CN110025830B - 一种缓释抑菌型人工真皮模型及其构建方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种缓释抑菌型人工真皮模型及其构建方法，包括：硅胶膜，设置于硅胶膜下的支架层，设置于硅胶膜与支架层之间的缓释层；构建方法如下：缓释层选用生物纤维素膜，通过真空干燥将膨胀状态的生物纤维素膜制成致密的生物纤维素薄膜，同时使抑菌剂保留在生物纤维素薄膜内部，再将生物纤维素薄膜平铺于模具底部与胶原蛋白等支架成分一起冻干，融为一体；最后将其与硅胶膜进行粘合，形成最终的模型；缓释层的设计不仅可负载抑菌剂而且可调控抑菌剂的释放速度，确保抑菌剂稳定均匀的释放，避免使用人工真皮的过程中出现感染或中毒现象。

Description

一种缓释抑菌型人工真皮模型及其构建方法
技术领域
本发明涉及皮肤组织工程领域，特别是一种缓释抑菌型人工真皮模型及其构建方法。
背景技术
皮肤包在人体表面，直接同外界环境接触，具有保护、排泄、调节体温和感受外界刺激等作用的一种器官，是人的身体器官中最大的器官。临床上各种类型的皮肤缺损创面十分常见，目前用于创面治疗的真皮替代物主要有：人工真皮、脱细胞异体皮、含有活性细胞的组织工程的人工真皮等。人工真皮类产品原来来源广泛、产品易于储运、产品临床效果显著且产品安全性较高，目前占据市场主流地位。
用于创面修复的人工真皮通常需要在创面上停留10-30天，在此期间创面可能会出现感染。现有抑菌型人工真皮，为两层结构(如图1)，抑菌剂被直接加入到支架材料中，不具备缓释功能；抑菌剂直接与支架材料混合，导致产品使用前期抑菌剂释放浓度高，抑菌效果好，而在创面修复中后期，部分抑菌剂被代谢掉后浓度变低，抑菌效果变差；且初始过高的抑菌剂浓度可能会对创面或人体带来一定的毒性作用。
胶原作为细胞外基质中主要的成分之一，被广泛用于皮肤组织工程。胶原基支架具有良好的生物相容性、合适的多孔结构以及极低的免疫原性，但是胶原蛋白只提供支架的微孔结构，没有抗感染及促进创面修复的功能。因此，有必要在现有人工真皮的基础上开发一种具有缓释抑菌功能的人工真皮模型用于皮肤组织工程领域。
发明内容
为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种缓释抑菌型人工真皮模型及其构建方法，支架层和硅胶膜层之间增加一层缓释层，缓释层的设计不仅可负载抑菌剂而且可调控抑菌剂的释放速度，确保抑菌剂稳定均匀的释放，避免使用人工真皮的过程中出现感染或中毒现象。
为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：
一种缓释抑菌型人工真皮模型，包括：硅胶膜，设置于硅胶膜下的支架层，设置于硅胶膜与支架层之间的缓释层。
一种缓释抑菌型人工真皮模型的构建方法，包括如下步骤：
步骤一，构建缓释层；
取生物纤维素膜，将其浸泡于抑菌剂中；
将膨胀状态的生物纤维素膜进行预冻；
预冻后冻干成为不完全冻干薄膜；
再将不完全冻干薄膜干燥，使其表面完全干燥，得到缓释层；
步骤二，构建支架-缓释层复合物；
制备得到胶原溶液，在胶原溶液中加入交联剂，搅拌均匀；
用水喷于冻干盘底部，形成一层雾状水滴，再将缓释层平铺于冻干模具内；
再将胶原溶液浇注于模具内，流平后进行预冻；
预冻后，真空冷冻干燥，得到支架-缓释层复合物；
步骤三，在支架-缓释层复合物上粘合硅胶膜；
步骤四，包装，灭菌。
前述的一种缓释抑菌型人工真皮模型的构建方法，若抑菌剂为可溶性成分，选择密度范围5-10mg/cm3，厚度为1-2cm的生物纤维素膜。
前述的一种缓释抑菌型人工真皮模型的构建方法，若抑菌剂为纳米级颗粒，选择密度范围5-10mg/cm3，厚度范围0.5-1cm的生物纤维素膜。
