CN110025566A

CN110025566A - 基于干细胞培养上清液的化妆品及其应用

Info

Publication number: CN110025566A
Application number: CN201910411793.9A
Authority: CN
Inventors: 董健伸
Original assignee: Sanyang Health Technology Co Ltd
Current assignee: Sanyang Health Technology Co.,Ltd.
Priority date: 2019-05-16
Filing date: 2019-05-16
Publication date: 2019-07-19

Abstract

本发明公开了基于干细胞培养上清液的化妆品及其应用，其制备方法包括以下步骤：将原代干细胞接种于第一培养基中，原代培养，隔天换液，当原代脂肪干细胞生长至90%时，去除上清液，然后漂洗，得到传代干细胞；再将传代干细胞接种于第二培养基中，传代培养后进行离心分离，得到上清液；然后将上清液过滤除菌后，得到基于干细胞培养上清液的化妆品。本发明的化妆品有利于肌肤排出新陈代谢产物和累积的油脂类物质，面膜中的水分渗入表皮的角质层，皮肤变得柔软，肌肤自然光亮有弹性。

Description

基于干细胞培养上清液的化妆品及其应用

技术领域

本发明属于化妆品技术领域，具体涉及基于干细胞培养上清液的化妆品及其应用。

背景技术

传统的美白化妆品对人体的美白效果往往不是太好，内部含有的成分会对皮肤造成损害，并且美白效果不持久，多为暂时性的，美白效果不佳且价格昂贵。在人们追求天然的当下，化妆品已然成了一个与生物密不可分的行业，打着“细胞”概念的化妆品逐渐增多；细胞提取物作为化妆品原料，其所需技术相对普通化妆品成分而言更加复杂，需要投入更多并需要专业的环境、专业的技术团队进行操作。

发明内容

本发明公开了基于干细胞培养上清液的化妆品，没有外源性动物成分而更安全，而且呈现丰富的细胞因子，对皮肤美白、保湿有效果，可以直接作为化妆品使用，或者作为化妆品原料制备其他化妆品。

本发明采用如下技术方案：

基于干细胞培养上清液的化妆品，其制备方法包括以下步骤：将原代干细胞接种于第一培养基中，原代培养，隔天换液，当原代脂肪干细胞生长至90%时，去除上清液，然后漂洗，得到传代干细胞；再将传代干细胞接种于第二培养基中，传代培养后进行离心分离，得到上清液；然后将上清液过滤除菌后，得到基于干细胞培养上清液的化妆品。

本发明制备的基于干细胞培养上清液的化妆品可以直接作为化妆品使用，也可以作为原料与常规化妆品辅料配置成多种功能的水剂、凝胶、膏剂、粉剂、乳液等化妆用产品。细胞在培养过程中，产生多种细胞因子并分泌于培养上清液中，这些细胞因子通过直接或间接的方式产生作用，提供活性，多种细胞因子之间相互影响、相互作用，皮肤分泌物的成分也影响细胞分泌物的作用；各种细胞因子的作用并不是孤立存在的，它们之间通过合成分泌的相互调节、受体表达的相互调控、生物学效应的相互影响等复杂交互作用而组成细胞因子网络 (Cytokine network)，相比单一细胞因子，细胞自然产生的混合细胞因子则可能取得无法预料的技术效果。本发明基于干细胞培养上清液的化妆品含有多种细胞因子，绝对含量不高，但生物活性极高，对多种细胞生理功能和代谢活动发挥生物调节作用，直接、间接地影响多种类型细胞的生长、分裂、分化、增殖和迁移，在美容护肤、伤口修复与愈合中有重要作用，效果持久，解决了现有技术美白化妆品在极短的时间内使皮肤变白，一旦停用，皮肤立即变得更黑，色素反弹，皱纹加深的问题。

本发明还公开了一种基于干细胞培养上清液的化妆膜，其制备方法包括以下步骤：将原代干细胞接种于第一培养基中，原代培养，隔天换液，当原代脂肪干细胞生长至90%时，去除上清液，然后漂洗，得到传代干细胞；再将传代干细胞接种于第二培养基中，传代培养后进行离心分离，得到上清液；然后将上清液过滤除菌后冻干，得到上清液冻干粉；然后将上清液冻干粉与甘油、无菌水混合后加入汉生胶，得到化妆膜液；最后将面膜纸浸渍化妆膜液，得到基于干细胞培养上清液的化妆膜。

本发明还公开了一种基于干细胞培养上清液的化妆膜液，其制备方法包括以下步骤：将原代干细胞接种于第一培养基中，原代培养，隔天换液，当原代脂肪干细胞生长至90%时，去除上清液，然后漂洗，得到传代干细胞；再将传代干细胞接种于第二培养基中，传代培养后进行离心分离，得到上清液；然后将上清液过滤除菌后冻干，得到上清液冻干粉；然后将上清液冻干粉与甘油、无菌水混合后加入汉生胶，得到基于干细胞培养上清液的化妆膜液。

