CN110031555B - 一种分离检测血清脂蛋白的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种分离检测血清脂蛋白的方法，其是将血清样品与缓冲溶液混合，配制血清样品稀释液，向其中加入苏丹黑B的有机溶剂溶液，并置于恒温摇床中震荡≥3 h，得到染色后的血清样品稀释液，采用非对称场流分离联用紫外可见光检测器对染色后的血清样品稀释液中的高密度脂蛋白与低密度脂蛋白进行分离并检测两者的粒径分布。本发明方法操作简单，分析时间短，既能定性检测血清中的脂蛋白，又能够准确地定量分析高密度脂蛋白与低密度脂蛋白的粒径分布，避免血清样品中游离蛋白质对脂蛋白分离的干扰，减小脂蛋白样品与过滤膜的交联，具有广泛的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种检测脂蛋白的方法，具体地说是涉及一种检测血清脂蛋白的制备方法。
背景技术
《2017中国心血管病报告》指出心血管病占居民疾病死亡构成的40%以上，成为我国居民的首位死因。心血管疾病已经成为重大的公共卫生问题，防治心血管病刻不容缓。冠心病（coronary artery disease，CAD）是一种十分常见的心血管疾病，目前，临床上以脂蛋白-胆固醇含量作为CAD的预测因子。然而最近研究发现，血清中脂蛋白-胆固醇含量处于正常值时，仍然具有发生CAD的风险，因此单纯从血清脂蛋白-胆固醇含量的角度评价CAD及事件发生概率具有一定局限性。最近研究发现，载脂蛋白与CAD的发生发展紧密相关，尤其是低密度脂蛋白（low density lipoprotein，LDL）携带的载脂蛋白B（ApoB）和高密度脂蛋白（high density lipoprotein，HDL）携带的载脂蛋白A1（ApoA1）。研究证实，ApoB/ApoA1是冠状动脉病变的危险因素。ApoB和ApoA1分别是LDL、HDL的主要载体蛋白，故LDL/HDL可以作为一种潜在的CAD预测因子。此外，研究报道脂蛋白的粒径分布变化可能与CAD有关联。因此，对血清中的脂蛋白进行分离及定量分析具有重要意义。
现有的分离血清脂蛋白的方法有超速离心法（ultracentrifugation，UC）、电泳法（electrophoresis，EP）和非对称场流分离技术（asymmetrical flow field-flowfractionation，AF4）。UC主要通过使用一种密度能形成梯度（连续增高或降低）的溶剂系统，例如盐溶液，使离心后的血清脂蛋白颗粒能按照各自的密度比重平衡在溶剂系统中，从而达到分离的目的；EP是根据血清脂蛋白颗粒在电场中迁移速率的差异达到分离的目的；AF4是基于血清脂蛋白颗粒尺寸的差异达到分离样品组分的目的。然而，UC分离血清脂蛋白时，分析时间长，操作过程复杂，实施难度高，不能获得脂蛋白的粒径分布；EP分离血清脂蛋白时，分辨率低、重现性差，且不能获得脂蛋白的粒径分布信息；AF4分离血清脂蛋白时，由于蛋白质的干扰，不能达到样品组分的完全分离，且染色后的血清脂蛋白膜吸附严重。因此，亟需开发一种定性检测血清脂蛋白并能够准确地定量分析其中高密度脂蛋白和低密度脂蛋白粒径信息的方法。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种从血清样品中区分脂蛋白的方法，以解决现有血清脂蛋白检测方法中由于其他蛋白质的干扰或吸附在检测膜上而造成的检测结果不准确的问题。
本发明的目的之二是提供一种检测血清脂蛋白的方法，以解决现有血清脂蛋白检测方法中由于其他蛋白质的干扰，不能完全分离高密度脂蛋白和低密度脂蛋白，且两者粒径分布信息准确性差等问题。
本发明的目的之一是这样实现的：
一种从血清样品中区分脂蛋白的方法，其是向血清样品或血清样品稀释液中加入苏丹黑B的有机溶剂溶液，并置于恒温摇床中震荡≥3 h；所述血清样品稀释液是将血清样品加入至缓冲溶液中，所述血清样品与所述缓冲溶液的体积比为1∶6~8。
