CN110062659A - 高速核酸扩增装置及核酸扩增反应的温度控制方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种核酸扩增装置，涉及能够快速加热和冷却反应容器中的反应物以对需要温度变化的化学/生物反应的能够高速核酸扩增的核酸扩增装置以及核酸扩增反应中的温度控制方法。

Description

高速核酸扩增装置及核酸扩增反应的温度控制方法
技术领域
本发明涉及一种能够快速加热和冷却反应容器中的反应物，以对应需要温度变化的化学/生化反应的高速核酸扩增装置以及用于快速加热和冷却需要温度变化的化学/生物化学反应的反应温度的技术。
背景技术
PCR(聚合酶链反应)是用于选择性扩增生物样品中的特定核酸的技术，在该方法中，装入样品的反应物通常需要数十次重复的加热和冷却循环。确定核酸扩增反应中的总反应时间的重要因素之一是将反应物加热至预定温度或冷却至预定温度所花费的时间。因此，该方法中使用的装置具有能够周期性地加热和冷却温度的模块，并且正在开发提高温度控制的精度和/或速度。
近年来，核酸扩增已经用于农业、畜牧业、环境和医疗领域的大量样品处理中，因此，需要开发能够高速快速反应的装置。
影响细胞及细胞外进行的化学/生物化学反应的所需结果的关键因素之一是温度，其可能需要根据具体反应重复控制温度。例如，典型的核酸扩增方法如PCR(聚合酶链式反应)是能够选择性扩增生物样品等中的特定核酸的技术。在该过程中，装入样品的反应溶液通常重复数十次加热和冷却。
现有的核酸扩增反应中的一个重要技术课题是提高靶标检测的特异性和痕量靶标检测的灵敏度。然而，最近，核酸扩增用于农业、畜牧业、环境和医疗部门的大量样品处理，缩短核酸扩增的总反应时间已成为一项重要挑战。
PCR是典型的核酸扩增反应，通过在55至95℃的温度范围内重复加热和冷却约25至40倍来扩增靶核酸，当控制加热-冷却循环的时间时，可以调节整体反应时间。
现有的具有珀耳帖、热风/冷风、加热器/吹制方法等的PCR热循环仪已经用于PCR中的这种重复加热/冷却。
基于热电的温度控制技术是当今最常用的PCR装置技术。这种装置将反应容器安装/固定到一个金属块上，并使用热电元件反复加热和冷却块以进行PCR反应。虽然这种方法整体上并不复杂，但有必要构建一个复杂的电路，用于精确的温度控制，并反复加热和冷却一个块，以便加热/冷却块和反应容器中的样品之间发生热交换，单独地，存在的缺点是反复需要块达到设定的加热/冷却温度所需的时间，这导致整个反应的时间更长。
使用热空气/冷空气的方法是应用于Roche的一种PCR装置的Lightcycler的技术。已经通过加热线圈并达到特定温度的风与反应容器接触，以引起反应容器中样品的温度变化(Wittwer et al.,Anal Biochem.186,328-331,1990；Wittwer et al.,BioTechniques,22,176-181,1997)。然而，需要一种控制与多个反应容器均匀地发生热交换的技术，与热电元件的情况相同，除了加热源和样品之间的热交换时间之外，还需要加热线圈的温度变化时间，这远不是用于缩短时间的快速温度控制技术。
作为另一种方法，已经报道了使用电阻加热器和鼓风机的热交换方法。在该方法中，将反应容器紧密固定在电阻加热器上的状态下进行，通过升高加热器的温度加热反应容器内的样品，在关闭加热器的情况下吹气，重复降低反应容器温度的过程。由于反复需要加热器的加热时间，该方法也不能满足快速温度控制以缩短反应时间的目的。
缩短PCR时间允许将基于PCR的诊断方法应用于该领域，可以在快速响应快速传播的传染病(例如最近的变异病毒爆发)中发挥重要作用。因此，非常需要开发一种有效的温度控制方法，该方法可以通过最小化核酸扩增技术的温度变化期间的时间消耗来缩短整个PCR时间。
发明内容
要解决的技术问题
本发明是鉴于所述诸多问题而提出的，其目的在于，提供一种高速核酸扩增装置，其能够在需要反复温度变化的核酸扩增反应中快速加热和冷却反应容器中的反应物，并且能够快速核酸扩增。
本发明的另一个目的在于，提供一种在需要反复温度变化的核酸扩增反应中快速加热-冷却反应容器中反应物的方法。
技术方案
为了实现所述目的，本发明的高速核酸扩增装置，作为用于高速核酸扩增反应的装置，其中，包括：支架，用于固定进行所述反应的管；加热模块，包括产生热量以加热所述管的加热器和连接到所述加热器的加热块；驱动模块，用于沿垂直方向移动所述加热模块，以改变所述加热模块与所述支架之间的距离；以及冷却模块，用于冷却固定在所述支架上的管。
优选地，所述加热模块包括用于产生热量的加热器和连接到所述加热器的加热块，所述加热块由所述加热器加热，所述加热块包括一个以上的凹部，所述凹部供所述管的至少局部被插入，所述驱动模块用于移动所述支架或所述加热块以改变所述凹部与所述管之间的距离。
所述加热块设置在所述支架的下方，所述驱动模块沿垂直方向移动所述加热块，所述支架具有预定的内径并沿垂直方向穿透，并包括一个以上的安装孔，所述管安装在所述安装孔上，所述管的下部向下暴露，当所述加热块被上升时，所述管的下部插入到所述凹部，当所述加热块下降时，所述管的下部与所述凹部分离。
所述加热模块还包括设置在所述加热器侧面的引导部，所述引导部包括：引导管，具有在垂直方向上穿过的孔；引导梁，插入到所述引导管的孔中并在垂直方向上延伸；以及弹性弹簧，位于所述引导管上，并在内部插入所述引导梁。
所述冷却模块包括用于产生冷却风的鼓风机和用于将在所述鼓风机中产生的冷却风传递到固定到所述支架的管的吹气喷嘴，当所述加热模块与所述支架相邻时，所述吹气喷嘴被关闭，当所述加热模块与所述支架分离时，所述吹气喷嘴被开放。
所述加热模块设置在所述支架的下方，所述驱动模块沿垂直方向移动所述加热模块，所述吹气喷嘴沿横向设置在所述支架的一侧，所述加热模块包括开闭块，所述开闭块包括屏蔽部，当所述加热模块上升时，所述屏蔽部关闭所述吹风喷嘴，当所述加热模块下降时，所述屏蔽部从所述吹气喷嘴向下间隔开，打开所述吹气喷嘴。
所述支架包括多个安装孔，所述安装孔具有一个以上的排列线并排设置，所述吹气喷嘴包括与所述鼓风机相邻的入口部以及与所述支架相邻的出口部在水平方向上的宽度宽于所述入口部在水平方向上的宽度，并且，所述吹气喷嘴的出口部朝水平方向配置在所述支架的外侧，所述出口部的宽度方向与所述安装孔的布置线具有并排的方向。
感测模块用于检测所述管中反应物的反应信号；以及盖模块，设置在所述支架上并且能够开闭，所述盖模块包括用于向所述管提供光的光源部，所述感测模块包括用于感测所述管内的反应物产生的光的传感器部。
所述盖模块还包括设置在所述光源部下方的滤光器，所述感测模块还包括设置在所述管和所述传感器部之间的发射滤光器。
所述加热块包括光传递部，光传递部沿至少一个方向贯通，使得在所述管中产生的光在至少一个方向上传递。
还包括用于控制所述加热模块、驱动模块以及冷却模块的动作的控制装置。
本发明的核酸扩增反应中的温度控制方法，其中，作为在第一温度下进行的变性步骤和在第二温度下进行的退火/延伸反应步骤重复数次的核酸扩增反应中的温度控制方法，包括：将所述核酸扩增反应中使用的装入反应物的容器与预定保持所述第一温度的加热块接触预定时间后，将所述反应容器温度加热至所述第一温度的第一步骤；以及将所述容器和所述加热块彼此以预定间隔隔开后分离的所述容器预定时间暴露在人造气流后，将所述容器冷却至第二温度的第二步骤，相对于冷却至所述第二温度的容器，所述第一步骤和第二步骤重复几次。
