CN110051827B - 尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶1a1亚型在代谢don中的用途 - Google Patents

尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶1a1亚型在代谢don中的用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶1A1亚型（UGT 1A1）基因在制备用于促进动物代谢脱氧雪腐镰刀菌烯醇能力的脱毒剂的用途，属于分子生物学领域。由此，本发明提供了DON在肝脏代谢的关键调控因子，为饲料中DON的暴露量评估提供科学依据，也为动物代谢DON能力评估提供方便有效的指标。本发明还公开了利用检测UGT 1A1的转录水平来评估动物代谢DON能力的方法，能够准确、方便、快速地完成评估。本发明公开的UGT 1A1在制备动物脱毒剂中的用途，对能够促进排泄、减少残留，降低DON毒性的新的脱毒剂的开发具有重要的作用和意义。

Description

尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶1A1亚型在代谢DON中的用途
技术领域
本发明属于分子生物学领域，具体涉及尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶1A1亚型在动物代谢DON中的用途。
背景技术
近年来由生物毒素污染造成的食品安全问题日益突显，尤其是真菌毒素污染，由此引发的技术性贸易壁垒和国际贸易纠纷不断发生，因此预防和控制真菌毒素污染成为全球农业、环境、卫生及食品等科学领域共同关注的热点。真菌毒素是由自然界中广泛存在的真菌遇到适宜的温度和湿度在小麦、玉米等谷物中生长繁殖、产生的次级代谢有毒有害物质，对谷物产品和饲料危害很大。据联合国粮农组织(FAO)资料，全球每年因农产品和饲料真菌毒素污染造成的直接或间接经济损失达数百亿美元，主要包括黄曲霉毒素、镰刀菌毒素(脱氧雪腐镰刀菌烯醇为主)等。
脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxynivalenol，DON)又称呕吐毒素，主要由禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)和黄色镰刀菌(Fusarium culmorum)产生。主要污染麦类、玉米等谷物，畜禽误食被谷物污染的饲料后，极易引起厌食、呕吐、腹泻、发烧、站立不稳、反应迟钝等急性中毒症状，据DON的剂量和暴露时间不同还可造成免疫抑制或免疫刺激，严重时损害造血系统甚至死亡。此外，DON还具有很强细胞毒性、免疫毒性和胚胎毒性，对机体内细胞信号传导和基因表达均有不同程度的影响。不同动物对DON的敏感程度不一样，猪最敏感，其次是小鼠>大鼠>家禽>反刍动物。敏感性差异主要与DON在体内的残留、代谢转化、消除速率有关。然而，DON在动物体内的代谢、消除规律，关键代谢酶的功能特性及表达调控机制仍有待深入研究。
DON在生物体内的代谢过程非常复杂，研究发现在动物的尿液和粪便中检测到DON的主要代谢产物是脱环氧DON(DOM1)，由肠道或瘤胃微生物脱环氧作用完成。近年来随着研究的深入，发现DON主要是在肝脏发生II相代谢反应，与葡萄糖醛酸结合，形成葡萄糖醛酸缀合物。从而使DON脂溶性减弱，水溶性增强，更有利于体内排出、降低毒性作用。DON在不同动物肝微粒体培养结果显示，葡萄糖醛酸苷化反应主要发生在3、15羟基部位，7羟基部位，且存在明显的物种差异。在人尿液中DON主要以DON-3-葡萄糖醛酸的形式排出，比例达到91％，最近Warth等(Warth B,Sulyok M,Fruhmann P,et al.Development and validationof a rapid multibiomarker liquid chromatography/tandem mass spectrometrymethod to assess human exposure to mycotoxins.Rapid Commun MassSpectrom.2012,26:1533-1540.在此全文引入作为参考)又在人尿液中检测到DON-15-葡萄糖醛酸，鼠尿中也发现了两种不同的葡萄糖醛酸代谢产物，提示葡萄糖醛酸代谢产物可能作为人类食物和动物饲料中DON膳食暴露量评估的生物标志物。然而，猪和鼠的肝微粒体体外试验未见有DON代谢产物，但在仔猪、小鼠等肝微粒体培养中发现有DON的代谢产物，推测DON葡萄糖醛酸反应具有种间和物种差异性。
尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶(Uridine diphosphate glucuronosyltransferase，UGT)是生物体内催化Ⅱ相代谢途径葡萄糖醛酸结合反应的主要功能酶。UGT是一个超基因家族，在人已确认的UGT亚型有19种，可分为UGT 1和UGT 2两个家族以及UGT1A、UGT 2A和UGT 2B三个亚族[13]。但在猪机体内，通过基因克隆和基因产物的表达，已确定的UGT亚型只有UGT 2B31、UGT 2B4、UGT 2A1、UGT 1AB3四种。UGT不同亚型的表达，除受添加药物作用影响外，与年龄、饮食、疾病状态、种族差异、遗传多态性以及激素水平等密切相关。
UGT位于内质网膜和核膜上，在不同脏器和组织如肾脏、脑、皮肤、肠、脾、胸腺、心脏等都有不同程度表达，但以肝细胞中的活性最强。在不同组织中UGT能催化一系列的内源性和外源性亲脂糖苷配基底物(如胆红素、甾体激素、药物、杀虫剂等)的葡萄糖醛酸结合过程，将亲脂性的葡萄糖醛酸(glucuronic acid，GA)转移至亲脂性底物的-OH、-SH、-NH2、-COOH、甚至于烯醇化合物上，增强化合物的水溶性，促进其排泄，是机体重要的解毒途径之一。DON作为含有多个-OH基团的烯醇类化合物，在不同动物和人的肝微粒体酶系体外研究，代谢产物为DON-3-葡萄糖醛酸和DON-15-葡萄糖醛酸，结合人和鼠尿液中DON的代谢产物，推测DON在肝脏主要发生葡萄糖醛酸反应，是机体对真菌毒素DON脱毒反应的主要途径。猪作为DON最敏感的动物，如何提高肝脏葡萄糖醛酸反应速率，促进排出、减少残留、降低毒性，成为畜牧生产的需求，尚未得到解决。
发明内容
为了解决上述技术问题的至少一个，发明人选择饲料真菌毒素污染范围最广泛的DON为研究目标，以DON最敏感动物猪的肝细胞为研究对象，通过采用体外实验观察法，从DON主要在肝脏中转化、代谢角度出发，以DON葡萄糖醛酸结合反应中尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶(UGT)功能作用研究为突破口，采用Real-time PCR、酶活性分析、Western-blot等技术，出乎意料地筛选出DON葡萄糖醛酸代谢关键酶基因。进一步地，发明人通过基因克隆、Bac-to-Bac重组表达系统、酶活性动力学以及LC-MS/MS技术对DON代谢产物分析，验证了该关键酶基因的功能和作用。从而完成本发明。
本发明的第一方面提供尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶1A1亚型(UGT 1A1)在制备用于促进动物代谢脱氧雪腐镰刀菌烯醇能力的脱毒剂中的用途。
在本发明的实施方案中，所述脱毒剂为口服制剂和注射制剂。
在本发明的实施方案中，所述脱毒剂中UGT 1A1含量为0.025mg/mL。
本发明的第二方面提供尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶1A1亚型(UGT 1A1)基因在制备用于评估动物代谢脱氧雪腐镰刀菌烯醇能力的试剂盒中的用途。
在本发明的实施方案中，所述脱毒剂中包括能够扩增UGT 1A1基因的转录产物的至少一部分序列的引物对。
在本发明的具体实施方案中，所述转录产物为mRNA。
在本发明的具体实施方案中，所述转录产物包括mRNA的反转录产物cDNA。
在本发明的实施方案中，所述引物对分别具有SEQ ID NO.9和SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列。
在本发明的具体实施方案中，所述动物为猪。
本发明的第三方面提供一种评估动物代谢脱氧雪腐镰刀菌烯醇能力的方法，包括以下步骤：
获取所述动物的RNA样本；
测定UGT 1A1基因的转录水平，
如果UGT 1A1基因的转录水平高于参考基因的转录水平，则所述动物代谢脱氧雪腐镰刀菌烯醇能力较强，反之较弱。
在本发明的实施方案中，所述测定UGT 1A1基因的转录水平是利用逆转录定量PCR的方法进行的，所用引物对分别具有SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示的核苷酸序列。
在本发明的实施方案中，其特征在于，所述动物为猪。
本发明的有益效果
本发明提供了DON在肝脏代谢的关键调控因子，为饲料中DON的暴露量评估提供科学依据，也为动物代谢DON能力预测提供方便有效的指标。
本发明利用监测UGT 1A1的转录水平来评估动物代谢DON能力的方法，能够方便、快速地完成。
本发明公开的UGT 1A1在制备动物脱毒剂中的用途。对能够促进排泄、减少残留，降低DON毒性的新的脱毒剂的开发具有重要的作用和意义。
附图说明
图1示出了不同浓度DON处理肝细胞后细胞形态变化。
图2示出了不同浓度DON处理肝细胞后细胞活性变化。
图3示出了DON处理后不同UGT酶mRNA表达的变化。
图4示出了重组转移载体的凝胶电泳检测结果。1-5：pFast-Bac-UGT1A1阳性质粒；MK：DL15000。
图5示出了重组转移载体的酶切鉴定结果。1：目的基因PCR产物；2：pFastBacUGT1A1双酶切(Bam HI和Hind III)；3：pFastBac UGT1A1质粒单酶切线性化；MK：DL2000。