所述血清样品采用如下方法制备：取8 mL血液样品置于10 mL促凝管中，上下翻转数次，随后使用高速台式离心机，在6000 r/min，4 ℃下低温离心20 min，取上清液（血清）在相同的条件下再次离心15 min，确保上清液中不含血细胞。
将制好的血清样品于-80 ℃超低温冻存。在使用时，将-80 ℃冻存的血清样品放置4 ℃，使其缓慢解冻。
所述缓冲溶液可以选用本领域技术人员已知的，优选地，所述缓冲溶液为包括NaCl、PBS和NaN3的混合水溶液，更优选地，所述缓冲溶液为包括50 mMNaCl、10 mM PBS和3mM NaN3的混合水溶液。
优选地，所述血清样品与所述缓冲溶液的体积比为1∶7。
所述苏丹黑B的有机溶剂溶液中，所述有机溶剂为可以溶解苏丹黑B的有机溶剂，优选乙醇或丙酮。
优选地，所述苏丹黑B的有机溶剂溶液为苏丹黑B的乙醇溶液；可以采用如下方法配制：将苏丹黑B固体溶于乙醇中，之后将其置于200 W超声处理2 min，使用0.45 μm PTFE过滤膜进行过滤即得；所述乙醇的浓度为99.75%（v/v）；优选地，所述苏丹黑B固体与乙醇的比为0.3 %（w/v）。
所述苏丹黑B的用量根据人体中脂蛋白的用量而确定，其可以根据不同血液样品中脂蛋白的含量来调整，以使脂蛋白完全染色，且苏丹黑B不过多析出。优选地，所述血清样品稀释液与浓度为0.3 %（w/v）的苏丹黑B的乙醇溶液按照体积比为10∶1进行混合，染色。
所述恒温摇床的温度为35~40℃，优选37℃。
所述恒温摇床的震荡频率为150~300 rpm，优选200rpm。
优选地，在恒温摇床中的震荡时间为3~6 h。
本发明的目的之二是这样实现的：
一种检测血清脂蛋白的方法，包括如下步骤：
（a）将血清样品与缓冲溶液混合，配置血清样品稀释液；
（b）向步骤（a）所得血清样品稀释液中加入苏丹黑B的有机溶剂溶液，并置于恒温摇床中震荡≥3 h，得到染色后的血清样品稀释液；
（c）采用非对称场流分离联用紫外可见光检测器对染色后的血清样品稀释液中的高密度脂蛋白与低密度脂蛋白进行分离并检测两者的粒径分布。
步骤（a）中，所述血清样品采用如下方法制备：取8 mL血液样品置于10 mL促凝管中，上下翻转数次，随后使用高速台式离心机，在6000 r/min，4 ℃下低温离心20 min，取上清液（血清）在相同的条件下再次离心15 min，确保上清液中不含血细胞。
将制好的血清样品于-80 ℃超低温冻存。在使用时，将-80 ℃冻存的血清样品放置4 ℃，使其缓慢解冻。
所述缓冲溶液可以选用本领域技术人员已知的，优选地，所述缓冲溶液为包括NaCl、PBS和NaN3的混合水溶液，更优选地，所述缓冲溶液为包括50 mMNaCl、10 mM PBS和3mM NaN3的混合水溶液。
优选地，所述血清样品与所述缓冲溶液的体积比为1∶7。
步骤（b）中，所述苏丹黑B的有机溶剂溶液中，所述溶剂为可以溶解苏丹黑B的有机溶剂，优选乙醇或丙酮。
优选地，所述苏丹黑B的有机溶剂溶液为苏丹黑B的乙醇溶液；可以采用如下方法配制：将苏丹黑B固体溶于乙醇中，之后将其置于200 W超声处理2 min，使用0.45 μm PTFE过滤膜进行过滤即得；所述乙醇的浓度为99.75%（v/v）；优选地，所述苏丹黑B固体与乙醇的比为0.3 %（w/v）。
所述苏丹黑B的用量根据人体中脂蛋白的用量而确定，其可以根据不同血液样品中脂蛋白的含量来调整，以使脂蛋白完全染色，且苏丹黑B不过多析出。优选地，所述血清样品稀释液与浓度为0.3 %（w/v）的苏丹黑B的乙醇溶液按照体积比为10∶1进行混合，染色。
所述恒温摇床的温度为35~40 ℃，优选37 ℃。
所述恒温摇床的震荡频率为150~300 rpm，优选200 rpm。
优选地，在恒温摇床中的震荡时间为3~6 h。