根据本发明的方法的在所述第二步骤中，所述加热块的位置是固定的，并且所述容器向上移动到所述加热块的预定位置以使所述容器隔开所述预定间隔，此时，持续地提供所述人造气流。
在所述第二步骤中，所述容器的位置是固定的，并且所述加热块向下移动到所述容器的预定位置以使所述加热块隔开所述预定间隔，当所述加热块以预定间隔与所述容器隔开时才提供所述人造气流。
根据本发明的方法中，在55至65度的所述第二温度下，导致退火和延伸的重叠。
由在第一温度下进行的变性步骤，在第二’温度下进行的退火步骤以及在第二温度下进行的延伸反应组成的一个循环重复几次的核酸扩增反应中的温度控制方法，其中，包括：
将所述核酸扩增反应中使用的容器与预定保持所述第一温度的加热块接触预定时间后，将所述容器温度加热至所述第一温度的第一步骤；将所述容器和所述加热块彼此以预定间隔隔开后相互分离，分离的所述容器预定时间暴露在人造气流后，将所述容器冷却至第二’温度的第二步骤；以及将所述容器与所述加热块接触预定时间后以第二温度加热后，与所述加热块预定间隔隔开，将分离的所述容器预定时间静置在空气中的第三步骤。
在本发明的一实施例，所述容器和加热块以预定间隔隔开相互分离的步骤中，所述加热块的位置是固定的，并且所述容器向上移动到所述加热块的预定位置以使所述容器隔开所述预定间隔，此时，持续地提供所述人造气流。
在本发明的另一实施例，所述容器和加热块以预定间隔隔开相互分离的步骤中，所述容器的位置是固定的，并且所述加热块向下移动到所述容器的预定位置以使所述加热块隔开所述预定间隔时才提供所述人造气流。
在所有上述方法中，可以考虑相对于冷却装置的位置，特别是0.5至2cm，所述预定间隔是反应容器从加热块分离的被充分冷却的距离。
有益效果
根据本发明，可以快速控制核酸扩增反应中反应物的温度。即，装入反应物的管子接触加热模块的加热块并快速加热，当在预定温度下充分进行加热时，管子与加热块分离，吹气喷嘴打开，并且反应物可以通过鼓风机中产生的冷却风迅速冷却。
另外，通过根据使用者的意图设定加热模块的操作，可以控制反应物的加热时间和冷却时间，使得反应物的温度达到各种目标温度并保持目标温度范围。例如，通过将加热模块的操作周期设置为不同，或者不同地设置保持加热模块的升高位置的时间，或者保持加热模块的降低位置的时间，来设置反应物的加热时间和冷却时间，用户可以根据需要容易地控制反应物的温度。
此外，可以通过非常简单的操作实现反应物的加热和冷却。即，加热模块中设置的加热块和开闭块一起升降，使得加热块靠近管加热以进行快速加热，同时，开闭块阻塞吹气喷嘴阻止被冷却风的冷却。此外，在冷却时，加热块与管分离以停止加热，并且开闭块与吹气喷嘴分开以打开吹气喷嘴，由此实现通过冷却风的快速冷却。因此，加热和冷却可以仅通过用于移动加热模块的驱动模块的操作信号快速且适当地执行，而不需要用于冷却的单独的操作信号输入。
另外，由于在盖模块的光源部中产生的光在加热过程中进入管并且反应物中产生的光被传递到传感器部，因此可以实时检测反应物的反应。
因此，可以快速进行需要以预定间隔进行加热和冷却的温度调节的典型化学/生物化学反应的PCR(聚合酶链反应)。
在本文的核酸扩增反应中，可以使用单独的装置进行加热和冷却，从而可以快速控制反应物的温度。即，当装入反应物的容器与保持预定温度的加热块接触并快速加热，并且在预定温度下充分进行加热时，容器与加热块分离，通过鼓风机成成的冷却风可以快速冷却反应物。
另外，可以根据使用者的意图控制反应物的加热时间和冷却时间，使得反应物的温度达到各种目标温度并保持目标温度范围。
因此，可以快速进行需要以预定间隔进行加热和冷却的温度调节的典型化学/生物化学反应的PCR(聚合酶链反应)。
附图说明
图1及图2是示出根据本发明的核酸扩增装置的外观的图。
图3是示出从根据本发明的核酸扩增装置的外观去除壳体的盖模块的状态的视图，图4是图3的P部分的放大图。
图5和图6是示出从根据本发明的核酸扩增装置的外观去除壳体的侧板的状态的视图。
图7是根据本发明的核酸扩增装置的截面图，图8是图7的Q部分的放大图。
图9是示出根据本发明的核酸扩增装置的加热块的图。
图10是示出根据本发明的核酸扩增装置的加热块和感测模块之间的位置关系的视图。
图11是示出根据本发明的核酸扩增装置的吹气喷嘴的视图。
图12是根据本发明的核酸扩增装置的截面图。
图13a是图12中的R部分的放大图。
图13b是在图12的R部分去除管后从不同方向观看的视图。
图14是示出根据本发明的核酸扩增装置的覆盖模块的视图，图15是沿图14的X-X线的截面图。
图16是示出根据本发明的核酸扩增装置的覆盖模块的连接结构的视图。
图17是沿图14的Y-Y截面的视图。
图18是示出根据本发明的核酸扩增装置的管、支架及加热块之间的关系的图。
图19是示出根据本发明的核酸扩增装置的加热模块处于降低位置的状态的视图。
图20是示出根据本发明的核酸扩增装置的加热模块处于升高位置的状态的视图。
图21是示出在根据本发明的核酸扩增装置的覆盖模块中产生的光的路径的图。
图22a及22b是可用于根据本发明的方法的装置的实例，用于示出外观，由反应容器1、加热块2以及鼓风机3构成，并且，装入反应溶液的反应容器1移动，以分别与由加热块2和鼓风机3产生的风5接触。
图23a及23b示意性地示出在根据本发明的方法中实现加热和冷却的可能方法，在左图中，装入反应溶液的反应容器1移动到加热块2，接触反应溶液以加热反应容器，然后，反应容器1移动到鼓风机3，表示通过与鼓风机3产生的风5的接触来冷却反应溶液。在右图中，通过吹制实现加热，并通过块实现冷却。
图24示出当进行根据本发明的方法时反应溶液的温度变化，该结果表明，通过控制与加热/冷却介质的接触时间，可以在各个区间中进行温度变化。
图25示出当在根据本发明的方法中反应溶液的温度变化区间反复地需要约65至90℃时，反复执行加热步骤8秒，紧接着冷却过程7秒时，示出反应溶液的温度变化结果。
图26是示出在根据本发明的方法中当需要三种温度变化时，反复进行加热步骤进行3秒，沉降步骤进行5秒，加热步骤进行10秒，冷却步骤进行9秒时，示出反应溶液的91℃->56℃->72℃->91℃的温度变化。
图27示出使用根据本发明的方法扩增肺炎支原体克隆载体，然后进行解链曲线分析，表明可以检测到各种浓度的核酸。
图28是根据图6进行的扩增产物的电泳凝胶的照片，显示正确扩增了所需产物。
图29示出使用根据本发明的方法扩增来源于HBV患者的核酸样品，然后进行解链曲线分析，表明可以检测各种浓度的HBV。
图30是根据图29进行的扩增产物的电泳凝胶照片，表明所需产物被正确扩增。
图31是示出用于进行PCR的两种条件的图。(来源："The PCR Revolution:Basictechnologies and applications"编辑Stephene A.Bustin,"Chapter 4:Rapidpolymerase chain reaction and melting analysis"-Carl T.Wittwer,RandyP.Rasmussen,and Kirk M.Ririe")。
