现下列突变：
C>G241在CMV启动子中
C>T 1942主链，牛生长激素多腺苷酸化信号(bGHpolyA)的下游
A>-2876主链，卡那霉素基因的下游
C>T 3277在pUC复制起始点(Ori)中，高拷贝数突变(参见Nucleic Acid Research1985)
G>C3753正好在RNASeH位点的上游的pUC Ori末端
CMV启动子上游离的主链中的碱基对2、3和4被从ACT改变成CTG。
载体的主链可以为pAV0242。载体可以是复制缺陷型腺病毒5型(Ad5)载体。
所述质粒还可包含调控序列，其可非常适合用于在施用了质粒的细胞中进行基因表达。所述编码序列可包含可允许编码序列在宿主细胞中更高效转录的密码子。
所述编码序列还可包含Ig前导序列。所述前导序列可以是编码序列的5’。由该序列编码的共有抗原可包含N末端Ig前导序列和随后的共有抗原蛋白。所述N末端Ig前导序列可以是IgE或IgG。
所述质粒可以是pSE420(Invitrogen，San Diego，Calif.)，其可用于在大肠杆菌(Escherichia coli，E.coli)中产生蛋白质。所述质粒还可以是pYES2(Invitrogen，SanDiego，Calif.)，其可用于在酵母的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株中产生蛋白质。所述质粒还可以是MAXBACTM完全杆状病毒表达系统(Invitrogen，San Diego，Calif.)的质粒，其可用于在昆虫细胞中产生蛋白质。所述质粒还可以是pcDNA I或pcDNA3(Invitrogen，San Diego，Calif.)，其可用于在哺乳动物细胞诸如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中产生蛋白质。
4.药物组合物和疫苗
提供了包含核酸分子的组合物。例如，组合物可包含众多的6、7、8、9、10或更多种不同的质粒。
组合物可包含载体pVSW、pDQE、pHAT、pBCU、pORF、TE6.AE6、BE6、phDV、pVSW.2、pDQE.2、pHAT.2、pBCU.2、pORF.2。可使用具有不同数目的质粒的其它组合。
在一些实施方案中，提供了包含5种质粒的疫苗，所述每一种质粒具有esx-抗原的编码序列。在一些实施方案中，疫苗是包含如下质粒的组合物：包含V-S-W构建体的质粒、包含D-Q-E构建体的质粒、包含H-A-T构建体的质粒、包含B-C-U构建体的质粒和包含O-R-F构建体的质粒。在一些此类实施方案中，包含V-S-W构建体的质粒可包含SEQ ID NO:19或SEQID NO:1。在一些此类实施方案中，包含D-Q-E构建体的质粒可包含SEQ ID NO:21或SEQ IDNO:3。在一些此类实施方案中，包含H-A-T构建体的质粒可包含SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:5。在一些此类实施方案中，包含B-C-U构建体的质粒可包含SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:7。在一些此类实施方案中，包含O-R-F构建体的质粒可包含SEQ ID NO:27或SEQ ID NO:9。在一些实施方案中，疫苗是包含如下质粒的组合物：a)包含SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:1的质粒、b)包含SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:3的质粒、c)包含SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:5的质粒、d)包含SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:7的质粒和e)包含SEQ ID NO:27或SEQ ID NO:9的质粒。在一些实施方案中，疫苗是包含如下质粒的组合物：a)包含SEQ ID NO:19的质粒；b)包含SEQ ID NO:21的质粒；c)包含SEQ ID NO:23的质粒；d)包含SEQ ID NO:25的质粒；和e)包含SEQ ID NO:27的质粒。
在一些实施方案中，组合物还包含趋化因子CCL20、IL-12、IL-15和/或IL-28的编码序列。可将.趋化因子CCL20、IL-12、IL-15和/或IL-28的编码序列包含在编码一个或多个TB抗原的序列的一个或多个核酸分子中。可将趋化因子CCL20、IL-12、IL-15和/或IL-28的编码序列包含在单独的核酸分子诸如单独的质粒上。
本文中提供了能够在哺乳动物中产生抗TB的免疫应答的疫苗。所述疫苗可包含上文中论述的每一种质粒。所述疫苗可包含多个所述质粒或其组合。所述疫苗可被提供来诱导治疗性或预防性免疫应答。
所述疫苗可以以药物组合物的形式存在。所述药物组合物可包含所述疫苗。
所述疫苗可以1纳克至100毫克、约1微克至约10毫克，或优选地约0.1微克至约10毫克，或更优选约1毫克至约2毫克的量包含共有抗原和质粒。在更优选实施方案中，根据本发明的药物组合物包含约5纳克至约1000微克的DNA。在一些优选实施方案中，药物组合物包含约10纳克至约800微克的DNA。在一些优选实施方案中，药物组合物含有约25至约250微克、约100至约200微克、约1纳克至100毫克、约1微克至约10毫克、约0.1微克至约10毫克、约1毫克至约2毫克、约5纳克至约1000微克、约10纳克至约800微克、约0.1至约500微克、约1至约350微克、约25至约250微克、约100至约200微克的共有抗原或其质粒。药物组合物可包含约5纳克至约10mg的疫苗DNA。在一些实施方案中，根据本发明的药物组合物含有约25纳克至约5mg的疫苗DNA。在一些实施方案中，药物组合物含有约50纳克至约1mg的DNA。在一些实施方案中，药物组合物含有约0.1至约500微克的DNA。在一些实施方案中，药物组合物含有约1至约350微克的DNA。在一些实施方案中，药物组合物含有约5至约250微克的DNA。在一些实施方案中，药物组合物含有约10至约200微克的DNA。在一些实施方案中，药物组合物含有约15至约150微克的DNA。在一些实施方案中，药物组合物含有约20至约100微克的DNA。在一些实施方案中，药物组合物含有约25至约75微克的DNA。在一些实施方案中，药物组合物含有约30至约50微克的DNA。在一些实施方案中，药物组合物含有约35至约40微克的DNA。在一些实施方案中，药物组合物含有约100至约200微克的DNA。在一些实施方案中，药物组合物含有约10微克至约100微克的DNA。在一些实施方案中，药物组合物含有约20微克至约80微克的DNA。在一些实施方案中，药物组合物含有约25至约60微克的DNA。在一些实施方案中，药物组合物含有约30纳克至约50微克的DNA。在一些实施方案中，药物组合物含有约35纳克至约45微克的DNA。在一些优选实施方案中，药物组合物含有约0.1至约500微克的DNA。在一些优选实施方案中，药物组合物含有约1至约350微克的DNA。在一些优选实施方案中，药物组合物含有约25至约250微克的DNA。在一些优选实施方案中，药物组合物含有约100至约200微克的DNA。
在一些实施方案中，根据本发明的药物组合物包含至少10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100纳克的疫苗的DNA。在一些实施方案中，药物组合物可包含至少1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95,100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245、250、255、260、265、270、275、280、285、290、295、300、305、310、315、320、325、330、335、340、345、350、355、360、365、370、375、380、385、390、395、400、405、410、415、420、425、430、435、440、445、450、455、460、465、470、475、480、485、490、495、500、605、610、615、620、625、630、635、640、645、650、655、660、665、670、675、680、685、690、695、700、705、710、715、720、725、730、735、740、745、750、755、760、765、770、775、780、785、790、795、800、805、810、815、820、825、830、835、840、845、850、855、860、865、870、875、880、885、890、895.900、905、910、915、920、925、930、935、940、945、950、955、960、965、970、975、980、985、990、995或1000微克的疫苗的DNA。在一些实施方案中，药物组合物可包含至少1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5或10mg或更多的疫苗的DNA。
在其它实施方案中，药物组合物可包含高达(和包括)15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100纳克的疫苗的DNA。在一些实施方案中，药物组合物可包含高达(和包括)1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95,100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245、250、255、260、265、270、275、280、285、290、295、300、305、310、315、320、325、330、335、340、345、350、355、360、365、370、375、380、385、390、395、400、405、410、415、420、425、430、435、440、445、450、455、460、465、470、475、480、485、490、495、500、605、610、615、620、625、630、635、640、645、650、655、660、665、670、675、680、685、690、695、700、705、710、715、720、725、730、735、740、745、750、755、760、765、770、775、780、785、790、795、800、805、810、815、820、825、830、835、840、845、850、855、860、865、870、875、880、885、890、895.900、905、910、915、920、925、930、935、940、945、950、955、960、965、970、975、980、985、990、995或1000微克的疫苗的DNA。在一些实施方案中，药物组合物可包含高达(和包括)1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5或10mg的疫苗的DNA。
药物组合物还可根据待使用的施用模式包含用于配制目的的其它试剂。在其中药物组合物是可注射药物组合物的情况下，它们是无菌的、无热原的和无颗粒的。优选使用等渗制剂。一般地，用于等渗的添加剂可以包括氯化钠、葡萄糖、甘露醇、山梨醇和乳糖。在一些情况下，等渗溶液诸如磷酸盐缓冲盐水是优选的。稳定剂包括明胶和白蛋白。在一些实施方案中，血管收缩剂被添加至制剂中。
疫苗还可包含药学上可接受的赋形剂。药学上可接受的赋形剂可以是功能性分子诸如媒介物、佐剂、载体或稀释剂。药学上可接受的赋形剂可以是转染促进剂，其可包括表面活性剂，诸如免疫刺激复合物(ISCOMS)、弗氏不完全佐剂(Freunds incompleteadjuvant)，LPS类似物，包括单磷酰脂质A、胞壁酰肽、醌类似物、囊泡诸如角鲨烯和角鲨烯、透明质酸、脂质、脂质体、钙离子、病毒蛋白、聚阴离子、聚阳离子或纳米颗粒，或其它已知的转染促进剂。
转染促进剂是多聚阴离子、多聚阳离子，包括聚-L-谷氨酸盐(LGS)或脂质。转染促进剂是聚-L-谷氨酸盐，并且更优选地，所述聚-L-谷氨酸以低于6mg/ml的浓度存在于疫苗中。转染促进剂还可包括表面活性剂诸如免疫刺激复合物(ISCOMS)、弗氏不完全佐剂，LPS类似物，包括单磷酰脂质A、胞壁酰肽、醌类似物和囊泡诸如角鲨烯和角鲨烯，并且还可将透明质酸与基因构建体结合施用。在一些实施方案中，所述DNA载体疫苗还可包括转染促进剂，诸如脂质、脂质体，包括卵磷脂脂质体或本领域中已知的其它脂质体，作为DNA-脂质体混合物(参见例如W09324640)、钙离子、病毒蛋白质、聚阴离子、聚阳离子或纳米颗粒，或其它已知的转染促进剂。优选地，所述转染促进剂是聚阴离子、聚阳离子，包括聚-L-谷氨酸盐(LGS)或脂质。疫苗中的转染剂的浓度低于4mg/ml、低于2mg/ml、低于1mg/ml、低于0.750mg/ml、低于0.500mg/ml、低于0.250mg/ml、低于0.100mg/ml、低于0.050mg/ml或低于0.010mg/ml。
所述药学上可接受的赋形剂可以是佐剂。所述佐剂可以是在可选择的质粒中表达的其它基因或作为疫苗中与上述质粒组合的蛋白质被去神经系统化。所述佐剂可选自由以下组成的组：α-干扰素(IFN-α)、β-干扰素(IFN-β)、γ-干扰素、血小板衍生生长因子(PDGF)、TNFα、TNFβ、GM-CSF、表皮生长因子(EGF)、皮肤T细胞虏获趋化因子(CTACK)、胸腺上皮细胞表达趋化因子(TECK)、粘膜相关上皮趋化因子(MEC)、IL-12、IL-15、MHC、CD80、CD86，包括IL-15(具有信号序列或缺失信号序列，和任选地包含来自IgE的信号肽)。所述佐剂可以是IL-12、IL-15、IL-28、CTACK、TECK、血小板衍生生长因子(PDGF)、TNFα、TNFβ、GM-CSF、表皮生长因子(EGF)、IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12、IL-18或其组合。在示例性实施方案中，所述佐剂是IL-12。
可以是有用的佐剂的其它基因包括编码MCP-1、MIP-1a、MIP-1p、IL-8、RANTES、L-选择蛋白、P-选择蛋白、E-选择蛋白、CD34、GlyCAM-1、MadCAM-1、LFA-1、VLA-1、Mac-1、pl50.95、PECAM、ICAM-1、ICAM-2、ICAM-3、CD2、LFA-3、M-CSF、G-CSF、IL-4、IL-18的突变体形式、CD40、CD40L、血管生长因子、成纤维细胞生长因子、IL-7、神经生长因子、血管内皮生长因子、Fas、TNF受体、Flt、Apo-1、p55、WSL-1、DR3、TRAMP、Apo-3、AIR、LARD、NGRF、DR4、DR5、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2、DR6、胱天蛋白酶ICE、Fos、c-jun、Sp-1、Ap-1、Ap-2、p38、p65Rel、MyD88、IRAK、TRAF6、IkB、无活性NIK、SAP K、SAP-1、JNK、干扰素应答基因、NFkB、Bax、TRAIL、TRAILrec、TRAILrecDRC5、TRAIL-R3、TRAIL-R4、RANK、RANK LIGAND、Ox40、Ox40LIGAND、NKG2D、MICA、MICB、NKG2A、NKG2B、NKG2C、NKG2E、NKG2F、TAP1、TAP2及其功能性片段或其组合的那些基因。
在一些实施方案中，佐剂可以是一种或多种蛋白质和/或编码选自由CCL-20、IL-12、IL-15、IL-28、CTACK、TECK、MEC或RANTES组成的组的蛋白质的核酸分子。IL-12构建体和序列的实例公开于PCT申请no.PCT/US1997/019502以及对应的美国申请序列No.08/956,865和2011年12月12日提交的美国临时申请序列No61/569600中，其各自通过引用并入本文。IL-15构建体和序列的实例公开于PCT申请no.PCT/US04/18962和对应的美国申请序列No.10/560,650中，以及PCT申请no.PCT/US07/00886和对应的美国申请序列No.12/160,766中和PCT申请no.PCT/US10/048827中，其各自通过引用并入本文。IL-28构建体和序列的实例公开于PCT申请no.PCT/US09/039648和对应的美国申请序列No.12/936,192中，其各自通过引用并入本文。RANTES以及其它构建体和序列的实例公开于PCT申请no.PCT/US1999/004332和对应的美国申请序列No.09/622452中，其各自通过引用并入本文。RANTES构建体和序列的其它实例公开于PCT申请no.PCT/US11/024098中，其通过引用并入本文。RANTES以及其它构建体和序列的实例公开于PCT申请no.PCT/US1999/004332和对应的美国申请序列No.09/622452中，其各自通过引用并入本文。RANTES构建体和序列的其它实例公开于PCT申请no.PCT/US11/024098中，其通过引用并入本文。趋化因子CTACK、TECK和MEC构建体及序列的实例公开于PCT申请no.PCT/US2005/042231和对应的美国申请序列No.11/719,646中，其各自通过引用并入本文。OX40和其它免疫调节剂的实例公开于美国申请序列No.10/560,653中，其通过引用并入本文。DR5和其它免疫调节剂的实例公开于美国申请序列No.09/622452中，其通过引用并入本文。
所述疫苗还可包含如1994年4月1日提交的美国序列No.021,579(其通过引用整体并入)中描述的基因疫苗促进剂。
可按照待使用的施用模式配制疫苗。可注射疫苗药物组合物可以是无菌、无热原和无颗粒的。可使用等渗制剂或溶液。用于等渗性的添加剂可包括氯化钠、葡萄糖、甘露醇、山梨醇和乳糖。所述疫苗可包含血管收缩剂。等渗溶液可包括磷酸盐缓冲盐水。疫苗还可包含稳定剂，包括明胶和白蛋白。所述稳定可使得制剂在室温或环境温度长时间稳定，诸如向疫苗制剂添加LGS或聚阳离子或聚阴离子。
所述疫苗可以是DNA疫苗。在美国专利5,593,972、5,739,118、5,817,637、5,830,876、5,962,428、5,981,505、5,580,859、5,703,055和5,676,594(所述专利通过引用完全并入本文)中公开了DNA疫苗。DNA疫苗还可包含抑制其整合进染色体的元件或试剂。
在美国专利No.4,510,245、4,797,368、4,722,848、4,790,987、4,920,209、5,017,487、5,077,044、5,110,587、5,112,749、5,174,993、5,223,424、5,225,336、5,240,703、5,242,829、5,294,441、5,294,548、5,310,668、5,387,744、5,389,368、5,424,065、5,451,499、5,453,3 64、5,462,734、5,470,734、5,474,935、5,482,713、5,591,439、5,643,579、5,650,309、5,698,202、5,955,088、6,034,298、6,042,836、6,156,319和6,589,529(所述专利各自通过引用并入本文)中描述了减毒活疫苗、将重组载体用于外来抗原的那些疫苗、亚单位疫苗和糖蛋白疫苗的实例。
基因构建体还可以是重组病毒载体的基因组的部分，包括重组腺病毒、重组腺病毒相关病毒和重组痘苗病毒。基因构建体可以是减毒活微生物或生活在细胞中的重组微生物载体中的遗传物质的部分。
5.递送疫苗的方法
本文中提供了用于递送疫苗以提供遗传构建体和共有抗原的抗原蛋白的方法，所述抗原蛋白包含使得它们特别有效地抗可诱导针对其的免疫应答的TB的免疫原的表位。可提供递送疫苗或接种的方法以诱导治疗性和预防性免疫应答。接种方法可在哺乳动物中产生针对TB的免疫应答。所述疫苗可被递送至个体以调节哺乳动物的免疫系统的活性和增强免疫应答。疫苗的递送可以是将共有抗原作为在细胞中表达并被递送至细胞的表面上的核酸分子进行的转染，免疫系统识别细胞表面上的所述抗原并诱导细胞、体液或细胞和体液应答。疫苗的递送可用于通过向哺乳动物施用如上所述的疫苗以诱导或引发哺乳动物的针对TB的免疫应答。
