CN110063945B - 一种用于急性胰腺炎治疗的胆红素纳米颗粒及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于急性胰腺炎治疗的胆红素纳米颗粒及其制备方法。主要由丝素蛋白、胆红素、京尼平和神经酰胺组成；方法将胆红素、京尼平和神经酰胺溶解于混合有机试剂，其次将丝素蛋白溶解于水溶液中，然后将胆红素、京尼平和神经酰胺的混合溶液缓慢滴入丝素蛋白溶液，持续搅拌，透析除去有机溶剂，将得到的纳米颗粒混悬液用纯水稀释得到胆红素纳米颗粒。本发明胆红素纳米颗粒可用于急性胰腺炎的治疗，缓解胰腺炎引起的组织水肿，可应用于急性胰腺炎治疗药物的制备，具有广阔的临床应用前景。

Description

一种用于急性胰腺炎治疗的胆红素纳米颗粒及其制备方法

技术领域

本发明属于纳米药物载体技术领域，具体涉及一种用于急性胰腺炎治疗的纳米颗粒及其制备。

背景技术

急性胰腺炎是胰腺的炎症性疾病，最常见的症状是急性腹痛，炎症反应剧烈可造成多器官衰竭。研究已证实急性胰腺患者血清中的淀粉酶以及脂肪酶高于正常人的三至四倍。即使得到及时治疗，仍然约有75％的患者出现轻度胰腺损伤。值得强调的是，约25％的患者可能出现严重的并发症，而50％的患者甚至死于系统性并发症。近几十年来，寻找安全有效的手段治疗急性胰腺炎尤为紧迫，但目前临床上对于急性胰腺炎的治疗鲜有进步。调节细胞活动重要起始的确切机制和对急性胰腺炎严重程度的准确把握极大程度地限制了临床上对于急性胰腺炎疾病治疗的深入研究，因此提出新的治疗策略，开发新的治疗药物以改善对该疾病的治疗迫在眉睫。

胆红素是血红素加氧酶催化血红素代谢的产物，20世纪研究发现胆红素具有抗氧化抗炎的作用，可以靶向体内活性氧丰富的组织，临床研究也发现胆红素水平与一系列活性氧相关的疾病呈负相关。由于胆红素的水溶性极差，且高浓度时具有神经毒性，因此其临床应用受到很大限制。

虽然丝素蛋白纳米药物能借助纳米载体对药物进行包裹和控制释放，但是。丝素蛋白作为一种天然大分子材料，生物相容性好，易于加工和修饰，具有作为药物递送载体的潜力。

并且针对于胆红素的稳定性较差，脂溶性强的特点，如何优化丝素蛋白纳米制剂的处方，使其能发挥包载药物的治疗依然是一个技术难题。

目前，尚无利用胆红素用于急性胰腺炎的报道，也没有利用胆红素、丝素蛋白和神经酰胺共同制备纳米颗粒的报道，更无利用神经酰胺和京尼平与丝素蛋白共同制备纳米颗粒包载胆红素的相关报道。

发明内容

为了解决背景技术中存在的问题，本发明旨在于一种可应用于急性胰腺炎治疗的胆红素纳米颗粒，其目的在于，提供一种胆红素的新应用，通过胆红素的纳米制剂治疗急性胰腺炎，可明显延缓病情进展恶化，显著降低血清中淀粉酶和脂肪酶含量，并缓解胰腺炎引起的组织水肿，降低组织病理学评分，并且该治疗存在可操作性强，费用低等优点。

本发明的胆红素纳米颗粒有望利用胆红素的抗炎抗氧化作用机制，靶向递送至炎症部位，发挥治疗作用，从而为进一步的临床转化打下坚实的基础。

本发明所采用的技术方案是：

一、一种用于急性胰腺炎治疗的胆红素纳米颗粒：

主要由丝素蛋白、胆红素、京尼平和神经酰胺组成。

所述神经酰胺为神经酰胺磷酸乙醇胺、神经酰胺磷酸胆碱的至少一种，优选神经酰胺磷酸乙醇胺。

所述纳米颗粒的粒径为160～200nm。

二、一种胆红素纳米颗粒的制备方法，方法包括以下步骤：

首先，将胆红素、京尼平和神经酰胺用DMSO溶解后，再用丙酮稀释，配置成胆红素、京尼平和神经酰胺混合溶液；接着，将丝素蛋白溶解于水溶液中，配置成质量分数4％～10％的丝素蛋白溶液；然后将胆红素、京尼平和神经酰胺的混合溶液缓慢滴入丝素蛋白溶液，滴入过程中持续搅拌6h，透析除去有机溶剂，获得纳米颗粒混悬液，再将纳米颗粒混悬液用纯水稀释得到胆红素纳米颗粒溶液。