步骤（c）中，采用非对称场流分离联用紫外可见光检测器进行检测分析时，所采用的载液为包括NaCl、PBS和NaN3的混合水溶液，更优选地，所述载液为包括50~200mMNaCl、10mM PBS和3 mM NaN3的混合水溶液。
检测器流速为1 mL/min，交叉流流速为1~2 mL/min。
检测器波长λ=600 nm。
采用非对称场流分离联用紫外可见光检测器进行检测分析时，所采用的过滤膜为可再生纤维素过滤膜（RC），垫片厚度为350 μm。
本发明通过区分血清中的脂蛋白与其他蛋白质，采用非对称场流分离联用紫外可见光检测器（AF4-UV/Vis）分离血清中的脂蛋白，避免血清样品中游离蛋白质对脂蛋白分离的干扰，减小脂蛋白样品与过滤膜的交联，在保证样品结构完整性的同时能够获得脂蛋白中高密度脂蛋白与低密度脂蛋白颗粒的粒径分布。
本发明方法操作简单，分析时间短，既能定性检测血清中的脂蛋白，又能够准确地定量分析高密度脂蛋白与低密度脂蛋白的粒径分布，具有广泛的应用前景。
附图说明
图1是对比例1的方法对血清脂蛋白进行分离表征的AF4-UV/Vis图谱。
图2是采用对比例2的方法对血清脂蛋白样品进行分离表征的AF4-UV/Vis图谱及粒径分布。
图3是采用对比例2的方法对血清脂蛋白样品进行分离表征后过滤膜表面的直观图。
图4是采用实施例1~2、对比例2~3的方法对血清脂蛋白样品进行分离表征的AF4-UV/Vis图谱及粒径分布。
图5是采用实施例1的方法对血清脂蛋白样品进行分离表征后过滤膜表面的直观图。
图6是采用实施例1、3和对比例4的方法对血清脂蛋白样品进行分离表征的AF4-UV/Vis图谱及粒径分布。
图7是采用实施例1、4~5的方法对血清脂蛋白样品进行分离表征的AF4-UV/Vis图谱及粒径分布。
图8是实施例6中CAD患者混合血清样品与健康志愿者混合血清样品中的脂蛋白AF4-UV/Vis图谱。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的阐述，下述实施例仅作为说明，并不以任何方式限制本发明的保护范围。
在下述实施例中未详细描述的过程和方法是本领域公知的常规方法，实施例中所用试剂均为分析纯或化学纯，且均可市购或通过本领域普通技术人员熟知的方法制备。下述实施例均实现了本发明的目的。
在下述实施例中，采用以下方法制备血清样品：取8 mL冠心病患者志愿者血液样品置于10 mL促凝管中，上下翻转数次，随后使用高速台式离心机，在6000 r/min，4 ℃下低温离心20 min，取上清液（血清）在相同的条件下再次离心15 min，目的是确保上清液中不含血细胞。将制好的血清样品于-80 ℃超低温冻存，待后续分析使用。在使用时，将-80 ℃冻存的血清样品放置4 ℃，使其缓慢解冻。
在对血清样品进行分离表征前，采用缓冲溶液稀释解冻后的血清样品，缓冲溶液为50 mMNaCl、10 mM PBS和3 mM NaN3的混合水溶液，血清样品与缓冲溶液的体积比为1∶7，得到血清样品稀释液。
下述实施例中采用苏丹黑B的乙醇溶液，其配制方法如下：将0.03 g苏丹黑B固体溶于10 mL乙醇溶液（99.75%，v/v），200 W超声处理2 min，使用0.45 μm PTFE过滤膜进行过滤，分装保存。
对比例1
将血清样品稀释液采用非对称场流分离联用紫外可见光检测器（AF4-UV/Vis）对其中的脂蛋白进行分离表征。分析条件为：进样体积为20 μL；检测器流速为1 mL/min，交叉流流速为2 mL/min；350 μm厚度的垫片；可再生纤维素（RC）过滤膜；载液为100 mMNaCl +10 mM PBS + 3 mM NaN3的混合水溶液；检测器波长λ=280 nm。
所得结果如图1所示，由图1可见，基于非对称场流分离联用紫外可见光检测器（AF4-UV/Vis）对血清脂蛋白进行分离表征，结果重复性良好，且能够获得脂蛋白颗粒的粒径分布信息。然而，血清中大量游离的蛋白质对脂蛋白的分离表征造成干扰，使样品各组分之间存在交叉，不能获得良好的分离。