当将所述疫苗和质粒递送进哺乳动物的细胞时，所述转染的细胞将表达并分泌从疫苗注射的每一种质粒的共有抗原。这些蛋白质将被免疫系统识别为外来物，并且将针对它们产生抗体。这些抗体将由免疫系统维持，并且允许针对随后的TB感染的有效应答。
在美国专利No.4,945,050和5,036,006(所述两个美国专利通过引用以其整体并入本文)中描述了递送DNA疫苗的方法。
可向哺乳动物施用所述疫苗以引发哺乳动物的免疫应答。所述哺乳动物可以是人、灵长类动物、非人灵长类动物、母牛、牛、绵羊、山羊、羚羊、野牛、水牛、野牛、牛科动物、鹿、刺猬、大象、骆驼、羊驼、小鼠、大鼠和鸡。
所述疫苗可用于在哺乳动物中产生免疫应答，包括治疗性或预防性免疫应答。所述免疫应答可产生针对一种或多种TB抗原的抗体和/或杀伤T细胞。可分离此类抗体和T细胞。
一些实施方案提供产生抗一种或多种TB抗原的免疫应答的方法，所述方法包括向个体施用所述疫苗。一些实施方案提供预防性接种个体以抗TB感染的方法，所述方法包括施用所述疫苗。一些实施方案提供治疗性接种已被TB感染的个体的方法，所述方法包括施用所述疫苗。可在施用疫苗之前常规地诊断TB感染。
所述疫苗诱导体液免疫原性并提供抗利用TB的致死攻击的保护作用，从而在利用如本文中描述的多价TB疫苗构建体接种后提供70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的抗致死攻击的保护作用。
a.组合治疗
可将所述疫苗与其它蛋白质和/或编码如下蛋白的基因组合施用：CCL20、α-干扰素、γ-干扰素、血小板衍生生长因子(PDGF)、TNFα、TNFβ、GM-CSF、表皮生长因子(EGF)、皮肤T细胞虏获趋化因子(CTACK)、胸腺上皮细胞表达趋化因子(TECK)、粘膜相关上皮趋化因子(MEC)、IL-12、IL-15包括具有缺失的信号序列和任选地包含不同的信号肽诸如IgE信号肽的IL-15、MHC、CD80、CD86、IL-28、IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-18、MCP-1、MIP-1α、MIP-1β、IL-8、RANTES、L-选择蛋白、P-选择蛋白、E-选择蛋白、CD34、GlyCAM-1、MadCAM-1、LFA-1、VLA-1、Mac-1、pl50.95、PECAM、ICAM-1、ICAM-2、ICAM-3、CD2、LFA-3、M-CSF、G-CSF、IL-18的突变体形式、CD40、CD40L、血管生长因子、成纤维细胞生长因子、IL-7、神经生长因子、血管内皮生长因子、Fas、TNF受体、Flt、Apo-1、p55、WSL-1、DR3、TRAMP、Apo-3、AIR、LARD、NGRF、DR4、DR5、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2、DR6、胱天蛋白酶ICE、Fos、c-jun、Sp-1、Ap-1、Ap-2、p38、p65Rel、MyD88、IRAK、TRAF6、IkB、无活性NIK、SAP K、SAP-1、JNK、干扰素应答基因、NFkB、Bax、TRAIL、TRAILrec、TRAILrecDRC5、TRAIL-R3、TRAIL-R4、RANK、RANK LIGAND、Ox40、Ox40LIGAND、NKG2D、MICA、MICB、NKG2A、NKG2B、NKG2C、NKG2E、NKG2F、TAP1、TAP2及其功能性片段或其组合。在一些实施方案中，将所述疫苗与一种或多种下列核酸分子和/或蛋白质组合施用：选自由包含编码CCL20、IL-12、IL-15、IL-28、CTACK、TECK、MEC和RANTES或其功能性片段的一种或多种的编码序列的核酸分子组成的组的核酸分子，和选自由CCL02、IL-12蛋白、IL-15蛋白、IL-28蛋白、CTACK蛋白、TECK蛋白、MEC蛋白或RANTES蛋白或其功能性片段组成的组的蛋白。
疫苗可以通过不同的途径(包括口服、胃肠外、舌下、经皮、经直肠、经粘膜、局部、经由吸入、经颊施用、胸膜内、静脉内、动脉内、腹膜内、皮下、肌内、鼻内鞘内和关节内或其组合)施用。对于兽医学用途，可按照正常兽医实践作为适当地可接受的制剂施用组合物。兽医可以容易地确定最适合于特定动物的给药方案和施用途径。疫苗可通过常规注射器、无针注射装置、“微粒轰击基因枪”或其它物理方法诸如电穿孔(“EP”)、“流体动力法”或超声波进行施用。
可利用几种公知的技术将疫苗的质粒递送至哺乳动物，所述技术包括利用和不利用体内电穿孔的DNA注射(也称为DNA接种)、脂质体介导的、纳米颗粒促进的重组载体诸如重组腺病毒、重组腺病毒相关病毒和重组痘苗病毒。可经由DNA注射并连同体内电穿孔递送共有抗原。
b.电穿孔
疫苗或药物组合物可通过电穿孔来施用。可使用电穿孔装置来实现经由本发明的质粒的电穿孔的疫苗的施用，所述电穿孔装置被构造来向哺乳动物的期望的组织递送有效地在细胞膜中引起可逆孔形成的能量的脉冲，并且优选的能量脉冲是与由用户预设的电流输入相似的恒定电流。电穿孔装置可包括电穿孔组件和电极部件或操作部件。电穿孔组件可包括和包含电穿孔装置的各种元件的一个或多个，包括：控制器、电流波形发生器、阻抗测试器、波形记录器、输入元件、状态报告元件、通信端口、记忆组件、电源和电源开关。电穿孔可使用体内电穿孔装置例如EP系统(Inovio Pharmaceuticals,Inc.,Blue Bell,PA)或Elgen电穿孔仪(Inovio Pharmaceuticals,Inc.)促进质粒对细胞的转染来实现。
电穿孔组件可作为电穿孔装置的一个元件起作用，并且其它元件是与所述电穿孔组件通信的分开的元件(或组件)。电穿孔组件可作为电穿孔装置的多于一个元件起作用，其可以与同所述电穿孔组件分开的所述电穿孔设备的另外的其它元件通信。作为机电装置或机械装置的一部分存在的电穿孔装置的元件可以不受限制，因为所述元件可作为一个装置或作为彼此相互通信的分开的元件起作用。电穿孔组件可以能够递送在期望的组织中产生恒定电流的能量脉冲，并且包括反馈机制。电极部件可包括在空间排列上具有多个电极的电极阵列，其中所述电极组件接收来自电穿孔组件的能量脉冲并将其通过电极递送至期望的组织。多个电极的至少一个在能量脉冲的递送过程中是中性的，并且测量期望的组织的阻抗，以及与将所述阻抗传达给电穿孔组件。反馈机制可接收测量的阻抗，并可调整由电穿孔组件递送的能量脉冲以维持恒定电流。
多个电极可以分散模式递送能量脉冲。多个的电极可通过在程序化顺序下控制电极以分散模式递送能量脉冲，并且所述程序化顺序由用户输入至电穿孔组件中。程序化顺序可包含多个按顺序递送的脉冲，其中多个脉冲的每一个脉冲通过至少两个有源电极(其中一个中性电极测量阻抗)来递送，并且其中多个脉冲的随后脉冲通过至少两个有源电极(一个中性电极测量阻抗)的不同的一个电极来递送。
可通过硬件或软件来进行反馈机制。可通过模拟闭环电路来进行反馈机制。反馈每50μs、20μs、10μs或1μs产生一次，但优选地是实时反馈或瞬时反馈(即，基本上同时的，如通过可获得的测定响应时间的技术测定)。中性电极可测量期望的组织中的阻抗，并将所述阻抗传达到反馈机制，并且所述反馈机制响应所述阻抗并调整能量脉冲以将恒定电流维持在与预设电流相似的值上。反馈机制可在能量脉冲递送过程中连续和瞬时地维持恒定电流。
可促进本发明的DNA疫苗的递送的电穿孔装置和电穿孔方法的实例包括在Draghia-Akli等人的美国专利No.7,245,963、Smith等人提交的美国专利公开2005/0052630(其内容在此通过引用整体并入)中描述的那些电穿孔装置和方法。可用于促进DNA疫苗的递送的其它电穿孔装置和电穿孔方法包括2007年10月17日提交的共同未决和共同拥有的美国专利申请序列No.11/874072中提供的那些电穿孔装置和方法，所述专利申请序列根据35USC 119(e)要求2006年10月17日提交的美国临时申请序列No.60/852,149和2007年10月10日提交的60/978,982(其全都在此整体并入)的权益。
Draghia-Akli等人的美国专利No.7,245,963描述了标准电极系统及它们用于促进将生物分子引入至身体或植物的选择的组织的细胞中的用途。标准电极系统可包含多种针电极；皮下针头；提供从可编程恒定电流脉冲控制器至多个针电极的导电连接的电连接器；和电源。操作者可抓住多个安装在支持结构上的针电极，并将它们牢固地插入身体或植物的选择的组织中。随后经由皮下针头将生物分子递送至选择的组织。激活可编程恒定电流脉冲控制器，并将恒定电流电极脉冲施加于多个针电极。施加的恒定电流电脉冲促进将生物分子引入至多个电极之间的细胞中。美国专利No.7,245,963的整个内容在此通过引用并入。
由Smith等人提交的美国专利公开2005/0052630描述了可用于有效地促进将生物分子引入至身体或植物的选择的组织的细胞中的电穿孔装置。所述电穿孔装置包括其操作通过软件或固件来指定的电动力学装置("EKD装置")。EKD装置基于脉冲参数的用户控制和输入在阵列中的电极之间产生一系列可编程的恒定电流脉冲波形，并且允许存储和获取电流波形数据。电穿孔装置还包含具有一个阵列的针电极的可替换电极盘、用于注射针的中央注射通道和可移去的引导盘。美国专利公开2005/0052630的整个内容在此通过引用并入。
美国专利No.7,245,963和美国专利公开2005/0052630中描述的电极阵列和方法可适用于不仅至组织诸如肌肉，而且还至其它组织或器官内的深度穿透。由于电极阵列的配置，还可将注射针(以递送选择的生物分子)完全插入靶器官中，并且在利用电极预先描绘的区域中垂直于靶组织施用注射剂。美国专利No.7,245,963和美国专利公开2005/005263中描述的电极优选为20mm长和21规格。
此外，在一些包括电穿孔装置及其用途的实施方案中，设想存在电穿孔装置，其为在下列专利：1993年12月28日授予的美国专利5,273,525、2000年8月29日授予的美国专利6,110,161、2001年7月17日授予的6,261,281和2005年10月25日授予的6,958,060，以及2005年9月6日授予的美国专利6,939,862中描述的那些电穿孔装置。此外，本文设想了针对注射DNA的方法设计的涵盖2004年2月24日授予的美国专利6,697,669(其涉及使用各种装置的任一种递送DNA)和2008年2月5日授予的美国专利7,328,064中提供的主题的专利。上述专利通过引用整体并入。
b.制备DNA质粒的方法
本文中提供了用于制备包含本文中论述的DNA疫苗的DNA质粒的方法。所述DNA质粒，在通过最终的亚克隆步骤克隆进哺乳动物的表达质粒后，可使用本领域已知的方法将所述载体用在大规模发酵罐中接种细胞培养物。
可使用已知的装置和技术的组合配制或制造与本发明的EP装置一起使用的DNA质粒，但优选使用2007年5月23日提交的批准的、共同未决的美国临时申请美国序列No.60/939,792中描述的优化的质粒制造技术来制造它们。在一些实例中，可以大于或等于10mg/mL的浓度配制用于这些研究的DNA质粒。所述制造技术除了美国序列No.60/939792中描述的那些装置和方案(包括2007年7月3日授予的批准的专利、美国专利No.7,238,522中描述的那些装置和方案)之外，还包括或包含对于本领域普通技术人员来说是公知的各种装置和方案。以上提及的申请和专利(分别为美国序列No.60/939,792和美国专利No.7,238,522)在此整体并入。
实施例
本发明将在下面的实施例中进一步说明。应理解，这些实施例，虽然指示了本发明的优选实施方案，但仅是以说明性方式给出的。根据上面的讨论和这些实施例，本领域技术人员可确定本发明的本质特征，并且在不背离其精神和范围的情况下，可以对本发明进行各种改变和改进，以使其适应各种用途和条件。因此，根据前述描述，除了本文中显示和描述的那些改进之外的本发明的各种改进对于本领域技术人员来说将显而易见。此类改进也意欲落入所附权利要求的范围内。
实施例1
最初产生总共9种多价TB构建体。它们由以下载体组成：含有15种esat-6家族(esx)蛋白的6种三价pVax载体；融合与两种其它免疫原性TB抗原Ag85A和Ag85B组合的esat6(esxA)的2种二价载体；和表达6种选择的esx蛋白的多价载体。所述esx家族成员在构建体中的分布示于表3中。
所有多价载体通过内源性蛋白水解(费林蛋白酶)切割位点相分隔，所述切割位点允许每一种单独的蛋白质分泌。此外，可合成设计构建体，并优化密码子和RNA以提高表达。此外，如图2中所示，通过点突变修饰所有具有C-甘露糖基化(W-X-X-W(SEQ ID NO:29))或N-连接糖基化(N-X-S/T)规范序列的假定抗原。防止在哺乳动物宿主中产生的细菌递送的序列的哺乳动物糖基化是所述构建的目的。将所有序列合成进pUC57载体中，所述载体在5’末端含有kozak共有序列和IgE前导序列以帮助增强蛋白质效率和合成，以及含有poly A尾以终止翻译。将插入物在BamHI与Xhol位点之间克隆进pVAX表达启动子。在图1A中举例说明了多价质粒的构建体设计。在于小鼠中进行免疫研究之前，蛋白质印迹确认所有构建体的表达。图1B举例说明一些实例。在图2中给出所有构建体的氨基酸序列。
评价由新型esx疫苗在B6小鼠中诱导的体液和细胞免疫应答的量级。通过干扰素-γELISpots测定细胞免疫应答。观察到针对我们的多价载体的特定结合抗体的产生的一些实例。使用酶联免疫吸附测定(ELISA)来检测抗原特异性抗体。在图3和4中报告了针对我们的构建体的体液和细胞免疫原性的实例。
图1A描绘多价esx疫苗质粒的构建和三价表达载体的体外表达。构建多价TB esx疫苗质粒。图1a显示其中ESX序列被克隆进入pVax1载体的位点和方式。
图1B提供显示5种esx构建体的抗原表达的数据。所述数据通过蛋白质印迹产生。使用利用Turbofectin转染的RD细胞进行表达。24小时后，收获细胞，获得总的细胞裂解物，并对蛋白质进行定量。使用抗-HA抗体(HA标签位于转基因的C末端区域)检测合成的蛋白质。将pVAX1用作阴性对照。
图2A和图2B显示多价TB疫苗构建体的经修饰的氨基酸插入物。蛋白质序列显示具有加以下划线的以蓝色/斜体字标示的新型IgE前导序列(如每一N末端上的前18个氨基酸)的所有构建体；费林蛋白酶切割序列位点是小写字母/断开的下划线/以黄色突出显示的；C-甘露糖基化突变加以下划线并以红色标示并且N-连接糖基化突变加以下划线并以粗体标示。具有加以下划线的以粗体标示的氨基酸的抗原(esxA、esxE、esxF、esxU、esxW)具有突变(N-X-S/T至N-X-A)的N-连接糖基化规范序列位点。加以双下划线的以红色标示的氨基酸具有突变的C-甘露糖基化规范序列位点(W-X-X-W-SEQ ID NO:29至W-X-X-A–SEQ ID NO:30或W-X-X-W至A-X-X-W–SEQ ID NO:31)。
图3显示响应多价疫苗施用的体液免疫应答I。显示了不同时间点上的如通过ELISA测量的在进行免疫方案后的来自(n＝5只/组)首次接触实验的小鼠和载体特异性免疫的小鼠的血清中的抗-抗原特异性TB IgG应答。显示了AE6构建体的Ag85A-特异性应答和多价BE6构建体的Ag85B-特异性和Esat-6-特异性应答。
图4A-图4C提供显示对多价疫苗的细胞免疫应答的柱形图。多价构建体的细胞免疫原性通过IFNγELISpot来测定。为了进行细胞免疫原性研究，通过肌内注射，随后使用CELLECTRA自适应恒流设备(Inovio)进行电穿孔来将45ug的每一种抗原递送至B6小鼠的胫前肌。小鼠(n＝5只/组)以2周的间隔(第0、2和4周)接受3次免疫。在最后的免疫后8天(第5周)评估细胞应答。按照制造商说明书(R&D Systems)使用96孔板(Millipore)进行ELISpots。将来自每一个经免疫的小鼠的200,000个脾细胞添加至板的每一个孔，在R10(阴性对照)、conanacalin A(阳性对照)或对于每一种抗原是特异性肽混合物存在的情况下在37℃、5％CO2下刺激所述脾细胞过夜。肽混合物由横跨完整蛋白质的交叠9或11个氨基酸的15聚体肽组成。
合成多价免疫原集合在此处经显示驱动针对广谱的ESAT 6基因家族成员的多样和相关的免疫。该免疫方法可用于TB患者的免疫治疗或初免加强方式或用作用于控制TB感染的卓越方法。
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4.Sutcliffe I.C.New insights into the distribution of EXG 100 proteinsecretion systems.Antonie Van Leuuwenhoek 99：127-131(2011)
实施例2
通过使用针对优化表达设计的编码序列，构建另外的esx构建体，并测试其表达。图5A显示包含总共15种esx抗原的编码序列的所有5种新的三价esx构建体的图示。与其它构建体类似，将所有基因克隆进pVAX1哺乳动物载体，并处于CMV启动子之下。每一种插入物包含N末端IgE前导序列肽的编码序列、在2个相邻的esx抗原编码序列之间具有蛋白酶切割位点的编码序列的一组3个esx抗原的编码序列、C末端HA标签的编码序列。这些插入物在CMV启动子序列与BGH polyA信号的序列之间被插入pVAX1载体。pVAX1载体还包含卡那霉素抗性基因和pUC起始点。
5种插入物的每一种示于图5A和被标以I-V。
图5A中显示的插入物I包含N末端IgE前导序列肽的编码序列、esx抗原esxO的编码序列、呋喃蛋白水解切割位点的编码序列、esx抗原esxR的编码序列、呋喃蛋白水解切割位点的编码序列、esx抗原esxF的编码序列和C末端HA标签的编码序列。该插入物的编码序列是SEQ ID NO：27并被称为pORF插入物的新形式(pORF.2)，当被克隆进pVAX1时其被命名为pORF质粒的新形式(pORF.2)。
图5A中显示的插入物II包含N末端IgE前导序列肽的编码序列、esx抗原esxB的编码序列、呋喃蛋白水解切割位点的编码序列、esx抗原esxC的编码序列、呋喃蛋白水解切割位点的编码序列、esx抗原esxU的编码序列和C末端HA标签的编码序列。该插入物的编码序列是SEQ ID NO:25并被称为pBCU插入物的新形式(pBCU.2)，当被克隆进pVAX1时其被命名为pBCU质粒的新形式(pBCU.2)。
图5A中显示的插入物III包含N末端IgE前导序列肽的编码序列、esx抗原esxH的编码序列、呋喃蛋白水解切割位点的编码序列、esx抗原esxA的编码序列、呋喃蛋白水解切割位点的编码序列、esx抗原esxT的编码序列和C末端HA标签的编码序列。该插入物的编码序列是SEQ ID NO:23并被称为pHAT插入物的新形式(pHAT.2)，当被克隆进pVAX1时其被命名为pHAT质粒的新形式(pHAT.2)。
图5A中显示的插入物IV包含N末端IgE前导序列肽的编码序列、esx抗原esxD的编码序列、呋喃蛋白水解切割位点的编码序列、esx抗原esxQ的编码序列、呋喃蛋白水解切割位点的编码序列、esx抗原esxE的编码序列和C末端HA标签的编码序列。该插入物的编码序列是SEQ ID NO:21并被称为pDQE插入物的新形式(pDQE.2)，当被克隆进pVAX1时其被命名为pDQE质粒的新形式(pDQE.2)。
图5A中显示的插入物V包含N末端IgE前导序列肽的编码序列、esx抗原esxV的编码序列、呋喃蛋白水解切割位点的编码序列、esx抗原esxS的编码序列、呋喃蛋白水解切割位点的编码序列、esx抗原esxW的编码序列和C末端HA标签的编码序列。该插入物的编码序列是SEQ ID NO:19并被称为pVSW插入物的新形式(pVSW.2)，当被克隆进pVAX1时其被命名为pVSW质粒的新形式(pVSW.2)。
图5B显示测试具有插入物I-V的esx的表达的实验的结果。用pVSW、pBCU、pDQE、pHAT和pORF质粒的新形式(pVSW.2、pBCU.2、pDQE.2、pHAT.2和pORF.2)之一或对照质粒pVAX转染RD细胞。通过使用抗-HA mAb检测的蛋白质印迹分析表达。还已知的是通过肌动蛋白的染色的上样对照，并且指示了相对尺寸(KDa)。所述数据显示除pVAX样品外在每一个测试测定中利用抗-HA mAb检测到蛋白质。所述实验表明pVSW、pBCU、pDQE、pHAT和pORF质粒的新形式(pVSW.2、pBCU.2、pDQE.2、pHAT.2和pORF.2质粒)中的插入物在哺乳动物细胞中表达。