所述步骤1)中的胆红素在DMSO中的浓度为5mg/ml±20％；京尼平在DMSO中的浓度为0.5mg/ml±20％；神经酰胺在DMSO中的浓度为5mg/ml±20％。

所述步骤1)中的丙酮与二甲基亚砜(DMSO)的体积比为7:2。

所述步骤2)中丝素蛋白的浓度为5％～10％。

所述步骤3)中胆红素、京尼平和神经酰胺的混合溶液和丝素蛋白溶液的体积比为9:1。

所述步骤3)中搅拌温度范围为40～60℃，优选为50℃。

本发明方法制备而成的胆红素纳米颗粒在制备治疗急性胰腺炎的药物中的应用。

本发明对于胆红素的稳定性较差、脂溶性强的特点，优化了丝素蛋白纳米制剂的处方，让胆红素与白蛋白结合物形成可溶性复合物，使丝素蛋白纳米制剂能最大限度地发挥包载胆红素药物，加强药物的治疗效果，解决了胆红素在纳米制剂中稳定性较差、脂溶性强的技术问题。

本发明利用包载胆红素的丝素蛋白纳米粒能改善胆红素的水溶性，结合神经酰胺和京尼平提高胆红素的稳定性并降低其毒性，具有极大的临床应用前景。

本发明还提供了上述用于急性胰腺炎治疗的胆红素纳米颗粒在制备治疗急性胰腺炎药物中的应用。

本发明保护胆红素纳米颗粒的制备及其在急性胰腺炎治疗药物制备中的应用。

本发明制成的纳米颗粒具有较窄的粒径分布，较高的载药量，良好的生物相容性。

本发明的有益效果和优势在于：

本发明通过去溶剂法自组装交联变性制备纳米颗粒，对胆红素起到了增溶、稳定作用，并利用其纳米效应，提高了其在体内的半衰期，从而提高胆红素在细胞内的摄取量，延长药物的滞留时间，具有胞内长效以及靶向的优势，有利于提高胆红素的生物利用度。

并且，本发明整个制备方法过程操作简单，条件稳定，重现性良好。

本发明通过大量试验发现所述胆红素纳米颗粒对治疗急性胰腺炎效果好，无毒副作用，成本低廉；将有助于延缓病情进展恶化，还具有可操作性强，能显著降低患者及医疗机构的诊疗费用等优点。

附图说明

图1为本发明实施例1制备的胆红素纳米颗粒的透射电镜图；

图2为本发明实施例1制备的胆红素纳米颗粒的体外累计释放曲线图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步的描述。

实施例1胆红素纳米颗粒的制备

蚕茧经过碳酸氢钠弱碱溶液脱胶以后，用溴化锂溶液完全溶解，在经过去离子水透析后得到再生丝素蛋白；将10mg胆红素，1mg京尼平，10mg神经酰胺磷酸乙醇胺溶解在2mlDMSO中，再加入7ml丙酮混合，得到有机相；取50mg丝素蛋白溶解在1ml的纯水中，4000rpm离心5min后取上清液为水相；将水相与有机相在50℃混合搅拌6h，透析除去有机溶剂；将所得到的纳米混悬液用纯水稀释即得胆红素纳米颗粒①。

胆红素纳米颗粒②的制备方法同该法，所不同的是，以等质量的神经酰胺磷酸胆碱替代神经酰胺磷酸乙醇胺。

空白丝素蛋白纳米颗粒的制备方法同该法，所不同的是，不加入胆红素。

胆红素白蛋白纳米颗粒的制备方法同该法，所不同的是，以等质量的白蛋白替代丝素蛋白。

原花青素胆红素纳米颗粒的制备方法同该法，所不同的是，以等质量的原花青素替代京尼平。

卵磷脂胆红素纳米颗粒的制备方法同该法，所不同的是，以等质量的卵磷脂替代神经酰胺磷酸乙醇胺。

胆绿素纳米颗粒的制备方法同该法，所不同的是，以等质量的胆绿素替代胆红素。

胆红素纳米颗粒对照组的制备方法类同该法，具体制备方法如下描述：

胆红素纳米颗粒对照组①：将10mg胆红素，2.0mg京尼平，10mg神经酰胺磷酸乙醇胺溶解在2ml DMSO中，再加入7ml丙酮混合，得到有机相；取30mg丝素蛋白溶解在1ml的纯水中，4000rpm离心5min后取上清液为水相；将水相与有机相在50℃混合搅拌6h，透析除去有机溶剂；将所得到的纳米混悬液用纯水稀释即得胆红素纳米颗粒对照组①。

