CN110029078A - 具有防病杀虫双重作用的链霉菌及其应用、培养方法、生防菌剂 - Google Patents
具有防病杀虫双重作用的链霉菌及其应用、培养方法、生防菌剂 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及具有防病杀虫双重作用的链霉菌及其应用、培养方法、生防菌剂，属于植物病虫害防治技术领域。本发明中分离得到一株具抑菌活性的内生链霉菌MS001；其发酵液对葡萄座腔菌、胶孢炭疽菌、苹果拟茎点霉、小麦纹枯病菌、小麦全蚀病菌、番茄灰霉病菌、小麦赤霉病菌、君子兰茎基腐病菌、南天竹炭疽病菌都具有较强的抑菌活性，抑菌对象具广谱性；并且其发酵液具有抑制棉铃虫、松褐天牛幼虫等植物害虫生长的作用。因此链霉菌MS001可以防治苹果树、园林植物、蔬菜、和粮食作物上的一些病害和虫害。
Description
技术领域
本发明涉及具有防病杀虫双重作用的链霉菌及其应用、培养方法、生防菌剂，属于植物病虫害防治技术领域。
背景技术
内生放线菌广泛分布于植物的根、茎、叶、果实及种子中，大量的研究表明从植物体内分离的放线菌具有很大的应用价值。
澳大利亚研究小组从小麦根部分离出60多株放线菌，筛选得到防治小麦全蚀病(Gaeumannomyces graminis var.tritici)的菌株，经温室试验使小麦全蚀病的危害降低70％(Coombs J T,Franco CM.Isolation and identification of actinobacteria fromsurface-sterilized wheat roots[J].Applied and Environmental Microbiology,2003,69(9):5603～5608.)。梁亚萍等人从野生植物中分离得到29株内生放线菌，其中SG2和SF4菌株对温室番茄早疫病(Alternaria solani)和黄瓜白粉病(Sphaerothecacucurbitae)的防治效果分别达到89.72％和89.61％(梁亚萍,宗兆锋,马强.6株野生植物内生放线菌防病促生作用的初步研究[J].西北农林科技大学学报,2007,35(7):131～136.)。涂璇等人分离自黄瓜的内生放线菌淡紫灰链霉菌(Streptomyces fradiae)对番茄早疫病(Alternaria solani)、灰霉病(Botrytis cinerea)、玉米弯孢病(Curvularialunata)、辣椒疫霉病(Phytophthora capsici)等抑菌效果明显(涂璇,黄丽丽,高小宁,等.黄瓜内生放线菌的分离、筛选及其活性菌株鉴定[J].植物病理学报,2008,38(3):244～251.)。陈红兵等人从辣椒体内分离出一株放线菌菌株Lj20，经温室对抗试验，对黄瓜灰霉病(Botrytis cinerea)有较强的抑制作用(陈红兵,马林,韩巨才,等.放线菌Lj20抗真菌物质的分离及其在病害防治中的作用[J].植物保护学报,2011,1:42～46.)。王靖从白菜、油菜及银杏树的根际土壤及根、茎、叶等材料中分离拮抗放线菌，来自白菜根际土壤的A316及红豆树根部的A10经盆栽和大田试验，对白菜和油菜根肿病菌(Plasuwdiophorabrassicae)有很好的抑制作用(王靖.十字花科作物根肿病生防放线菌研究[D].雅安:四川农业大学,2011:8～12.)。李庆蒙等人从江西庐山珙桐树中分离筛选出拮抗放线菌奈良链霉菌(S.naraensis)，对稻瘟病菌(Pyricularia oryzae)、烟草黑胫病菌(Phytophthoraparasitica var.nicotianae)等植物病原真菌的相对抑制率高达90％以上(李庆蒙,王世强.拮抗放线菌JD211的抑菌活性及其鉴定[J].生物灾害科学,2013,394～398.)。沈玥从健康玉米植株中分离出拮抗放线菌菌株NEAU-M89，对玉米大斑病(Exserohilum turcicum)、玉米小斑病(Helminthosporium maydis)抑制效果最好(沈玥.玉米内生放线菌的筛选、鉴定及抑制玉米大斑病菌机理研究[D].哈尔滨:东北农业大学,2014:10～13.)。张志斌等人从东乡野生稻内分离放线菌共11株，其中8株具有抗菌活性，并从高抑菌活性菌株S123中分离到化合物Nigericin，对枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)及水稻纹枯病菌(Thanatephorus cucumeris)均有抑制活性(张志斌,邓映明.东乡野生稻内生放线菌分离及菌株S123次级代谢产物分析[J].微生物学通报,2015,42(9):1662～1670.)。王相晶对7种植物的根部及根部土壤进行放线菌分离，其中内生菌菌株gq1和gq12对大豆疫霉病菌(Phytophthora sojae)有很好的抑制活性(王相晶.7种植物内生和根际放线菌的分离鉴定及抗菌活性研究[D].哈尔滨:东北农业大学,2015:13～14.)。