对比例2
采用苏丹黑B的乙醇溶液对血清样品稀释液中的脂蛋白进行染色：取血清样品稀释液30 μL，向其中加入3 μL的苏丹黑B的乙醇溶液。
对染色后的血清样品稀释液进行检测分析，分析条件为：进样体积为20 μL；检测器流速为1 mL/min，交叉流流速为2 mL/min；350 μm厚度的垫片；RC过滤膜；载液为50mMNaCl + 10 mM PBS + 3 mM NaN3的混合水溶液；检测器波长λ=600 nm。
所得检测结果如图2~3所示，从图2中可以看出，使用苏丹黑B染色血清样品稀释液中的脂蛋白，消除了血清中游离蛋白质的干扰，实现了血清样品组分之间的基线分离，然而，样品与过滤膜吸附较大（图3），致使洗脱峰信号强度较低。
实施例1
采用苏丹黑B的乙醇溶液对血清样品稀释液中的脂蛋白进行染色：取血清样品稀释液30 μL，向其中加入3 μL的苏丹黑B的乙醇溶液，并在置于37 ℃下的恒温摇床中，震荡频率为200 rpm，震荡3 h。
对染色后的血清样品稀释液进行检测分析，分析条件为：进样体积为20 μL；检测器流速为1 mL/min，交叉流流速为2 mL/min；350 μm厚度的垫片；RC过滤膜；载液为50mMNaCl+ 10 mM PBS + 3 mM NaN3的混合水溶液；检测器波长λ=600 nm。
对比例3
采用苏丹黑B的乙醇溶液对血清样品稀释液中的脂蛋白进行染色：取血清样品稀释液30 μL，向其中加入3 μL的苏丹黑B的乙醇溶液，并在置于37 ℃下的恒温摇床中，震荡频率为200 rpm，震荡1 h，对血清样品稀释液进行染色。
对染色后的血清样品稀释液进行检测分析，分析条件为：进样体积为20 μL；检测器流速为1 mL/min，交叉流流速为2 mL/min；350 μm厚度的垫片；RC过滤膜；载液为50mMNaCl+ 10 mM PBS + 3 mM NaN3的混合水溶液；检测器波长λ=600 nm。
实施例2
采用苏丹黑B的乙醇溶液对血清样品稀释液中的脂蛋白进行染色：取血清样品稀释液30 μL，向其中加入3 μL的苏丹黑B的乙醇溶液，并在置于37 ℃下的恒温摇床中，震荡频率为200 rpm震荡6 h，对血清样品稀释液进行染色。
对染色后的血清样品稀释液进行检测分析，分析条件为：进样体积为20 μL；检测器流速为1 mL/min，交叉流流速为2 mL/min；350 μm厚度的垫片；RC过滤膜；载液为50mMNaCl+ 10 mM PBS + 3 mM NaN3的混合水溶液；检测器波长λ=600 nm。
对实施例1~2、对比例2~3所得血清样品稀释液进行检测分析，所得结果如图4~5所示。从图中可以看出，采用恒温摇床辅助染色后，加强了苏丹黑B与血清脂蛋白的结合，减小了样品与过滤膜的吸附，增强了样品洗脱峰信号强度，实现了样品组分之间的基线分离，且获得了样品颗粒的粒径分布信息。
实施例3
按照实施例1的方法采用苏丹黑B的乙醇溶液对血清样品稀释液中的脂蛋白进行染色。对染色后的血清样品稀释液进行检测分析，分析条件为：进样体积为20 μL；载液为50mMNaCl+ 10 mM PBS + 3 mM NaN3的混合水溶液；350 μm厚度的垫片；RC过滤膜；检测器波长λ=600 nm；检测器流速为1 mL/min，交叉流流速为1 mL/min。
对比例4
按照实施例1的方法采用苏丹黑B的乙醇溶液对血清样品稀释液中的脂蛋白进行染色。对染色后的血清样品进行检测分析，分析条件为：进样体积为20 μL；载液为50mMNaCl+ 10 mM PBS + 3 mM NaN3的混合水溶液；350 μm厚度的垫片；RC过滤膜；检测器波长λ=600 nm；检测器流速为1 mL/min，交叉流流速为3mL/min。
采用实施例1、3和对比例4的方法对血清脂蛋白进行染色后，所得结果如图6所示。
实施例4