胆红素纳米颗粒对照组②：将10mg胆红素，1.0mg京尼平，5mg神经酰胺磷酸乙醇胺溶解在2ml DMSO中，再加入2ml丙酮混合，得到有机相；取50mg丝素蛋白溶解在1ml的纯水中，4000rpm离心5min后取上清液为水相；将水相与有机相在50℃混合搅拌6h，透析除去有机溶剂；将所得到的纳米混悬液用纯水稀释即得胆红素纳米颗粒对照组②。

胆红素纳米颗粒对照组③：将20mg胆红素，1.0mg京尼平，10mg神经酰胺磷酸乙醇胺溶解在2ml DMSO中，再加入7ml丙酮混合，得到有机相；取50mg丝素蛋白溶解在1ml的纯水中，4000rpm离心5min后取上清液为水相；将水相与有机相在80℃混合搅拌6h，透析除去有机溶剂；将所得到的纳米混悬液用纯水稀释即得胆红素纳米颗粒对照组③。

实施例2胆红素纳米颗粒的表征

2.1粒径和Zeta电位

取实施例1中制备得到的胆红素纳米颗粒，通过动态光散射检测纳米粒子的平均尺寸和Zeta电位。并通过透射电子显微镜进行胆红素纳米颗粒①的形态学检查，具体来说，将胆红素纳米颗粒稀释至适宜浓度后，滴于涂有碳膜的铜网上制备样品，然后在透射电镜下观察样品形态。

粒径和Zeta电位如表1所示，结果表明胆红素纳米颗粒①粒径为184.34±10.78，PDI数值为0.083。胆红素纳米颗粒②粒径为176.39±8.73，PDI数值为0.102。PDI表示的是纳米粒粒径分布的均匀度，多分散系数(PDI)值越小说明纳米粒大小越均匀，表明本发明纳米颗粒的粒径范围较小。透射电镜图如图1所示，胆红素纳米颗粒呈球状，粒径分布较均一，密集堆积，这也是蛋白质纳米粒子的特征。该胆红素纳米颗粒①和②的Zeta电位分别为-18.36±1.24mV和-19.42±2.11，带负电荷的纳米颗粒具有长循环的特点，并且其细胞毒性较小。

本发明的胆红素纳米颗粒的上述Zeta电位，可减少其毒性并延长其在体循环中的滞留时间，实现长循环的目的。同时，通过比较不同纳米颗粒的结果，表明京尼平交联剂对于胆红素纳米颗粒的制备具有重要作用。本发明的胆红素纳米颗粒的粒径范围较小，集中在160-200nm之间，改变其中的处方及工艺参数，会增大其粒径及分布范围，但是Zeta电位变化并不明显。

表1胆红素纳米颗粒的粒径和Zeta电位

	粒径(nm)	PDI	Zeta电位(mV)
				胆红素纳米颗粒①	184.34±10.78	0.083	-18.36±1.24
胆红素纳米颗粒②	176.39±8.73	0.102	-19.42±2.11
				空白丝素蛋白纳米颗粒	169.64±7.32	0.095	-20.33±2.39
胆红素白蛋白纳米颗粒	167.32±8.94	0.071	-15.78±1.03
				原花青素胆红素纳米颗粒	326.43±24.38	0.129	-13.64±1.20
卵磷脂胆红素纳米颗粒	194.62±17.81	0.144	-20.33±2.15
				胆绿素纳米颗粒	174.53±9.83	0.105	-21.32±2.34
胆红素纳米颗粒对照组①	273.45±10.74	0.159	-18.33±2.37
				胆红素纳米颗粒对照组②	217.36±6.39	0.097	-17.39±1.95
胆红素纳米颗粒对照组③	378.32±9.83	0.274	-20.74±3.25

2.2胆红素载药量和包封效率

取实施例1中制备得到的胆红素纳米颗粒，选用高速冷冻离心法测定其胆红素的包封率和载药量,。其中，离心条件为4℃，转速为15000rpm/min，离心时间为20min。在离心力作用下，纳米颗粒沉淀，纯水复溶后，冷冻干燥。称取冻干后纳米样品的质量，并加入二甲基亚砜和0.1M NaOH混合溶液(1:1，v/v)破坏纳米结构，并测定纳米颗粒中的胆红素含量。根据以下公式计算包封率：载药量(％)＝纳米颗粒中的胆红素质量(mg)/纳米颗粒质量(mg)。根据以下公式计算包封率：包封率(％)＝纳米颗粒中的胆红素质量(mg)/投药量(mg)。