前述的一种缓释抑菌型人工真皮模型的构建方法，若抑菌剂为微米级颗粒，选择密度范围1-5mg/cm3，厚度范围1-1.5cm的生物纤维素膜。
前述的一种缓释抑菌型人工真皮模型的构建方法，
步骤一，构建缓释层；
抑菌剂选用硝酸银；
取密度为10mg/cm3，厚度为1.5cm±0.1cm的生物纤维素膜，将其浸泡于浓度为5％的硝酸银溶液中10小时；
将膨胀状态的生物纤维素膜在-20℃下进行预冻；
预冻后转入真空冷冻干燥机，冻干10小时，成为不完全冻干薄膜，厚度为0.5-1mm；
再将不完全冻干薄膜在30℃下干燥24小时，使其表面完全干燥，得到缓释层。
前述的一种缓释抑菌型人工真皮模型的构建方法，
步骤一，构建缓释层；
抑菌剂选用纳米银颗粒；
取干重为5mg/cm3，厚度为0.8cm±0.1cm的湿态生物纤维素膜，将其浸泡于浓度为10％的纳米银悬浊液中浸泡10小时；
将膨胀状态的生物纤维素膜在-20℃下进行预冻；
预冻后转入真空冷冻干燥机，冻干10小时，成为不完全冻干薄膜，厚度为0.5-1mm；
再将不完全冻干薄膜在30℃下干燥24小时，使其表面完全干燥，得到缓释层。
前述的一种缓释抑菌型人工真皮模型的构建方法，
步骤一，构建缓释层；
抑菌剂选用磷酸锆钠银；
取干重为2mg/cm3，厚度为1.2cm±0.1cm，孔隙大小为微米级的湿态生物纤维素膜，将其浸泡于粒径小于10μm，浓度为5％的磷酸锆钠银悬浊液中，浸泡时长24小时；
将膨胀状态的生物纤维素膜在-20℃下进行预冻；
预冻后转入真空冷冻干燥机，冻干10小时，成为不完全冻干薄膜，厚度为0.5-1mm；
再将不完全冻干薄膜在30℃下干燥24小时，使其表面完全干燥，得到缓释层。
前述的一种缓释抑菌型人工真皮模型的构建方法，
步骤二，构建支架-缓释层复合物；
制备得到500ml浓度为0.5％的胶原溶液，在胶原溶液中加入质量分数为0.005％的甲醛，4℃下搅拌4小时；
使用喷雾器，将注射用水喷于冻干盘底部，形成一层雾状水滴，再将缓释层平铺于冻干模具内；
再将胶原溶液浇注于模具内，高度为3mm，流平后进行预冻；
在-20℃下预冻4小时，再真空冷冻干燥24小时，得到支架-缓释层复合物。
前述的一种缓释抑菌型人工真皮模型的构建方法，
步骤三，在支架-缓释层复合物上粘合硅胶膜；
利用涂布器在硅橡胶膜上涂上一层用于粘合的硅凝胶，厚度为0.1mm，在其固化前，将支架-缓释层复合物放置在硅凝胶上，缓释层与硅凝胶进行粘合；
再在支架层的表面上施加20g/cm2的压力，使支架-缓释层完全与硅胶膜粘合牢固。
本发明的有益之处在于：
支架层和硅胶膜层之间增加一层缓释层，缓释层中可负载抑菌剂且可调控抑菌剂的释放速度，确保抑菌剂在整个治疗周期内持续平稳的释放，避免使用人工真皮的过程中出现创面感染或短时间内抑菌剂浓度过高造成的细胞毒性；
缓释层由纳米级的生物纤维素膜制成，可负载水溶性物质或微溶性粉末颗粒，有助于抑菌剂选择的多样化；
可根据不同的抑菌剂选择不同的生物纤维素膜，确保生物纤维膜可以充分吸附抑菌剂以及持续平稳的释放。
附图说明
图1是传统人工真皮结构示意图；
图2是本发明的人工真皮模型结构示意图；
图3是本发明的缓释层在电镜下的微观结构；
图4是本发明的湿润膨胀状态生物纤维素膜在电镜下的微观结构；
图5是本发明的薄膜状生物纤维素膜在电镜下的微观结构；
图6是本发明的海绵层在电镜下的微观结构；
图7是本发明的实验一的结果示意图。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。
如图2所示，一种缓释抑菌型人工真皮模型，包括：硅胶膜，设置于硅胶膜下的支架层，设置于硅胶膜与支架层之间的缓释层。