图6示出了重组杆状病毒的PCR鉴定结果。1-5:KWTMM-C(约4000kb)；MK:DL5000plus DNA Marker。
图7示出了重组杆状病毒感染的Sf9昆虫细胞后SDS-PAGE检测结果。泳道A：培养基上清；泳道B：细胞裂解上清；泳道C：细胞裂解沉淀；MK：分子量Marker。
图8示出了重组杆状病毒感染的Sf9昆虫细胞后western blot检测结果。泳道A：培养基上清；泳道B：细胞裂解上清；泳道C：细胞裂解沉淀；MK：分子量Marker；Ctrl+：Anti-Hiswestern blot阳性对照。
图9示出了DON葡萄糖醛酸化后的质谱图。
具体实施方式
为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。
实施例
以下例子在此用于示范本发明的优选实施方案。本领域内的技术人员会明白，下述例子中披露的技术代表发明人发现的可以用于实施本发明的技术，因此可以视为实施本发明的优选方案。但是本领域内的技术人员根据本说明书应该明白，这里所公开的特定实施例可以做很多修改，仍然能得到相同的或者类似的结果，而非背离本发明的精神或范围。
除非另有定义，所有在此使用的技术和科学的术语，和本发明所属领域内的技术人员所通常理解的意思相同，在此公开引用及他们引用的材料都将以引用的方式被并入。
那些本领域内的技术人员将意识到或者通过常规试验就能了解许多这里所描述的发明的特定实施方案的许多等同技术。这些等同将被包含在权利要求书中。
实施例1
1.材料
1.1猪肝细胞
猪肝细胞取自一周龄巴拿马小型乳猪，由上海市农业科学院庄行实验站提供。
1.2材料
DON标准品购自Romer公司；胶原酶IV、DMEM培养基、小牛血清、胰酶消化液、青霉素、链霉素均购自美国GIBCO公司；Dulbecco’s磷酸盐缓冲液、Dulbecco’s Hanks’平衡盐和台盼蓝均购自Sigma公司；Trizol试剂购自Invitrogen公司；限制性内切酶、T4DNA连接酶、荧光定量PCR试剂盒(SYBR Green Premix Ex Taq)购自TaKaRa，胎牛血清购自杭州四季青公司；KOD-plus DNA聚合酶购自TOYOBO公司；质粒提取试剂盒和胶回收试剂盒购自天根生化科技有限公司；鼠源性抗His单克隆抗体购自瑞士Roche公司；E.coli DH10 Bac、昆虫细胞转染试剂(CellfectinⅡReagent)、细胞系sf9、细胞培养液Sf-900ⅡSFM、Grace’s昆虫细胞培养液、质粒载体pFastBacTM 1购自Invitrogen公司；His-beads购自美国Novagen公司。
2.方法
2.1肝细胞的分离和培养
根据Klaunig等(KLAUNIG J E,GOLDBLATT P J,HINTON D E,et al.MouseLiverCell Culture[J].Hepatocyte Isolation,in vitro,1981,17(10):913-925.在此全文引入作为参考)的方法，用胶原酶IV原位灌流法取得猪肝细胞后，传代纯化。用0.4％的台盼蓝液检验细胞活力，活力达90％以上时，以2.0×105个/mL活度接种到24孔板(0.8mL)中和6孔板(3mL)中，在37℃、5％CO2、饱和湿度的CO2培养箱中培养，用含10％胎牛血清的培养液培养48小时。
2.2细胞染毒
显微镜观察已生长良好的单层猪肝细胞，换含DON浓度为0、0.001、0.01、0.1、1和10mg/L的培养液暴露培养48h。
2.3总RNA的提取以及cDNA的合成
将肝细胞消化后，2000r/min离心20min，弃上清，加入D-Hank's液5mL洗涤细胞1次，于冰上加入1mL的Trizol和200μL氯仿，用力上下倒置混匀，按照试剂盒操作说明书提取总RNA。按照RT-PCR试剂盒操作说明书逆转录合成cDNA，-20℃保存。
2.4荧光定量PCR反应
(1)引物设计：使用软件Primer Primer 5.0设计，引物序列见下表1，以β-actin作为内参。
(2)反应体系：采用SYBR Green I荧光定量Real-time PCR。按实时荧光定量试剂盒操作说明冰上配制20μL扩增体系如下：SYBR Premix Ex Taq(2×)10μL，ROX ReferenceDye(50×)0.4μL，正向引物(10pM)0.8μL，反向引物(10pM)0.8μL，cDNA模板2.0μL，补充Nuclease-Free水至20μL。融解曲线按仪器自定程序：95℃，15s；60℃，1min；95℃，15s，60℃，15s。样品均二次重复，同时设置空白对照。
(3)基因表达量的测定：通过不同基因在荧光信号到达阈值时所经历循环数Ct值(Cycle threshold)，用2-ΔΔCT法对有效性数据进行统计分析，以β-actin为内标基因计算出不同基因在肝细胞中表达量的变化。
表1 Real-time PCR目的基因引物序列及PCR条件(退火温度)
Figure BDA0002065884070000071
2.5 Sf9细胞的培养
