CN110063427B - 一种野甘草提取物在制备淡水鱼抗应激剂中的应用及其制备方法 - Google Patents

一种野甘草提取物在制备淡水鱼抗应激剂中的应用及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种野甘草提取物在制备淡水鱼抗应激剂中的应用及其制备方法。野甘草提取物作为淡水鱼抗应激剂能使淡水鱼抗养殖高密度、硫酸铜和敌百虫应激的能力提升，降低高密度养殖环境下淡水鱼的应激反应、发病率和死亡率，降低养殖风险，增加养殖者的收入。

Description

一种野甘草提取物在制备淡水鱼抗应激剂中的应用及其制备 方法
技术领域
本发明属于淡水鱼养殖技术领域，尤其涉及一种野甘草提取物在制备淡水鱼抗应激剂中的应用及其制备方法。
背景技术
由于养殖鱼类和地域的不同，鱼的适宜生长密度是不同的；并且在养殖过程中，环境的变化会导致鱼的适宜生长密度发生改变。一般情况下，养殖户很难根据这些变化对池塘内鱼苗的密度进行适当的调整；为了获得最大的养殖收益，养殖者会尽可能的提高池塘内鱼苗的密度。高密度集约化也是目前水产养殖的重要特征，然而高密度养殖意味着饲料投喂量的提高，从而导致水体中养殖废物增多，使水质变差。其具体表现为水中溶氧量降低，氨氮和亚硝酸盐含量超标。已有报道显示：这些因素会降低鱼对饲料的消化吸收，降低鱼的生长和免疫功能，提高鱼的发病率和死亡率。
另外，高密度养殖水体会滋生更多有害的虫类和菌类，需要使用大量的消毒剂和杀虫剂来进行杀灭，而这又会导致水中消毒剂和杀虫剂的超量使用。目前，淡水鱼养殖中最常用的消毒杀虫剂之一是硫酸铜和敌百虫。硫酸铜在鱼养殖中的使用浓度一般为0.5-1.0mg/L，已有研究证实，养殖水体使用硫酸铜能诱导鱼的氧化应激和降低鱼的摄食、消化吸收、生长和免疫功能，从而使鱼生长缓慢，发病率升高、甚至死亡。敌百虫是一种胆碱酯酶抑制剂。敌百虫中毒能导致动物肌肉机能紊乱，而失去平衡。已有报道显示，敌百虫也可诱导养殖鱼类发生氧化应激并对鱼的消化吸收、呼吸和免疫功能造成不利影响。
在淡水鱼养殖过程中，消毒剂和杀虫剂的使用是必不可少的。针对因敌百虫或硫酸铜的使用引起的鱼类应激反应，养殖者一般通过加水或者换水进行缓解，而加水或者换水会增加养殖成本，同时也会使得养殖工序更为繁杂，提高养殖负担；且在养殖过程中单纯的加水或者换水也只能缓解一时，并不能实际地解决问题。一般情况下，养殖户为了提高养殖效率，往往使鱼密度维持在较高的范围内；然而随着季节或者不同地域的环境变化，鱼的适宜养殖密度也会发生变化，鱼对这种变化的抵抗能力也会发生改变，从而导致鱼的应激反应，使养殖鱼类的发病率和死亡率升高。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种野甘草提取物在制备淡水鱼抗应激剂中的应用及其制备方法，野甘草提取物作为淡水鱼抗应激剂能使鱼类抗养殖高密度、硫酸铜和敌百虫应激的能力提升，降低高密度养殖环境下鱼类的发病率和死亡率。
本发明采用的技术方案如下：
一种野甘草提取物在制备淡水鱼抗应激剂中的应用。
野甘草原产美洲热带，现已广布于全球热带。野甘草多生长于荒地、山坡和路旁，喜生于湿润环境，现已成为一般性农田和草坪杂草，获取方便，且成本低廉。现代药学研究结果显示，野甘草提取物具有多种生物活性；其主要化学成分生物碱、黄酮和二萜等，具有清除体内外活性氧(ROS)和降低氧化应激的功能。经本方案研究发现，野甘草提取物能抑制淡水鱼养殖应激，尤其是对淡水鱼养殖过程中因养殖高密度、硫酸铜、敌百虫导致的应激有极好的抑制作用。在饲料中添加野甘草丙酮提取物可抑制养殖高密度应激导致的鱼增重、摄食量和饲料效率下降，可抑制硫酸铜应激导致的鱼摄食量下降，可抑制敌百虫应激导致的鱼体侧翻，提升了鱼类的生长速度，降低了鱼类的发病率，降低了养殖者的损耗，增加了养殖者的收入。