上述文献中虽然报道了一些对于植物致病菌具有拮抗作用的放线菌，但是这些放线菌一般仅能拮抗少数几种病原菌，并且不能够抑制植物害虫。
发明内容
本发明的目的是提供具有防病杀虫双重作用的链霉菌，该菌株能够拮抗9种植物病原菌，并能抑制两种植物害虫的生长。
本发明还提供了上述链霉菌的应用，为植物病虫害的防治提供了一种新的途径。
本发明还提供了上述链霉菌的培养方法，具有更好的培养效果。
本发明还提供了具有防病杀虫双重作用的生防菌剂，其能够抑制植物病虫害的发生。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
具有防病杀虫双重作用的链霉菌，该菌株为链霉菌(Streptomyces sp.)MS001，保藏编号为CCTCC NO:M 2019266。
本发明中从新疆野苹果枝干中分离得到一株具抑菌活性的内生链霉菌(Streptomyces sp.)MS001；其发酵液抑菌活性强，且抑菌对象具广谱性；并且其发酵液具有抑制植物害虫生长的作用，因此可以防治苹果树、园林植物、蔬菜、和粮食作物上的一些病虫害。
上述的具有防病杀虫双重作用的链霉菌在拮抗植物致病菌中的应用。具体的，所述植物致病菌为葡萄座腔菌、胶孢炭疽菌、和/或苹果拟茎点霉。
本发明中通过实验发现链霉菌MS001发酵液对葡萄座腔菌的抑菌率为95.21±0.00％，对胶孢炭疽菌的抑菌率为83.08±1.38％，对苹果拟茎点霉的抑菌率达到91.04±1.55％，对葡萄座腔菌、苹果拟茎点霉的抑菌作用最高，抑菌率在90％以上，能很好的抑制3种苹果枝干病害病原菌菌丝的生长。
具体的，所述植物致病菌为小麦纹枯病菌、小麦全蚀病菌、番茄灰霉病菌、小麦赤霉病菌、君子兰茎基腐病菌、和/或南天竹炭疽病菌。
本发明中通过实验发现链霉菌MS001发酵液对番茄灰霉病菌的抑菌率达到77.60±3.67％，对南天竹炭疽病菌的抑菌率达到66.88±1.10％，对君子兰茎基腐病菌的抑菌率达到64.03±0.82％，对小麦赤霉病菌的抑菌率达到82.03±2.28％，对小麦纹枯病菌的抑菌率达到80.89±0.96％，对小麦全蚀病菌的抑菌率达到31.27±2.13％，对6种植物病原菌生长均具有抑制作用。
上述的具有防病杀虫双重作用的链霉菌在抑制植物害虫中的应用。具体的，所述植物害虫为棉铃虫。具体的，所述植物害虫也可以为松褐天牛幼虫。
本发明中通过实验发现链霉菌MS001发酵液对于棉铃虫和松褐天牛幼虫具有很强的毒杀活性，因此可以用于抑制这两种植物害虫。
上述的具有防病杀虫双重作用的链霉菌的培养方法，在培养所述链霉菌时，使用高氏一号培养基或PDA培养基。
本发明中通过不同培养基对于链霉菌MS001的培养，发现高氏一号培养基、PDA培养基菌液对葡萄座腔菌的抑菌率分别为95.05±1.80％、98.18±0.90％，抑菌效率极高，与其他培养基的抑菌结果存在显著差异，因此该菌株的最适培养基为高氏一号培养基、PDA培养基。
优选的，所述培养的条件为：温度20-32℃，pH＝5-9。
本发明中通过实验发现，对于链霉菌MS001，20-32℃条件下生长情况良好，发酵液对病原菌的抑菌率也较高。链霉菌菌株MS001不能适应极酸和极碱的环境，适宜生活pH值在5-9之间。
一种具有防病杀虫双重作用的生防菌剂，包括生防菌和辅料，所述生防菌为链霉菌(Streptomyces sp.)MS001，保藏编号为CCTCC NO:M 2019266。
本发明中的链霉菌MS001能够拮抗植物病原菌，并且能够抑制植物害虫的生长，因此可以添加其他辅料作为生防菌剂使用。
附图说明
图1为本发明试验例1中链霉菌MS001在不同培养基上培养10天的形态特征图；
图2为本发明试验例1中菌株MS001菌落、气生菌丝及孢子链形态特征图；
图3为本发明试验例2中链霉菌MS001不同培养基发酵液对葡萄座腔菌抑菌活性比较图；
图4为本发明试验例3中链霉菌MS001发酵液对葡萄座腔菌抑制作用结果图；
图5为本发明试验例3中链霉菌MS001发酵液对胶孢炭疽菌抑制作用结果图；
图6为本发明试验例3中链霉菌MS001发酵液对苹果拟茎点霉抑制作用结果图；