图32是显示在PCR反应中将温度冷却至98->65℃所需的时间t与冷却风的风速v之间的关系的图。
具体实施方式
在下文中，将参考附图描述本发明的优选实施例。本实施例是示例性的，并不旨在以任何方式限制本发明。
图1及图2是示出根据本发明的核酸扩增装置的外观的图。图3是示出从根据本发明的核酸扩增装置的外观去除壳体100的盖模块600的状态的视图，图4是图3的P部分的放大图。图5和图6是示出从根据本发明的核酸扩增装置的外观去除壳体100的侧板的状态的视图。图7是沿图1的X-X线的截面图，图8是图7的Q部分的放大图。图9是示出根据本发明的核酸扩增装置的加热块的图，图10是示出根据本发明的核酸扩增装置的加热块和感测模块之间的位置关系的视图，图11是示出根据本发明的核酸扩增装置的吹气喷嘴的视图。图12是沿图1的Y-Y截面图，图13a是图12中的R部分的放大图，图13b是在图12的R部分去除管后从不同方向观看的视图。
根据本发明的核酸扩增装置是用于控制包含在管T中的反应物的温度的核酸扩增装置，包括：壳体100，构成装置的外观并在至少局部固定有管T；加热模块200，位于所述管T下方并产生热量以加热所述管T；感测模块300，用于感测由所述加热模块200加热的管中产生的光；驱动模块400，用于上下移动所述加热模块200，以改变所述管T与所述加热模块200之间的距离；冷却模块500，用于冷却包含在所述管T中的反应物；盖模块600，设置在所述壳体100上并且能够向所述管T提供光；预定的控制装置700，用于控制整个装置的操作。
壳体100可以具有预定的六面体结构，并且可以具有构成底表面的下板110、构成上表面的上板120以及构成侧表面的侧板130。支架150、加热模块200、感测模块300、驱动模块400、冷却模块500以及控制装置700可具有嵌入所述壳体100内的结构。
上板120可以具有朝上下方向贯穿的预定开口122，使得支架150可以向上暴露。管T可以固定地安装在通过所述入口122暴露的支架150上。在所述上板120可设置有预定的盖模块600，盖模块600可旋转地连接到所述上板120并打开及关闭所述安装孔154。稍后将描述盖模块600的具体配置。
所述上板120和所述盖模块600可以通过预定的铰链部160彼此连接。在上板120设置有用于紧固所述盖模块600的预定紧固装置124，并且可以设置有指示装置的操作状态的预定的显示装置140。
所述支架150设置在所述壳体100内，并且可以通过形成在所述壳体100中的入口122向上暴露。
所述支架150具有块状的保持体152，所述保持体152可以固定在所述壳体100的至少一部分上。安装孔154可以形成在所述保持体152的上表面上，以便垂直地穿透或向下凹陷。因此，包含样品的管T可以安装并固定在所述安装孔154中。优选地，提供多个安装孔154并且布置有预定的排，例如，如图所示，八个安装孔154布置成一排。
当所述安装孔154朝上下贯通，使得管T安装在所述安装孔154内时，管T的下部可以在所述支架150下方突出并且可以暴露。另外，安装孔154可以具有多个预定线并排形成的布置。
另外，可以设置预定的固定夹具156以将所述保持体152固定到所述壳体100的上板120的下表面。
另外，在壳体100可以设置有可以输入和交换电信号并供电的预定的信号输入/输出装置170以及电源装置180。
加热模块200是可以定位在所述支架150下方并且可以加热包含在安装在所述支架150上的管T中的反应物的构件。
加热模块200是三维结构，其可以通过稍后描述的驱动模块400移位，并且包括加热器210、设置在所述加热器210上方的加热块220、设置在所述加热器210的侧部的引导部230、设置在所述加热器210上部的开闭部240。
加热器210是产生热量以加热包含在管T中的反应物的构件，并且可以通过控制装置700中产生的电信号操作。可以控制加热器210以产生用户想要的正确温度的热量。加热器210可以配置为包括例如珀耳帖元件，但不限于此。
图9是示出加热块220的整体结构的视图，参考图9，加热块220作为块形状的构件，可包括凹部222及光传递部224。加热块220可以设置在加热器210的上部。加热块220是接收由加热器210产生的热量并将热量传递给安装在上侧的支架150上的管T的构件，加热块220优选地由具有良好导热性的材料制成。
凹部222形成在加热块220的上部。所述凹部222形成在与形成在所述支架150上的安装孔154的位置对应的位置处，并且多个凹部222可以以预定线彼此平行地形成。例如，如上所述，当八个安装孔154形成并布置成一排时，八个凹部222也可以形成并排列成一行。分别凹部222具有与所述管T的下部形状对应的形状，使得管T的下部可以与凹部222紧密接触。
光传递部224由通道形状的部分构成，该通道形成在分别凹部222的至少一侧并且横向贯穿。例如，光传递部224可以形成在凹部222的后部，并且可以包括预定的通道，该预定通道在前后方向上穿过加热块220的后部。
引导部230可以连接到加热器210的侧面。引导部230可包括引导管232、引导梁234以及弹性弹簧236。
包括在加热模块200中的引导管232具有垂直贯穿的引导孔并且固定到所述加热器210的侧面。
引导梁234可以垂直延伸穿过加热模块200中的所述引导孔，下端可以固定在下板110上，上端可以固定在上板120或固定夹具154上。
所述弹性弹簧236设置在引导管232和上板120之间，以便穿过所述引导梁234。因此，当所述弹性弹簧236被压缩时，所述弹性弹簧236相对所述引导管232向下施加弹力。即，弹性弹簧236可以施加弹力以保持所述引导管232的下降位置。另外，当加热器210及加热块220向上移动时，防止加热块220和管T之间的强烈碰撞，同时，加热块220与管T紧密接触。
开闭部240具有与设置有预定的高度和厚度的屏蔽壁相同的结构。开闭部240设置在所述加热器210上，配置在所述加热块220的侧部，并且可以以预定高度定位在吹气喷嘴520和加热块220之间。
检测模块300可以包括模块壳体310、光捕获部320以及发射滤光器330。优选地，感测模块300设置在所述加热模块200的加热器210上，并且可以与加热模块200一起移位。
模块壳体310包括模块盖312及模块基座314，模块壳体310可在内部包括光捕获部320和发射滤光器330。
优选地，所述加热块220也嵌入到所述模块壳体310的内部，使得在模块盖312中形成向上开口的空间，使得加热块220的凹部222向上暴露。在模块基座314还设置有安装壁316，安装壁316连接到加热块220，并分别安装有光捕获部320和发射滤光器330，与光传递部224连通的通孔318可以与所述加热块220的光传递部224的位置相对应地形成在所述安装壁316上，以供光通过。
光捕获部320可以是预定的传感器部324安装在预定PCB 322上的构件。所述传感器部324可以是例如光电二极管，并且可以具有与光传递部224的数量和布置相对应的数量和布置。即，根据加热块220的凹部222的数量形成八个光传递部224，并且提供与各个光传递部224对应的八个光捕获部320。例如，如图10所示，PCB 322可以竖立在所述加热块220后面，并且所述传感器部324和光传递部224可以彼此面对。