在使用小鼠的实验中比较由pVSW、pBCU、pDQE、pHAT和pORF质粒的新形式(pVSW.2、pBCU.2、pDQE.2、pHAT.2和pORF.2质粒)编码和表达的esx抗原的免疫原性。图6A显示实验方案的概述。以2周的间隔(第0、2和4周)用pVSW、pBCU、pDQE、pHAT和pORF质粒的新形式(pVSW.2、pBCU.2、pDQE.2、pHAT.2和pORF.2质粒)之一对CB6F1小鼠(n＝5只/组)进行3次接种+电穿孔(EP)，在最后的免疫后1周(第5周)收获脾脏以通过IFN-γELISpot测定分析细胞免疫应答。
图6B-图6F显示测量对由用于Esx-特异性T细胞的接种的pVSW、pBCU、pDQE、pHAT和pORF质粒的新形式(pVSW.2、pBCU.2、pDQE.2、pHAT.2和pORF.2质粒)之一编码的3个单独的esx抗原的每一个的细胞免疫应答的实验的数据，通过IFN-γELISpot测量针对一组肽对它们各自抗原的Esx-特异性T细胞应答。误差条指示SEM并且独立地进行实验至少2次，所述实验结果相似。
图6B显示其中用质粒pDQE的新形式(pDQE.2)接种小鼠的实验的结果。检测针对抗原esxD、esxQ和esxE的每一种的免疫应答，针对esxQ的应答最大。
图6C显示其中用质粒pVSW的新形式(pVSW.2)接种小鼠的实验的结果。检测针对抗原esxV、esxS和esxW的每一种的免疫应答，针对esxS和eszW的应答高。
图6D显示其中用质粒pBCU的新形式(pBCU.2)接种小鼠的实验的结果。检测针对抗原esxB、esxC和esxU的每一种的免疫应答，针对esxU的应答最大。
图6E显示其中用质粒pHAT的新形式(pHAT.2)接种小鼠的实验的结果。检测针对抗原esxH、esxA和esxT的每一种的免疫应答，针对esxH的应答最高。
图6F显示其中用质粒pORF的新形式(pORF.2)接种小鼠的实验的结果。检测针对抗原esxO、esxR和esxF的每一种的免疫应答，针对esxR的应答最高。
评价在利用pVSW、pBCU、pDQE、pHAT和pORF质粒的新形式(pVSW.2、pBCU.2、pDQE.2、pHAT.2和pORF.2质粒)之一进行DNA接种后的esx-特异性CD4和CD8T应答。利用20μg的每一种单独的pVSW、pBCU、pDQE、pHAT和pORF的新形式(pVSW.2、pBCU.2、pDQE.2、pHAT.2和pORF.2)以3周的间隔通过i.m./EP对CB6F1小鼠(n＝5)进行3次注射。在最后的接种后一周收集脾细胞，用它们各自的肽混合物进行刺激，在使用针对IFN-γ和TNF-α的抗体进行细胞内染色后，通过流式细胞术分析所述细胞。结果示于图7A至图7C中。
图7A显示用于分析对于IFN-γ和TNF-α细胞因子都是阳性的CD4和CD8T细胞的频率的门控策略。
图7B是描绘esx-特异性CD4T细胞响应esx-特异性肽抗原释放双细胞因子IFN-γ/TNF-α(和pVAX对照)的柱形图。
图7C是描绘esx-特异性CD8T细胞响应esx-特异性肽抗原释放双细胞因子IFN-γ/TNF-α(和pVAX对照)的柱形图。
在测量图7B和图7C中的这些实验的结果中，来自用单独的培养基刺激的细胞的本底染色已被扣除。误差条代表每组5只小鼠的SEM。独立地进行实验至少2次，所述实验结果相似。进行将由RSQ-15疫苗(其为每一种单独的pVSW、pBCU、pDQE、pHAT和pORF质粒的新形式(pVSW.2、pBCU.2、pDQE.2、pHAT.2和pORF.2质粒)的组合)诱导的免疫应答与由BCG疫苗SSI(BCG Statens Serum Institut(SSI)菌株，也称为Bacillus Calmette-Guerin(BCG)菌株Danish，来自Statens Serum Institute(SSI BCG)或如图中提及的BCG)诱导的那些免疫应答相比较的实验。相较于BCG，RSQ-15诱导更广和更强的esx-特异性Th1免疫应答。
图8A显示包括用于RSQ-15和BCG接种的免疫计划的方案的概述。利用作为混合物(RSQ-15疫苗；20ug/esx构建体)共递送的所有esx构建体(每一种单独的pVSW、pBCU、pDQE、pHAT和pORF质粒的新形式(pVSW.2、pBCU.2、pDQE.2、pHAT.2和pORF.2质粒))以2周的间隔(第0、2和4周)对CB6F1小鼠(n＝5)进行3次免疫。在第-1周通过单次s.c.BCG疫苗注射(106CFU)免疫CB6F1小鼠(n＝5)。在第8周(其为在RSQ-15组的最后的免疫后1个月和在BCG组的BCG接种后9周)，使用来自RSQ-15-初免的或BCG-初免的小鼠的脾细胞分析T细胞应答。用所有单独的esx-特异性肽的混合物刺激脾细胞，并通过ELISpot测定来测量IFN-γ的产量。
图8B和图8C分别显示RSQ-15组和BCG组的结果。误差条指示SEM并且独立地进行实验至少2次，所述实验结果相似。利用RSQ-15的免疫相较于BCG诱导更广和更强的esx-特异性Th1免疫应答。
进行实验以将利用BCG疫苗初免的哺乳动物中的免疫应答与利用RSQ-15疫苗的单次加或2次加强来加强的动物中的免疫应答相比较。包括只有pVAX1和只有BCG的对照。结果显示利用RSQ-15DNA疫苗的初免-加强BCG接种增强esx-特异性BCG-诱导的应答。
图9A显示包括用于2个不同的初免-加强方案：BCG初免，单次RSQ-15加强的组相对BCG初免，2次RSQ-15加强的组的免疫计划的方案的概述。在第0周利用106CFU的BCG SSI免疫CB6F1小鼠s.c.。6周后(第6周)，利用100μg(20μg/esx构建体，即pVSW、pBCU、pDQE、pHAT和pORF质粒的新形式(pVSW.2、pBCU.2、pDQE.2、pHAT.2和pORF.2质粒))的RSQ-15疫苗，通过i.m.注射加强单次加强组中的小鼠，1周后在第7周处死小鼠。在第6周，利用100μg的RSQ-15疫苗通过i.m.注射加强2次加强组中的小鼠，2周后在第8周利用100μg的RSQ-15疫苗进行第二次加强，在第9周在第二次加强后7天处死小鼠。通过IFN-γELISpot分析处死的小鼠的脾。结果代表每组5只小鼠的SEM。独立地进行实验至少2次，所述实验结果相似。深色柱为来自BCG对照的数据并且显示两组加强的动物都显示相较于由BCG对照诱导的免疫应答显著更高的免疫应答。
使用pORF、pHAT和pVSW质粒的新形式(pORF.2、pHAT.2和pVSW.2)进行实验，以测量利用那些新形式之一免疫的动物的针对选自它们的亚家族直系同源物成员的其它esx肽的混合物的免疫应答。评估针对这些直系同源物的免疫应答的交叉反应性。利用20μg的pORF的新形式(pORF.2)以2周的间隔免疫小鼠3次，或利用20μg的pHAT的新形式(pHAT.2)以2周的间隔免疫小鼠3次，或利用20μg的pVSW的新形式(pVSW.2)以2周的间隔免疫小鼠3次。最后的免疫后1周，收获脾脏，随后用它们各自的esx-特异性肽的混合物或直系同源物的esx-特异性肽的混合物进行刺激，以监控通过IFN-γELISpot测定的esx抗原之间的交叉反应性的程度。
图10A显示来自通过IFN-γELISpot小鼠测定的利用pORF质粒的新形式(pORF.2)免疫的处死的小鼠的脾的结果。除了针对esxO的免疫应答以外，还观察到识别esxV、esxR、esxH、esxN和esxL的免疫应答。误差条指示SEM并且所显示的数据代表产生相似结果的两个独立实验中的每组5只小鼠。
图10B显示来自通过IFN-γELISpot小鼠测定的利用pHAT质粒的新形式(pHAT.2)免疫的处死的小鼠的脾的结果。除了针对esxH的免疫应答以外，还观察到识别esxR的免疫应答。误差条指示SEM并且所显示的数据代表产生相似结果的两个独立实验中的每组5只小鼠。
图10C显示来自通过IFN-γELISpot小鼠测定的利用pVSW质粒的新形式(pVSW.2)免疫的处死的小鼠的脾的结果。除了针对esxV的免疫应答以外，还观察到识别esxO、esxK、esxP、esxM和esxG的免疫应答。误差条指示SEM并且所显示的数据代表产生相似结果的两个独立实验中的每组5只小鼠。
序列表
<110> 宾夕法尼亚大学理事会（THE TRUSTEES OF THE UNIVERSITY OFPENNSYLVANIA）
大卫·B·韦纳（Weiner, David B.）
丹尼尔·维拉里尔（Villarreal, Daniel）
<120> 用于结核病的预防或治疗的合成免疫原
<130> 133172.4702
<150> US 61/800,375
<151> 2013-03-15
<160> 31
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 987
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pVSW核酸序列
<400> 1
atggactgga catggattct gttcctggtc gccgccgcaa caagagtgca ttcaactatc 60
aattatcagt ttggagacgt ggacgcacac ggtgccatga tcagagccca ggctgggtca 120
ctggaggctg aacatcaggc aatcattagt gacgtgctca ctgcttcaga tttctggggc 180
ggagccggga gtgccgcttg ccagggtttc atcacccagc tgggccggaa ctttcaggtc 240
atctacgagc aggcaaatgc acacggtcag aaggtccagg cagcaggaaa caatatggct 300
cagaccgact ccgcagtcgg aagctcctgg gctagagggc ggaagaggag atctagtctg 360
ctcgatgccc acatccccca gctgattgcc tctcatacag ctttcgctgc aaaagccgga 420
ctcatgcgac atactatcgg gcaggcagag cagcaggcca tgtctgctca ggcatttcac 480
cagggagaaa gtgccgctgc attccaggga gcacatgctc gatttgtggc agctgcagcc 540
aaggtcaaca cactgctcga cattgcacag gccaatctgg gagaggctgc aggtacctac 600
gtggcagctg atgcagccgc tgcatcaagc tatacaggct tccgcggacg aaaacggcgc 660
tccacttcta ggtttatgac cgaccctcac gctatgaggg atatggccgg aagattcgag 720
gtgcatgctc agacagtcga ggacgaagcc cgaaggatgt gggctagcgc acagaacatc 780
gcaggagctg gttggagcgg aatggcagaa gccacttccc tggataccat gacacagatg 840
aatcaggcct ttagaaacat tgtgaatatg ctgcacggcg tgcgggacgg actcgtccgc 900
gatgccaaca attatgagca gcaggaacag gcttcccagc agattctctc cagttaccca 960
tacgatgtcc ccgattacgc ataataa 987
<210> 2
<211> 327
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VSW氨基酸
<400> 2
Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val
1 5 10 15
His Ser Thr Ile Asn Tyr Gln Phe Gly Asp Val Asp Ala His Gly Ala
20 25 30
Met Ile Arg Ala Gln Ala Gly Ser Leu Glu Ala Glu His Gln Ala Ile
35 40 45
Ile Ser Asp Val Leu Thr Ala Ser Asp Phe Trp Gly Gly Ala Gly Ser
50 55 60
Ala Ala Cys Gln Gly Phe Ile Thr Gln Leu Gly Arg Asn Phe Gln Val
65 70 75 80
Ile Tyr Glu Gln Ala Asn Ala His Gly Gln Lys Val Gln Ala Ala Gly
85 90 95
Asn Asn Met Ala Gln Thr Asp Ser Ala Val Gly Ser Ser Trp Ala Arg
100 105 110
Gly Arg Lys Arg Arg Ser Ser Leu Leu Asp Ala His Ile Pro Gln Leu
115 120 125
Ile Ala Ser His Thr Ala Phe Ala Ala Lys Ala Gly Leu Met Arg His
130 135 140
Thr Ile Gly Gln Ala Glu Gln Gln Ala Met Ser Ala Gln Ala Phe His
145 150 155 160
Gln Gly Glu Ser Ala Ala Ala Phe Gln Gly Ala His Ala Arg Phe Val
165 170 175
Ala Ala Ala Ala Lys Val Asn Thr Leu Leu Asp Ile Ala Gln Ala Asn
180 185 190
Leu Gly Glu Ala Ala Gly Thr Tyr Val Ala Ala Asp Ala Ala Ala Ala
195 200 205
Ser Ser Tyr Thr Gly Phe Arg Gly Arg Lys Arg Arg Ser Thr Ser Arg
210 215 220
Phe Met Thr Asp Pro His Ala Met Arg Asp Met Ala Gly Arg Phe Glu
225 230 235 240
Val His Ala Gln Thr Val Glu Asp Glu Ala Arg Arg Met Trp Ala Ser
245 250 255
Ala Gln Asn Ile Ala Gly Ala Gly Trp Ser Gly Met Ala Glu Ala Thr
260 265 270
Ser Leu Asp Thr Met Thr Gln Met Asn Gln Ala Phe Arg Asn Ile Val
275 280 285
Asn Met Leu His Gly Val Arg Asp Gly Leu Val Arg Asp Ala Asn Asn
290 295 300
Tyr Glu Gln Gln Glu Gln Ala Ser Gln Gln Ile Leu Ser Ser Tyr Pro
305 310 315 320
Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala
325
<210> 3
<211> 1071
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pDQE核酸
<400> 3
atggactgga catggattct gttcctcgtc gccgccgcaa ctagagtgca ttccgccgat 60
acaattcagg tcacccctca gatgctgagg tctaccgcaa atgacatcca ggccaacatg 120
gagcaggcta tggggattgc aaagggttac ctggccaacc aggaaaatgt gatgaacccc 180
gctacttgga gcgggaccgg tgtggtcgct tcccacatga ctgcaaccga gatcactaat 240
gaactgaaca aagtgctcac cggcggaaca agactggcag agggactcgt ccaggcagct 300
gcactgatgg agggtcacga agccgatagc cagaccgcat tccaggccct ctttggcgct 360
tcacatggga gccgcggtcg aaagaggaga agctcccagt ccatgtactc ttatccagct 420
atgacagcaa atgtgggcga catggccggc tacactggaa ccacacagtc tctgggagcc 480
gatattgcta gtgagcgaac cgcaccctca agggcttgcc agggggacct gggtatgagt 540
caccaggatt ggcaggccca gtggaaccag gctatggagg ccctggctcg ggcatatcgg 600
cgctgccgaa gggccctgcg acagatcggg gtgctcgaac gacctgtcgg ggactctagt 660
gattgtggta caattcgggt gggctcattc aggggaagat ggctggaccc ccgacatgca 720
ggacctgcaa ccgcagctga cgccggcgat cggggacgca aaagacggag tgacccaaca 780
gtgctggccg atgctgtcgc aagaatggcc gagtttggac ggcacgtgga ggaactcgtc 840
gctgagatcg aatccctggt gacaaggctc catgtcacat ggactggaga gggagcagca 900
gctcacgcag aagctcagag gcattgggca gccggcgaag ccatgatgag acaggcactg 960
gcacagctca ctgctgcagg acagtccgct catgcaaatt atgccggagc tatggctact 1020
aatctcggaa tgtggtccta tccttacgac gtgcctgact acgcataatg a 1071
<210> 4
<211> 355
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> pDQE氨基酸序列
<400> 4
Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val
1 5 10 15
His Ser Ala Asp Thr Ile Gln Val Thr Pro Gln Met Leu Arg Ser Thr
20 25 30
Ala Asn Asp Ile Gln Ala Asn Met Glu Gln Ala Met Gly Ile Ala Lys
35 40 45
Gly Tyr Leu Ala Asn Gln Glu Asn Val Met Asn Pro Ala Thr Trp Ser
50 55 60
Gly Thr Gly Val Val Ala Ser His Met Thr Ala Thr Glu Ile Thr Asn
65 70 75 80
Glu Leu Asn Lys Val Leu Thr Gly Gly Thr Arg Leu Ala Glu Gly Leu
85 90 95
Val Gln Ala Ala Ala Leu Met Glu Gly His Glu Ala Asp Ser Gln Thr
100 105 110
Ala Phe Gln Ala Leu Phe Gly Ala Ser His Gly Ser Arg Gly Arg Lys
115 120 125
Arg Arg Ser Ser Gln Ser Met Tyr Ser Tyr Pro Ala Met Thr Ala Asn
130 135 140
Val Gly Asp Met Ala Gly Tyr Thr Gly Thr Thr Gln Ser Leu Gly Ala
145 150 155 160