本发明中，化妆膜液组成合理，弥补卸妆与洗脸仍然不足的清洁工作，实现其它的保养功能，例如补水保湿、美白、抗衰老、平衡油脂等；面膜纸为现有技术，比如无纺布、蚕丝面膜、生物纤维面膜、不织布面膜、超导膜面膜，利用化妆膜液制备的化妆膜可以为面膜也可以为面积小或者大的其他部位皮肤用膜，在短时间内阻隔皮肤与外界环境接触，以使皮肤表面温度提高，毛孔松开，皮脂软化以及使老化角质松动，达到清洁作用，同时使营养成份加速渗透到皮肤，水份充盈角质层，达到补水营养的目的，促进汗腺分泌与新陈代谢，使肌肤的含氧量上升，有利于肌肤排除表皮细胞新陈代谢的产物和累积的油脂类物质，面膜中的水分渗入表皮的角质层，皮肤变得柔软，肌肤自然光亮有弹性。

本发明中，原代干细胞是指没有经过培养的干细胞，来源于人体组织，比如脂肪，可以将新鲜的脂肪标本（人体脂肪）用磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗三次，于无菌操作台上用无菌剪刀剪碎，加入等体积0.2%胶原酶I，置于37℃的水浴锅中消化1.5个小时，再加入等体积的培养基终止消化，1500转离心5分钟，去除上清得到原代脂肪干细胞；原代干细胞接种于第一培养基中的密度为10⁶个/ml；第一培养基为含10%胎牛血清(FBS)的DMEM/F12培养基，含有促细胞增殖的各种生长因子和其他多种有利于细胞生存的物质；隔天换液为现有术语；原代培养在37℃、5%CO₂的培养箱中进行；漂洗为采用生理盐水连续漂洗2遍；传代干细胞接种于第二培养基中的密度为10⁵个/ml；第二培养基为添加维生素E以及肝细胞生长因子的无血清MSC培养基(ScienCell公司)；传代培养在37℃、5%CO₂的培养箱中进行；传代培养的时间为7天；离心分离为1200rpm离心5分钟；过滤除菌的滤膜为0.1微米。优选的，第二培养基中，根据添加量，维生素E为8μL/L，肝细胞生长因子30μg/L。

本发明中，将上清液过滤除菌之前先对上清液进行3000rpm离心处理10分钟，进一步去除杂质。

本发明中，上清液冻干粉、甘油、无菌水、汉生胶的用量比为8mg∶0.02 mL ∶9mL∶0.02g。

本发明中，浸渍时间为2分钟，本发明的基于干细胞培养上清液的化妆膜液对于现有面膜纸具有优异的浸润性能，可以较为均匀、高含量的吸附于面膜纸上。

本发明进一步公开了基于干细胞培养上清液的化妆品在制备皮肤用化妆产品中的应用。

本发明公开的干细胞培养上清液安全，富含多种细胞因子与营养物质，对改善、保持皮肤有明显效果；首先采用第一培养基提高干细胞增殖活力，然后采用无血清的第二培养基继续培养，在收获干细胞分泌因子的同时保证上清液安全，并且通过限定添加维生素E以及肝细胞生长因子获得补水、美白效果不错的化妆品原料。

本发明的基于干细胞培养上清液使皮肤毛细血管扩张，加速血液循环，增强细胞活力，可提高机体免疫能力，还可使血液中氧合血红蛋白释放更多的氧，以供应给组织细胞，同时，还可使细胞组织活性增强，并可改善微循环，促进皮肤成纤维细胞生长，促进胶原蛋白合成，延缓皮肤衰老。

附图说明

图1为原代细胞照片；

图2为传代培养的细胞照片。

具体实施方式

实施例一

新鲜的脂肪标本（人体脂肪）用磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗三次，于无菌操作台上用无菌剪刀剪碎，加入等体积0.2%胶原酶I，置于37℃的水浴锅中消化1.5个小时。加入等体积的培养基终止消化，1500转离心5分钟。去除上清，得到原代脂肪干细胞，用含10%胎牛血清(FBS，体积分数)的DMEM/F12培养基将细胞重悬，按细胞密度10⁶个/ml在培养皿中进行接种，然后于37℃，5%CO₂的培养箱中进行原代培养，隔天换液。当原代细胞生长至90%时，进行传代培养，去除培养皿中的上清液，加入生理盐水连续漂洗2遍，去除上清液，得到传代干细胞，用第二培养基为添加维生素E以及肝细胞生长因子的无血清MSC培养基（ScienCell公司），维生素E以及肝细胞生长因子的添加量为：维生素E为8μL/L，肝细胞生长因子30μg/L。将细胞重悬，按细胞密度10⁵个/mL在培养皿中进行接种，然后于37℃，5%CO₂的培养箱中进行传代培养；传代培养7天后，1200rpm离心5分钟，再将得到的上清液进行3000rpm离心处理10分钟，再取上清液用0.1微米的滤膜过滤除菌，即得到基于干细胞培养上清液的化妆品；可以直接作为水剂化妆品，也可以与其他组分配制成水剂化妆品，还可以于冷冻干燥制成冻干粉，溶酶复溶后使用。在上清液中含有多种细胞生长因子，使用ELISA法检测确定其中包含VEGF、PDGF、HGF、bFGF等。