发射滤光器330可以设置在所述光捕获部320和所述加热块220之间。发射滤光器330是带通滤光器，仅通过入射光使由管的荧光材料产生的波长的光通过。因此，管中产生的光可以穿过加热块220后面的光传递部224，穿过发射滤光器330，并进入光捕获部320的传感器部324。
驱动模块400是用于移动所述加热模块200和感测模块300的构件。
驱动模块400位于所述加热模块200下方，并且可包括例如预定的电机410和电机轴420。电机轴420连接到所述加热模块200的下部，当所述电机410运转时，所述电机轴420向上移动以向上移动所述加热模块200。本发明不限于此，驱动模块400的结构可以是能够移动所述加热模块200和感测模块300的任何装置。
加热模块200和感测模块300通过驱动模块400的操作在升高位置和降低位置之间往复运动。例如，当驱动模块400向上操作时，加热模块200和感测模块300移动到升高位置，当驱动模块400向下操作时，加热模块200和感测模块300可以移动到降低的位置。
冷却模块500包括鼓风机510和吹气喷嘴520。
鼓风机510是产生风以冷却管T的构件，虽未图示，鼓风机510可包括预定的螺旋桨和电机410。
吹气喷嘴520是用于将从鼓风机510产生的风传递到安装在所述支架150上的管T的构件。优选地，吹气喷嘴520在内部具有在两个方向上穿透的预定空间，并且所述空间的一侧用作入口部522并且邻近所述鼓风机510设置，另一侧作用为出口部524，使得与所述支架150相邻配置。
如图11所示，与入口部522相比，出口部524可以具有在水平方向上变宽并且在垂直方向上变窄的形状。因此，当从上方观察时，吹气喷嘴520可以具有漏斗形状，具有窄入口和宽出口，并且当从侧面观察时具有宽入口和窄出口的六字形形状。
吹气喷嘴520的出口部524与安装在所述支架150上的多个管T并排布置，将冷却风均匀地提供给安装在支架150上的多个管T。
即，参照图13A，所述出口部524的宽度方向可以布置成沿着由所述安装孔154的布置形成的线彼此平行。
如上所述，盖模块600是通过铰链部160可旋转地连接到壳体100的上板120的预定的盖。在下文中，将参照图14至图17描述盖模块600。盖模块600位于所述支架150上，包括盖壳体610、盖基座620、发光部630、滤光器650以及管帽加热部640。
盖壳体610可以具有矩形平行六面体形状，并且可以包括具有预定空间的壳体部612和连接到壳体部612以可打开及关闭的开闭盖614。
盖基座620嵌入盖壳体610的内部。当开闭盖614打开时，盖基座620的内部的至少一部分露出。盖基座620具有滤芯622和透光部624。滤芯622形成在盖基座620的前表面上并且在向后方向上具有预定深度并且在横向方向上具有预定宽度。透光部624由垂直延伸穿过滤芯622的上部和下部的预定通道形成。
发光部630包括PCB 632和安装在所述PCB 632的下表面上的多个光源部634。如图16的箭头B所示，所述PCB 632安装在所述盖基座620的上表面上，并且分别光源部634位于与分别的透光部624的位置对应的位置。因此，光源部634的数量和透光部624的数量可以相同。
所述透光部624和光源部634的布置可以与所述加热块220的凹部222的布置相同。即，具有对应于八个凹部222布置成一排的布置，八个光源部634和透光部624可以串联布置在所述凹部222上。
滤光器650是具有预定厚度和预定面积的光学带通滤波器，发光部630从光源部634发射的宽带光源仅允许通过适合于在使用该装置的反应中使用的荧光物质的特定波长入射到管的反应物。如图15及图16的箭头A所示，能够插入到形成在盖基座620的滤芯622。当滤光器650插入到滤芯622内时，滤光器650穿过透光部624的至少局部。另一方面，通过打开开闭盖614去除及替换滤光器650。
如图16中的箭头C所示，管帽加热部640安装在盖基座620的下表面上，，并且是能够发射热量的构件。在管帽加热部640形成有多个垂直穿透的通孔642，所述多个通孔642具有与所述透光部624的布置对应的布置，使得从发光部630发射的光可以穿过并进入管。管帽加热部640用于加热管的盖子，以防止由于高温反应而蒸发的水蒸气在盖子的下表面上冷凝，最大限度地减少样品体积的变化，并保持通过管上部光源中的盖子照射的预定光量用于荧光测量。
控制装置700可以包括能够控制所述加热模块200、感测模块300、驱动模块400和冷却模块500的操作的预定CPU。控制装置700通过接收外部信号来控制所述加热模块200、感测模块300、驱动模块400和冷却模块500的操作，并向外部输出操作状态。
在下文中，将描述根据本发明的核酸扩增装置的操作。图19是示出根据本发明的核酸扩增装置的加热模块200处于降低位置的状态的图。图20是示出根据本发明的核酸扩增装置的加热模块200处于升高位置的状态的图。图21是示出在根据本发明的核酸扩增装置的盖模块600中产生的光的路径的图。
首先，将包含反应物的管T安装在支架150中。此时，打开壳体100上的盖模块600后管T安装在支架150的安装孔154，然后关闭盖模块600。
此时，如图18所示，管T首先存放在支架150的安装孔154中，并且在驱动模块400被操作之前，加热模块200、感测模块300位于降低位置，并且加热块220与支架150间隔开。
当控制装置700产生操作信号时，可以操作加热模块200、感测模块300、驱动模块400、冷却模块500和盖模块600。另一方面，每个操作可以同时或以时间差执行，并且其形态不受限制。
当操作信号被传输到加热模块200时，加热器210可以操作以产生热量。另外，当操作信号被传输到驱动模块400时，电机410操作以升高加热模块200。因此，如图20所示，加热模块200移动到升高位置。
当加热模块200由驱动模块400升高并且加热模块200的加热块220接近支架150时，安装在支架150上的管T中的反应物被加热。此时，优选地，形成在加热块220中的凹部222的凹陷表面和所述管T的下表面彼此接触，从而可以实现快速的热传递。
此时，当加热模块200升高时，不需要冷却管T，从而可以停止冷却模块500的鼓风机510。
另一方面，根据一实施例，当加热模块200上升时，加热模块200的开闭部240上升，并且升高的开闭部240关闭冷却模块500的吹气喷嘴520的出口部524，使得从冷却模块500产生的冷却风不能传递到管T。
如图21所示，在盖模块600中设置的光源部634中产生光，在光源部634中产生的光通过滤光器650以具有适当的光波长，并穿过透光部624、通孔642，进入管T。当光入射到管T内的反应物上时，由于管内的核酸扩增而产生荧光信号，所述荧光信号通过加热块220的光传递部224通过发射滤光器330，然后进入传感器部324。因此，可以实时检测管内反应物的反应。
当加热模块200将升高位置保持预定时间并达到指定加热时间时，控制装置700可以产生信号以使所述驱动模块400的电机410反转。
当驱动模块400的电机410沿相反方向操作时，加热模块200降低。随着加热模块200降低，管T和加热块220彼此分离，并且停止加热块220对管T的加热。此时，术语“中断”不限于完全排除热传递。