图7为本发明试验例3中链霉菌MS001发酵液对番茄灰霉病菌抑制作用结果图；
图8为本发明试验例3中链霉菌MS001发酵液对南天竹炭疽病菌抑制作用结果图；
图9为本发明试验例3中链霉菌MS001发酵液对君子兰茎基腐病菌抑制作用结果图；
图10为本发明试验例3中链霉菌MS001发酵液对小麦赤霉病菌抑制作用结果图；
图11为本发明试验例3中链霉菌MS001发酵液对小麦纹枯病菌抑制作用结果图；
图12为本发明试验例3中链霉菌MS001发酵液对小麦全蚀病菌抑制作用结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明。除特殊说明的之外，各实施例及试验例中所用的设备和试剂均可从商业途径得到。以下试验例中使用的供试病原菌有：葡萄座腔菌(Botryosphaeria dothidea)、胶孢炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides)、苹果拟茎点霉(Phomopsis mali)、小麦纹枯病菌(Rhizoctoniacerealis)、小麦全蚀病菌(Gaeumannomyces graminis)、番茄灰霉病菌(Botrytiscinerea)、小麦赤霉病菌(Fusarium graminearum)、君子兰茎基腐病菌(Fusariumoxysporum)、南天竹炭疽病菌(Colletotrichum karstii)。
其中葡萄座腔菌、胶孢炭疽菌、苹果拟茎点霉，以及小麦纹枯病菌病菌、小麦全蚀病菌、番茄灰霉病菌、小麦赤霉病菌、君子兰茎基腐病菌、南天竹炭疽病菌均由本发明团队采集于洛阳市大田发病植株，纯化分离后通过科赫氏法则验证，经微观形态观察和分子生物学鉴定，现保存于河南科技大学林学院林业生物技术实验室。
葡萄座腔菌、胶孢炭疽菌、苹果拟茎点霉，君子兰茎基腐病菌、南天竹炭疽病菌的ITS rDNA序列被克隆测序，已提交Genbank数据库，对应的序列号分别为：MH250045、MH156052、MH250047、MF471668、KX987162。小麦纹枯病菌、小麦全蚀病菌、番茄灰霉病菌、小麦赤霉病菌的ITS rDNA序列被克隆测序，暂未提交Genbank数据库，对应的序列分别如SEQID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示。
具有防病杀虫双重作用的链霉菌的实施例1
本实施例中具有防病杀虫双重作用的链霉菌，该菌株为链霉菌(Streptomycessp.)MS001，保藏编号为CCTCC NO:M 2019266；保藏日期：2019年04月17日，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉.武汉大学(湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中心)。
具有防病杀虫双重作用的链霉菌在拮抗植物致病菌中的应用的实施例1
本实施例中所用的菌株为链霉菌(Streptomyces sp.)MS001，保藏编号为CCTCCNO:M2019266。植物致病菌为葡萄座腔菌、胶孢炭疽菌、和/或苹果拟茎点霉。
具有防病杀虫双重作用的链霉菌在拮抗植物致病菌中的应用的实施例2
本实施例中所用的菌株为链霉菌(Streptomyces sp.)MS001，保藏编号为CCTCCNO:M2019266。植物致病菌为小麦纹枯病菌、小麦全蚀病菌、番茄灰霉病菌、小麦赤霉病菌、君子兰茎基腐病菌、和/或南天竹炭疽病菌。
具有防病杀虫双重作用的链霉菌在抑制植物害虫中的应用的实施例1
本实施例中所用的菌株为链霉菌(Streptomyces sp.)MS001，保藏编号为CCTCCNO:M2019266。植物害虫为棉铃虫和/或松褐天牛幼虫。
具有防病杀虫双重作用的链霉菌的培养方法的实施例1
本实施例中具有防病杀虫双重作用的链霉菌的培养方法，使用的培养基为高氏一号培养基；培养的条件为：温度20-32℃，pH＝5-9。更为优选的，培养温度为23℃，pH＝7。
从节约培养的链霉菌种子液容量考虑，菌株MS001发酵液最佳接种量为4％。从节省培养时间考虑，将菌株发酵液最佳培养时间定为4d。从单位容器发酵效率考虑，将100/500mL作为最佳装液量。
具有防病杀虫双重作用的生防菌剂的实施例1
本实施例中的具有防病杀虫双重作用的生防菌剂，包括生防菌和辅料，所述生防菌为链霉菌(Streptomyces sp.)MS001，保藏编号为CCTCC NO:M 2019266。辅料可以是本领域常用的辅料。
试验例1具有防病杀虫双重作用的链霉菌的获得