实施例二

将实施例一的冻干粉与甘油、无菌水混合后加入汉生胶，搅拌均匀得到化妆膜液；冻干粉、甘油、无菌水、汉生胶的用量比为38mg∶0.02 mL ∶9mL∶0.02g。

将面膜纸浸渍化妆膜液2分钟，取出得到基于干细胞培养上清液的化妆膜，为面膜。

实施例三

选择8位年龄在32～38岁之间的志愿者，其中女性6名、男性2名，进行面膜性能实验，具体为5名女性与1名男性志愿者敷本发明的面膜，剩余1名女性与1名男性志愿者敷市购面膜（一种），每两天敷一次，共敷五次，每人每次敷的时间一致，期间饮食清淡，尽量一致。敷面膜前后面部性能测试如下表：

含水量①②③分别表示敷面膜前测试面部含水量、第三次敷面膜后12小时测试面部含水量、第五次敷面膜后12小时测试面部含水量，可以看出本发明面膜性能优于现有面膜，使用过程无过敏发生。如果仅采用无血清MSC培养基作为第二培养基，其余不变，得到的面膜经过两名女性志愿者测试，第三次敷面膜后12小时测试面部含水量为53%，未进一步测试。如果仅采用无血清MSC培养基作为第二培养基，并在得到干细胞培养上清液后添加维生素E以及肝细胞生长因子，其余不变，得到的化妆膜液存在过敏现象，弃用。如果在第二培养基中添加5%体积百分数的血清替代物胰岛素-硒-转铁蛋白以及浓度为5μg/mL的β-巯基乙醇，其余不变，得到的化妆膜液使人过敏，弃用。

实施例四

化妆品美白功效评估是通过对照受试者使用测试样品前后皮肤的颜色和黑色素值来评定美白效果，如果观察区别不明显则采用仪器测试L*a*b*值以及黑色素值。选择20位年龄在30～40岁之间的志愿者，其中女性15名、男性5名，进行基于干细胞培养上清液的化妆品美白实验，在额头（没有头发遮挡）选择大小都为1厘米×1厘米的两块区域分别涂覆实施例一的基于干细胞培养上清液的化妆品水剂（浓缩处理至粘度适合涂覆）与市购美白化妆品，早晚各一次，涂覆参数基本一致，涂覆30天后，观察测试结果如下表：

如果将原代脂肪干细胞不采用第一培养基，直接加入第二培养基培养，其余不变，得到的基于干细胞培养上清液的化妆品水剂经过五名女性志愿者涂覆，30天后，观察发现所有人美白效果一般，同时涂覆的实施例一的基于干细胞培养上清液的化妆品水剂具有较好（一名）、好（四名）的效果。

30天后停止涂覆，再过7天观察发现，现有市购化妆品涂覆区域美白效果完全消失，实施例一的基于干细胞培养上清液的化妆品水剂涂覆区域还可以看出美白效果。

Claims

1.基于干细胞培养上清液的化妆品，其特征在于，所述基于干细胞培养上清液的化妆品的制备方法包括以下步骤：将原代干细胞接种于第一培养基中，原代培养，隔天换液，当原代脂肪干细胞生长至90%时，去除上清液，然后漂洗，得到传代干细胞；再将传代干细胞接种于第二培养基中，传代培养后进行离心分离，得到上清液；然后将上清液过滤除菌后，得到基于干细胞培养上清液的化妆品。

2.根据权利要求1所述基于干细胞培养上清液的化妆品，其特征在于，干细胞为脂肪干细胞。

3.根据权利要求1所述基于干细胞培养上清液的化妆品，其特征在于，原代干细胞接种于第一培养基中的密度为10⁶个/mL；第一培养基为含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基；原代培养在37℃、5%CO₂的培养箱中进行。

4.根据权利要求1所述基于干细胞培养上清液的化妆品，其特征在于，传代干细胞接种于第二培养基中的密度为10⁵个/mL；第二培养基为添加维生素E以及肝细胞生长因子的无血清MSC培养基；传代培养在37℃、5%CO₂的培养箱中进行；传代培养的时间为7天。

5.根据权利要求4所述基于干细胞培养上清液的化妆品，其特征在于，第二培养基中，根据添加量，维生素E为8μL/L，肝细胞生长因子30μg/L。

6.根据权利要求1所述基于干细胞培养上清液的化妆品，其特征在于，离心分离为1200rpm离心5分钟；过滤除菌的滤膜为0.1微米。

7.根据权利要求1所述基于干细胞培养上清液的化妆品，其特征在于，将上清液过滤除菌之前先对上清液进行3000rpm离心处理10分钟。

8.根据权利要求1所述基于干细胞培养上清液的化妆品，其特征在于，漂洗为采用生理盐水连续漂洗2遍。

9.权利要求1所述基于干细胞培养上清液的化妆品作为皮肤化妆品的应用。

10.权利要求1所述基于干细胞培养上清液的化妆品在制备化妆产品中的应用。