进一步地，所述抗应激剂为抗高密度、抗硫酸铜、抗敌百虫应激中的至少一种。抗高密度应激是指抗高密度养殖应激。用鲫鱼试验发现，养殖密度为0.48尾鱼/L水时，鱼的增重、摄食量和饲料效率最高，随着密度的提高，鱼的增重、摄食量和饲料效率逐渐降低；当鱼的密度增至0.97尾/L水时，鱼增重、摄食量和饲料效率下降到最低水平；进一步提高鱼密度达1.13尾/L水时，鱼出现死亡。产生最大密度应激而不引起鱼死亡的养殖密度为0.97尾/L水。野甘草提取物抗高密度应激是指在养殖密度为0.97尾鱼/L水时，野甘草提取物能够抑制由于养殖密度提高导致的鱼增重、摄食量和饲料效率的下降。
具体地，将所述野甘草提取物添加到鱼饲料中，对淡水鱼进行投喂。
所述野甘草提取物在鱼饲料中的含量为3.77–6.0g/kg。当野甘草提取物在饲料中的含量低于3.77g/kg时，其对淡水鱼养殖应激也有明显的抑制作用但不是最佳，而野甘草提取物在饲料中的含量在3.77-6.0g/kg时，其对淡水鱼应激具有最佳的抑制作用，且不会对鱼类生长产生副作用。
所述野甘草提取物在饲料中的含量为4.07g/kg、4.43g/kg、3.77g/kg中的任意一种。当野甘草提取物在饲料中的含量为3.77g/kg时，其对淡水鱼因敌百虫的使用而产生的应激具有最好的抑制效果，且用量最低；当野甘草提取物在饲料中的含量为4.07g/kg时，其对淡水鱼因养殖高密度而产生的应激具有最好的抑制效果，且同时也会对敌百虫应激表现出最佳的抑制效果，且用量最低；当野甘草提取物在饲料中的含量为4.43g/kg，其对淡水鱼因硫酸铜的使用而产生的应激具有最好的抑制效果，同时还会对养殖高密度应激、敌百虫应激表现出最佳的抑制效果，且用量最低。
进一步地，所述野甘草提取物与饲料混合的方法如下：在饲料制备时，根据饲料配方计算出单位质量鱼饲料所需油脂的质量，将野甘草提取物均匀溶解在该油脂中，得到混合液，再将混合液混入制备饲料的其他原料中，进行饲料的制备。油脂可以是鱼油、大豆油、玉米油、菜籽油、花生油、葵花籽油等中的一种或多种构成的混合物。
野甘草提取物不易溶解，如果直接将其与制备饲料的原料混合，其容易以团状或块状等形式分布在饲料中，与其他原料无法充分混合，使得最终制得的饲料中原料分布不均匀，无法控制单位质量饲料中野甘草提取物的含量，从而无法达到抗应激的稳定效果。而本申请中提供了一种简单有效的将野甘草提取物添加到饲料中的方法，即将野甘草提取物先溶解在油脂中，形成均匀的混合液，然后再将混合液与其他制备饲料的原料混合均匀进行饲料制备即可。在这一制备方法中，通过将油脂作为野甘草提取物与饲料原料混合的媒介，使得野甘草提取物能均匀分布在饲料中，保证了单位质量饲料中的有效野甘草提取物含量，使投喂该饲料后的淡水鱼能稳定地抗应激。
所述鱼饲料包含以下重量份的组分：鱼粉24-27份、豆粕31-33份、面粉35-39份、鱼油1-2份、葵花籽油1-2份、维生素添加剂0.5-1.5份、矿物添加剂0.5-1.5份；含粗蛋白32-35份、粗脂肪5-6.5份、磷0.8-1.5份；将野甘草提取物溶解在鱼油和/或葵花籽油中再与其它组分混合制备饲料。