从新疆伊犁地区巩留县野苹果健康枝条分离到一株抑菌活性的链霉菌(Streptomyces sp.)菌株MS001，中国典型培养物保藏中心保藏号为CCTCC M 2019266。
1、链霉菌菌株MS001培养特征
参照《链霉菌鉴定手册》和《微生物学试验手册》将链霉菌MS001接种在ISP2、ISP3、ISP4、ISP5、PDA、NA、LB、PSA、高氏一号培养基上，28℃培养10d，链霉菌MS001在不同培养基中培养，形态特征如表1和图1所示(图1中：a为ISP2培养基，b为ISP3培养基，c为ISP4培养基，d为ISP5培养基，e为LB培养基，f为NA培养基，g为PDA培养基，h为PSA培养基，i为高氏一号培养基)。
其中，ISP2培养基：酵母提取物4.0g，麦芽糖10.0g，葡萄糖4.0g，琼脂20.0g，蒸馏水1000mL，pH 7.2-7.4。
ISP3培养基：燕麦20.0g，MnCl2·4H2O 0.001g，FeSO4·7H2O 0.001g，ZnSO4·7H2O0.001g，琼脂20.0g，蒸馏水1000mL，pH 7.2-7.4。
ISP4培养基：可溶性淀粉10.0g，(NH4)2SO4 2.0g，MgSO4·7H2O 1.0g，MnCl2·4H2O0.001g，FeSO4·7H2O 0.001g，ZnSO4·7H2O 0.001g，NaCl 1.0g，CaCO3 2.0g，琼脂20.0g，蒸馏水1000mL，pH 7.0-7.4。
ISP5培养基：L-天冬氨酸1.0g，甘油10.0g，K2HPO4 1.0g，MnCl2·4H2O 0.001g，FeSO4·7H2O 0.001g，ZnSO4·7H2O 0.001g，琼脂20.0g，蒸馏水1000mL，pH 7.0-7.4。
LB培养基：胰蛋白胨10.0g，酵母提取物5.0g，NaCl 10.0g，琼脂20.0g，蒸馏水1000mL，pH 7.2-7.4。
NA培养基：牛肉膏3.0g，蛋白胨5.0g，琼脂20.0g，蒸馏水1000mL，pH 7.2-7.4。
PDA培养基：去皮马铃薯200.0g，葡萄糖20.0g，琼脂20.0g，蒸馏水1000mL。
PSA培养基：去皮马铃薯200.0g，蔗糖20.0g，琼脂20.0g，蒸馏水1000mL。
高氏一号培养基：可溶性淀粉20.0g，NaCl0.5g，KNO3 1.0g，K2HPO4·3H2O 0.5g，MgSO4·7H2O 0.5g，FeSO4·7H2O 0.01g，琼脂20.0g，蒸馏水1000mL，pH 7.2-7.4。
链霉菌MS001在不同培养基上气生菌丝初期均为白色，后期生长出孢子堆，菌落颜色多呈现棕色和紫色，基内菌丝多表现出黄色，产黄色可溶性色素。
表1链霉菌MS001在不同培养基上的形态特征
2、链霉菌MS001形态特征
采用培养皿插片的方法在显微镜下观察链霉菌菌体及孢子的形态特征。培养结果如图2所示，其中a为菌落，b为气生菌丝，c、d为孢子链。在PDA培养基上划线接种链霉菌MS001，同时在接种位点将灭菌的盖玻片(18mm×18mm)斜插入培养基内，在菌物培养箱中28℃培养4-7d取出插片，在光学显微镜下观察其气生菌丝、孢子链和孢子的形态特征。链霉菌MS001在PDA培养基上培养6d后，单菌落圆形，直径1-1.5cm，气生菌丝生长旺盛，产生密集孢子堆，菌落棕色，产黄色可溶性色素。菌丝分枝较多，无横隔膜，孢子链形成初期2-6圈螺旋，后期孢子链伸展，孢子长圆形，表面光滑。
3、链霉菌MS001生理生化特征分析
检测了链霉菌MS001的生理生化相关指标(如表2)。菌株MS001能利用木糖、棉籽糖、L-阿拉伯糖、L-鼠李糖、果糖、葡萄糖、甘露醇、水杨苷作为碳源，其中对棉籽糖、甘露醇和水杨苷利用能力较弱，不能利用肌醇和蔗糖。菌株能使牛奶凝固与胨化，30d后不能使明胶液化，能使纤维素分解和淀粉水解，不产生硫化氢和黑色素。耐盐性结果显示，链霉菌菌株MS001在1％-7％的NaCl培养基中都能生长，菌株在7％NaCl浓度的条件下生长情况变差。从菌株生长温度测定结果显示，16-40℃菌株均能生长，22-28℃条件下生长情况良好，34℃以上温度菌株生长情况变差。
表2链霉菌MS001生理生化特征
注：+表示阳性；一表示阴性。
试验例2链霉菌MS001最适发酵条件的获得
1、最适培养基的获得