Asp Ile Ala Ser Glu Arg Thr Ala Pro Ser Arg Ala Cys Gln Gly Asp
165 170 175
Leu Gly Met Ser His Gln Asp Trp Gln Ala Gln Trp Asn Gln Ala Met
180 185 190
Glu Ala Leu Ala Arg Ala Tyr Arg Arg Cys Arg Arg Ala Leu Arg Gln
195 200 205
Ile Gly Val Leu Glu Arg Pro Val Gly Asp Ser Ser Asp Cys Gly Thr
210 215 220
Ile Arg Val Gly Ser Phe Arg Gly Arg Trp Leu Asp Pro Arg His Ala
225 230 235 240
Gly Pro Ala Thr Ala Ala Asp Ala Gly Asp Arg Gly Arg Lys Arg Arg
245 250 255
Ser Asp Pro Thr Val Leu Ala Asp Ala Val Ala Arg Met Ala Glu Phe
260 265 270
Gly Arg His Val Glu Glu Leu Val Ala Glu Ile Glu Ser Leu Val Thr
275 280 285
Arg Leu His Val Thr Trp Thr Gly Glu Gly Ala Ala Ala His Ala Glu
290 295 300
Ala Gln Arg His Trp Ala Ala Gly Glu Ala Met Met Arg Gln Ala Leu
305 310 315 320
Ala Gln Leu Thr Ala Ala Gly Gln Ser Ala His Ala Asn Tyr Ala Gly
325 330 335
Ala Met Ala Thr Asn Leu Gly Met Trp Ser Tyr Pro Tyr Asp Val Pro
340 345 350
Asp Tyr Ala
355
<210> 5
<211> 993
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pHAT核酸
<400> 5
atggactgga cctggattct cttcctggtc gccgccgcaa cccgcgtgca ctcatctcag 60
attatgtaca actaccccgc aatgctcgga cacgcaggag acatggcagg atacgcaggt 120
accctgcaga gcctcggagc tgagattgca gtggaacagg ccgctctgca gtccgcctgg 180
cagggcgaca caggaatcac ttaccaggcc tggcaggctc agtggaacca ggctatggag 240
gatctggtca gagcatatca cgccatgagc tccacccatg aggccaatac aatggctatg 300
atggcacggg atacagctga agcagccaag tggggcggac gagggaggaa aaggagatct 360
actgagcagc agtggaactt tgccggcatc gaagctgcag ccagtgccat tcagggaaat 420
gtggcttcaa tccacagcct gctcgacgag ggaaagcagt ccctgaccaa actcgctgca 480
gcatggggcg gcagcggcag tgaggcatac cagggagtcc agcagaagtg ggatgcaact 540
gccaccgaac tgaacaatgc actgcagaac ctcgcccgca ctattagtga ggccgggcag 600
gctatggcat caaccgaagg gaatgtggcc ggcatgttcg ctagaggtcg gaaacggcgc 660
tccaacgcag accccgtgct gtcttacaac ttcgatgcta tcgagtactc tgtccgccag 720
gaaatccata ccacagctgc acgattcaac gccgctctgc aggagctcag gagccagatc 780
gcccctctgc agcagctctg gacacgcgag gcagcagctg catatcacgc cgaacagctg 840
aagtggcatc aggccgctag cgccctgaac gaaatcctga ttgacctcgg gaatgctgtg 900
cgacacggtg cagacgatgt cgcccatgct gatcgccgcg ccgccggtgc ctgggctagg 960
tatccctacg atgtccccga ttacgcataa tga 993
<210> 6
<211> 329
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> pHAT氨基酸序列
<400> 6
Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val
1 5 10 15
His Ser Ser Gln Ile Met Tyr Asn Tyr Pro Ala Met Leu Gly His Ala
20 25 30
Gly Asp Met Ala Gly Tyr Ala Gly Thr Leu Gln Ser Leu Gly Ala Glu
35 40 45
Ile Ala Val Glu Gln Ala Ala Leu Gln Ser Ala Trp Gln Gly Asp Thr
50 55 60
Gly Ile Thr Tyr Gln Ala Trp Gln Ala Gln Trp Asn Gln Ala Met Glu
65 70 75 80
Asp Leu Val Arg Ala Tyr His Ala Met Ser Ser Thr His Glu Ala Asn
85 90 95
Thr Met Ala Met Met Ala Arg Asp Thr Ala Glu Ala Ala Lys Trp Gly
100 105 110
Gly Arg Gly Arg Lys Arg Arg Ser Thr Glu Gln Gln Trp Asn Phe Ala
115 120 125
Gly Ile Glu Ala Ala Ala Ser Ala Ile Gln Gly Asn Val Ala Ser Ile
130 135 140
His Ser Leu Leu Asp Glu Gly Lys Gln Ser Leu Thr Lys Leu Ala Ala
145 150 155 160
Ala Trp Gly Gly Ser Gly Ser Glu Ala Tyr Gln Gly Val Gln Gln Lys
165 170 175
Trp Asp Ala Thr Ala Thr Glu Leu Asn Asn Ala Leu Gln Asn Leu Ala
180 185 190
Arg Thr Ile Ser Glu Ala Gly Gln Ala Met Ala Ser Thr Glu Gly Asn
195 200 205
Val Ala Gly Met Phe Ala Arg Gly Arg Lys Arg Arg Ser Asn Ala Asp
210 215 220
Pro Val Leu Ser Tyr Asn Phe Asp Ala Ile Glu Tyr Ser Val Arg Gln
225 230 235 240
Glu Ile His Thr Thr Ala Ala Arg Phe Asn Ala Ala Leu Gln Glu Leu
245 250 255
Arg Ser Gln Ile Ala Pro Leu Gln Gln Leu Trp Thr Arg Glu Ala Ala
260 265 270
Ala Ala Tyr His Ala Glu Gln Leu Lys Trp His Gln Ala Ala Ser Ala
275 280 285
Leu Asn Glu Ile Leu Ile Asp Leu Gly Asn Ala Val Arg His Gly Ala
290 295 300
Asp Asp Val Ala His Ala Asp Arg Arg Ala Ala Gly Ala Trp Ala Arg
305 310 315 320
Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala
325
<210> 7
<211> 1080
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pBCU核酸序列
<400> 7
atggactgga cctggattct cttcctggtg gctgccgcaa cacgggtgca ctctgccgaa 60
atgaaaactg atgccgcaac tctggctcag gaggccggga acttcgaacg catctccggt 120
gacctcaaga cacagattga tcaggtggag tcaactgcag ggagcctgca gggccagtgg 180
cgaggggccg ctggtacagc agcacaggct gcagtggtca ggtttcagga agccgctaac 240
aagcagaaac aggagctgga cgaaatctcc actaatattc ggcaggctgg agtgcagtac 300
tctcgcgccg atgaggaaca gcagcaggct ctgagctccc agatgggctt ccgaggaagg 360
aagaggagat ctagtgacca gattacatac aaccccgggg ccgtgagcga ctttgcatct 420
gatgtcggca gtagggccgg acagctccac atgatctatg aggacactgc cagtaaaacc 480
aatgctctgc aggaattctt tgccggccat ggagctcagg gcttctttga tgcccaggct 540
cagatgctgt ccgggctcca gggtctgatt gagactgtgg gccagcacgg aaccacaact 600
ggccatgtcc tcgacaacgc catcggaacc gatcaggcaa ttgccgggct gttcagaggt 660
cggaaacggc gctctgtgga gccaggaagg atcggcggaa atcaggccag actggcagcc 720
gtgctgctcg acgtgagcac ccccaacaca ctcaatgctg actttgatct gatgagatca 780
gtggcaggca tcaccgatgc ccgcaatgag gaaattcgag caatgctcca ggccttcatc 840
ggccggatgt caggagtgcc ccctagcgtg tggggcggcc tggctgcagc ccggtttcag 900
gacgtggtcg atcgctggaa cgccgagagc acccgactct atcacgtgct gcatgctatc 960
gcagacacaa ttaggcacaa tgaggctgca ctgagagaag ctggacagat ccatgcaaga 1020
catattgccg ccgccggtgg tgacctgtac ccatacgatg tccccgatta cgcttgataa 1080
<210> 8
<211> 358
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> pBCU氨基酸序列
<400> 8
Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val
1 5 10 15
His Ser Ala Glu Met Lys Thr Asp Ala Ala Thr Leu Ala Gln Glu Ala
20 25 30
Gly Asn Phe Glu Arg Ile Ser Gly Asp Leu Lys Thr Gln Ile Asp Gln
35 40 45
Val Glu Ser Thr Ala Gly Ser Leu Gln Gly Gln Trp Arg Gly Ala Ala
50 55 60
Gly Thr Ala Ala Gln Ala Ala Val Val Arg Phe Gln Glu Ala Ala Asn
65 70 75 80
Lys Gln Lys Gln Glu Leu Asp Glu Ile Ser Thr Asn Ile Arg Gln Ala
85 90 95
Gly Val Gln Tyr Ser Arg Ala Asp Glu Glu Gln Gln Gln Ala Leu Ser
100 105 110
Ser Gln Met Gly Phe Arg Gly Arg Lys Arg Arg Ser Ser Asp Gln Ile
115 120 125
Thr Tyr Asn Pro Gly Ala Val Ser Asp Phe Ala Ser Asp Val Gly Ser
130 135 140
Arg Ala Gly Gln Leu His Met Ile Tyr Glu Asp Thr Ala Ser Lys Thr
145 150 155 160
Asn Ala Leu Gln Glu Phe Phe Ala Gly His Gly Ala Gln Gly Phe Phe
165 170 175
Asp Ala Gln Ala Gln Met Leu Ser Gly Leu Gln Gly Leu Ile Glu Thr
180 185 190
Val Gly Gln His Gly Thr Thr Thr Gly His Val Leu Asp Asn Ala Ile
195 200 205
Gly Thr Asp Gln Ala Ile Ala Gly Leu Phe Arg Gly Arg Lys Arg Arg
210 215 220
Ser Val Glu Pro Gly Arg Ile Gly Gly Asn Gln Ala Arg Leu Ala Ala
225 230 235 240
Val Leu Leu Asp Val Ser Thr Pro Asn Thr Leu Asn Ala Asp Phe Asp
245 250 255
Leu Met Arg Ser Val Ala Gly Ile Thr Asp Ala Arg Asn Glu Glu Ile
260 265 270
Arg Ala Met Leu Gln Ala Phe Ile Gly Arg Met Ser Gly Val Pro Pro
275 280 285
Ser Val Trp Gly Gly Leu Ala Ala Ala Arg Phe Gln Asp Val Val Asp
290 295 300
Arg Trp Asn Ala Glu Ser Thr Arg Leu Tyr His Val Leu His Ala Ile
305 310 315 320
Ala Asp Thr Ile Arg His Asn Glu Ala Ala Leu Arg Glu Ala Gly Gln
325 330 335
Ile His Ala Arg His Ile Ala Ala Ala Gly Gly Asp Leu Tyr Pro Tyr
340 345 350
Asp Val Pro Asp Tyr Ala
355
<210> 9
<211> 999
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pORF核酸序列
<400> 9
atggactgga cctggattct cttcctggtc gccgccgcaa cacgggtgca ttcaacaatc 60
aattatcagt ttggggacgt ggacgcccac ggagcaatga tccgagcaca ggctggtctg 120
ctggaggcag aacatcaggc tattgtgcga gacgtgctgg cagctggcga tttctggggc 180
ggagcaggca gcgtggcatg ccaggagttc atcacacagc tgggccgaaa ctttcaggtc 240
atctacgaac aggcaaatgc acacggacag aaggtccagg cagccggtaa caatatggcc 300
cagactgact ctgctgtggg cagctcctgg gcccgaggaa ggaaaaggag atctagtcag 360
atcatgtaca actatcccgc catgatggct catgcaggag acatggccgg gtatgctggt 420
accctgcaga gcctcggggc agatatcgca tccgagcagg ccgtgctgag cagcgcctgg 480
cagggcgaca ccggaattac ataccagggc tggcagacac agtggaacca ggccctggaa 540
gatctcgtcc gggcttatca gtccatgtct ggcactcacg agagcaatac catggctatg 600
ctggcacgcg atggagccga agctgcaaag tggggcggca gaggacgaaa acggcgctca 660
ggtgcagacg ataccctgcg agtggagcct gctgtcatgc agggctttgc cgctagtctg 720
gacggagcag ccgagcacct cgctgtgcag ctggcagaac tcgatgcaca ggtcggacag 780
atgctgggcg gatggagggg cgccagtggt tcagcatacg gatctgcctg ggagctggct 840
catagagggg caggtgaagt gcagctgggc ctcagtatgc tcgctgcagc aattgcacac 900
gctggagcag gatatcagca taatgaggct gcatccgccc aggtgctcag agaggtcggt 960
ggtggatacc catacgatgt ccccgattac gcttgataa 999
<210> 10
<211> 331
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> pORF氨基酸序列
<400> 10
Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val
1 5 10 15
His Ser Thr Ile Asn Tyr Gln Phe Gly Asp Val Asp Ala His Gly Ala
20 25 30
Met Ile Arg Ala Gln Ala Gly Leu Leu Glu Ala Glu His Gln Ala Ile
35 40 45
Val Arg Asp Val Leu Ala Ala Gly Asp Phe Trp Gly Gly Ala Gly Ser
50 55 60
Val Ala Cys Gln Glu Phe Ile Thr Gln Leu Gly Arg Asn Phe Gln Val
65 70 75 80
Ile Tyr Glu Gln Ala Asn Ala His Gly Gln Lys Val Gln Ala Ala Gly
85 90 95
Asn Asn Met Ala Gln Thr Asp Ser Ala Val Gly Ser Ser Trp Ala Arg
100 105 110