药物包载能力是药物递送中的关键因素之一。为了获得高载药量和高稳定性的给药纳米体系，本发明使用优化的处方工艺制备了胆红素纳米颗粒，结果见表2。取实施例1中制备得到的胆红素纳米颗粒①包封率为86.34％，胆红素纳米颗粒②包封率为75.28％，远高于卵磷脂胆红素纳米颗粒的包封率(25.66％)。

实验结果表明神经酰胺对胆红素纳米颗粒的成功制备具有重要意义，本发明的胆红素纳米颗粒的载药量和包封率均较高，改变其中的处方及工艺参数，会降低其载药量和包封率。

表2胆红素纳米颗粒的粒径和Zeta电位

2.3体外药物释放曲线

用pH＝7.4的磷酸盐缓冲液研究胆红素纳米颗粒①的累计药物释放特征。PH7.4与正常细胞的细胞外生理pH相当。结果如图2所示，胆红素可从实施例1中制备得到的胆红素纳米颗粒①中逐渐缓慢释放，表明将药物包载于丝素蛋白纳米载体中可显著延长其在血浆中的循环时间。在释放实验12小时后，胆红素溶液组已经完全释放，而胆红素纳米颗粒只释放了30％左右的药物，表明其具有显著的缓慢释药特性，且无明显突释现象。本发明的胆红素纳米颗粒可以在生理pH条件下以缓慢和持续的释放活性药物。

实施例3胆红素纳米颗粒对急性胰腺炎的治疗作用

3.1急性胰腺炎大鼠模型的建立

取5周龄雄性SD大鼠，随机分为对照组、模型组、给药干预组。实验前实验前大鼠适应性饲养1周，造模前12h禁食，不禁水。间隔1小时给老鼠两次腹腔注射精氨酸(2.5mg/ml给药)，第二次给药完成之后，淀粉酶升高即为造模成功。实验结束后(即开始造模24小时后)，通过眼眶取血收集分离血清，-80℃保存，以便后续测淀粉酶脂肪酶水平，ELISA测得血清炎症因子TNF-α，IL-6水平以及抗炎因子IL-10的水平；处死大鼠后，腹腔剖开剥离得到胰腺脏器，称重后，常规HE染色进行双盲组织病理学评分。其中评分标准参照Schmidt胰腺组织病理学评分标准(0～4分)，分数越高表示病理恶性程度越高。

3.2实验分组

对照组：以生理盐水替代精氨酸溶液

模型组：造模成功后，无干预治疗

给药干预组1：造模成功后，尾静脉注射胆红素纳米颗粒①给药；

给药干预组2：造模成功后，尾静脉注射胆红素纳米颗粒②给药；

给药干预组3：造模成功后，尾静脉注射空白丝素蛋白纳米颗粒给药；

给药干预组4：造模成功后，尾静脉注射胆红素白蛋白纳米颗粒给药；

给药干预组5：造模成功后，尾静脉注射原花青素胆红素纳米颗粒给药；

给药干预组6：造模成功后，尾静脉注射卵磷脂胆红素纳米颗粒给药；

给药干预组7：造模成功后，尾静脉注射胆绿素纳米颗粒给药；

给药干预组8：造模成功后，尾静脉注射胆红素纳米颗粒对照组①给药；

给药干预组9：造模成功后，尾静脉注射胆红素纳米颗粒对照组②给药；

给药干预组10：造模成功后，尾静脉注射胆红素纳米颗粒对照组③给药；

3.3实验结果和结论

表3胆红素纳米颗粒治疗急性胰腺炎大鼠的结果

实验结果如表3所示。血清中淀粉酶以及脂肪酶是胰腺炎严重程度的标志物。胆红素纳米颗粒的淀粉酶以及脂肪酶水平明显低于单纯造模组和其他给药干预组，相比于空白丝素蛋白纳米颗粒、胆红素白蛋白纳米颗粒、原花青素胆红素纳米颗粒、卵磷脂胆红素纳米颗粒和胆绿素纳米颗粒显示出巨大的优势。TNF-α以及IL-6等炎症因子越高表示体内炎症反应越重，常用于指示胰腺炎的恶性程度。