将所述野甘草提取物加入油脂中后，以超声波震荡30-50min，使其混合均匀。将野甘草提取物加入油脂中后，利用超声波震荡，使得野甘草提取物能更好地溶解，提升了制得的饲料中提取物含量的均匀性。
所述野甘草提取物为野甘草丙酮提取物；也可以采用其他高极性溶剂进行提取获得，例如乙醇等。本发明采用丙酮进行提取，其对野甘草的提取效果较好。
一种野甘草提取物的制备方法，包括下述步骤：
A1、将野甘草干燥至恒重并粉碎得到野甘草粉末，其中，野甘草至少粉碎至过18目筛；
A2、一次提取：将野甘草粉末与石油醚混合均匀，混合时按照600-800r/min的速度搅拌5-8h，然后对混合液进行过滤，弃去滤液，得到一次提取残渣。此步骤中按1g野甘草添加6-8ml石油醚的比例进行提取；
A3、二次提取：将一次提取残渣与乙酸乙酯混合均匀，混合时按照600-800r/min的速度搅拌5-8h，然后对混合液进行过滤，弃去滤液，得到二次提取残渣。此步骤中按1g一次提取残渣添加6-8ml乙酸乙酯的比例进行提取；
A4、三次提取：将二次提取残渣与丙酮混合均匀，混合时按照600-800r/min的速度搅拌5-8h，然后对混合液进行过滤，得到澄清无残渣的三次提取滤液。此步骤中按1g二次提取残渣添加6-8ml丙酮的比例进行提取；
A5、将第三次丙酮提取滤液减压蒸馏至恒重去除丙酮，获得野甘草丙酮提取物。
该提取方法采用极性由小到大的石油醚、乙酸乙酯和丙酮对野甘草粉末进行提取，其中第一次石油醚提取液、第二次乙酸乙酯提取液弃去，将第三次丙酮提取滤液减压蒸馏至恒重去除丙酮，获得野甘草丙酮提取物。采用该提取方法，石油醚将野甘草中极性最低的物质提取出去；乙酸乙酯将野甘草中中极性物质提取出去；再用丙酮提取时，极性较高的物质被提取。在前二次提取中，极性较低的物质被除去，残渣中极性较低的物质含量很少；从而在最终得到的野甘草丙酮提取物中，不会包含太多的极性较低的物质，使极性较高的物质在提取物中含量更高。这样得到的丙酮极性段的高极性提取物质相对纯度更高，能够更好的起到抗应激的作用。
进一步地，所述一次提取、二次提取及三次提取均重复2-4次；每一步均进行重复提取，进一步提高了野甘草提取物纯度和得率。
综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：
1、本发明首次使用了野甘草提取物作为淡水鱼的抗应激剂，并将其添加在鱼饲料中进行使用；
2、本发明确定了野甘草提取物抗鱼应激的极性活性部位；
3、本发明确定了野甘草丙酮提取物在鱼饲料中的最佳添加浓度；
4、本发明提供了简便的将野甘草丙酮提取物添加入饲料中的媒介和溶解方法；
5、本发明确定了野甘草丙酮提取物不同添加浓度的效用，饲料中添加的野甘草丙酮提取物浓度在3.77-6.00g/kg时，抗敌百虫应激效果最好；当饲料中添加的野甘草丙酮提取物浓度在4.07-6.00g/kg时，抗高密度应激的效果最好；当饲料中添加的野甘草丙酮提取物浓度在4.43-6.00g/kg时，抗硫酸铜应激效果最好。当饲料中添加的野甘草丙酮提取物浓度在4.43-6.00g/kg时，可同时显现出最好的抗硫酸铜、敌百虫和高密度应激的效果。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为养殖密度对鲫鱼增重的影响图(注：图中数据以4个重复的平均数±标准差表示；柱上标记字母不同者表示数据间差异显著(P<0.05)。增重＝末重－初重(表2))；
图2为养殖密度对鲫鱼饲料效率的影响图(注：图中数据以4个重复的平均数±标准差表示；柱上标记字母不同者表示数据间差异显著(P<0.05)。饲料效率＝100×增重/摄食量(表2))；