一种缓释抑菌型人工真皮模型的构建方法，包括如下步骤：
步骤一，构建缓释层；
取生物纤维素膜，将其浸泡于抑菌剂中；
将膨胀状态的生物纤维素膜进行预冻；
预冻后冻干成为不完全冻干薄膜；
再将不完全冻干薄膜干燥，使其表面完全干燥，得到缓释层；
步骤二，构建支架-缓释层复合物；
制备得到胶原溶液，在胶原溶液中加入交联剂，作为一种实施例，交联剂包括，甲醛、戊二醛、京尼平；搅拌；
用水喷于冻干盘底部，形成一层雾状水滴，再将缓释层平铺于冻干模具内；
再将胶原溶液浇注于模具内，流平后进行预冻；
预冻后，真空冷冻干燥，得到支架-缓释层复合物；
步骤三，在支架-缓释层复合物上粘合硅胶膜；
步骤四，将制得的产品装入铝箔袋中进行包装，然后进行辐照灭菌。
根据抑菌剂的溶解性和粒径选择合适的生物纤维素膜；
若抑菌剂为可溶性成分，选择密度范围5-10mg/cm3，厚度为1-2cm的生物纤维素膜。
若抑菌剂为纳米级颗粒，选择密度范围5-10mg/cm3，厚度范围0.5-1cm的生物纤维素膜。
若抑菌剂为微米级颗粒，选择密度范围1-5mg/cm3，厚度范围1-1.5cm的生物纤维素膜。
实施例1：
抑菌剂选用可溶性成分的一种实施例-硝酸银；
步骤一，缓释层的构建：
由于硝酸银为水溶性无机盐，当缓释层遇水以后银离子变为游离态，在浓度差的驱动下透过纤维素薄膜致密的纤维结构，到达创面从而起到持续杀菌的作用。因而，本实施例需选择一种密度较大且较厚的生物纤维素膜，以确保银离子的缓慢释放。
取密度为10mg/cm3，厚度为1cm左右的生物纤维素膜，将其浸泡于浓度为5％的硝酸银溶液中10小时，使其充分吸收硝酸银。将膨胀状态的生物纤维素膜于-20℃预冻，后转入真空冷冻干燥机，冻干10小时，使其不完全冻干而成为厚度约为1mm的薄膜，使得薄膜表面形成一层致密的纤维层从而控制银离子的释放。再将该生物纤维素膜于30℃干燥24小时，使其表面完全干燥。
步骤二，支架-缓释层复合物的构建；
称取胶原溶于水，制备得到500ml浓度为0.5％的胶原溶液，在胶原溶液中加入质量分数为0.005％的甲醛，4℃下搅拌4小时，使其分散均匀充分交联。
使用喷雾器，将注射用水喷于冻干盘底部，形成一层雾状水滴。然后将缓释层平铺于冻干模具内。然后将胶原溶液浇注于模具内，高度为3mm，流平后转入冻干机中进行预冻。在-20℃下预冻4小时，然后真空冷冻干燥24小时，得到支架-缓释层复合物。
步骤三，
利用涂布器在一种高强度硅橡胶膜上涂上一层用于粘合的硅凝胶，厚度为0.1mm。在其固化前，将支架-缓释层复合物放置在硅凝胶上，缓释层与硅凝胶进行粘合。再于海绵层上施加20g/cm2的压力，使支架-缓释层完全与硅胶膜粘合牢固。
步骤四，
将制得的产品装入铝箔袋中进行包装，然后进行辐照灭菌。
取本实施例中制备得到的胶原支架层进行电镜扫描，从图6中可以看出制备得到的胶原支架层呈三维多孔结构，孔径大致分布在50-200微米之间。如图3所示，缓释层呈纳米级纤维结构，纤维之间负载有硝酸银颗粒。
实施例2；
抑菌剂选用微米级颗粒的一种实施例-磷酸锆钠银；
步骤一，缓释层的构建；
由于磷酸锆钠银的粒径较大为微米级，因而需选择密度较低厚度适中的生物纤维素膜。以确保磷酸锆钠银颗粒可以均匀地吸附于生物纤维素膜内。当生物纤维素膜由膨胀状态变成薄膜态后，生物纤维素膜的孔隙为从微米级变为纳米级，从而使得磷酸锆钠银颗粒被包裹于生物纤维素膜之间。由于生物纤维具有吸液的功能，当体液进入缓释层后，磷酸锆钠银所负载的银离子即进入体液成为游离态，从而可透过细菌纤维素膜进入创面，同时由于孔隙变为纳米级，从而有效的控制了银离子从缓释层中的释放速度。