Sf9细胞为半贴壁生长，用含10％胎牛血清的Grace's培养基(含100U/mL)青霉素、100U/mL链霉素)，27℃静止培养，待细胞长至90汇合度时传代。传代时应注意避免过多的气泡产生，尽量减少对细胞的损伤。
2.6目的基因的扩增
根据已发表的猪UGT 1A1基因序列设计一对引物，委托上海生物工程公司合成，对UGT 1A1基因进行PCR扩增。上游引物P1含Bam HI酶切位点和ATG起始密码子，下游引物在终止密码子前加入了编码6个组氨酸的碱基序列和HindⅢ酶切位点。
P1：CATGTTGCTGGTGAACCAGAGCCACCAGGGCTT(SEQ ID NO.13)
P2：CGCTAGTGGGTCTTGCTCTTGTGGCTCTTCT(SEQ ID NO.14)
PCR条件为：94℃预变性5min；94℃变性20s，55℃退火20s，72℃延伸1min，共30个循环；72℃延伸5min。PCR产物用0.1％琼脂糖凝胶进行电泳、回收纯化。
2.7杆状病毒转移载体的构建与鉴定
将扩增片段UGT 1A1-6His进行胶纯化，然后用限制性内切酶Bam HI和HindⅢ进行消化，连接到经同样酶消化的pFastBacⅠ载体质粒上。转化JM109感受态细胞，进行氨苄抗性平板筛选，挑取若干个克隆进行扩增，小量提取质粒，进行Bam HI和和HindⅢ酶切鉴定，筛选得到阳性质粒，命名为pFastBac-UGT 1A1。酶切鉴定为阳性的重组菌进行序列测定以验证插入序列的正确性。
2.8表达UGT 1A1重组杆状病毒的构建与鉴定
将转移载体pFastBac-UGT 1A1转化DH10bac，经蓝白斑筛选，提取质粒，PCR鉴定穿梭质粒Bacmid-UGT1A1。采用Cellfectin Reagent将Bacmid-UGT1A1转染对数生长期的Sf9昆虫细胞，经5～7d或细胞出现病变时，提取重组杆状病毒基因组DNA，用M13上下游引物进行PCR扩增特异性片段，鉴定重组杆状病毒。M13上下游引物分别为F：GTTTTCCCAGTCACGAC(SEQ ID NO.15)，R：CAGGAAACAGCTATGAC(SEQ ID NO.16)。重组杆状病毒PCR产物预计为2300bp+插入片段，野生杆状病毒为300bp。鉴定后扩增种毒，进行蚀斑减数试验测定种毒效价，4℃遮光保存。
2.9 SDS-PAGE和Western blot检测UGT 1A1的表达纯化
将Bacmid-UGT1A1接种对数生长期的Sf9昆虫细胞，28℃培养至96h，收集上清80mL，经300000g超速离心后，经镍亲和层析柱纯化，进行SDS-PAGE电泳，电转印至硝酸纤维素膜，用含10％脱脂乳PBST封闭过夜，以鼠抗Flag抗体(1：2500)作一抗，作用2h，PBST洗涤，用HRP标记的羊抗鼠IgG(1：2500)作二抗，作用1h，DAB显色试剂盒检测。
2.10重组UGT 1A1蛋白酶对DON的降减活性
在提取的蛋白混悬液中加入DON，采用LC-MS/MS方法对代谢产物进行定性、定量鉴定，并观察不同蛋白浓度、DON浓度、pH值调节下，根据代谢产物变化，鉴定酶活性和动力学参数。
3结果与分析
3.1不同浓度DON对猪肝细胞活力的影响
显微镜观察发现(图1)，随着DON添加浓度的增高，漂浮的死亡细胞增多；图2结果显示，1ppm可使细胞活力显著下降，与对照组相比差异显著(P<0.05)，10ppm时与对照相比差异极显著(P<0.01)。发明人选择1ppm作为观察剂量。
3.2 DON处理后对肝细胞中UGT酶活性变化
图3结果显示，1ppm DON处理后，肝细胞中UGT酶表达发生不同的变化，其中UGT1A1较UGT 2B31显著提高(P<0.05)，UGT 2B4和UGT 1AB3有下降趋势，因此发明人选择UGT1A1为研究对象。
3.3猪UGT 1A1扩增结果及测序分析
PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定出现约1600bp左右的条带，与预期大小一致。
3.4 pFastBac-UGT 1A1转移载体的鉴定
图4和图5电泳结果显示，重组质粒pFastBac-UGT 1A1进行PCR、电泳，出现1条长约1660bp的特异条带；经Bam HI和HindⅢ酶切、电泳出现2条带：一条带为载体，约为5200bp，另一条为插入的目的条带，约为1600bp，与预期结果相符。序列测序表明，该转化菌的质粒中含有目的基因片段，且读码框正确，重组质粒pFastBac-UGT 1A1构建成。
3.5重组杆状病毒PCR鉴定
图6结果显示，以重组杆状病毒基因组DNA为模板，用M13上下游引物进行PCR扩增。电泳结果在约4000bp处显示有特异性片段，与预测结果一致。
3.6 SDS-PAGE和Western blot检测结果
图7和图8结果显示，重组杆状病毒感染的Sf9昆虫细胞96h，收集上清超速浓缩，镍亲和层析柱纯化进行SDS-PAGE，在64.4kD处出现1条带，转膜后进行免疫印迹检测，出现1条特异性的抗原-抗体结合带。
3.7 UGT1A1对DON的降减作用