图3为养殖密度对鲫鱼死亡率的影响图(注：图中数据以4个重复的平均数±标准差表示；柱上标记字母不同者表示数据间差异显著(P<0.05))；
图4为投喂不同极性野甘草提取物的鲫鱼肠道组织抗超氧阴离子活性(ASA)、抗羟自由基活性(AHR)和不同极性野甘草提取物体外螯合金属离子(Fe2+)活性(MCA)的示意图(注：图中数据以3个重复的平均数±标准差表示；柱上标记字母不同者表示数据间差异显著(P<0.05))；
图5为野甘草各提取物黄酮类含量与其抗超氧阴离子活性(ASA)、抗羟自由基活性(AHR)和螯合金属离子(Fe2+)活性(MCA)的关系图(注：图中数据以3个重复的平均数±标准差表示)；
图6为在高密度应激状态下投喂野甘草丙酮提取物60天后，鲫鱼增重恢复率折线回归分析图(注：数据以4个重复的平均数表示。增重恢复率(％)＝(A－Y)/(D－Y)×100(表3))；
图7为水体中不同含量硫酸铜(Cu)对鲫鱼采食量的影响图(注：图中数据以3个重复的平均数±标准差表示；柱上标记字母不同者表示数据间差异显著(P<0.05))；
图8为水体中不同含量硫酸铜(Cu)对鲫鱼死亡率的影响图(注：图中数据以3个重复的平均数±标准差表示；柱上标记字母不同者表示数据间差异显著(P<0.05))；
图9为水体中不同含量敌百虫对鲫鱼侧翻率的影响图(注：图中数据以3个重复的平均数±标准差表示；柱上标记字母不同者表示数据间差异显著(P<0.05))；
图10为水体中不同含量敌百虫对鲫鱼死亡率的影响图(注：图中数据以3个重复的平均数±标准差表示；柱上标记字母不同者表示数据间差异显著(P<0.05))；
图11为投喂野甘草丙酮提取物60天，硫酸铜应激后鲫摄食率折线回归分析图(注：数据以3个重复的平均数表示。摄食率(％)＝摄食量/体重×100(表4))；
图12为投喂野甘草丙酮提取物60天，敌百虫应激后鲫侧翻率折线回归分析图(注：数据以3个重复的平均数表示。侧翻率(％)＝侧翻数量/鱼数量×100(表5))。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明，即所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。通常在此处附图中描述和示出的本发明实施例的组件可以以各种不同的配置来布置和设计。
因此，以下对在附图中提供的本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
一种野甘草提取物在制备淡水鱼抗应激剂中的应用。所述抗应激剂为抗高密度、抗硫酸铜、抗敌百虫应激中的至少一种。
应用野甘草提取物抑制淡水鱼养殖应激的方法，具体方式为利用含有野甘草提取物的鱼饲料对淡水鱼进行投喂。其中，鱼饲料可以为淡水鱼养殖过程中的任意常用饲料配方，只需在原配方的基础上添加野甘草提取物即可；野甘草的提取方式有多种，可以采用乙醇、丙酮等类似的高极性溶剂进行提取。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
具体实施例
1、一种野甘草提取物的制备方法，依次进行如下步骤：
1)获得野甘草全株1000g，50℃鼓风干燥箱内干燥至恒重，粉碎过18目筛，获得野甘草粉末。
2)取野甘草粉末400g，按野甘草粉末与石油醚1：8的比例混合，800转/分钟旋转搅拌6小时；将混合液过滤，获得澄清的滤液和残渣(重复提取3次)；将滤液减压蒸馏至恒重去除石油醚，获得野甘草石油醚提取物。