取干重为2mg/cm3，厚度为1.2cm±0.1cm左右的孔隙大小为微米级的湿态生物纤维素膜如图4，将其浸泡于粒径小于10μm，浓度为5％的磷酸锆钠银悬浊液中浸泡24小时，使得磷酸锆钠银颗粒吸附于纤维素的孔隙之间。将上述膨胀状态的生物纤维素膜于-20℃预冻，后转入真空冷冻干燥机，冻干10小时，使其不完全冻干而成为薄膜状如图5。再将该生物纤维素膜于30℃干燥24小时，使其表面完全干燥。
步骤二，支架-缓释层复合物的构建；
称取一定量的胶原溶于水，制备得到500ml浓度为0.5％的胶原溶液，在胶原溶液中加入质量分数为0.001％的戊二醛，4℃下搅拌4小时，使其分散均匀充分交联。
使用喷雾器，将注射用水喷于冻干盘底部，形成一层雾状水滴。然后将缓释层平铺于冻干模具内。然后将胶原溶液浇注于模具内，高度为3mm，流平后转入冻干机中进行预冻。在-20℃下预冻4小时，然后真空冷冻干燥24小时，得到支架-缓释层复合物。
步骤三，
利用涂布器在一种高强度硅橡胶膜上涂上一层用于粘合的硅凝胶，厚度为0.1mm。在其固化前，将支架-缓释层复合物放置在硅凝胶上，缓释层与硅凝胶进行粘合。再于海绵层上施加20g/cm2的压力，使支架-缓释层完全与硅胶膜粘合牢固。
为了方便与负压引流技术联合使用，进一步，再使用打孔模具，在其表面均匀的打上长约2-3mm的狭缝，得到开孔性样品。
步骤四，
将制得的产品装入铝箔袋中进行包装，然后进行辐照灭菌。
取本实施例中制备得到的缓释抑菌型人工真皮，由于具有分布均匀的狭缝，因而还具有联合负压引流和排出渗液的作用。
实施例3，
抑菌剂选用纳米级颗粒的一种实施例-纳米银颗粒；
步骤一，缓释层的构建；
本实施例选用纳米银颗粒为抑菌剂，兼顾纳米银的吸附与释放。本实施例选择密度适中，厚度较厚的生物纤维素膜作为缓释层。
取干重为5mg/cm3，厚度为0.8cm±0.1cm左右的湿态生物纤维素膜，将其浸泡于浓度为10％的纳米银悬浊液中浸泡10小时，使其充分吸收纳米银。将上述膨胀状态的生物纤维素膜于-20℃预冻，后转入真空冷冻干燥机，冻干10小时，使其不完全冻干而成为厚度为1mm左右的薄膜状，从而使纳米银颗粒被包裹于纤维素之间。再将该生物纤维素膜于30℃干燥24小时，使其表面完全干燥。当缓释层接触体液时，纤维素内部被润湿，纳米银在浓度差的驱动下向创面缓慢释放，从而起到缓释的作用。
步骤二，支架-缓释层复合物的构建；
称取一定量的胶原溶于水，制备得到500ml浓度为0.5％的胶原溶液，在胶原溶液中加入质量分数为0.01％的京尼平，4℃下搅拌4小时，使其分散均匀充分交联。
使用喷雾器，将注射用水喷于冻干盘底部，形成一层雾状水滴。然后将缓释层平铺于冻干模具内。然后将胶原溶液浇注于模具内，高度为3mm，流平后转入冻干机中进行预冻。在-20℃下预冻4小时，然后真空冷冻干燥24小时，得到支架-缓释层复合物。
步骤三，
利用涂布器在一种高强度硅橡胶膜上涂上一层用于粘合的硅凝胶，厚度为0.1mm。在其固化前，将支架-缓释层复合物放置在硅凝胶上，缓释层与硅凝胶进行粘合。再于支架层的表面上施加20g/cm2的压力，使支架-缓释层完全与硅胶膜粘合牢固。
步骤四，
将制得的产品装入铝箔袋中进行包装，然后进行辐照灭菌。
△实验一，取实施例1制得的样品，放入磷酸盐缓冲液中，测定银离子释放度。
取实施例1制得的样品和现有技术方法(将硝酸银与胶原蛋白混合冻干)所制得的样品，进行银离子溶出度测试。
具体测试方法如下：1、参照2015版《中国药典》四部0931溶出度与释放度测定法，所述方法进行模拟溶出试验。2、溶出介质为pH7.4的磷酸盐缓冲液。3、使用ICP-MS对释放到缓冲液中的银离子进行检测。4、每隔5天取样，测试缓冲液中银离子浓度。5、第n天银离子释放度Q计算公式如下：
Qn＝CnV-Cn-5V
Cn表示第n天银离子浓度；
Cn-5表示第n-5天银离子浓度；