当加热模块200下降时，鼓风机510操作以冷却管T。根据一示例，随着设置在加热模块200中的开闭部240降低，吹气喷嘴520的出口部524被打开并且由鼓风机510产生冷却风，以冷却安装在支架150上的管T。
当加热模块200将下降位置保持预定时间并达到指定的冷却时间时，控制装置700产生信号以再次操作所述驱动模块400，使得加热块220上升对安装在所述支架150上的管T中的反应物进行加热。然后，当再次达到加热时间时，如上所述加热块220下降，并且通过将管暴露在风中来冷却管的过程重复预定次数。
根据本发明，可以快速控制反应物的温度。即，包含反应物的管T与加热模块200的加热块220接触并被快速加热，当充分进行加热时，加热模块200或支架移动以打开吹气喷嘴520，因此，通过鼓风机510中产生的冷却风可以快速冷却反应物。
另外，通过根据用户的意图设定加热模块200或支架200的操作，调节反应物的加热时间和冷却时间，使得反应物的温度达到各种目标温度并保持目标温度范围。例如，通过将加热模块200的操作周期设置为不同，或者保持加热模块200被上升的位置的时间，或者保持加热模块200降低的位置的时间，可以不同地设定反应物的加热时间及冷却时间，以根据用户的需要容易地控制和选择反应物的温度。
此外，可以通过非常简单的操作实现反应物的加热和冷却。即，设置在加热模块200的加热块220和开闭块240一起升降，从而，在加热期间，加热块220靠近管T以便快速加热，同时，开闭块240关闭吹气喷嘴520以阻止冷却风的冷却。需要冷却时，加热块220与管T分离以停止加热，同时开闭块240与吹气喷嘴520分离以打开吹气喷嘴520，从而通过冷却风实现迅速的冷却。因此，仅通过用于移动加热模块200的驱动模块400的操作信号可以适当地执行加热和冷却，而不需要用于冷却的单独的操作信号输入。
由于在加热过程中在盖模块600的光源部634中产生的光入射在管T中的反应物上，并且在反应物中产生的光被传输到传感器部324并被感测，可以实时检测反应结果。
因此，可以快速且准确地进行需要温度调节的典型化学/生物化学反应的PCR(聚合酶链反应)。
另一方面，本发明还涉及一种用于在核酸扩增反应中温度调节反应溶液的方法。
可以使用如上所述的装置或图22a和22b中例示的装置来执行根据本发明的方法。
在根据本发明的方法中，使用单独的装置进行加热和冷却，使得装入反应溶液的反应容器在保持高温的加热块和鼓风机产生的风之间移动，使得加热块和风反复地接触调节温度。
根据本发明的方法可用于使用周期性温度变化来扩增特定部分的核酸的技术，例如PCR(聚合酶链反应)反应中用于温度调节。这种PCR通常包括三个反应步骤，一个循环，数次，至少两次，至少两次至50次，至少两次至40次，至少两次至30次，但不限于此。PCR是一种放大痕量存在的目标以便检测的过程，样品中存在的目标量、样品中装入的杂质的程度、检测方法的种类、检测的目的、PCR反应中使用的酶的类型以及根据PCR反应条件而不同，本领域技术人员将能够确定适合于这些条件的循环数。
在第一次变性步骤中，双链核酸在90℃或更高的温度下分离成单链。第二退火步骤通常在55-60℃下进行，此时两种类型的引物与所述变性步骤中分离成单链的每条核酸链的互补部分结合。在第三个延伸步骤中，DNA聚合酶使用单链作为模板，通过使用碱性单体(dNTP)从引物合成DNA。温度通常为65至75℃。即，通常通过重复加热和冷却的温度变化，在55至95℃的温度范围内进行PCR，通常，该加热-冷却过程重复25至40次以扩增靶核酸。在PCR反应中，退火和延伸步骤可以根据具体的温度在一个步骤中进行，在这种情况下，一个循环包括变性和退火/延伸两个步骤，并且根据本发明的方法可以应用于两者。
如上所述的PCR方法在平衡和功率范例方面可以根据温度状态分为如图31所述的两种方法。前一种方法是过去主要使用的方法，每个步骤在特定温度下进行预定时间，并且不考虑从一步到另一步的转变引起的温度变化期间的反应。在后者中，每个步骤不会在特定温度下保持预定时间，而是每个步骤在连续变化的温度下进行，即，每个步骤的反应在特定温度范围内发生。因此，PCR的每个步骤(例如退火，延伸和变性)的反应速度取决于温度，同时，在温度变化期间的特定温度下可以同时发生一个或多个反应(变性、退火、延伸)。
根据本发明的方法特别是后者的一种方式针对PCR反应优化的方法。与常规方法相比，这种方法可能稍微不那么敏感或特异，但是可以非常方便地用于需要快速筛选大量样品的应用中。
在一个方面，本发明涉及核酸扩增反应中的温度控制方法，其包括在第一温度下进行的变性步骤和在第二温度下进行的退火/延伸反应步骤，其中这些步骤重复数次。
在一个实施例中，所述方法还包括使所述核酸扩增反应中使用的容器与预定保持所述第一温度的加热块接触预定时间后，将所述容器温度加热至第一温度的第一步骤；以及将所述容器和所述加热块彼此以预定间隔隔开后所述分离的容器预定时间暴露在人造气流后，将所述容器冷却至第二温度的第二步骤，相对于冷却至所述第二温度的容器，第一步骤和第二步骤重复几次。
在另一个实施例中，本发明提供调节第三步骤的PCR反应温度的方法，即在第一温度下进行的变性步骤，在第二’温度下进行的退火步骤和在第二温度下进行的延伸步骤。
在一个实施例中，所述方法还包括使所述核酸扩增反应中使用的容器与预定保持所述第一温度的加热块接触预定时间后，将所述容器温度加热至所述第一温度的第一步骤；将所述容器和所述加热块彼此以预定间隔隔开后所述分离的容器预定时间暴露在气流后，将所述容器冷却至第二’温度的第二步骤；以及将所述暴露的容器预定时间暴露在气流后，将所述容器冷却至第三温度的第三步骤。
最近，大量样品用于筛选目的，快速反应对此至关重要。然而，在PCR反应中，加热-冷却过程中的温度控制是实现快速反应的关键因素。
根据本发明的方法的第一步骤中，使装入反应溶液的反应容器与保持在预定温度的加热块接触预定时间，以将反应溶液加热至预定时间以达到所需的变性温度，在第二步骤中，将容器从加热块中分离并沿预定方向移动，在预定时间内，用鼓风机产生的人造气流与达到所需的冷却温度接触，以冷却反应溶液。
此时，可以控制与加热块的接触时间或与鼓风机产生的风的接触时间，以控制反应溶液的温度以达到各种目标温度。通过重复该过程，可以调节反应溶液的温度在预定范围内重复温度范围。
在一个实施例中，源自鼓风机的人造气流，即风，处于常温。环境温度可以在不同环境之间稍微变化，但是可以通过将外部温度测量温度计连接到装置通过产生风的风扇的RPM来控制风速。在室内使用时，考虑到PCR的温度条件，常温是20℃的风或30℃的风或35℃的风，在PCR温度范围内，温度在95℃的情况下，在冷却至55℃至65℃的时间内几乎没有差异。另一方面，风速会影响冷却时间。
将加热至98℃的反应溶液冷却至65℃的一般退火/延伸温度所需的时间以便核酸变性，即暴露于人造气流的预定时间所需的时间与吹向反应容器的空气的速度有关，在一实施例中，冷却时间可以通过以下等式确定：t＝4+2*e-(v-7.4)/6.2。
例如，当用于PCR的标准PCR管用作反应容器并且使用20μL反应溶液时，如图32所示，从98℃冷却至65℃所需的时间t对应于风速v。
在本申请中，温度基于反应容器中包含的反应溶液或反应物。然而，由于使用根据本发明的方法的PCR的性质，考虑具有约1至50μl的非常小体积的一般PCR管的材料和优异的传热性，可以说容器的温度和溶液的温度没有差别。因此，除非本文另有说明，否则反应容器的温度是指反应物或反应溶液的温度。