Gly Arg Lys Arg Arg Ser Ser Gln Ile Met Tyr Asn Tyr Pro Ala Met
115 120 125
Met Ala His Ala Gly Asp Met Ala Gly Tyr Ala Gly Thr Leu Gln Ser
130 135 140
Leu Gly Ala Asp Ile Ala Ser Glu Gln Ala Val Leu Ser Ser Ala Trp
145 150 155 160
Gln Gly Asp Thr Gly Ile Thr Tyr Gln Gly Trp Gln Thr Gln Trp Asn
165 170 175
Gln Ala Leu Glu Asp Leu Val Arg Ala Tyr Gln Ser Met Ser Gly Thr
180 185 190
His Glu Ser Asn Thr Met Ala Met Leu Ala Arg Asp Gly Ala Glu Ala
195 200 205
Ala Lys Trp Gly Gly Arg Gly Arg Lys Arg Arg Ser Gly Ala Asp Asp
210 215 220
Thr Leu Arg Val Glu Pro Ala Val Met Gln Gly Phe Ala Ala Ser Leu
225 230 235 240
Asp Gly Ala Ala Glu His Leu Ala Val Gln Leu Ala Glu Leu Asp Ala
245 250 255
Gln Val Gly Gln Met Leu Gly Gly Trp Arg Gly Ala Ser Gly Ser Ala
260 265 270
Tyr Gly Ser Ala Trp Glu Leu Ala His Arg Gly Ala Gly Glu Val Gln
275 280 285
Leu Gly Leu Ser Met Leu Ala Ala Ala Ile Ala His Ala Gly Ala Gly
290 295 300
Tyr Gln His Asn Glu Ala Ala Ser Ala Gln Val Leu Arg Glu Val Gly
305 310 315 320
Gly Gly Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala
325 330
<210> 11
<211> 1329
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BE6核酸序列
<400> 11
atggactgga cttggattct cttcctggtc gcagcagcaa cacgagtgca ttctaccgat 60
gtctcacgaa aaattagggc ttggggtagg agactgatga ttggaaccgc agctgcagtg 120
gtcctgccag gactcgtggg actggcagga ggagccgcta cagctggcgc attcagccgc 180
cctggactgc cagtggagta cctccaggtc ccaagcccat ccatgggacg agatatcaag 240
gtgcagtttc agtccggggg taacaatgcc cccgctgtct acctgctcga tggcctgcgg 300
gctcaggacg attataatgg atgggacatt aacacccctg ccttcgaatg gtactatcag 360
tccggcctgt ctatcgtgat gcctgtcggc ggacagagct ccttttacag cgactggtat 420
tccccagcct gcggcaaggc tggctgtcag acttataaat gggagacttt cctcacctcc 480
gaactgccac agtggctctc tgccaatagg gctgtgaaac ccaccggatc tgcagccatt 540
gggctgagta tggcaggttc tagtgccatg attctggctg cataccaccc tcagcagttt 600
atctatgccg gatctctgag tgctctgctc gatccttcac aggggatggg tccaagcctc 660
atcggactgg ctatggggga cgcagggggt tacaaggccg ctgacatgtg ggggccctca 720
agcgatcctg cttgggagag aaacgaccca acacagcaga ttcccaaact ggtggcaaac 780
aatgcccggc tctgggtcta ttgcggcaac ggagccccca atgaactggg cggagccaat 840
atccctgctg agttcctgga aaattttgtg aggtcctcta acctgaagtt ccaggatgct 900
tacaacgcag ccgggggtca caacgccgtc ttcaattttc cccctaacgg cgctcattct 960
gcagagtatt ggggagcaca gctgaacgcc atgaaggggg acctgcagag ttcactcgga 1020
gctggtcgag gaaggaaacg acgatctaca gagcagcagt ggaattttgc cgggatcgaa 1080
gctgcagcca gcgctattca gggcaacgtg gccagtatcc attcactgct cgatgagggc 1140
aagcagagcc tcactaaact ggctgcagca tggggaggat cagggagcga ggcataccag 1200
ggtgtgcagc agaagtggga cgcaaccgcc acagaactga acaatgcact ccagaatctg 1260
gccagaacaa tcagtgaggc cggccaggct atggcatcca ctgagggtaa cgtggctggc 1320
atgttcgca 1329
<210> 12
<211> 443
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BE6氨基酸序列
<400> 12
Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val
1 5 10 15
His Ser Thr Asp Val Ser Arg Lys Ile Arg Ala Trp Gly Arg Arg Leu
20 25 30
Met Ile Gly Thr Ala Ala Ala Val Val Leu Pro Gly Leu Val Gly Leu
35 40 45
Ala Gly Gly Ala Ala Thr Ala Gly Ala Phe Ser Arg Pro Gly Leu Pro
50 55 60
Val Glu Tyr Leu Gln Val Pro Ser Pro Ser Met Gly Arg Asp Ile Lys
65 70 75 80
Val Gln Phe Gln Ser Gly Gly Asn Asn Ala Pro Ala Val Tyr Leu Leu
85 90 95
Asp Gly Leu Arg Ala Gln Asp Asp Tyr Asn Gly Trp Asp Ile Asn Thr
100 105 110
Pro Ala Phe Glu Trp Tyr Tyr Gln Ser Gly Leu Ser Ile Val Met Pro
115 120 125
Val Gly Gly Gln Ser Ser Phe Tyr Ser Asp Trp Tyr Ser Pro Ala Cys
130 135 140
Gly Lys Ala Gly Cys Gln Thr Tyr Lys Trp Glu Thr Phe Leu Thr Ser
145 150 155 160
Glu Leu Pro Gln Trp Leu Ser Ala Asn Arg Ala Val Lys Pro Thr Gly
165 170 175
Ser Ala Ala Ile Gly Leu Ser Met Ala Gly Ser Ser Ala Met Ile Leu
180 185 190
Ala Ala Tyr His Pro Gln Gln Phe Ile Tyr Ala Gly Ser Leu Ser Ala
195 200 205
Leu Leu Asp Pro Ser Gln Gly Met Gly Pro Ser Leu Ile Gly Leu Ala
210 215 220
Met Gly Asp Ala Gly Gly Tyr Lys Ala Ala Asp Met Trp Gly Pro Ser
225 230 235 240
Ser Asp Pro Ala Trp Glu Arg Asn Asp Pro Thr Gln Gln Ile Pro Lys
245 250 255
Leu Val Ala Asn Asn Ala Arg Leu Trp Val Tyr Cys Gly Asn Gly Ala
260 265 270
Pro Asn Glu Leu Gly Gly Ala Asn Ile Pro Ala Glu Phe Leu Glu Asn
275 280 285
Phe Val Arg Ser Ser Asn Leu Lys Phe Gln Asp Ala Tyr Asn Ala Ala
290 295 300
Gly Gly His Asn Ala Val Phe Asn Phe Pro Pro Asn Gly Ala His Ser
305 310 315 320
Ala Glu Tyr Trp Gly Ala Gln Leu Asn Ala Met Lys Gly Asp Leu Gln
325 330 335
Ser Ser Leu Gly Ala Gly Arg Gly Arg Lys Arg Arg Ser Thr Glu Gln
340 345 350
Gln Trp Asn Phe Ala Gly Ile Glu Ala Ala Ala Ser Ala Ile Gln Gly
355 360 365
Asn Val Ala Ser Ile His Ser Leu Leu Asp Glu Gly Lys Gln Ser Leu
370 375 380
Thr Lys Leu Ala Ala Ala Trp Gly Gly Ser Gly Ser Glu Ala Tyr Gln
385 390 395 400
Gly Val Gln Gln Lys Trp Asp Ala Thr Ala Thr Glu Leu Asn Asn Ala
405 410 415
Leu Gln Asn Leu Ala Arg Thr Ile Ser Glu Ala Gly Gln Ala Met Ala
420 425 430
Ser Thr Glu Gly Asn Val Ala Gly Met Phe Ala
435 440
<210> 13
<211> 1368
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> AE6核酸序列
<400> 13
atggattgga catggattct gtttctcgtc gcagcagcca caagagtgca tagccagctc 60
gtcgatagag tgaggggggc agtgactggc atgtctagga gactggtggt cggagctgtg 120
ggagcagctc tggtcagtgg tctcgtggga gcagtcggag gaaccgctac agcaggagcc 180
ttctctcgcc ctgggctccc agtggagtac ctgcaggtcc cctcacctag catgggccga 240
gatattaagg tgcagtttca gtcagggggt gctaacagcc cagcactgta cctgctcgac 300
ggactgcgag ctcaggacga tttctccgga tgggatatca atacacctgc ctttgaatgg 360
tatgaccaga gtggcctgtc agtggtcatg cctgtgggcg gacagagctc cttctacagt 420
gattggtatc agccagcctg cggaaaggct gggtgtcaga cttataaatg ggagacattt 480
ctgacttccg aactcccagg atggctgcag gctaaccgcc acgtgaaacc cacaggttcc 540
gcagtggtcg gcctgtctat ggcagcctct agtgcactga ctctcgccat ctaccatcca 600
cagcagttcg tctatgctgg agcaatgagt gggctgctcg atccatcaca ggcaatggga 660
ccaaccctga tcggtctcgc tatgggcgac gcagggggtt acaaggctag cgacatgtgg 720
ggacccaaag aggaccccgc ctggcagaga aacgaccccc tgctcaatgt ggggaagctg 780
attgctaaca atgcacgggt gtgggtctat tgcggtaacg gcaagccttc cgatctcggc 840
ggaaacaatc tgccagccaa attcctggag ggctttgtga ggacctctaa catcaagttc 900
caggacgcct acaacgctgg gggtggccac aatggtgtct tcgactttcc cgattctgga 960
acacatagtg ccgaatattg gggggcccag ctgaacgcta tgaaacccga cctccagaga 1020
gcactgggtg ccacccctaa tacaggacca gcaccacagg gtgcccgagg caggaagcga 1080
cgatcaactg agcagcagtg gaactttgcc gggatcgaag ctgcagccag cgcaattcag 1140
ggcaatgtgg ccagcatcca ctccctgctc gatgagggga agcagagcct gaccaaactc 1200
gctgcagcct ggggagggtc cggatctgag gcttaccagg gggtgcagca gaagtgggac 1260
gccactgcta ccgaactgaa caatgccctg cagaacctcg ctcggactat tagcgaggca 1320
ggacaggcaa tggcatccac cgaaggaaat gtggctggga tgtttgca 1368
<210> 14
<211> 456
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AE6氨基酸序列
<400> 14
Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val
1 5 10 15
His Ser Gln Leu Val Asp Arg Val Arg Gly Ala Val Thr Gly Met Ser
20 25 30
Arg Arg Leu Val Val Gly Ala Val Gly Ala Ala Leu Val Ser Gly Leu
35 40 45
Val Gly Ala Val Gly Gly Thr Ala Thr Ala Gly Ala Phe Ser Arg Pro
50 55 60
Gly Leu Pro Val Glu Tyr Leu Gln Val Pro Ser Pro Ser Met Gly Arg
65 70 75 80
Asp Ile Lys Val Gln Phe Gln Ser Gly Gly Ala Asn Ser Pro Ala Leu
85 90 95
Tyr Leu Leu Asp Gly Leu Arg Ala Gln Asp Asp Phe Ser Gly Trp Asp
100 105 110
Ile Asn Thr Pro Ala Phe Glu Trp Tyr Asp Gln Ser Gly Leu Ser Val
115 120 125
Val Met Pro Val Gly Gly Gln Ser Ser Phe Tyr Ser Asp Trp Tyr Gln
130 135 140
Pro Ala Cys Gly Lys Ala Gly Cys Gln Thr Tyr Lys Trp Glu Thr Phe
145 150 155 160
Leu Thr Ser Glu Leu Pro Gly Trp Leu Gln Ala Asn Arg His Val Lys
165 170 175
Pro Thr Gly Ser Ala Val Val Gly Leu Ser Met Ala Ala Ser Ser Ala
180 185 190
Leu Thr Leu Ala Ile Tyr His Pro Gln Gln Phe Val Tyr Ala Gly Ala
195 200 205
Met Ser Gly Leu Leu Asp Pro Ser Gln Ala Met Gly Pro Thr Leu Ile
210 215 220
Gly Leu Ala Met Gly Asp Ala Gly Gly Tyr Lys Ala Ser Asp Met Trp
225 230 235 240
Gly Pro Lys Glu Asp Pro Ala Trp Gln Arg Asn Asp Pro Leu Leu Asn
245 250 255
Val Gly Lys Leu Ile Ala Asn Asn Ala Arg Val Trp Val Tyr Cys Gly
260 265 270
Asn Gly Lys Pro Ser Asp Leu Gly Gly Asn Asn Leu Pro Ala Lys Phe
275 280 285
Leu Glu Gly Phe Val Arg Thr Ser Asn Ile Lys Phe Gln Asp Ala Tyr
290 295 300
Asn Ala Gly Gly Gly His Asn Gly Val Phe Asp Phe Pro Asp Ser Gly
305 310 315 320
Thr His Ser Ala Glu Tyr Trp Gly Ala Gln Leu Asn Ala Met Lys Pro
325 330 335
Asp Leu Gln Arg Ala Leu Gly Ala Thr Pro Asn Thr Gly Pro Ala Pro
340 345 350
Gln Gly Ala Arg Gly Arg Lys Arg Arg Ser Thr Glu Gln Gln Trp Asn
355 360 365
Phe Ala Gly Ile Glu Ala Ala Ala Ser Ala Ile Gln Gly Asn Val Ala
370 375 380
Ser Ile His Ser Leu Leu Asp Glu Gly Lys Gln Ser Leu Thr Lys Leu
385 390 395 400
Ala Ala Ala Trp Gly Gly Ser Gly Ser Glu Ala Tyr Gln Gly Val Gln
405 410 415
Gln Lys Trp Asp Ala Thr Ala Thr Glu Leu Asn Asn Ala Leu Gln Asn
420 425 430
Leu Ala Arg Thr Ile Ser Glu Ala Gly Gln Ala Met Ala Ser Thr Glu
435 440 445
Gly Asn Val Ala Gly Met Phe Ala
450 455
<210> 15