3)将步骤2)中的第一次提取的残渣按野甘草石油醚提取残渣与乙酸乙酯1：8的比例混合，800转/分钟旋转搅拌6小时；将混合液过滤，获得澄清的滤液和残渣(重复提取3次)；将滤液减压蒸馏至恒重去除乙酸乙酯，获得野甘草乙酸乙酯提取物。
4)将步骤3)中的第二次提取残渣按野甘草乙酸乙酯提取残渣与丙酮1：8的比例混合，800转/分钟旋转搅拌6小时；将混合液过滤，获得澄清的滤液和残渣(重复提取3次)；将滤液减压蒸馏至恒重去除丙酮，获得野甘草丙酮提取物。
5)将步骤4)中的第三次提取残渣按野甘草丙酮提取残渣与水1：8的比例混合，800转/分钟旋转搅拌6小时；将混合液离心，获得澄清无残渣的上清液(重复提取3次)；将上清液减压蒸馏至恒重去除水，获得野甘草水提取物。
采用化学法测定野甘草四种提取物的黄酮类化合物含量，结果(见表1)显示所述野甘草丙酮提取物的黄酮类含量最高，为64.31-71.03g/kg。
表1野甘草提取物的黄酮类物质含量
Figure BDA0002025522480000071
注：数据以3个重复的平均数±标准差表示；在同一列数据中上标字母不同者表示差异显著(P<0.05)。
2、从当地购得鲫鱼苗后，在养殖室内暂养一周。选择体重8.0±0.2g鲫鱼苗720尾，随机分为8个处理组，每组4个鱼缸。8个处理组的鱼尾数分别为：5、10、15、20、25、30、35和40尾/缸。每个鱼缸的形态、大小和颜色相同，尺寸都为30×30×40cm并内置800L/h流量增氧机一台。以自来水为水源、缸内水体积为31L。控制养殖室温22±2℃；增氧机持续供氧；投喂鱼粉豆粕型杂食性鱼饲料；每2-3天换水一次。养殖期为60天。
60天养殖期后，考察各处理组鲫鱼增重、摄食量、饲料效率和死亡率，结果见表2和图1-3。由图可知，增重最多的放养密度为0.16-0.48尾/L水；随着养殖密度的提高，增重逐渐下降，增重最少的养殖密度为0.97-1.29尾/L水。摄食最多的放养密度为0.32-0.48尾/L水；随着养殖密度的提高，摄食量逐渐下降，摄食最少的密度为0.97-1.29尾/L水。饲料效率最高的放养密度为0.16-0.48尾/L水；随着养殖密度的提高，饲料效率逐渐下降，饲料效率最低的密度为0.97-1.29尾/L水。放养密度1.13-1.29尾/L水时，鲫鱼出现死亡。即当养殖密度为0.48尾鱼/L水时，鲫鱼的增重、摄食量和饲料效率最高，确定最佳放养密度为0.48尾/L水。随着密度的提高，鲫鱼的增重、摄食量和饲料效率逐渐降低；当鲫鱼的密度增至0.97尾/L水时，鲫鱼增重、摄食量和饲料效率下降到最低水平；进一步提高鲫鱼密度达1.13尾/L水，鲫鱼出现死亡。产生最大密度应激而不引起鲫鱼死亡的养殖密度为0.97尾/L水。
表2养殖密度对鲫鱼生长和摄食量的影响
Figure BDA0002025522480000072
Figure BDA0002025522480000081
注：表中数据以4个重复的平均数±标准差表示，每个鱼缸31L水；在同一列数据中，上标字母不同者表示数据间差异显著(P<0.05)。
3、根据饲料配方，将野甘草4种提取物按0和2g/kg的浓度添加到饲料中，制成相应的5种颗粒饲料。
饲料配方：
Figure BDA0002025522480000082
