CN110024721A - 一种诱导鲆鲽鱼类卵巢生殖细胞凋亡的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种诱导鲆鲽鱼类卵巢生殖细胞凋亡的方法。本发明的方法，包括如下步骤：在产卵季节过后对鲆鲽雌鱼进行高温培养，在高温培养阶段向鲆鲽雌鱼多次注射用于使生殖细胞凋亡的药物；其中，所述药物为白消安，特别是以生殖孔注射方式进行多次注射。本发明的方法能够保证鲆鲽雌鱼具有较高的存活率，同时能够实现对鲆鲽鱼类卵巢生殖细胞良好的凋亡效果。
Description
技术领域
本发明涉及生殖细胞移植技术领域，具体涉及一种诱导鲆鲽鱼类卵巢生殖细胞凋亡的方法。
背景技术
生殖细胞移植(Germ cell transplantation GCT)经过十多年的发展已经成为具有广泛应用的新兴生物技术，该技术在用于干细胞生物学特性、转基因等前沿科学研究的同时，在应用于鱼类性别选择育种、苗种繁育开发、濒危野生鱼类保护等产业方向也具有重大的意义。
在哺乳动物中，高温对精子发生的影响已经得到了深入的研究，高温能引起鼠、牛、猪、羊等的精巢损害，精子质量的下降，胚胎生长迟滞、抑制或退化，甚至引起短时的或永久的不育；在鱼类中，高温同样能引起红鳍东方鲀、银汉鱼精巢细胞的退化和凋亡。然而，由于牙鲆雌鱼等鲆鲽鱼类卵巢中的卵母细胞个体较大，因此上述方法并不能够良好地适用于鱼类卵巢生殖细胞的凋亡；即便采用较高温度、多次处理等严苛条件对卵巢生殖细胞进行凋亡，然而此时雌鱼的存活率低，无法满足实际应用的需求。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明提供一种诱导鲆鲽鱼类卵巢生殖细胞凋亡的方法，该方法能够保证鲆鲽雌鱼具有较高的存活率，同时能够实现对鲆鲽鱼类卵巢生殖细胞良好的凋亡效果。
本发明提供的诱导鲆鲽鱼类卵巢生殖细胞凋亡的方法，包括如下步骤：
在产卵季节过后对鲆鲽雌鱼进行高温培养，在高温培养阶段向鲆鲽雌鱼多次注射用于使生殖细胞凋亡的药物。
在本发明中，鲆鲽雌鱼采用产卵后的鲆鲽雌鱼，其为性成熟的鲆鲽雌鱼；研究发现，采用性成熟的鲆鲽雌鱼作为处理对象，易于同时实现较高的存活率和较好的凋亡效果。
本发明对用于使生殖细胞凋亡的药物不作严格限制，只要能够使生殖细胞凋亡即可；优选地，所述药物为白消安；特别是，优选以生殖孔注射方式进行所述注射。
现有技术存在针对罗非鱼、银汉鱼的高温结合白消安注射的相关方法，然而上述方法主要针对的是鱼类精原细胞；由于牙鲆等鲆鲽雌鱼中卵母细胞个体较大，因此上述适用于精原细胞凋亡的方法并不能够良好地适用于鱼类卵巢生殖细胞；即无法同时获得较高的存活率和针对鲆鲽鱼类卵巢生殖细胞的较好凋亡效果。
此外，现有的高温结合白消安注射法通常是在对罗非鱼、银汉鱼进行高温培养的同时以腹腔注射方式两次注射白消安，其中罗非鱼、银汉鱼高温培养的温度分别为35℃、25℃左右，而高温培养时间通常为35天左右；同时，现有研究发现，注射次数过高(超过两次)或高温培养时间过长(超过40天)会显著降低鱼类的存活率。发明人采用了上述方法对鲆鲽雌鱼卵巢生殖细胞进行凋亡试验，结果表明鲆鲽雌鱼死亡率高达70％以上，并且鲆鲽雌鱼卵巢生殖细胞的凋亡效果不佳。