<211> 942
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TE6核酸序列
<400> 15
atggattgga cttggattct ctttctcgtc gcagcagcaa cccgcgtgca tagcacagag 60
cagcagtgga acttcgccgg tattgaagcc gctgcatctg ccatccaggg gaacgtggct 120
tccattcact ctctgctcga cgagggcaag cagagtctga ccaaactcgc agctgcatgg 180
ggaggaagcg gctccgaggc ataccaggga gtccagcaga agtgggatgc caccgctaca 240
gaactgaaca atgccctgca gaacctcgct cgcaccatct ctgaggctgg ccaggcaatg 300
gccagtacag aagggaatgt ggccggcatg ttcgccaggg gcaggaaaag gagaagtacc 360
gagcagcagt ggaactttgc cgggatcgaa gccgctgcat cagcaattca gggtaatgtg 420
gctagtatcc attcactcct ggacgagggc aagcagagcc tgacaaaact cgccgctgca 480
tgggggggtt ctgggagtga ggcctatcag ggtgtgcagc agaaatggga tgctactgca 540
accgaactga acaatgcact gcagaacctc gcccgaacta tttcagaggc tgggcaggcc 600
atggctagca ccgaaggcaa tgtcgcagga atgttcgcca gaggccggaa acggcgcagc 660
actgaacagc agtggaattt tgccggcatt gaagccgctg catccgccat ccagggaaat 720
gtggctagca ttcactccct gctcgacgag ggaaagcagt ccctgacaaa gctggccgcc 780
gcatggggag gatcaggcag cgaagcctat cagggcgtgc agcagaaatg ggacgcaaca 840
gccactgaac tgaacaatgc tctgcagaac ctggcacgaa caatctccga ggcaggacag 900
gctatggcat ctactgaagg gaatgtggct ggcatgttcg ca 942
<210> 16
<211> 314
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TE6氨基酸序列
<400> 16
Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val
1 5 10 15
His Ser Thr Glu Gln Gln Trp Asn Phe Ala Gly Ile Glu Ala Ala Ala
20 25 30
Ser Ala Ile Gln Gly Asn Val Ala Ser Ile His Ser Leu Leu Asp Glu
35 40 45
Gly Lys Gln Ser Leu Thr Lys Leu Ala Ala Ala Trp Gly Gly Ser Gly
50 55 60
Ser Glu Ala Tyr Gln Gly Val Gln Gln Lys Trp Asp Ala Thr Ala Thr
65 70 75 80
Glu Leu Asn Asn Ala Leu Gln Asn Leu Ala Arg Thr Ile Ser Glu Ala
85 90 95
Gly Gln Ala Met Ala Ser Thr Glu Gly Asn Val Ala Gly Met Phe Ala
100 105 110
Arg Gly Arg Lys Arg Arg Ser Thr Glu Gln Gln Trp Asn Phe Ala Gly
115 120 125
Ile Glu Ala Ala Ala Ser Ala Ile Gln Gly Asn Val Ala Ser Ile His
130 135 140
Ser Leu Leu Asp Glu Gly Lys Gln Ser Leu Thr Lys Leu Ala Ala Ala
145 150 155 160
Trp Gly Gly Ser Gly Ser Glu Ala Tyr Gln Gly Val Gln Gln Lys Trp
165 170 175
Asp Ala Thr Ala Thr Glu Leu Asn Asn Ala Leu Gln Asn Leu Ala Arg
180 185 190
Thr Ile Ser Glu Ala Gly Gln Ala Met Ala Ser Thr Glu Gly Asn Val
195 200 205
Ala Gly Met Phe Ala Arg Gly Arg Lys Arg Arg Ser Thr Glu Gln Gln
210 215 220
Trp Asn Phe Ala Gly Ile Glu Ala Ala Ala Ser Ala Ile Gln Gly Asn
225 230 235 240
Val Ala Ser Ile His Ser Leu Leu Asp Glu Gly Lys Gln Ser Leu Thr
245 250 255
Lys Leu Ala Ala Ala Trp Gly Gly Ser Gly Ser Glu Ala Tyr Gln Gly
260 265 270
Val Gln Gln Lys Trp Asp Ala Thr Ala Thr Glu Leu Asn Asn Ala Leu
275 280 285
Gln Asn Leu Ala Arg Thr Ile Ser Glu Ala Gly Gln Ala Met Ala Ser
290 295 300
Thr Glu Gly Asn Val Ala Gly Met Phe Ala
305 310
<210> 17
<211> 2013
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pHDV核酸序列
<400> 17
atggactgga cctggattct cttcctggtg gccgccgcaa cacgggtgca ctcctcacag 60
attatgtaca actaccctgc tatgctggga cacgcaggag acatggcagg atacgctggt 120
accctgcagt ctctcggagc agagatcgca gtggaacagg ccgctctgca gagtgcctgg 180
cagggcgaca caggaattac ttaccaggct tggcaggcac agtggaatca ggccatggag 240
gatctggtcc gagcctatca cgctatgagc tccactcatg aggccaacac catggcaatg 300
atggcccggg ataccgctga agcagccaag tggggcggac gagtgaggag agccaaaagg 360
acagagcagc agtggaattt cgctggcatc gaagctgcag cctctgccat tcagggaaac 420
gtcgcttcca tccattctct gctcgacgaa ggcaagcaga gtctgactaa actcgctgca 480
gcatggggag gttcaggcag cgaggcatat cagggagtgc agcagaagtg ggatgcaacc 540
gccacagaac tgaacaatgc tctgcagaat ctcgcaagaa caatctccga ggccggacag 600
gctatggcat ctactgaagg gaacgtggct ggcatgttcg cacgggtgcg gcgagcaaaa 660
agggtcgagc caggaagaat tggcggaaac caggctcgcc tggctgcagt gctgctcgac 720
gtgagcaccc ccaacacact gaatgccgac tttgatctca tgcgctccgt ggccggaatt 780
acagatgctc ggaacgagga aatccgcgcc atgctgcagg ctttcattgg caggatgagc 840
ggagtgccac cttccgtctg gggaggtctg gcagctgcac gatttcagga cgtggtcgat 900
cgctggaatg ccgagagcac ccgactgtac cacgtgctcc atgccatcgc tgacacaatt 960
aggcacaacg aggccgctct gagagaagca ggccagatcc acgccaggca tattgcagcc 1020
gctggcggag acctgagagt gcgaagggcc aagcggagcc tgctcgatgc tcacatcccc 1080
cagctgattg catcccatac tgccttcgca gccaaagccg gtctcatgag acataccatc 1140
ggacaggctg agcagcaggc aatgagtgca caggcctttc accagggaga atcagctgca 1200
gccttccagg gggctcatgc acggtttgtg gctgcagccg ctaaggtcaa taccctgctc 1260
gacatcgcac aggctaacct gggagaggca gcaggtacat acgtggctgc agatgccgct 1320
gcagcctcta gttatactgg cttccgcgtg agacgggcta agcgagcaga cacaatccag 1380
gtcactcctc agatgctgag aagcaccgct aatgatatcc aggcaaacat ggagcaggcc 1440
atgggcattg ctaaaggata tctggccaac caggaaaatg tgatgaaccc agctacctgg 1500
tcagggaccg gtgtggtcgc cagccacatg actgctaccg agatcacaaa tgaactgaac 1560
aaggtgctca ctggaggtac ccgactggca gagggactcg tccaggctgc agccctgatg 1620
gagggccacg aagccgactc ccagacagcc ttccaggctc tctttggggc cagtcatggt 1680
tcaagggtgc gccgagctaa aagaactatc aactaccagt tcggcgacgt ggatgcacac 1740
ggtgccatga ttcgagcaca ggcaggctcc ctggaggcag aacatcaggc catcatttct 1800
gacgtgctca ctgccagtga tttttgggga ggagctggct ctgctgcatg ccagggattc 1860
atcacccagc tggggaggaa ttttcaggtc atctacgagc aggctaacgc acacggacag 1920
aaggtccagg cagctggcaa caatatggcc cagaccgatt ccgccgtggg tagttcttgg 1980
gcttatccat acgacgtgcc tgattacgct tga 2013
<210> 18
<211> 670
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> pHDV氨基酸序列
<400> 18
Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val
1 5 10 15
His Ser Ser Gln Ile Met Tyr Asn Tyr Pro Ala Met Leu Gly His Ala
20 25 30
Gly Asp Met Ala Gly Tyr Ala Gly Thr Leu Gln Ser Leu Gly Ala Glu
35 40 45
Ile Ala Val Glu Gln Ala Ala Leu Gln Ser Ala Trp Gln Gly Asp Thr
50 55 60
Gly Ile Thr Tyr Gln Ala Trp Gln Ala Gln Trp Asn Gln Ala Met Glu
65 70 75 80
Asp Leu Val Arg Ala Tyr His Ala Met Ser Ser Thr His Glu Ala Asn
85 90 95
Thr Met Ala Met Met Ala Arg Asp Thr Ala Glu Ala Ala Lys Trp Gly
100 105 110
Gly Arg Val Arg Arg Ala Lys Arg Thr Glu Gln Gln Trp Asn Phe Ala
115 120 125
Gly Ile Glu Ala Ala Ala Ser Ala Ile Gln Gly Asn Val Ala Ser Ile
130 135 140
His Ser Leu Leu Asp Glu Gly Lys Gln Ser Leu Thr Lys Leu Ala Ala
145 150 155 160
Ala Trp Gly Gly Ser Gly Ser Glu Ala Tyr Gln Gly Val Gln Gln Lys
165 170 175
Trp Asp Ala Thr Ala Thr Glu Leu Asn Asn Ala Leu Gln Asn Leu Ala
180 185 190
Arg Thr Ile Ser Glu Ala Gly Gln Ala Met Ala Ser Thr Glu Gly Asn
195 200 205
Val Ala Gly Met Phe Ala Arg Val Arg Arg Ala Lys Arg Val Glu Pro
210 215 220
Gly Arg Ile Gly Gly Asn Gln Ala Arg Leu Ala Ala Val Leu Leu Asp
225 230 235 240
Val Ser Thr Pro Asn Thr Leu Asn Ala Asp Phe Asp Leu Met Arg Ser
245 250 255
Val Ala Gly Ile Thr Asp Ala Arg Asn Glu Glu Ile Arg Ala Met Leu
260 265 270
Gln Ala Phe Ile Gly Arg Met Ser Gly Val Pro Pro Ser Val Trp Gly
275 280 285
Gly Leu Ala Ala Ala Arg Phe Gln Asp Val Val Asp Arg Trp Asn Ala
290 295 300
Glu Ser Thr Arg Leu Tyr His Val Leu His Ala Ile Ala Asp Thr Ile
305 310 315 320
Arg His Asn Glu Ala Ala Leu Arg Glu Ala Gly Gln Ile His Ala Arg
325 330 335
His Ile Ala Ala Ala Gly Gly Asp Leu Arg Val Arg Arg Ala Lys Arg
340 345 350
Ser Leu Leu Asp Ala His Ile Pro Gln Leu Ile Ala Ser His Thr Ala
355 360 365
Phe Ala Ala Lys Ala Gly Leu Met Arg His Thr Ile Gly Gln Ala Glu
370 375 380
Gln Gln Ala Met Ser Ala Gln Ala Phe His Gln Gly Glu Ser Ala Ala
385 390 395 400
Ala Phe Gln Gly Ala His Ala Arg Phe Val Ala Ala Ala Ala Lys Val
405 410 415
Asn Thr Leu Leu Asp Ile Ala Gln Ala Asn Leu Gly Glu Ala Ala Gly
420 425 430
Thr Tyr Val Ala Ala Asp Ala Ala Ala Ala Ser Ser Tyr Thr Gly Phe
435 440 445
Arg Val Arg Arg Ala Lys Arg Ala Asp Thr Ile Gln Val Thr Pro Gln
450 455 460
Met Leu Arg Ser Thr Ala Asn Asp Ile Gln Ala Asn Met Glu Gln Ala
465 470 475 480
Met Gly Ile Ala Lys Gly Tyr Leu Ala Asn Gln Glu Asn Val Met Asn
485 490 495
Pro Ala Thr Trp Ser Gly Thr Gly Val Val Ala Ser His Met Thr Ala
500 505 510
Thr Glu Ile Thr Asn Glu Leu Asn Lys Val Leu Thr Gly Gly Thr Arg
515 520 525
Leu Ala Glu Gly Leu Val Gln Ala Ala Ala Leu Met Glu Gly His Glu
530 535 540
Ala Asp Ser Gln Thr Ala Phe Gln Ala Leu Phe Gly Ala Ser His Gly
545 550 555 560
Ser Arg Val Arg Arg Ala Lys Arg Thr Ile Asn Tyr Gln Phe Gly Asp
565 570 575
Val Asp Ala His Gly Ala Met Ile Arg Ala Gln Ala Gly Ser Leu Glu
580 585 590
Ala Glu His Gln Ala Ile Ile Ser Asp Val Leu Thr Ala Ser Asp Phe
595 600 605
Trp Gly Gly Ala Gly Ser Ala Ala Cys Gln Gly Phe Ile Thr Gln Leu
610 615 620
Gly Arg Asn Phe Gln Val Ile Tyr Glu Gln Ala Asn Ala His Gly Gln
625 630 635 640
Lys Val Gln Ala Ala Gly Asn Asn Met Ala Gln Thr Asp Ser Ala Val
645 650 655
Gly Ser Ser Trp Ala Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala
660 665 670
<210> 19
<211> 987
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pVSW核酸2
<400> 19
atggactgga catggattct gtttctggtc gccgctgcta caagagtgca tagtacaatc 60
aattatcagt tcggggacgt ggacgctcac ggagcaatga tccgagcaca ggctggatca 120
ctggaggctg aacatcaggc aatcattagt gacgtgctga ctgcttcaga tttctggggc 180
ggggccggga gtgccgcttg ccagggattc atcacccagc tgggcagaaa ctttcaggtc 240