以A-F号培养基(A培养基：高氏一号液体培养基；B培养基：葡萄糖10g、蛋白胨3g、氯化钠2.5g、碳酸钙2g、水1000mL、pH 7.2-7.4；C培养基：乳糖10g、牛肉膏10g、NaCl 1g、FeSO4·7H2O 0.002g、MgSO4·7H2O 0.002g、蒸馏水1000mL、pH 7.2-7.4；D培养基：蔗糖20g、可溶性淀粉30g、蛋白胨2g、黄豆粉8g、NaCl 2g、MgSO4·7H2O 0.5g、CaCO3 3g、K2HPO4·7H2O0.5g、蒸馏水1000mL、pH 7.2-7.4；E培养基：NA液体培养基；F培养基：PDB培养基；G培养基：2％MEA液体培养基)作为基础发酵培养基。将5％链霉菌MS001种子液接入装有20mL基础发酵培养基的三角瓶(50mL)中，28℃、180r/min恒温振荡培养4d，发酵液10000r/min离心10min，无菌微孔滤膜过滤，吸5mL发酵液加入到75mL的PDA培养基中，摇匀倒3个平板，以葡萄座腔菌(B.dothidea)为病原菌做平板抑制试验，统计数据，计算抑菌率，抑菌率＝[(对照菌落直径-处理菌落直径)/(对照菌落直径-菌饼直径)]×100％。
链霉菌MS001在不同培养基中培养获得发酵液，PDA培养基经无菌发酵液处理。实验时在平板中央放置葡萄座腔菌菌饼，菌饼在不同培养基发酵液的影响下，菌丝生长速度不同。十字交叉法测量菌落直径，计算抑菌率。不同培养基对葡萄座腔菌的抑菌结果如图3所示，图中数据为平均抑菌率±标准差，字母表示数据经Duncan氏新复极差法检验在0.05水平差异显著；A、B、C、D、E、F、G培养基菌液对葡萄座腔菌的抑菌率分别为95.05±1.80％、88.28±4.75％、3.39±2.51％、98.18±0.90％、5.06±2.74％、2.28±1.16％、8.10±2.63％，不同培养基发酵液对病原菌的抑菌率D>A>B>G>E>C>F，抑菌结果差异显著性不同，其中A和D培养基发酵液抑菌率的差异显著性在同一水平，和其它培养基发酵液抑菌活性存在差异，B培养基发酵液抑菌活性低于A、D培养基，C、E、F、G培养基发酵液对病原菌抑菌活性较差。因此，A和D培养基可作为最佳发酵培养基，考虑成本、过滤难易程度等问题，发现A培养基更具优势，因此确定A(高氏一号)培养基为最适发酵培养基。
2、链霉菌菌株MS001抑菌活性最佳碳源、氮源筛选
采用单因素变量法，以高氏一号液体培养基作为基础培养液。
(1)最佳碳源筛选：改变高氏一号液体培养基中碳源成分，其他物质不变。碳源含量分别为2％的可溶性淀粉、葡萄糖、麦芽糖、木糖、果糖、阿拉伯糖和不加碳源。每瓶培养基中加入5％链霉菌MS001种子液，菌液在28℃、180r/min条件震荡培养4d，将培养好的链霉菌发酵液在10000r/min条件下离心10min，得到的上清液在超净工作台中使用无菌微孔滤膜过滤器(孔径0.22μm)进行过滤，吸取5mL无菌的链霉菌发酵液，加入到75mL的PDA培养基中，摇匀倒3个平板，以葡萄座腔菌为病原菌做平板抑制试验，统计数据，计算抑菌率。
统计不同碳源培养基中链霉菌菌株MS001所表现的抑菌活性，不同碳源发酵液对葡萄座腔菌的抑菌活性大小为可溶性淀粉>阿拉伯糖>麦芽糖>葡萄糖>果糖>不加碳源>木糖，抑菌率依次为93.69±1.52％、32.77±9.91％、29.85±4.96％、27.18±2.63％、20.87±6.36％、6.07±4.05％、5.83±4.62％，可溶性淀粉作为唯一碳源时，链霉菌MS001对葡萄座腔菌表现出的抑菌活性最好，与其它碳源发酵液抑菌率相比表现差异显著性，木糖发酵液抑菌活性最差，其次是未加碳源培养基。
(2)最佳氮源的确定：改变高氏一号液体培养基中氮源成分，其他物质不变。氮源含量分别为l％的硝酸钾、氯化铵、酵母膏、蛋白胨、黄豆粉和不加氮源，进行单因素试验。菌液在28℃、180r/min条件震荡培养4d，将培养好的溶液在10000r/min条件下离心10min，得到的上清液在超净工作台中使用无菌微孔滤膜过滤器(孔径0.22μm)进行过滤，吸取5mL无菌的链霉菌发酵液，加入到75mL的PDA培养基中，摇匀倒3个平板，以葡萄座腔菌为病原菌做平板抑制试验，统计数据，计算抑菌率。
统计不同氮源培养基对葡萄座腔菌的抑菌活性，抑菌活性分别为硝酸钾>酵母膏>黄豆粉>蛋白胨>不加氮源>氯化铵，平均抑菌率依次为93.69±1.52％、93.45±2.63％、83.01±7.37％、71.60±6.67％、57.77±7.60％、36.41±5.47％。不同氮源抑菌活性经单因素方差显著性分析，硝酸钾和酵母膏作为氮源时，链霉菌MS001抑菌活性最高，抑菌率均超过93％，这两种氮源成分的链霉菌MS001发酵液的抑菌活性不存在差异显著性，比其它氮源成分发酵液的抑菌活性高且存在显著性差异，氯化铵发酵液比未加氮源发酵液抑菌率低，抑菌活性最差。