本发明人经大量研究发现，通过对产卵季节过后的鲆鲽雌鱼进行高温培养同时多次注射用于使生殖细胞凋亡的药物，特别是通过在高温培养阶段向产卵季节过后的鲆鲽雌鱼以生殖孔注射方式多次注射用于使生殖细胞凋亡的药物，能够克服上述死亡率高的问题，同时能够获得对鲆鲽雌鱼卵巢生殖细胞的良好凋亡效果；其原因可能在于，产卵季节过后的鲆鲽雌鱼的卵巢退化至Ⅱ期卵巢，生殖细胞易于受到所述药物的影响，既利于保证凋亡效果，同时能够大大降低药物剂量以提高鲆鲽雌鱼的存活率；此外，采用生殖孔注射方式能够使白消安直接作用于鲆鲽雌鱼的靶器官，进一步降低了白消安的注射剂量，从而显著提高了鲆鲽雌鱼的存活率；虽然采用多次注射的方式延长了高温培养时间，然而意外地发现该方式并未明显降低鲆鲽雌鱼的存活率，并且出乎意料地实现对鲆鲽鱼类卵巢生殖细胞的良好凋亡效果。鉴于此，从而完成了本发明。
具体地，在本发明中，控制所述高温培养的温度为不同鲆鲽鱼类养殖水温的极限高温温度；此外，控制所述高温培养的时间为54-72天，优选为58-68天，更优选为60-65天。在上述温度和时间下进行高温培养，有利于保证鲆鲽雌鱼的存活率，同时实现良好的卵巢生殖细胞凋亡效果。
具体地，牙鲆雌鱼的高温培养的温度为25-29℃，优选为27.5-28.5℃，更优选为28℃；牙鲆雌鱼的正常养殖温度为5-22℃，其中最低养殖温度为5-6℃，最适养殖温度为16-22℃。大菱鲆雌鱼的高温培养的温度为23-27℃，正常养殖温度为7-17℃，其中最低养殖温度为7-8℃，最适养殖温度为14-17℃。半滑舌鳎雌鱼的高温培养的温度为28-32℃，正常养殖温度为4-24℃，其中最低养殖温度为4-6℃，最适养殖温度为14-24℃。条斑星鲽雌鱼和圆斑星鲽雌鱼的高温培养的温度为25-28℃，正常养殖温度为2-23℃，其中最低养殖温度为2-6℃，最适养殖温度为15-23℃。
针对牙鲆雌鱼的研究发现，高温培养的温度不宜过高或过低，温度过低(例如26℃以下)无法保证鲆鲽鱼类卵巢生殖细胞的凋亡效果，而温度过高(例如30℃以上)会导致鲆鲽雌鱼存活率显著降低；此外，高温培养的时间不宜过长或过短，时间过短(例如50天以下)会影响鲆鲽鱼类卵巢生殖细胞的凋亡效果，而时间过长(例如75天以上)会显著降低鲆鲽雌鱼的存活率。
进一步地，本发明的诱导鲆鲽鱼类卵巢生殖细胞凋亡的方法，在所述高温培养之前还包括：将培养温度从正常养殖温度梯度升温至所述高温培养的温度(不同鲆鲽类鱼高温培养的极限温度)；其中，所述梯度升温的速率为1-2℃/天，优选为1℃/天。此外，对正常养殖温度不作严格限制，优选为适合鲆鲽雌鱼生长的温度，即鲆鲽雌鱼的最适养殖温度。梯度升温有利于鲆鲽雌鱼对温度进行逐渐适应，进而有利于保证鲆鲽雌鱼的存活率。
在本发明中，所述注射可以分四次进行，每次注射的剂量可以为15-20mg/kg，优选为18-20mg/kg；此外，每次注射的剂量可以相同或不同。在本发明中，注射剂量15-20mg/kg指的是对每1kg鲆鲽雌鱼注射15-20mg药物。上述特定的注射条件能够保证鲆鲽雌鱼具有一定的存活率，并且能够实现对鲆鲽鱼类卵巢生殖细胞良好的凋亡效果。
进一步地，可以控制相邻两次注射的间隔时间为12-16天，优选为13-15天，更优选为14天；此外，可以控制第四次注射后进行的高温培养的时间为12-16天，优选为13-15天，更优选为14天。
更具体地，本发明的方法，可以包括如下顺序进行的步骤：
在产卵季节过后将鲆鲽雌鱼高温培养6-8天；
对鲆鲽雌鱼第一次注射药物，随后继续高温培养12-16天；
对鲆鲽雌鱼第二次注射药物，随后继续高温培养12-16天；
对鲆鲽雌鱼第三次注射药物，随后继续高温培养12-16天；
对鲆鲽雌鱼第四次注射药物，随后继续高温培养12-16天。
在上述条件下，鲆鲽雌鱼的存活率达到60％以上，此外鲆鲽雌鱼产卵板明显萎缩，整个卵巢腔隙显著变大，产卵板无卵原细胞并且卵母细胞大量凋亡，同时性腺指数和vasa基因表达量显著降低，鲆鲽鱼类卵巢生殖细胞的凋亡效果好。