经试验结果发现(图9)，在0.025mg/mL UGT 1A1作用的条件下，DON浓度降低52.12％。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 上海市农业科学院
<120> 尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶1A1亚型在代谢DON中的用途
<130> XY-2019-1-W-003
<160> 16
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tggaacggac taagtcagaa gttg 24
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cgttatggct gggatgttgt t 21
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ttaaatctgc gttgcttcca taca 24
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ggcccatcct gcactccata ac 22
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ttcaggtact catgtgatgg aagg 24
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cagccccaag caaggtaaag 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tgcgtgacat caaggagaag 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tgccagggta cattgtggta 20
<210> 9
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tcactttggc aaacttg 17
<210> 10
<211> 17
<212> DNA
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tcgaattcct agttctg 17
<210> 11
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
tcatcaccat cggcaacg 18
<210> 12
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gccgtgatct ccttctgca 19
<210> 13
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
catgttgctg gtgaaccaga gccaccaggg ctt 33
<210> 14
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
cgctagtggg tcttgctctt gtggctcttc t 31
<210> 15
<211> 17
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gttttcccag tcacgac 17
<210> 16
<211> 17
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
caggaaacag ctatgac 17

Claims (4)

1.尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶1A1亚型在制备用于促进动物代谢脱氧雪腐镰刀菌烯醇能力的脱毒剂中的用途，其特征在于，所述脱毒剂为口服制剂和注射制剂，所述脱毒剂中UGT 1A1含量为0.025 mg/mL，所述动物为猪。
2.检测尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶1A1亚型基因的试剂在制备用于评估动物代谢脱氧雪腐镰刀菌烯醇能力的试剂盒中的用途，其特征在于，所述动物为猪。
3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述试剂盒中包括能够扩增尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶1A1亚型基因的转录产物的至少一部分序列的引物对。
4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述引物对分别为SEQ ID NO. 9和SEQ IDNO.10所示的核苷酸序列。
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