3、菌株MS001最优发酵条件
接种量2％、4％、6％、8％、10％、15％、20％的发酵液对葡萄座腔菌的抑菌率分别为45.77±2.55％、92.59±2.42％、91.27±2.10％、93.39±1.21％、92.86±0.79％、85.71±3.64％、85.71±2.75％，随着接种量的增加，发酵液对病原菌的抑菌率出现先增加、趋于平稳、后下降的趋势。接种量为4％、6％、8％、10％时链霉菌MS001发酵液的抑菌活性不表现差异显著性，抑菌率均达到90％以上；接种量达到15％和20％，发酵液抑菌活性下降，2％接种量发酵液抑菌活性最低。从节约培养的链霉菌种子液容量考虑，菌株MS001发酵液最佳接种量为4％。
链霉菌MS001不同发酵时间对葡萄座腔菌的抑菌活性，发酵液培养2d对葡萄座腔菌抑菌率达到69.83±2.56％、4d抑菌率为92.96±1.86％、6d抑菌率为95.66±1.05％、8d抑菌率为91.48±1.84％、10d抑菌率为90.00±1.84％、15d抑菌率为85.44±1.46％、20d抑菌率为87.62±0.73％，随着菌株发酵时间的增加，发酵液对葡萄座腔菌的抑菌作用先增加后降低。其中4d、6d、8d、10d的发酵液对病原菌株的抑菌率均达到90％以上；4d和6d的抑菌活性最强，其抑菌率之间没有差异；发酵液培养8d和10d，抑菌活性略微下降，与4d和6d的抑菌活性差异显著。从节省培养时间考虑，将菌株发酵液最佳培养时间定为4d。
20℃、23℃、26℃、29℃、32℃条件下链霉菌MS001发酵液对葡萄座腔菌的抑菌率都在90％以上，抑菌活性都很强，抑菌率分别为93.44±2.47％、96.25±1.07％、96.72±0.41％、97.19±1.86％、96.25±1.07％。在23℃、26℃、29℃、32℃温度下培养，发酵液对病原菌的抑菌率不存在显著性差异，20℃时抑菌率稍低。从能源利用方面分析，23℃为最佳培养温度。
pH值3、4、5、6、7、8、9、10、11、12条件下链霉菌MS001发酵液对葡萄座腔菌(B.dothidea)的抑菌率分别为3.85±1.71％、8.92±7.76％、82.58±0.39％、92.72±1.63％、94.12±1.41％、91.08±3.88％、81.45±1.04％、9.86±2.82％、7.01±5.39％、3.39±2.83％，随着pH值的升高，发酵液抑菌活性先增加后降低。链霉菌菌株MS001不能适应极酸和极碱的环境，适宜生活pH值在5-9之间。pH等于6、7、8时，发酵液抑菌活性差异不显著，pH值为7时抑菌率最高。因此，链霉菌MS001的发酵培养最适pH值等于7。
装液量为50mL、100mL、150mL、200mL、250mL时，链霉菌菌株对葡萄座腔菌抑菌率为91.94±1.08％、92.65±1.79％、65.43±1.21％、63.33±1.21％、65.44±2.78％，随着装液量的增加，发酵液的抑菌活性先增加后减弱。在500mL三角瓶中装入50mL和100mL装液量培养菌液，对病原菌的抑菌率最高，抑菌活性差异不显著。从单位容器发酵效率考虑，将100/500mL作为最佳装液量。
综上所述，链霉菌菌株MS001最适发酵条件设置为4％接种量，装液量100/500mL、pH值等于7、23℃条件下培养4天。
试验例3链霉菌MS001发酵液抑菌广谱性
1、链霉菌MS001发酵液对3种苹果枝干病原菌的抑菌作用
高氏一号培养基中接种5％链霉菌MS001种子液，28℃、180r/min摇床培养4d，发酵液经无菌微孔滤膜过滤，获得无菌发酵液，75mL PDA培养基中分别加入7.5mL链霉菌发酵液，倒平板、冷却，在平板中央放置葡萄座腔菌、胶孢炭疽菌、苹果拟茎点霉菌饼(直径7mm)作为发酵液处理组，未加发酵液的培养基作为对照组，测量对照组、菌液处理组病原菌直径，计算抑菌率。
PDA培养基中加入7.5mL体积的链霉菌MS001发酵液，对葡萄座腔菌的抑菌率为95.21±0.00％，对胶孢炭疽菌的抑菌率为83.08±1.38％，对苹果拟茎点霉的抑菌率达到91.04±1.55％，对葡萄座腔菌、苹果拟茎点霉的抑菌作用最高，抑菌率在90％以上(如表3所示)，能很好的抑制3株苹果枝干病害病原菌菌丝的生长，见图4-6，左侧照片为对照病原，右侧照片为MS001对病原抑制效果。其中图4为对葡萄座腔菌，图5为对胶孢炭疽菌，图6为对苹果拟茎点霉。以上结果表明，链霉菌MS001发酵液对3种苹果枝干病害均具较高抑菌作用。
表3链霉菌MS001发酵液和2种农药对3种苹果枝干病害抑菌作用
2、链霉菌MS001发酵液对其它6植物病害抑菌作用