结果表明急性胰腺炎模型组的大鼠血清中的炎症因子的水平大约为对照组的两倍，胆红素白蛋白纳米颗粒和原花青素胆红素纳米颗粒的大鼠血清中TNF-α以及IL-6等的水平明显低于急性胰腺炎组，但胆红素纳米颗粒处理的老鼠炎症水平更接近对照组的炎症因子的水平，空白丝素蛋白纳米颗粒和胆绿素纳米颗粒处理的实验组与单纯造模组无明显差异。IL-10是一种抗炎性因子，发挥下调炎症反应，拮抗炎性介质的作用。相比于给药干预组，胆红素纳米颗粒处理之后的SD大鼠抗炎水平提高。急性胰腺炎造模大鼠胰腺组织病理损害程度较假手术对照组明显升高，同时胆红素纳米颗粒干预治疗后，其病理评分大幅度降低，且低于其他任何药物干预治疗组。

对照组中的大鼠胰腺组织结构清晰，偶见炎性细胞浸润，而模型组胰腺组织有明显腺泡小叶结构破坏，水肿严重，片状出血，炎性细胞浸润等。经胆红素纳米颗粒干预治疗后，可维持小叶结构，水肿水平降低，炎性细胞浸润降低，偶见点状出血，其胰腺组织病理评分高于模型组和其他药物干预组。但是在胆红素纳米颗粒的两个实验组中，胆红素纳米颗粒①的综合治疗效果优于胆红素纳米颗粒②。通过改变本发明的处方及制备工艺所得到的胆红素纳米颗粒对照组，其同样具有一定的治疗效果，但是疗效较低，可能与其粒径较大不利于体内长循环和胰腺炎定位靶向蓄积有关。

上述结果明显表明，本发明的胆红素纳米颗粒可以有效降低急性胰腺炎大鼠中淀粉酶以及脂肪酶，缓减其胰腺组织的炎症，从而提示急性胰腺炎的发生和发展得以改善。因此，胆红素纳米颗粒有望应用于胰腺炎治疗药物的制备。

以上所揭露的仅为本发明较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的。

Claims (5)

1.一种用于急性胰腺炎治疗的胆红素纳米颗粒，其特征在于：

主要由丝素蛋白、胆红素、京尼平和神经酰胺组成；胆红素在DMSO中的浓度为5mg/ml±20%；京尼平在DMSO中的浓度为0.5mg/ml±20%；神经酰胺在DMSO中的浓度为5mg/ml±20%；丝素蛋白的浓度为5%~10%；

所述的胆红素纳米颗粒通过以下制备方法制备获得：

首先，将胆红素、京尼平和神经酰胺用DMSO溶解后，再用丙酮稀释，配置成胆红素、京尼平和神经酰胺混合溶液；接着，将丝素蛋白溶解于水溶液中，配置成质量分数4%~10%的丝素蛋白溶液；然后将胆红素、京尼平和神经酰胺的混合溶液滴入丝素蛋白溶液，滴入过程中持续搅拌6h，透析除去有机溶剂，获得纳米颗粒混悬液，再将纳米颗粒混悬液用纯水稀释得到胆红素纳米颗粒溶液；

所述的丙酮与二甲基亚砜的体积比为7:2；

所述胆红素、京尼平和神经酰胺的混合溶液和丝素蛋白溶液的体积比为9:1；

所述搅拌温度范围为40~60℃。

2.根据权利要求1所述的胆红素纳米颗粒，其特征在于：

所述神经酰胺为神经酰胺磷酸乙醇胺、神经酰胺磷酸胆碱的至少一种。

3.根据权利要求1所述的胆红素纳米颗粒，其特征在于：

所述纳米颗粒的粒径为160~200nm。

4.根据权利要求1-3任一所述胆红素纳米颗粒的制备方法，其特征在于，方法包括以下步骤：首先，将胆红素、京尼平和神经酰胺用DMSO溶解后，再用丙酮稀释，配置成胆红素、京尼平和神经酰胺混合溶液；接着，将丝素蛋白溶解于水溶液中，配置成质量分数4%~10%的丝素蛋白溶液；然后将胆红素、京尼平和神经酰胺的混合溶液滴入丝素蛋白溶液，滴入过程中持续搅拌6h，透析除去有机溶剂，获得纳米颗粒混悬液，再将纳米颗粒混悬液用纯水稀释得到胆红素纳米颗粒溶液；

所述的丙酮与二甲基亚砜的体积比为7:2；

所述胆红素、京尼平和神经酰胺的混合溶液和丝素蛋白溶液的体积比为9:1；

所述搅拌温度范围为40~60℃。

5.根据权利要求1所述的胆红素纳米颗粒或者根据权利要求4所述方法制备而成的胆红素纳米颗粒在制备治疗急性胰腺炎的药物中的应用。

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