atctacgagc aggcaaatgc acacggacag aaggtccagg cagcaggaaa caatatggct 300
cagaccgact ccgcagtcgg gagctcctgg gccagaggaa ggaagcggag atctagtctg 360
ctggatgccc acatccccca gctgattgcc tctcatacag ctttcgctgc aaaagccgga 420
ctgatgcgac atactatcgg ccaggcagag cagcaggcca tgtctgctca ggcatttcac 480
cagggcgaaa gtgccgctgc attccaggga gcacatgctc gatttgtggc agctgcagcc 540
aaggtcaaca cactgctgga cattgcacag gccaatctgg gagaggctgc aggaacctac 600
gtggcagctg atgcagccgc tgcatcaagc tatacagggt tccgcggacg aaaaaggcgc 660
tccacttcta ggtttatgac cgaccctcac gctatgcggg atatggccgg cagattcgag 720
gtgcatgccc agacagtcga ggacgaagcc cgacggatgt gggctagcgc acagaacatc 780
gcaggagctg gatggagcgg aatggcagaa gccacttccc tggataccat gacacagatg 840
aatcaggcct ttcgcaacat tgtgaatatg ctgcacggag tgagggacgg actggtccgc 900
gatgccaaca attatgaaca gcaggaacag gcaagccagc agattctgag cagctaccca 960
tacgatgtcc ccgactacgc ataatga 987
<210> 20
<211> 327
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> pVSW氨基酸序列2
<400> 20
Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val
1 5 10 15
His Ser Thr Ile Asn Tyr Gln Phe Gly Asp Val Asp Ala His Gly Ala
20 25 30
Met Ile Arg Ala Gln Ala Gly Ser Leu Glu Ala Glu His Gln Ala Ile
35 40 45
Ile Ser Asp Val Leu Thr Ala Ser Asp Phe Trp Gly Gly Ala Gly Ser
50 55 60
Ala Ala Cys Gln Gly Phe Ile Thr Gln Leu Gly Arg Asn Phe Gln Val
65 70 75 80
Ile Tyr Glu Gln Ala Asn Ala His Gly Gln Lys Val Gln Ala Ala Gly
85 90 95
Asn Asn Met Ala Gln Thr Asp Ser Ala Val Gly Ser Ser Trp Ala Arg
100 105 110
Gly Arg Lys Arg Arg Ser Ser Leu Leu Asp Ala His Ile Pro Gln Leu
115 120 125
Ile Ala Ser His Thr Ala Phe Ala Ala Lys Ala Gly Leu Met Arg His
130 135 140
Thr Ile Gly Gln Ala Glu Gln Gln Ala Met Ser Ala Gln Ala Phe His
145 150 155 160
Gln Gly Glu Ser Ala Ala Ala Phe Gln Gly Ala His Ala Arg Phe Val
165 170 175
Ala Ala Ala Ala Lys Val Asn Thr Leu Leu Asp Ile Ala Gln Ala Asn
180 185 190
Leu Gly Glu Ala Ala Gly Thr Tyr Val Ala Ala Asp Ala Ala Ala Ala
195 200 205
Ser Ser Tyr Thr Gly Phe Arg Gly Arg Lys Arg Arg Ser Thr Ser Arg
210 215 220
Phe Met Thr Asp Pro His Ala Met Arg Asp Met Ala Gly Arg Phe Glu
225 230 235 240
Val His Ala Gln Thr Val Glu Asp Glu Ala Arg Arg Met Trp Ala Ser
245 250 255
Ala Gln Asn Ile Ala Gly Ala Gly Trp Ser Gly Met Ala Glu Ala Thr
260 265 270
Ser Leu Asp Thr Met Thr Gln Met Asn Gln Ala Phe Arg Asn Ile Val
275 280 285
Asn Met Leu His Gly Val Arg Asp Gly Leu Val Arg Asp Ala Asn Asn
290 295 300
Tyr Glu Gln Gln Glu Gln Ala Ser Gln Gln Ile Leu Ser Ser Tyr Pro
305 310 315 320
Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala
325
<210> 21
<211> 1071
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pDQE核酸序列
<400> 21
atggactgga cttggattct gttcctggtc gccgccgcaa ctcgcgtgca ctcagccgat 60
actattcagg tcactcctca gatgctgcgg tctaccgcca atgacatcca ggctaacatg 120
gagcaggcaa tgggaattgc caagggctac ctggccaacc aggaaaatgt gatgaacccc 180
gctacttgga gcggaaccgg cgtggtcgca tcccacatga ctgccaccga gatcactaat 240
gaactgaaca aagtgctgac cggcgggaca agactggcag agggactggt ccaggcagct 300
gcactgatgg agggccacga agccgatagc cagaccgcct tccaggctct gtttggagca 360
tcacatggca gccgcgggcg aaagcggaga agctcccagt ccatgtactc ttatccagca 420
atgacagcca atgtggggga catggccgga tacactggca ccacacagtc tctgggagct 480
gatattgcaa gtgagcgaac cgctccctca cgggcatgcc agggggacct gggaatgagt 540
caccaggatt ggcaggctca gtggaaccag gcaatggagg ccctggctag ggcatatagg 600
cgctgccgac gggccctgcg acagatcggc gtgctggaac gacctgtcgg cgactctagt 660
gattgtggga caattagggt ggggtcattc cggggaagat ggctggaccc ccgacatgca 720
ggacctgcta ccgcagctga cgccggcgat agggggcgca aaagaaggag cgacccaaca 780
gtgctggccg atgctgtcgc aagaatggcc gagtttggca ggcacgtgga ggaactggtc 840
gctgagatcg aatccctggt gacacgcctg catgtcacat ggactggaga gggagcagca 900
gctcacgcag aagctcagcg acattgggca gcaggagaag caatgatgag acaggcactg 960
gcccagctga ctgctgcagg gcagagtgct catgcaaatt atgccggagc aatggctact 1020
aacctgggaa tgtggtccta cccttacgat gtgcctgact acgcataatg a 1071
<210> 22
<211> 355
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> pDQE氨基酸序列2
<400> 22
Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val
1 5 10 15
His Ser Ala Asp Thr Ile Gln Val Thr Pro Gln Met Leu Arg Ser Thr
20 25 30
Ala Asn Asp Ile Gln Ala Asn Met Glu Gln Ala Met Gly Ile Ala Lys
35 40 45
Gly Tyr Leu Ala Asn Gln Glu Asn Val Met Asn Pro Ala Thr Trp Ser
50 55 60
Gly Thr Gly Val Val Ala Ser His Met Thr Ala Thr Glu Ile Thr Asn
65 70 75 80
Glu Leu Asn Lys Val Leu Thr Gly Gly Thr Arg Leu Ala Glu Gly Leu
85 90 95
Val Gln Ala Ala Ala Leu Met Glu Gly His Glu Ala Asp Ser Gln Thr
100 105 110
Ala Phe Gln Ala Leu Phe Gly Ala Ser His Gly Ser Arg Gly Arg Lys
115 120 125
Arg Arg Ser Ser Gln Ser Met Tyr Ser Tyr Pro Ala Met Thr Ala Asn
130 135 140
Val Gly Asp Met Ala Gly Tyr Thr Gly Thr Thr Gln Ser Leu Gly Ala
145 150 155 160
Asp Ile Ala Ser Glu Arg Thr Ala Pro Ser Arg Ala Cys Gln Gly Asp
165 170 175
Leu Gly Met Ser His Gln Asp Trp Gln Ala Gln Trp Asn Gln Ala Met
180 185 190
Glu Ala Leu Ala Arg Ala Tyr Arg Arg Cys Arg Arg Ala Leu Arg Gln
195 200 205
Ile Gly Val Leu Glu Arg Pro Val Gly Asp Ser Ser Asp Cys Gly Thr
210 215 220
Ile Arg Val Gly Ser Phe Arg Gly Arg Trp Leu Asp Pro Arg His Ala
225 230 235 240
Gly Pro Ala Thr Ala Ala Asp Ala Gly Asp Arg Gly Arg Lys Arg Arg
245 250 255
Ser Asp Pro Thr Val Leu Ala Asp Ala Val Ala Arg Met Ala Glu Phe
260 265 270
Gly Arg His Val Glu Glu Leu Val Ala Glu Ile Glu Ser Leu Val Thr
275 280 285
Arg Leu His Val Thr Trp Thr Gly Glu Gly Ala Ala Ala His Ala Glu
290 295 300
Ala Gln Arg His Trp Ala Ala Gly Glu Ala Met Met Arg Gln Ala Leu
305 310 315 320
Ala Gln Leu Thr Ala Ala Gly Gln Ser Ala His Ala Asn Tyr Ala Gly
325 330 335
Ala Met Ala Thr Asn Leu Gly Met Trp Ser Tyr Pro Tyr Asp Val Pro
340 345 350
Asp Tyr Ala
355
<210> 23
<211> 993
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pHAT核酸序列2
<400> 23
atggactgga cttggattct gttcctggtc gctgccgcta ctagagtgca ttcatcacag 60
attatgtata actaccctgc tatgctggga cacgcaggag acatggcagg atacgctggg 120
accctgcaga gcctgggagc agagattgca gtggaacagg ccgctctgca gtccgcctgg 180
cagggagaca caggcatcac ttaccaggct tggcaggcac agtggaacca ggccatggag 240
gatctggtcc gcgcctatca cgctatgagc tccacccatg aggcaaatac aatggcaatg 300
atggcccggg atacagctga agcagcaaag tggggcgggc gaggacgaaa acggagatct 360
actgagcagc agtggaactt tgccgggatc gaagctgcag ccagtgctat tcagggaaat 420
gtggcatcaa tccacagcct gctggacgag ggcaagcagt ccctgaccaa actggctgca 480
gcatggggag gctctggcag tgaggcatac cagggggtcc agcagaagtg ggatgcaact 540
gccaccgaac tgaacaatgc actgcagaac ctggcccgga ctattagtga ggccggccag 600
gctatggcat caaccgaagg gaatgtggct ggaatgttcg caagagggag gaaaaggcgc 660
tccaacgccg accccgtgct gtcttacaac ttcgatgcta tcgagtactc tgtccgccag 720
gaaatccata ccacagctgc acgattcaac gccgctctgc aggagctgag gagccagatc 780
gcccctctgc agcagctgtg gacaagagag gcagccgctg catatcacgc cgaacagctg 840
aagtggcatc aggccgctag cgccctgaac gaaatcctga ttgacctggg aaatgccgtg 900
aggcacggag cagacgatgt cgctcatgcc gaccgaagag cagcaggcgc ttgggccaga 960
tacccctacg atgtccccga ttacgcataa tga 993
<210> 24
<211> 329
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> pHAT氨基酸序列2
<400> 24
Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val
1 5 10 15
His Ser Ser Gln Ile Met Tyr Asn Tyr Pro Ala Met Leu Gly His Ala
20 25 30
Gly Asp Met Ala Gly Tyr Ala Gly Thr Leu Gln Ser Leu Gly Ala Glu
35 40 45
Ile Ala Val Glu Gln Ala Ala Leu Gln Ser Ala Trp Gln Gly Asp Thr
50 55 60
Gly Ile Thr Tyr Gln Ala Trp Gln Ala Gln Trp Asn Gln Ala Met Glu
65 70 75 80
Asp Leu Val Arg Ala Tyr His Ala Met Ser Ser Thr His Glu Ala Asn
85 90 95
Thr Met Ala Met Met Ala Arg Asp Thr Ala Glu Ala Ala Lys Trp Gly
100 105 110
Gly Arg Gly Arg Lys Arg Arg Ser Thr Glu Gln Gln Trp Asn Phe Ala
115 120 125
Gly Ile Glu Ala Ala Ala Ser Ala Ile Gln Gly Asn Val Ala Ser Ile
130 135 140
His Ser Leu Leu Asp Glu Gly Lys Gln Ser Leu Thr Lys Leu Ala Ala
145 150 155 160
Ala Trp Gly Gly Ser Gly Ser Glu Ala Tyr Gln Gly Val Gln Gln Lys
165 170 175
Trp Asp Ala Thr Ala Thr Glu Leu Asn Asn Ala Leu Gln Asn Leu Ala
180 185 190
Arg Thr Ile Ser Glu Ala Gly Gln Ala Met Ala Ser Thr Glu Gly Asn
195 200 205
Val Ala Gly Met Phe Ala Arg Gly Arg Lys Arg Arg Ser Asn Ala Asp
210 215 220
Pro Val Leu Ser Tyr Asn Phe Asp Ala Ile Glu Tyr Ser Val Arg Gln
225 230 235 240
Glu Ile His Thr Thr Ala Ala Arg Phe Asn Ala Ala Leu Gln Glu Leu
245 250 255
Arg Ser Gln Ile Ala Pro Leu Gln Gln Leu Trp Thr Arg Glu Ala Ala
260 265 270
Ala Ala Tyr His Ala Glu Gln Leu Lys Trp His Gln Ala Ala Ser Ala
275 280 285
Leu Asn Glu Ile Leu Ile Asp Leu Gly Asn Ala Val Arg His Gly Ala
290 295 300
Asp Asp Val Ala His Ala Asp Arg Arg Ala Ala Gly Ala Trp Ala Arg
305 310 315 320
Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala
325
<210> 25
<211> 1074
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pBCU核酸序列2
<400> 25
atggactgga catggattct gttcctggtc gcagccgcta caagagtgca ttccgccgag 60
atgaaaactg acgccgctac cctggcacag gaggccggga acttcgaacg catcagtgga 120