在一个实施例中，可以使用如上所述的图1至图21或图22a和22b中所示的装置来执行根据本发明的方法。加热块2加热并保持在具有形成为反应容器形状的孔的金属材料的高温下，使得反应容器1的底部可以完全与加热块接触，另外，可以使用用于吹风4的鼓风机3位于加热块上方的装置。装入反应溶液的反应容器1在第一步骤中与加热块2接触并加热，然后向上移动以与由鼓风机3产生的风4接触并冷却。在这种情况下，可以通过非常简单的操作实现反应物的加热和冷却。即，在加热时，反应容器安装在加热块上以进行快速加热，同时，开闭块通过阻塞吹气喷嘴来阻挡冷却风的冷却，或者如果需要可以连续产生风。此外，在冷却时，加热块与容器分离以停止加热，并且开闭块与吹气喷嘴分开，使得吹气喷嘴打开，从而可以实现通过冷却风的快速冷却。
根据本发明的方法的第一步骤包括将反应容器的反应物的温度加热至第一温度。
在根据本发明的方法中，反应物在预定的反应容器中进行，并且反应容器可以根据实施根据本发明的方法的具体装置的结构而不同，例如，通常可以使用用于PCR的100μL，200μL容量管、毛细管、微流体通道、薄膜腔等，但不限于此。
根据本发明的方法的第一步骤中的第一温度是指在核酸扩增反应中将双链DNA分离成单链的充分的温度，第一温度可以通过各种因素确定，例如构成DNA的碱的组成，例如，G/C组成比、总长度、缓冲液中装入的盐的浓度，考虑到反应条件等，本领域技术人员将能够选择合适的温度。例如，90℃以上，约95℃，但不限于此。
在根据本发明的方法的第一步骤中反应物的加热可以使用加热块进行，尤其加热块在第一温度下固定并且不需要温度变化，因此可以快速反应。加热块例如如图22a和22b所示形成，以便能够如上所述进行有效的热传递。可以使用本领域公知的方法进行块的加热。本领域技术人员将能够选择合适的。例如，可以使用珀耳帖、电阻加热器、加热线圈、特定温度的风，或高温或冷温液体，但不限于此。
根据本发明的方法中温度变化的标准是反应溶液，在使用根据本发明的方法的PCR的情况下，基于20uL的一般PCR执行体积使用通常使用的聚丙烯反应容器，当应用相同的一般条件(管，体积)进行PCR时，可以比常规PCR更快地进行PCR。而且，本发明的方法可以应用于另一种材料的反应容器，另一种类型的反应容器(例如微流体装置)，或者体积不是20μL的反应溶液。在这种情况下，与具有单个加热/冷却源的现有的基于珀耳帖的温度控制方法相比，这种情况也可以快速进行。
当应用其他容器或不同体积时，可以改变本发明方法的升温速率(每秒温度变化)，通过实验获得根据体积变化或材料特性的升温速率，可以确定加热/冷却时间。
在根据本发明的方法的第一步骤中，反应容器保持在约100℃，例如，与保持在用于核酸的变性所需的约95℃的温度下的加热块接触预定时间。本文所用的术语预定时间是通常的PCR反应中常用的规格，例如，是指聚丙烯薄壁管(例如，来自Thermofisher的PCR管)的PCR管中反应物的温度达到足以通过与加热块接触而使反应溶液中的双链DNA变性的温度的时间，可以考虑反应溶液的体积来确定，并且本领域技术人员将能够考虑具体的反应条件来选择合适的时间。在使用20μL体积的反应溶液的一个实施例中，接触时间可以是1至15秒。
在根据本发明的方法中，在第一步骤之后，反应容器和加热块彼此分开预定距离。在该过程中，加热块和/或反应容器可以移动。如图23所示，降低加热块或固定加热块，并且反应容器可以向上移动。
间隔没有特别限制，并且由于移动所花费的时间，总反应时间的时间最小化，并且取决于鼓风机的位置，适合暴露的间隔。
与由加热块加热的加热块周边的空气充分隔开且用于冷却而喷射的风直接与加热块接触及到达，以便防止加热块的温度影响反应容器，从而不影响加热块的温度保持的间隔。在一个实施例中，可以是0.5cm至2cm。
在加热块和反应容器彼此分离之后，反应容器可以暴露于人造风中预定时间以在第二步骤中冷却，或者可选地，在空气中预定时间停止，前者是将退火/延伸执行一个步骤的总共两个步骤的反应，后者是用于分离退火/延伸的第三步骤的反应。
在根据本发明的一个实施例中，退火/延伸在一个步骤中进行，并且与加热块分离的反应容器暴露于人造气流预定的时间。人造气流可由具有室温风电机的风扇型装置产生，例如，通常冷却风扇、鼓风机、横风扇、空气压缩机，但不限于此。
根据本发明的退火/延伸以一个步骤执行的方法的第二步骤中，预定的接触时间是所需的第二温度，例如根据55至70℃决定。在本文的第二步骤中，预定时间指的是，反应物与风接触的时间以达到退火/延伸反应温度，可通过反映反应溶液的体积来确定，考虑到具体的反应条件，本领域技术人员将能够选择合适的时间。在使用反应溶液的体积的20μL的一个实施例中，接触时间可以是1至15秒。
在根据本发明的另一个实施例中，变性、退火和延伸在分开的反应中进行。在这种情况下，在第一温度下进行变性步骤之后，可以进行在加热块和反应容器彼此分离之后，将反应容器冷却至第二’退火温度，然后再次加热至第二延伸温度后，可以在室温下静置预定时间的第三步骤。
在这种情况下，根据本发明的方法是在核酸扩增反应中的温度控制方法，由在第一温度下进行的变性步骤，在第二’温度下进行的退火步骤和在第二温度下进行的延伸反应组成的一个循环重复几次，所述方法包括使所述核酸扩增反应中使用的容器与预定保持所述第一温度的加热块接触预定时间后，将所述容器温度加热至所述第一温度的第一步骤；将所述容器和所述加热块彼此以预定间隔隔开后所述分离的容器预定时间暴露在人造气流后，将所述容器冷却至第二’温度的第二步骤；以及将所述容器与所述加热块接触预定时间后以第二温度加热后，与所述加热块预定间隔隔开，使得将所述分离的容器预定时间静置在空气中的第三步骤。
在所述第三步中，将反应容器的温度升高至加热块中的例如72℃的延伸温度，然后将反应容器与加热块分离后静置在空气中，相比退火/延伸由一个步骤执行的情况相比，反应容器与加热块接触两次，并且可以通过改变接触时间来调节反应容器的温度。例如，在第一步骤中，基于20μl为了变形温度达到91℃，与加热块接触约10秒，在第三步骤中，为了延伸温度达到72℃，与加热块约接触3秒。
在上述步骤中将加热块和反应容器彼此分离的步骤中，加热块或反应容器移动，反应容器可以暴露，如上所述。以上对上述步骤的描述可参考上文。
尽管已经详细描述了本发明的优选实施例，但是本发明的范围不限于此
虽然详细描述的本发明的优选实施例，然而本发明的权利要求范围并不被限定，在以下权利要求范围中定义的本发明的基本概念的技术人员的多种修改及变更均属于本发明的权利要求范围。
实施例1：通过控制加热块和反应容器的接触时间来控制反应溶液的温度
根据本发明的控制高温温度的方法通过控制与加热块或鼓风机产生的风接触的时间来控制装入反应溶液的反应容器的温度，利用该方法，可以调节反应溶液的温度以快速达到目标温度。
在本实施例中，将温度测量装置连接到装入反应溶液的反应容器上，并且将反应容器重复移动到加热块或鼓风机，以与来自加热块或鼓风机的风接触预定时间。根据接触时间测量反应溶液温度的变化，使用的装置是反应溶液的组成、反应容器、加热块为如下。