1每千克维生素添加剂包含：视黄醇(500,000IU/g)0.80g、维生素D3(500,000IU/g)0.48g、DL-α-生育酚(50％)20.00g、维生素K3(23％)0.43g、维生素B1(90％)0.11g、核黄素(80％)0.63g、吡哆醇(81％)0.92g、氰钴胺(1％)0.10g、D-泛酸钙(90％)2.73g、烟酸(99％)2.82g、D-生物素(2％)5.00g、肌醇(99％)52.33g和叶酸(96％)0.52g。
2每千克矿物质添加剂包含：FeSO4·7H2O(含Fe 20％)69.70g、CuSO4·5H2O(含Cu25％)1.20g、ZnSO4·7H2O(含Zn 23％)21.64g、MnSO4·H2O(含Mn 32％)4.09g、Na2SeO3·5H2O(含Se 1％)2.50g和KI(含I 4％)2.90g。
其中，维生素添加剂及矿物质添加剂中，各物质中括号内的百分含量均表示该物质的质量分数，例如吡哆醇(81％)0.92g表示吡哆醇质量占总质量81％的物质为0.92g。
将野甘草提取物添加到饲料中的具体添加方法如下：
根据饲料配方计算出所制备的鱼饲料需要的鱼油和葵花籽油(油脂)质量；根据添加浓度计算出所制备的鱼饲料需要野甘草提取物的质量。将野甘草提取物添加入油脂中，超声震荡30min使其充分混合，再将溶有野甘草提取物的油脂混入其他饲料原料中，制成颗粒饲料。
4、在最佳应激密度(0.97尾/L水)和步骤2相同养殖环境条件下，选择体重21.2±1.0g鲫鱼苗495尾，随机分为6个处理组，每组3个鱼缸。6个处理组的鲫鱼尾数分别为：15、30、30、30、30和30尾/缸，分别命名为对照(D)、诱导(Y)、野甘草石油醚提取物(E1)、野甘草乙酸乙酯提取物(E2)、野甘草丙酮提取物(E3)和野甘草水提取物(E4)组。6个处理组分别投喂含0、0和2g/kg野甘草石油醚提取物、野甘草乙酸乙酯提取物、野甘草丙酮提取物和野甘草水提取物的饲料。10天后测定鲫的肠道组织抗超氧阴离子活性(ASA)、抗羟自由基活性(AHR)和野甘草4种提取物体外螯合金属离子(Fe2+)活性(MCA)。
采用试剂盒(南京建成生物工程研究所)法测定ASA、AHR和MCA，结果见图4；图4中，从左至右依次为野甘草石油醚提取物、野甘草乙酸乙酯提取物、野甘草丙酮提取物和野甘草水提取物；图4中，数据以3个重复的平均数±标准差表示。
结果(见图4)显示投喂野甘草4种提取物均不同程度恢复了鲫鱼肠道组织清除ROS活性，野甘草4种提取物均具有螯合过度金属离子的功能；野甘草的丙酮提取物效果最好。相关性分析结果(见图5)显示野甘草4种提取物的ASA、AHR和MCA与其黄酮类物质含量存在密切关系；4种提取物清除ROS和螯合金属离子活性可能是由于其含有黄酮类物质。
5、根据饲料配方(步骤3)，将野甘草丙酮提取物分别按0、1、2、3、4、5和6g/kg的浓度添加到饲料中，制成相应的7种颗粒饲料。
在最佳应激密度(0.97尾/L水)和以上相同养殖环境下，选择体重8.3±0.3g鲫鱼苗900尾，随机分为8个处理组，每组4个鱼缸。8个处理组的鱼尾数分别为：15、30、30、30、30、30、30和30尾/缸，分别命名为对照(D)、诱导(Y)、1g(A1)、2g(A2)、3g(A3)、4g(A4)、5g(A5)和6g(A6)组。8个处理组分别投喂含0、0、1、2、3、4、5和6g/kg野甘草丙酮提取物的饲料。60天后测定鲫的生长、摄食量和饲料效率和进行增重恢复率折线回归分析。
表3投喂野甘草丙酮提取物(AE)对鲫鱼养殖高密度应激的影响
Figure BDA0002025522480000091
注：数据以4个重复的平均数±标准差表示；在同一列数据中上标字母不同者表示差异显著(P<0.05)。