按照实施例1的方法采用苏丹黑B的乙醇溶液对血清样品稀释液中的脂蛋白进行染色。对染色后的血清样品稀释液进行检测分析，分析条件为：进样体积为20 μL；检测器流速为1 mL/min，交叉流流速为1 mL/min；350 μm厚度的垫片；RC过滤膜；检测器波长λ=600nm；载液为100 mMNaCl+ 10 mM PBS + 3 mM NaN3的混合水溶液。
实施例5
按照实施例1的方法采用苏丹黑B的乙醇溶液对血清样品稀释液中的脂蛋白进行染色。对染色后的血清样品稀释液进行检测分析，分析条件为：进样体积为20 μL；检测器流速为1 mL/min，交叉流流速为1 mL/min；350 μm厚度的垫片；RC过滤膜；检测器波长λ=600nm；载液为200 mMNaCl+ 10 mM PBS + 3 mM NaN3的混合水溶液。
采用实施例1、4~5的方法对血清样品稀释液中的脂蛋白进行染色后，所得结果如图7所示。
实施例6
取-80 ℃超低温冻存的5位CAD患者的血清样品各1 mL，混合，得到CAD患者血清混合液，向其中加入缓冲溶液配制成CAD患者混合血清样品稀释液，CAD患者血清混合液与缓冲溶液的体积比为1∶7，之后按照实施例1的方法苏丹黑B的乙醇溶液对CAD患者混合血清样品稀释液中的脂蛋白进行染色。
取-80 ℃超低温冻存的5位健康志愿者的血清样品各1 mL，混合，得到健康志愿者血清混合液，向其中加入缓冲溶液配置成健康志愿者混合血清样品稀释液，健康志愿者血清混合液与缓冲溶液的体积比为1∶7，之后按照实施例1的方法苏丹黑B的乙醇溶液对健康志愿者混合血清样品稀释液中的脂蛋白进行染色。
对染色后的CAD患者混合血清样品稀释液、健康志愿者混合血清样品稀释液进行检测分析，分析条件为：进样体积为20 μL；检测器流速为1 mL/min，交叉流流速为1 mL/min；350 μm厚度的垫片；RC过滤膜；检测器波长λ=600 nm；载液为100 mMNaCl + 10 mM PBS+ 3 mM NaN3的混合水溶液。
所得结果如图8所示，从图中可以看出，所建立的血清脂蛋白的AF4-UV/Vis分析方法实现了血清样品中HDL和LDL的基线分离，并获得其粒径分布信息；5位CAD患者的混合血清中的LDL/HDL值高于5位健康人的混合血清LDL/HDL值，证明LDL/HDL值或许可以作为一种潜在的冠心病预测因子。
Claims (4)
1.一种检测血清脂蛋白的方法，其特征在于，包括如下步骤：
（a）将血清样品与缓冲溶液混合，配制血清样品稀释液；所述缓冲溶液为包括NaCl、PBS和NaN3的混合水溶液；所述血清样品与所述缓冲溶液的体积比为1∶7；
（b）向步骤（a）所得血清样品稀释液中加入苏丹黑B的有机溶剂溶液，并置于恒温摇床中震荡≥3 h，得到染色后的血清样品稀释液；所述苏丹黑B的有机溶剂溶液为苏丹黑B的乙醇或丙酮溶液，所述血清样品稀释液与浓度为0.3 %的苏丹黑B的有机溶剂溶液按照体积比为10∶1进行混合；恒温摇床的温度为35~40 ℃；
（c）采用非对称场流分离联用紫外可见光检测器对染色后的血清样品稀释液中的高密度脂蛋白与低密度脂蛋白进行分离并检测两者的粒径分布；采用非对称场流分离联用紫外可见光检测器进行检测分析时，所采用的载液为包括NaCl、PBS和NaN3的混合水溶液。
2.根据权利要求1所述的检测血清脂蛋白的方法，其特征在于，所述载液为包括50~200mMNaCl、10 mM PBS和3 mM NaN3的混合水溶液。
3.根据权利要求1所述的检测血清脂蛋白的方法，其特征在于，步骤（c）中，所述检测器流速为1 mL/min，交叉流流速为1~2 mL/min。
4.根据权利要求1所述的检测血清脂蛋白的方法，其特征在于，步骤（c）中，所述检测器波长λ=600 nm，所采用的过滤膜为可再生纤维素过滤膜，垫片厚度为350 μm。
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