gacctgaaga cacagattga tcaggtggag tcaactgccg gaagcctgca gggacagtgg 180
cgaggcgccg ctggaacagc agcacaggct gcagtggtcc ggtttcagga agccgctaac 240
aagcagaaac aggagctgga cgaaatctcc actaatatta ggcaggctgg ggtgcagtac 300
tctcgcgcag atgaggaaca gcagcaggct ctgagctccc agatgggatt ccgaggccgg 360
aagcggagat ctagtgacca gattacatac aaccccggcg ccgtgagcga ctttgcatct 420
gatgtcggga gtcgggccgg acagctgcac atgatctatg aggacactgc cagcaaaacc 480
aatgctctgc aggaattctt tgccgggcat ggagctcagg gcttctttga tgcccaggct 540
cagatgctgt ccgggctgca gggactgatt gagactgtgg gccagcacgg gaccacaact 600
ggccatgtcc tggacaacgc catcgggacc gatcaggcaa ttgccggcct gttcagaggg 660
aggaaaaggc gctctgtgga accaggacgg atcggcggaa atcaggccag actggcagcc 720
gtgctgctgg acgtgagcac ccccaacaca ctgaatgctg actttgatct gatgagatca 780
gtggcaggca tcaccgatgc ccgcaatgag gaaattcgag caatgctgca ggccttcatc 840
ggaaggatgt caggagtgcc ccctagcgtc tggggaggcc tggctgcagc aaggtttcag 900
gacgtggtcg atcgctggaa cgccgagagc acccgactgt atcacgtgct gcatgctatc 960
gcagatacaa ttcggcacaa tgaggctgca ctgagagaag ccggccagat ccatgctaga 1020
catattgccg ctgctggagg cgacctgtac ccctacgacg tgcccgatta cgca 1074
<210> 26
<211> 358
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> pBCU氨基酸序列2
<400> 26
Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val
1 5 10 15
His Ser Ala Glu Met Lys Thr Asp Ala Ala Thr Leu Ala Gln Glu Ala
20 25 30
Gly Asn Phe Glu Arg Ile Ser Gly Asp Leu Lys Thr Gln Ile Asp Gln
35 40 45
Val Glu Ser Thr Ala Gly Ser Leu Gln Gly Gln Trp Arg Gly Ala Ala
50 55 60
Gly Thr Ala Ala Gln Ala Ala Val Val Arg Phe Gln Glu Ala Ala Asn
65 70 75 80
Lys Gln Lys Gln Glu Leu Asp Glu Ile Ser Thr Asn Ile Arg Gln Ala
85 90 95
Gly Val Gln Tyr Ser Arg Ala Asp Glu Glu Gln Gln Gln Ala Leu Ser
100 105 110
Ser Gln Met Gly Phe Arg Gly Arg Lys Arg Arg Ser Ser Asp Gln Ile
115 120 125
Thr Tyr Asn Pro Gly Ala Val Ser Asp Phe Ala Ser Asp Val Gly Ser
130 135 140
Arg Ala Gly Gln Leu His Met Ile Tyr Glu Asp Thr Ala Ser Lys Thr
145 150 155 160
Asn Ala Leu Gln Glu Phe Phe Ala Gly His Gly Ala Gln Gly Phe Phe
165 170 175
Asp Ala Gln Ala Gln Met Leu Ser Gly Leu Gln Gly Leu Ile Glu Thr
180 185 190
Val Gly Gln His Gly Thr Thr Thr Gly His Val Leu Asp Asn Ala Ile
195 200 205
Gly Thr Asp Gln Ala Ile Ala Gly Leu Phe Arg Gly Arg Lys Arg Arg
210 215 220
Ser Val Glu Pro Gly Arg Ile Gly Gly Asn Gln Ala Arg Leu Ala Ala
225 230 235 240
Val Leu Leu Asp Val Ser Thr Pro Asn Thr Leu Asn Ala Asp Phe Asp
245 250 255
Leu Met Arg Ser Val Ala Gly Ile Thr Asp Ala Arg Asn Glu Glu Ile
260 265 270
Arg Ala Met Leu Gln Ala Phe Ile Gly Arg Met Ser Gly Val Pro Pro
275 280 285
Ser Val Trp Gly Gly Leu Ala Ala Ala Arg Phe Gln Asp Val Val Asp
290 295 300
Arg Trp Asn Ala Glu Ser Thr Arg Leu Tyr His Val Leu His Ala Ile
305 310 315 320
Ala Asp Thr Ile Arg His Asn Glu Ala Ala Leu Arg Glu Ala Gly Gln
325 330 335
Ile His Ala Arg His Ile Ala Ala Ala Gly Gly Asp Leu Tyr Pro Tyr
340 345 350
Asp Val Pro Asp Tyr Ala
355
<210> 27
<211> 999
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pORF核酸序列2
<400> 27
atggactgga catggattct gtttctggtc gctgccgcta caagagtgca ttcaactatc 60
aattatcagt tcggggacgt ggacgctcac ggagcaatga tccgagcaca ggctggactg 120
ctggaggcag aacatcaggc tattgtgcga gacgtgctgg cagctggaga tttctggggc 180
ggggcaggct ccgtggcatg ccaggagttc atcacacagc tgggcaggaa ctttcaggtc 240
atctacgaac aggcaaatgc acacggacag aaggtccagg cagcaggaaa caatatggcc 300
cagactgact ctgctgtggg gagctcctgg gcccgaggac gaaaacggag atctagtcag 360
atcatgtaca actatcccgc catgatggct catgcagggg acatggccgg gtatgctgga 420
accctgcaga gcctgggagc agatatcgca tccgagcagg ccgtgctgag cagcgcctgg 480
cagggcgaca ccgggattac ataccagggc tggcagacac agtggaacca ggccctggaa 540
gatctggtcc gggcctatca gtccatgtct ggcactcacg agagcaatac catggctatg 600
ctggcaagag atggggccga agctgcaaag tggggaggca gaggcaggaa aaggcgctca 660
ggagcagacg ataccctgcg agtggagcct gccgtcatgc agggctttgc agctagtctg 720
gacggagcag cagagcacct ggctgtgcag ctggcagaac tggatgcaca ggtcggacag 780
atgctgggcg gctggagggg agctagtggc tcagcatacg gctctgcctg ggagctggct 840
catcgcggcg caggagaagt gcagctggga ctgagtatgc tggctgcagc cattgcccac 900
gctggagcag gctatcagca taatgaggct gcatctgccc aggtgctgag agaggtcggc 960
ggcggatacc cttacgatgt ccctgactat gcctaatga 999
<210> 28
<211> 331
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> pORF氨基酸序列2
<400> 28
Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val
1 5 10 15
His Ser Thr Ile Asn Tyr Gln Phe Gly Asp Val Asp Ala His Gly Ala
20 25 30
Met Ile Arg Ala Gln Ala Gly Leu Leu Glu Ala Glu His Gln Ala Ile
35 40 45
Val Arg Asp Val Leu Ala Ala Gly Asp Phe Trp Gly Gly Ala Gly Ser
50 55 60
Val Ala Cys Gln Glu Phe Ile Thr Gln Leu Gly Arg Asn Phe Gln Val
65 70 75 80
Ile Tyr Glu Gln Ala Asn Ala His Gly Gln Lys Val Gln Ala Ala Gly
85 90 95
Asn Asn Met Ala Gln Thr Asp Ser Ala Val Gly Ser Ser Trp Ala Arg
100 105 110
Gly Arg Lys Arg Arg Ser Ser Gln Ile Met Tyr Asn Tyr Pro Ala Met
115 120 125
Met Ala His Ala Gly Asp Met Ala Gly Tyr Ala Gly Thr Leu Gln Ser
130 135 140
Leu Gly Ala Asp Ile Ala Ser Glu Gln Ala Val Leu Ser Ser Ala Trp
145 150 155 160
Gln Gly Asp Thr Gly Ile Thr Tyr Gln Gly Trp Gln Thr Gln Trp Asn
165 170 175
Gln Ala Leu Glu Asp Leu Val Arg Ala Tyr Gln Ser Met Ser Gly Thr
180 185 190
His Glu Ser Asn Thr Met Ala Met Leu Ala Arg Asp Gly Ala Glu Ala
195 200 205
Ala Lys Trp Gly Gly Arg Gly Arg Lys Arg Arg Ser Gly Ala Asp Asp
210 215 220
Thr Leu Arg Val Glu Pro Ala Val Met Gln Gly Phe Ala Ala Ser Leu
225 230 235 240
Asp Gly Ala Ala Glu His Leu Ala Val Gln Leu Ala Glu Leu Asp Ala
245 250 255
Gln Val Gly Gln Met Leu Gly Gly Trp Arg Gly Ala Ser Gly Ser Ala
260 265 270
Tyr Gly Ser Ala Trp Glu Leu Ala His Arg Gly Ala Gly Glu Val Gln
275 280 285
Leu Gly Leu Ser Met Leu Ala Ala Ala Ile Ala His Ala Gly Ala Gly
290 295 300
Tyr Gln His Asn Glu Ala Ala Ser Ala Gln Val Leu Arg Glu Val Gly
305 310 315 320
Gly Gly Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala
325 330
<210> 29
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C-甘露糖基化位点1
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa=任意氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> Xaa=任意氨基酸
<400> 29
Trp Xaa Xaa Trp
1
<210> 30
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C-甘露糖基化位点2
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa=任意氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> Xaa=任意氨基酸
<400> 30
Trp Xaa Xaa Ala
1
<210> 31
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C-甘露糖基化位点3
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa=任意氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> Xaa=任意氨基酸
<400> 31
Ala Xaa Xaa Trp
1

Claims (10)

1.一种包含选自如下物质的组合物：
a)包含esxV、esxS和esxW编码序列的核酸分子、包含esxD、esxQ和esxE编码序列的核酸分子、包含esxH、esxA和esxT编码序列的核酸分子、包含esxB、esxC和esxU编码序列的核酸分子和包含esxO、esxR和esxF编码序列的核酸分子的组合；
b)包含SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:1的核酸分子、包含SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:3的核酸分子、包含SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:5的核酸分子、包含SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:7的核酸分子和包含SEQ ID NO:27或SEQ ID NO:9的核酸分子的组合；
c)包含SEQ ID NO:19的核酸分子、包含SEQ ID NO:21的核酸分子、包含SEQ ID NO:23的核酸分子、包含SEQ ID NO:25的核酸分子和包含SEQ ID NO:27的核酸分子的组合；
d)编码SEQ ID NO:20的核酸分子、编码SEQ ID NO:22的核酸分子、编码SEQ ID NO:24的核酸分子、编码SEQ ID NO:26的核酸分子和编码SEQ ID NO:28的核酸分子的组合；
e)选自以下的一种或多种核酸分子：包含SEQ ID NO:1的核酸分子、包含SEQ ID NO:3的核酸分子、包含SEQ ID NO:5的核酸分子、包含SEQ ID NO:7的核酸分子、包含SEQ ID NO:9的核酸分子、包含SEQ ID NO:11的核酸分子、包含SEQ ID NO:13的核酸分子、包含SEQ IDNO:15的核酸分子、包含SEQ ID NO:17的核酸分子、包含SEQ ID NO:19的核酸分子、包含SEQID NO:21的核酸分子、包含SEQ ID NO:23的核酸分子、包含SEQ ID NO:25的核酸分子、包含SEQ ID NO:27的核酸分子、具有至少90％的全长的其片段、具有至少95％的同源性的同源序列以及具有至少95％的同源性的同源序列的片段，具有至少95％的同源性的同源序列的所述片段具有至少90％的全长；和
f)编码选自以下的氨基酸序列的一种或多种核酸分子：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、具有至少90％的全长的其片段、具有至少95％的同源性的同源序列以及具有至少95％的同源性的同源序列的片段，具有至少95％的同源性的同源序列的所述片段具有至少90％的全长。
2.根据权利要求1所述的组合物，其包含如下核酸分子的组合：包含SEQ ID NO:19的核酸分子、包含SEQ ID NO:21的核酸分子、包含SEQ ID NO:23的核酸分子、包含SEQ ID NO:25的核酸分子和包含SEQ ID NO:27的核酸分子。
3.根据权利要求2所述的组合物，其中包含SEQ ID NO:19的所述核酸分子是质粒，包含SEQ ID NO:21的所述核酸分子是质粒，包含SEQ ID NO:23的所述核酸分子是质粒，包含SEQID NO:25的所述核酸分子是质粒以及包含SEQ ID NO:27的所述核酸分子是质粒。
4.根据权利要求1所述的组合物，其包含如下核酸分子的组合：包含esxV、esxS和esxW编码序列的核酸分子、包含esxD、esxQ和esxE编码序列的核酸分子、包含esxH、esxA和esxT编码序列的核酸分子、包含esxB、esxC和esxU编码序列的核酸分子和包含esxO、esxR和esxF编码序列的核酸分子。
5.根据权利要求4所述的组合物，其包含如下核酸分子的组合：包含SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:1的核酸分子、包含SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:3的核酸分子、包含SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:5的核酸分子、包含SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:7的核酸分子以及包含SEQID NO:27或SEQ ID NO:9的核酸分子。
6.根据权利要求1所述的组合物，其包含选自以下的核酸分子：SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25和SEQ IDNO:27。
7.根据权利要求6所述的组合物，其中所述核酸分子是质粒。
8.根据权利要求1所述的组合物，其包含如下核酸分子：包含SEQ ID NO:1的核酸分子、包含SEQ ID NO:3的核酸分子、包含SEQ ID NO:5的核酸分子、包含SEQ ID NO:7的核酸分子和包含SEQ ID NO:9的核酸分子。
9.根据权利要求1所述的组合物，其还包含编码选自IL-12、IL-15和IL-28的一种或多种蛋白的核酸序列。
10.根据任何权利要求1所述的组合物，其被配制用于使用电穿孔递送至个体。
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