温度测量装置：Pico技术(英国)TC-08热电偶数据记录器+热电偶(K型)。反应溶液：20μLPCR缓冲液(10mM Tris-HCl，pH 8.3+50mM KCl+2mM MgCl 2)。反应容器：Bio-rad0.2mL管条(薄型)，加热块：Bio-rad c1000热循环仪(98℃培养设置)，鼓风机：3D制造12V，0.15A，1.8W鼓风机风扇。
结果，通过控制加热块和冷却介质之间的接触时间，如图24所示，可以在各个区间中将温度调节到所需温度。
此外，如图25所示，可以重复温度控制。在本实施例中，将反应溶液的温度变化区间设定为65至90℃，使装入反应溶液的反应容器与加热块接触8秒，并且重复与鼓风机产生的风接触7秒的过程，从而进行温度控制。此时，反应溶液的实际温度测量结果为63至89℃。此时，反应溶液的温度在63℃达到89℃，然后再用15秒再回到63℃，重复30次仅需7分30秒。相反，在将反应容器固定到一个块并且改变块的温度以引起装入在反应容器中的样品的加热和冷却的情况下，即使使用性能出色的热电元件的装置(Bio-rad c1000)也要重复相同的温度区间30次时需要16分钟以上，两倍的时间。
由于根据本发明的方法是反应容器在加热介质和冷却介质之间快速移动的方法，因此可以快速地引起反应容器中样品的温度变化，而不需要花费很短时间来加热或冷却介质的温度变化，从而能够快速反应。
另外，当加热块与风接触时，若装入反应溶液的管与加热块分离后不与风接触而处于静置步骤，则可以进行三个温度变化步骤。图26显示装入反应溶液的管与加热块接触3秒钟，与加热块分离，在空气中保持5秒，然后再与加热块接触10秒钟的方式加热的情况。冷却是从鼓风机与风接触9秒钟。通过此方法反应溶液到达56℃(退火)，72℃(延伸)以及91℃(变性)三个温度。
实施例2.使用根据本发明的方法通过高速PCR检测靶核酸
2-1支原体肺炎检测
将20μL用于扩增肺炎支原体序列的PCR混合物加入到反应容器中，并且，与加热块接触8秒，并与来自鼓风机的风接触7秒，将该反应重复30次，反应装置、反应条件、反应物的组成比为如下。
反应容器：Bio-rad 0.2mL管条(薄型)
加热块：Bio-rad c1000热循环仪(98℃孵育设置)
鼓风机：3D制造12V，0.15A，1.8W鼓风机风扇
PCR混合物组成：正向和反向引物，dNTP，PCR缓冲液(iNtRon)，Taq聚合酶(iNtRon)，靶DNA(肺炎支原体克隆载体)，增强子，evaGreen染料(Jena bioscience)。
引物序列：5'-CAACCTCCATGTAGCTGATAG(正向)，5'-GGTGATATCGCCAGGTAAA(反向)
快速PCR条件：预变性1分钟(98℃)，加热块(98℃)8秒接触+7秒风接触，重复30次。
向每个反应管中加入105至101个拷贝的肺炎支原体靶DNA，并测试不含靶DNA的NC(阴性对照)。在高速PCR后，通过熔解曲线分析和电泳确认扩增产物，结果分别显示在图27和图28中。
图27是支原体肺炎快速PCR的解链曲线分析图。在没有靶的NC管中未检测到扩增产物，并且从10个拷贝的靶产生峰，并且扩增在104和105个拷贝处饱和。图28的电泳凝胶照片也显示出一致的结果。
在本实施例中用于PCR的30次热转化所需的时间是7分30秒，并且整个PCR所需的时间包括PCR前1分钟的预变性时间的8分30秒。与现有的使用PCR装备的PCR方法需要30分钟以上的相比，这是非常快的时间。
2-2HBV检测
将从HBV患者获得的HBV血清稀释以制备各种浓度的HBV血清，并从各自中提取病毒DNA并与PCR反应溶液混合。将含有不同浓度的病毒DNA的20μLPCR反应溶液加入到连接有多个PCR管的每个反应管条中，并关闭管盖，预变性步骤在加热至98℃的加热块中进行1分钟。接着，通过与加热块接触8秒，从鼓风机的风接触7秒并重复35次后，进行HBV诊断的高速PCR，反应装置、反应条件、反应物的组成比如下。
HBV gDNA提取：Gene All Exgene病毒DNA/RNA mini kit(128-150)
反应管：Bio-rad 0.2mL管条(薄型)
加热块：Bio-rad c1000热循环仪(98℃孵育设置)
鼓风机：3D制造12V，0.15A，1.8W鼓风机4个连接+吹气喷嘴
PCR混合物组成：正向和反向引物，dNTP，PCR缓冲液(iNtRon)，Taq聚合酶(iNtRon)，靶DNA(提取的肺炎支原体gDNA)，增强子，evaGreen染料(Jena bioscience)
引物序列：5'-GATGT'K'TCTGCGGCGTTTTATC(正向，'K'＝G或T)，5'-CA'M'ACGGGCAACATACCTTG(反向，'M'＝A或C)。
高速PCR：预变性1分钟(98℃)，加热块(98℃)8秒接触+7秒风接触，重复35次
在高速PCR后，通过熔解曲线分析和电泳确认扩增产物，结果分别显示在图29和图30中。
图29是显示用于诊断HBV感染的高速PCR扩增产物的解链曲线分析的图。在含有通过提取未感染HBV的正常样品制备的样品的NTC管中未检测到HBV。在从HBV患者中提取的病毒DNA稀释获得的样品中，在目标量为104拷贝中观察到扩增产物的峰值，随着样品稀释度的增加，峰高逐渐降低，可检测到100份HBV病毒DNA。图30中所示的电泳凝胶的结果也是一致的。
在本实施例中用于诊断HBV感染的高速PCR所需的时间是8分45秒，并且包括PCR前预变性1分钟的整个PCR所需的时间是9分45秒。与使用通常的热循环仪的HBV检测试剂盒(Abbott Realtime HBV扩增试剂)提出的需要1小时50分钟的通常的基于PCR的方法相比，这是非常快的时间。
图中
1：装入反应溶液的锥形管
2：保持高温的加热块
3：鼓风机
4：吹气喷嘴
5：风(人造气流)
100：壳体
110：下板
120：上板
122：入口
124：紧固装置
130：侧板
140：显示装置
150：支架
152：保持体
154：安装孔
156：固定夹具
160：铰链部
170：信号输入装置
180：电源装置
200：加热模块
210：加热器
220：加热块
222：凹部
224：光传递部
230：引导部
232：引导管
234：引导梁
236：弹性弹簧
240：开闭部
300：感测模块
310：模块壳体
312：模块盖
314：模块基座
316：安装壁
318：通孔
320：光捕获部
322：PCB
324：传感器部
330：发射滤光器
400：驱动模块
410：电机
420：电机轴
500：冷却模块
510：鼓风机
520：吹气喷嘴
522：入口部
524：出口部
600：盖模块
610：盖壳体
612：壳体部
614：开闭盖
620：盖基座
622：滤芯
624：透光部
630：发光部
632：PCB
634：光源部
640：管帽加热部
642：通孔
650：滤光器
700：控制装置。

Claims (24)

1.一种高速核酸扩增装置，作为用于高速核酸扩增反应的装置，其中，包括：
支架(150)，用于固定进行所述反应的管；
加热模块(200)，包括产生热量以加热所述管的加热器(210)和连接到所述加热器(210)的加热块(220)；
驱动模块(400)，用于沿垂直方向移动所述加热模块(200)，以改变所述加热模块(200)与所述支架(150)之间的距离；以及