PDA培养基中加入7.5mL体积的链霉菌MS001发酵液，对番茄灰霉病菌的抑菌率达到77.60±3.67％，对南天竹炭疽病菌的抑菌率达到66.88±1.10％，对君子兰茎基腐病菌的抑菌率达到64.03±0.82％，对小麦赤霉病菌的抑菌率达到82.03±2.28％，对小麦纹枯病菌的抑菌率达到80.89±0.96％，对小麦全蚀病菌的抑菌率达到31.27±2.13％，对6种植物病原菌生长均具有抑制作用。对小麦赤霉病菌、小麦纹枯病菌的抑菌率超过80％，表现出很高抑菌活性。详见表4和图7-12，左侧照片为对照病原，右侧照片为MS001对病原抑制效果。其中，图7为对番茄灰霉病菌，图8为对南天竹炭疽病菌，图9为对君子兰茎基腐病菌，图10为对小麦赤霉病菌，图11为对小麦纹枯病菌，图12为对小麦全蚀病菌。
表4链霉菌MS001发酵液对6种植物病害抑菌作用
3、链霉菌MS001发酵液毒力的测定
随着链霉菌MS001发酵液添加量的增加，对3种苹果枝干病害和其它6株植物病原菌表现的抑菌作用越显著，病原菌菌丝生长速度越慢，计算抑菌率，利用DSP软件处理数据，不同浓度发酵液对9种病原菌毒力回归方程见表5。发酵液浓度对数与抑菌率机率值呈正相关关系，相关系数大于0.9，EC50值由小到大依次为胶孢炭疽菌、君子兰茎基腐病菌、南天竹炭疽病菌、苹果拟茎点霉、番茄灰霉病菌、葡萄座腔菌、小麦纹枯病菌、小麦赤霉病菌、小麦全蚀病菌。发酵液对胶孢炭疽菌的毒力最强，EC50值为0.1763g/L。
表5链霉菌MS001发酵液对9种病原菌菌丝生长的毒力回归方程
试验例4链霉菌MS001发酵液对植物害虫的毒力测试
1、对棉铃虫的室内毒力测定
将待测菌株在最适发酵条件下培养48h，将5mL、25mL、75mL发酵液分别与500g人工饲料中混合，充分搅拌混匀，冷却凝固后饲喂棉铃虫。对照组分别将5mL、25mL、75mL高氏一号液体培养基与500g人工饲料中混合，充分搅拌混匀。棉铃虫由本实验室饲养，将初孵棉铃虫接于混合饲料上。每处理100头，重复3次，培养6d，调查死、活虫数量，计算死亡率。统计计算发酵液处理组校正死亡率。校正死亡率＝处理组死亡率—对照组死亡率。
以初孵棉铃虫为试虫，进行杀虫活性测定，由表6可知MS001发酵液添加量在75mL时对试虫致死率达到73.4％；25mL和5mL时，对试虫致死率分别为53.6％和为52.5％。存活的对照组试虫平均体重在106-128mg之间，但75mL、25mL和5mL处理组存活的试虫体重分别为6mg、19.5mg和34mg。结果表明发酵液对试虫具有很强的毒杀活性，未死亡的试虫体重增长受到显著的抑制作用。
表6链霉菌MS001发酵液对棉铃虫初孵幼虫的杀虫活性
2、对松褐天牛幼虫的室内毒力测定
将菌株MS001在最适发酵条件下培养48h，实验组1：每30头饲料量加5mL发酵液+25mL蒸馏水同饲料混匀分装；实验组2：每30头饲料量加15mL发酵液+15mL蒸馏水混匀分装；实验组3：每30头饲料量加30mL发酵液混匀分装；对照组：每30头饲料量加30mL蒸馏水混匀分装。松褐天牛幼虫由本实验室饲养，将初孵幼虫接于混合饲料上。每处理100头，重复3次，培养6d，调查死、活虫数量，计算死亡率。统计计算发酵液处理组校正死亡率。校正死亡率＝处理组死亡率—对照组死亡率。
以初孵松褐天牛幼虫为试虫，进行杀虫活性测定，由表7统计结果可知MS001发酵液添加量在30mL时对试虫致死率达到73.2％；15mL和5mL时，对试虫致死率分别为37.8％和为7.9％，发酵液对松褐天牛幼虫具有很强的毒杀活性。
表7链霉菌MS001发酵液对松褐天牛初孵幼虫的杀虫活性
本发明中从新疆野苹果枝干中分离得到一株具的内生链霉菌(Streptomycessp.)MS001，中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M 2019266。鉴定了其菌落培养特征、形态观察、理化性质。发酵条件优化结果确定最佳发酵培养基为高氏一号培养基，最佳碳源为可溶性淀粉，最佳氮源为硝酸钾；培养基中加入5％种子液，在23℃、pH等于7、装液量100/500mL条件培养4d为最优发酵条件，发酵液对3株苹果枝干病害和6株其它植物病原菌均具有抑菌活性，抑菌活性强，且抑菌对象具广谱性，可以防治苹果树、园林植物、蔬菜、和粮食作物上的一些病害。发酵液饲喂棉铃虫和松褐天牛幼虫毒力测定表明，链霉菌MS001对这两种试虫均表现出毒杀活性。
<110> 河南科技大学
<120> 具有防病杀虫双重作用的链霉菌及其应用、培养方法、生防菌剂