增重＝末重－初重；饲料效率＝100×增重/摄食量。
上述结果(见表3和图6)表明，与对照组相比，投喂野甘草丙酮提取物恢复了鲫鱼的生长、摄食量和饲料效率；野甘草丙酮提取物恢复鲫鱼生长的最佳添加浓度为4.07g/kg饲料。
6、在以上相同养殖环境下，选择体重21.2±1.1g鲫鱼苗210尾，随机分为7个处理组，每组3个鱼缸，每缸10尾鱼。在7个处理组鱼缸水体内溶解硫酸铜，使其浓度分别0.0、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8和0.9mg Cu/L水。投喂鱼粉豆粕型杂食性鱼饲料，四天后考察每个处理组的采食量和死亡率，实验结果见图7-8。由图可知，随着Cu浓度的提高鲫鱼的摄食量逐渐降低；当Cu浓度增至0.7mg/L水时，鲫鱼摄食量下降到最低水平；进一步提高Cu浓度达0.8mg/L水时，鲫鱼出现死亡。因此，产生最大硫酸铜应激而不引起死亡的Cu浓度为0.7mg/L水。
7、在以上相同养殖环境下，选择相同体重鲫鱼苗210尾，随机分为7个处理组，每组3个鱼缸，每缸10尾鱼。在7个处理组鱼缸水体内分别溶解0.0、0.4、1.0、1.6、2.2、2.8和3.4mg敌百虫/L水。四天后考察每个处理组的鲫鱼侧翻率和死亡率，实验结果见图9-10。由图可知，随着敌百虫浓度的提高鲫鱼的侧翻率逐渐升高；当敌百虫浓度增至2.2mg/L水时，鲫鱼侧翻率达到最高水平；进一步提高敌百虫浓度达2.8mg/L水时，鲫鱼出现死亡。因此，引起最大敌百虫应激而不引起鲫鱼死亡的浓度为2.2mg/L水。
8、在以上相同养殖环境下，选择体重4.3±0.1g鲫鱼苗420尾，随机分为7个处理组，每组4个鱼缸，每缸15尾鱼。7个处理组分别投喂含0、1、2、3、4、5和6g/kg野甘草丙酮提取物的饲料。60天后，分别从每个处理组随机选择30尾鱼，平均分给3个鱼缸(每缸10尾鱼)；在每个鱼缸水体中溶入0.7mg Cu/L的硫酸铜。投喂鱼粉豆粕型杂食性鱼饲料，四天后考察每个处理组的摄食量和进行摄食率折线回归分析。
表4投喂野甘草丙酮提取物(AE)对硫酸铜应激的影响
Figure BDA0002025522480000101
注：数据以3个重复的平均数±标准差表示，每个重复10尾鱼；在同一列数据中上标字母不同者表示差异显著(P<0.05)。
上述结果(见表4和图11)表明，投喂野甘草丙酮提取物抑制了硫酸铜诱导的鲫鱼摄食率的降低；野甘草丙酮提取物恢复摄食率的最佳添加浓度为4.43g/kg饲料。
9、按步骤8投喂不同浓度野甘草丙酮提取物的饲料60天后，分别从每个处理组随机选择30尾鱼，平均分给3个鱼缸(每缸10尾鱼)；在每个鱼缸水体中溶入2.2mg/L的敌百虫。四天后考察每个处理组的侧翻鲫鱼数量和进行侧翻率折线回归分析。
表5投喂野甘草丙酮提取物(AE)60天对敌百虫应激的影响
Figure BDA0002025522480000111
注：数据以3个重复的平均数±标准差表示，每个重复为4天侧翻数的平均值；在同一列数据中上标字母不同者表示差异显著(P<0.05)。
上述结果(见表5和图12)表明，投喂野甘草丙酮提取物抑制了敌百虫诱导的鲫鱼侧翻；野甘草丙酮提取物抑制鲫鱼侧翻的最佳添加浓度为3.77g/kg饲料。
综上所述，野甘草提取物作为淡水鱼抗应激剂能使鱼类抗高密度、硫酸铜和敌百虫应激的能力提升，降低高密度养殖环境下鱼类的死亡率和发病率。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围内。