冷却模块(500)，用于冷却固定在所述支架(150)上的管，
所述冷却模块(500)包括用于产生冷却风的鼓风机(510)和用于将在所述鼓风机(510)中产生的冷却风传递到固定到所述支架(150)的管的吹气喷嘴(520)，
当所述加热模块(200)与所述支架(150)相邻时，所述吹气喷嘴(520)被关闭，当所述加热模块(200)与所述支架(150)分离时，所述吹气喷嘴(520)被开放。
2.根据权利要求1所述的高速核酸扩增装置，其中，所述加热块(220)包括一个以上的凹部(222)，凹部(222)设置在所述支架(150)下方并且供所述管的至少局部被插入，
所述驱动模块(400)用于移动所述加热块(220)以改变所述凹部(222)与所述管之间的距离。
3.根据权利要求2所述的高速核酸扩增装置，其中，所述支架(150)包括一个以上的安装孔(154)，安装孔(154)具有预定的内径并朝上下方向贯通，所述管安装在所述安装孔(154)上，所述管的下部向下暴露，当所述加热块(220)上升时，所述管的下部插入到所述凹部(222)内,当所述可变块(220)降低时，所述管的下部与所述凹部(222)分离。
4.根据权利要求1所述的高速核酸扩增装置，其中，所述加热模块(200)还包括设置在所述加热器(210)侧面的引导部(230)，所述引导部(230)包括：引导管(232)，具有在垂直方向上穿过的孔；引导梁(234)，插入到所述引导管(232)的孔中并在垂直方向上延伸；以及弹性弹簧(236)，位于所述引导管(232)上，并在内部插入所述引导梁(234)。
5.根据权利要求1所述的高速核酸扩增装置，其中，所述加热块(220)设置在所述支架(150)的下方，所述吹气喷嘴(520)沿横向设置在所述支架(150)的一侧，所述加热模块(200)包括开闭部(240)，当所述加热块(220)上升时，所述开闭部(240)关闭所述吹气喷嘴(520)，当所述加热块(220)下降时，所述开闭部(240)从所述吹气喷嘴(520)朝下隔开打开所述吹气喷嘴(520)。
6.根据权利要求3所述的高速核酸扩增装置，其中，所述支架(150)包括多个安装孔(154)，并且所述安装孔(154)具有一个以上的对准线并排布置，并且所述吹气喷嘴(520)包括与所述鼓风机(510)相邻的入口部(522)以及与所述支架(150)相邻的出口部(524)，出口部(524)在水平方向上的宽度宽于所述入口部(522)在水平方向上的宽度，并且，所述吹气喷嘴(520)的出口部(524)朝水平方向配置在所述支架(150)的外侧，所述出口部(524)的宽度方向与所述安装孔(154)的布置线具有并排的方向。
7.根据权利要求1所述的高速核酸扩增装置，其中，进一步包括：感测模块(300)，用于检测所述管中反应物的反应信号；以及盖模块(600)，设置在所述支架(150)上并且能够开闭，所述盖模块(600)包括用于向所述管提供光的光源部(634)，所述感测模块(300)包括用于感测所述管内的反应物产生的光的传感器部(324)。
8.根据权利要求7所述的高速核酸扩增装置，其中，所述盖模块(600)还包括设置在所述光源部(634)下方的滤光器(650)，所述感测模块(300)还包括设置在所述管和所述传感器部(324)之间的发射滤光器(330)。
9.根据权利要求7所述的高速核酸扩增装置，其中，所述加热块(220)包括光传递部(224)，光传递部(224)沿至少一个方向贯通，使得在所述管中产生的光在至少一个方向上传递。
10.根据权利要求1所述的高速核酸扩增装置，其中，还包括用于控制所述加热模块(200)、驱动模块(400)以及冷却模块(500)的动作的控制装置(700)。
11.一种核酸扩增反应中的温度控制方法，其中，作为在第一温度下进行的变性步骤和在第二温度下进行的退火/延伸反应步骤重复数次的核酸扩增反应中的温度控制方法，包括：
将所述核酸扩增反应中使用的装入反应物的容器与预定保持所述第一温度的加热块接触预定时间后，将所述反应容器温度加热至所述第一温度的第一步骤；以及将所述容器和所述加热块彼此以预定间隔隔开后分离的所述容器预定时间暴露在人造气流后，将所述容器冷却至第二温度的第二步骤，
相对于冷却至所述第二温度的容器，所述第一步骤和第二步骤重复几次。
12.根据权利要求11所述的核酸扩增反应中的温度控制方法，其中，在所述第二步骤中，所述加热块的位置是固定的，并且所述容器向上移动到所述加热块的预定位置以使所述容器隔开所述预定间隔。
13.根据权利要求12所述的核酸扩增反应中的温度控制方法，其中，持续提供所述人造气流。
14.根据权利要求11所述的核酸扩增反应中的温度控制方法，其中，在所述第二步骤中，所述容器的位置是固定的，并且所述加热块向下移动到所述容器的预定位置以使所述加热块隔开所述预定间隔。
15.根据权利要求14所述的核酸扩增反应中的温度控制方法，其中，当所述加热块以预定间隔与所述容器隔开时才提供所述人造气流。
16.根据权利要求11所述的核酸扩增反应中的温度控制方法，其中，在55至70度的所述第二温度下，导致退火和延伸的重叠。
17.根据权利要求11至16中任一项所述的核酸扩增反应中的温度控制方法，其中，在所述第二步骤中，预定时间确定为t＝4+2*e-(v-7.4)/6.2，所述t是预定时间，v是人造风速。
18.一种核酸扩增反应中的温度控制方法，由在第一温度下进行的变性步骤，在第二’温度下进行的退火步骤以及在第二温度下进行的延伸反应组成的一个循环重复几次的核酸扩增反应中的温度控制方法，其中，包括：
将所述核酸扩增反应中使用的容器与预定保持所述第一温度的加热块接触预定时间后，将所述容器温度加热至所述第一温度的第一步骤；将所述容器和所述加热块彼此以预定间隔隔开后相互分离，分离的所述容器预定时间暴露在人造气流后，将所述容器冷却至第二’温度的第二步骤；以及将所述容器与所述加热块接触预定时间后以第二温度加热后，与所述加热块预定间隔隔开，将分离的所述容器预定时间静置在空气中的第三步骤，
所述第一步骤至第三步骤重复数次。
19.根据权利要求18所述的核酸扩增反应中的温度控制方法，其中，在所述第二步骤及第三步骤中，所述容器和加热块以预定间隔隔开相互分离的步骤中，所述加热块的位置是固定的，并且所述容器向上移动到所述加热块的预定位置以使所述容器隔开所述预定间隔。
20.根据权利要求19所述的核酸扩增反应中的温度控制方法，其中，持续提供所述人造气流。
21.根据权利要求18所述的核酸扩增反应中的温度控制方法，其中，在所述第二步骤及第三步骤中，所述容器和加热块以预定间隔隔开相互分离的步骤中，所述容器的位置是固定的，并且所述加热块向下移动到所述容器的预定位置以使所述加热块隔开所述预定间隔。
22.根据权利要求21所述的核酸扩增反应中的温度控制方法，其中，当所述加热块以预定间隔与所述容器隔开时才提供所述人造气流。
23.根据权利要求18至22中任一项所述的核酸扩增反应中的温度控制方法，其中，在所述第二步骤中，预定时间确定为t＝4+2*e-(v-7.4)/6.2，所述t是预定时间，v是人造风速。
24.根据权利要求11至18所述的核酸扩增反应中的温度控制方法，其中，所述预定间隔是0.5至2cm。
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