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<211> 500
<212> DNA
<213> 小麦纹枯病菌
<221> ITS rDNA
<400> 1
gcttggagga ctttattgga ctccttctgt ctacttaatc cacacaaact caatttattt 60
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<212> DNA
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<400> 3
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gtctatgtca gtaatggcag gctctaaaat cagtggcggc gccgctgggt cctgaacgta 420
gtaatatctc tcgttacagg ttctcggtgt gcttctgcca aaacccaaat ttttctatgg 480
ttgacctcgg atcaggtagg gatacccgct gaacttaagc atatcaataa gcggaggaaa 540
<211> 525
<212> DNA
<213> 小麦赤霉病菌
<221> ITS rDNA
<400> 4
gctaggagcg gaggacatta ccgagtttca actcccaaac ccctgtgaac ataccttatg 60
ttgcctcggc ggatcagccc gcgccccgta aaaagggacg gcccgccgca ggaaccctaa 120
actctgtttt tagtggaact tctgagtata aaaaacaaat aaatcaaaac tttcaacaac 180
ggatctcttg gttctggcat cgatgaagaa cgcagcaaaa tgcgataagt aatgtgaatt 240
gcagaattca gtgaatcatc gaatctttga acgcacattg cgcccgccag tattctggcg 300
ggcatgcctg ttcgagcgtc atttcaaccc tcaagcccag cttggtgttg ggagctgcag 360
tcctgctgca ctccccaaat acattggcgg tcacgtcgag cttccatagc gtagtaattt 420
acacatcgtt actggtaatc gtcgcggcca cgccgttaaa ccccaacttc tgaatgttga 480
cctcggatca ggtaggaata cccgctgaac ttaagcatat caaaa 525
Claims (10)
1.具有防病杀虫双重作用的链霉菌，其特征在于：该菌株为链霉菌（Streptomyces sp.）MS001，保藏编号为CCTCC NO:M 2019266。
2.如权利要求1所述的具有防病杀虫双重作用的链霉菌在拮抗植物致病菌中的应用。
3.根据权利要求2所述的具有防病杀虫双重作用的链霉菌在拮抗植物致病菌中的应用，其特征在于：所述植物致病菌为葡萄座腔菌、胶孢炭疽菌、和/或苹果拟茎点霉。
4.根据权利要求2所述的具有防病杀虫双重作用的链霉菌在拮抗植物致病菌中的应用，其特征在于：所述植物致病菌为小麦纹枯病菌、小麦全蚀病菌、番茄灰霉病菌、小麦赤霉病菌、君子兰茎基腐病菌、和/或南天竹炭疽病菌。
5.如权利要求1所述的具有防病杀虫双重作用的链霉菌在抑制植物害虫中的应用。
6.根据权利要求5所述的具有防病杀虫双重作用的链霉菌在抑制植物害虫中的应用，其特征在于：所述植物害虫为棉铃虫。
7.根据权利要求5所述的具有防病杀虫双重作用的链霉菌在抑制植物害虫中的应用，其特征在于：所述植物害虫为松褐天牛幼虫。
8.如权利要求1所述的具有防病杀虫双重作用的链霉菌的培养方法，其特征在于：在培养所述链霉菌时，使用高氏一号培养基或PDA培养基。
9.根据权利要求8所述的具有防病杀虫双重作用的链霉菌的培养方法，其特征在于：所述培养的条件为：温度20-32℃，pH=5-9。
10.一种具有防病杀虫双重作用的生防菌剂，其特征在于：包括生防菌和辅料，所述生防菌为链霉菌（Streptomyces sp.）MS001，保藏编号为CCTCC NO:M 2019266。
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