Claims (5)

1.一种野甘草提取物在制备淡水鱼抗应激饲料中的应用，所述野甘草提取物为野甘草丙酮提取物，所述抗应激为抗养殖高密度、抗硫酸铜和抗敌百虫应激，所述野甘草提取物在饲料中的含量为4.07 g/kg、4.43 g/kg、3.77 g/kg中的任意一种，野甘草丙酮提取物由以下步骤提取：
A1、将野甘草干燥至恒重并粉碎得到野甘草粉末，其中，野甘草至少粉碎至过18目筛；
A2、一次提取：将野甘草粉末与石油醚按1：6-8的比例混合，并按照600-800 r/min的速度搅拌5-8h，然后对其进行过滤，弃去滤液，得到一次提取残渣，其中按1g 野甘草添加6-8ml石油醚的比例进行提取；
A3、二次提取：将一次提取残渣与乙酸乙酯按1：6-8的比例混合，并按照600-800 r/min的速度搅拌5-8h，然后对其进行过滤，弃去滤液，得到二次提取残渣，其中按1g一次提取残渣添加6-8ml乙酸乙酯的比例进行提取；
A4、三次提取：将二次提取残渣与丙酮按1：6-8的比例混合，并按照600-800 r/min的速度搅拌5-8h，然后对其进行过滤，得到澄清无残渣的提取滤液，其中按1g二次提取残渣添加6-8ml丙酮的比例进行提取；
A5、将第三次提取的丙酮滤液减压蒸馏至恒重去除丙酮，获得野甘草丙酮提取物。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述野甘草提取物与饲料混合的方法如下：在饲料制备时，根据饲料配方计算出单位质量鱼饲料所需油脂的质量，将野甘草提取物均匀溶解在该油脂中，得到混合液，再将混合液混入制备饲料的其他原料中，进行饲料的制备。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述鱼饲料包含以下重量份的组分：鱼粉24-27份、豆粕31-33份、面粉35-39份、鱼油1-2份、葵花籽油1-2份、维生素添加剂0.5-1.5份、矿物添加剂0.5-1.5份；含粗蛋白32-35份、粗脂肪5-6.5份、磷0.8-1.5份；将野甘草提取物溶解在鱼油和葵花籽油中再与其它组分混合制备饲料。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述野甘草提取物加入油脂中后，以超声波震荡30-50 min使其混合均匀。
5.一种野甘草提取物的制备方法，其特征在于，包括下述步骤：
A1、将野甘草干燥至恒重并粉碎得到野甘草粉末，其中，野甘草至少粉碎至过18目筛；
A2、一次提取：将野甘草粉末与石油醚按1：6-8的比例混合，并按照600-800 r/min的速度搅拌5-8h，然后对其进行过滤，弃去滤液，得到一次提取残渣，其中按1g 野甘草添加6-8ml石油醚的比例进行提取；
A3、二次提取：将一次提取残渣与乙酸乙酯按1：6-8的比例混合，并按照600-800 r/min的速度搅拌5-8h，然后对其进行过滤，弃去滤液，得到二次提取残渣，其中按1g一次提取残渣添加6-8ml乙酸乙酯的比例进行提取；
A4、三次提取：将二次提取残渣与丙酮按1：6-8的比例混合，并按照600-800 r/min的速度搅拌5-8h，然后对其进行过滤，得到澄清无残渣的提取滤液，其中按1g二次提取残渣添加6-8ml丙酮的比例进行提取；
A5、将第三次提取的丙酮滤液减压蒸馏至恒重去除丙酮，获得野甘草丙酮提取物。
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