V表示缓冲液体积。
测试结果见表1，图7。
表1银离子溶出度
Figure BDA0002045779260000081
结果分析：本发明相比现有技术的敷料，抑菌剂的释放度要均匀稳定。
本发明提供一种缓释抑菌型人工真皮模型及其构建方法，支架层和硅胶膜层之间增加一层缓释层，缓释层中可负载抑菌剂且可调控抑菌剂的释放，确保抑菌剂稳定均匀的释放，避免使用人工真皮的过程中出现感染或中毒现象。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本行业的技术人员应该了解，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。

Claims (3)

1.一种缓释抑菌型人工真皮模型的构建方法，其特征在于，缓释抑菌型人工真皮模型，包括：硅胶膜，设置于所述硅胶膜下的支架层，设置于所述硅胶膜与支架层之间的缓释层；构建方法包括如下步骤：
步骤一，构建缓释层；
若抑菌剂选用硝酸银；
取密度为10mg/cm3，厚度为1.5cm±0.1cm的生物纤维素膜，将其浸泡于浓度为5%的硝酸银溶液中10小时；
将膨胀状态的生物纤维素膜在-20℃下进行预冻；
预冻后转入真空冷冻干燥机，冻干10小时，成为不完全冻干薄膜，厚度为0.5-1mm之间；
再将不完全冻干薄膜在30℃下干燥24小时，使其表面完全干燥，得到缓释层；
若抑菌剂选用纳米银颗粒；
取干重为5mg/cm3，厚度为0.8cm±0.1cm的湿态生物纤维素膜，将其浸泡于浓度为10%的纳米银悬浊液中浸泡10小时；
将膨胀状态的生物纤维素膜在-20℃下进行预冻；
预冻后转入真空冷冻干燥机，冻干10小时，成为不完全冻干薄膜，厚度为0.5-1mm；
再将不完全冻干薄膜在30℃下干燥24小时，使其表面完全干燥，得到缓释层；
若抑菌剂选用磷酸锆钠银；
取干重为2mg/cm3，厚度为1.2cm±0.1cm，孔隙大小为微米级的湿态生物纤维素膜，将其浸泡于粒径小于10μm，浓度为5%的磷酸锆钠银悬浊液中，浸泡时长24小时；
将膨胀状态的生物纤维素膜在-20℃下进行预冻；
预冻后转入真空冷冻干燥机，冻干10小时，成为不完全冻干薄膜，厚度为0.5-1mm；
再将不完全冻干薄膜在30℃下干燥24小时，使其表面完全干燥，得到缓释层；
步骤二，构建支架-缓释层复合物；
制备得到胶原溶液，在胶原溶液中加入交联剂，搅拌均匀；
用水喷于冻干盘底部，形成一层雾状水滴，再将缓释层平铺于冻干模具内；
再将胶原溶液浇注于模具内，流平后进行预冻；
预冻后，真空冷冻干燥，得到支架-缓释层复合物；
步骤三，在支架-缓释层复合物上粘合硅胶膜；
步骤四，包装，灭菌。
2.根据权利要求1所述的一种缓释抑菌型人工真皮模型的构建方法，其特征在于，
步骤二，构建支架-缓释层复合物；
制备得到500ml浓度为0.5%的胶原溶液，在胶原溶液中加入质量分数为0.005%的甲醛，4℃下搅拌4小时；
使用喷雾器，将注射用水喷于冻干盘底部，形成一层雾状水滴，再将缓释层平铺于冻干模具内；
再将胶原溶液浇注于模具内，高度为3mm，流平后进行预冻；
在-20℃下预冻4小时，再真空冷冻干燥24小时，得到支架-缓释层复合物。
3.根据权利要求1所述的一种缓释抑菌型人工真皮模型的构建方法，其特征在于，
步骤三，在支架-缓释层复合物上粘合硅胶膜；
利用涂布器在硅橡胶膜上涂上一层用于粘合的硅凝胶，厚度为0.1mm，在其固化前，将支架-缓释层复合物放置在硅凝胶上，缓释层与硅凝胶进行粘合；
再在支架层的表面上施加20g/cm2的压力，使支架-缓释层完全与硅胶膜粘合牢固。
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