本发明的方法对于作为试验对象的鲆鲽雌鱼不作严格限制，鲆鲽雌鱼例如可以选自牙鲆雌鱼，优选为≥3龄的牙鲆雌鱼，更优选为3-6龄的牙鲆雌鱼。研究发现，该年龄阶段的性成熟牙鲆雌鱼作为受体最为合适，年龄太大的牙鲆雌鱼耐高温性能差，容易死亡；而年龄太小(例如2岁龄以内)的牙鲆雌鱼不易通过生殖孔注射方式将白消安注射到性腺中。
本发明提供的诱导鲆鲽鱼类卵巢生殖细胞凋亡的方法，在高温培养阶段向产卵季节过后的性成熟鲆鲽雌鱼多次注射用于使生殖细胞凋亡的药物，能够出乎意料地提高牙鲆雌鱼的存活率并获得对鲆鲽鱼类卵巢生殖细胞的良好凋亡效果。经本发明方法处理后，鲆鲽雌鱼的存活率达到60％以上，此外鲆鲽雌鱼产卵板明显萎缩，整个卵巢腔隙显著变大，产卵板无卵原细胞并且卵母细胞大量凋亡，同时性腺指数和vasa基因表达量显著降低，鲆鲽鱼类卵巢生殖细胞的凋亡效果好。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明试验例1不同组别的牙鲆卵巢组织的显微观察图；其中，A、B为对照组A，C、D为对照组2，E、F为对照组1，G、H为处理组4，I、J为处理组1，K、L为对照组3，M、N为对照组4，O、P为对照组5，Q、R为对照组6，三角表示正在降解的卵母细胞；
图2为本发明试验例2不同组别的性腺指数变化；
图3为本发明试验例3不同组别的vasa基因相对表达量。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实验鱼和数据分析条件如下：
1、实验鱼
各实施例和对照例采用的实验鱼均为3龄已经产过卵的Ⅱ雌性牙鲆，平均体重为1.30±0.28kg；实验开始前，移入25m2实验池适应实验环境一周，进行日常管理养殖。
2、数据分析
各试验例的数据统计采用SPSS22.0进行。对每一组别之间存活率、性腺指数以及vasa表达差异采用单因素方差分析检验，以P<0.05作为差异显著性标准。
实施例1
产卵季节过后，将适应实验环境的3龄实验鱼雌性牙鲆20尾的培养温度按照每天1℃的升温速度从18℃(室温)升至28℃(高温培养温度)，适应7天后进行性腺枯竭实验。
性腺枯竭实验步骤如下：
采用200ppm MS-222麻醉实验鱼2-3min，以20mg/kg的注射剂量以生殖孔注射方式向雌性牙鲆第一次注射白消安，随后在28℃下高温培育14天；
接着，采用200ppm MS-222麻醉实验鱼2-3min，以20mg/kg的注射剂量以生殖孔注射方式向雌性牙鲆第二次注射白消安，随后在28℃下高温培育14天；
接着，采用200ppm MS-222麻醉实验鱼2-3min，以20mg/kg的注射剂量以生殖孔注射方式向雌性牙鲆第三次注射白消安，随后在28℃下高温培育14天；
接着，采用200ppm MS-222麻醉实验鱼2-3min，以20mg/kg的注射剂量以生殖孔注射方式向雌性牙鲆第四次注射白消安，随后在28℃下高温培育14天，即完成性腺枯竭实验(即处理组1)。
实施例2
产卵季节过后，将适应实验环境的3龄实验鱼雌性牙鲆20尾的培养温度按照每天1.5℃的升温速度从15.5℃(室温)升至27.5℃(高温培养温度)，适应8天后进行性腺枯竭实验。
性腺枯竭实验步骤如下：
采用200ppm MS-222麻醉实验鱼2-3min，以20mg/kg的注射剂量以生殖孔注射方式向雌性牙鲆第一次注射白消安，随后在27.5℃下高温培育15天；
接着，采用200ppm MS-222麻醉实验鱼2-3min，以20mg/kg的注射剂量以生殖孔注射方式向雌性牙鲆第二次注射白消安，随后在27.5℃下高温培育15天；
接着，采用200ppm MS-222麻醉实验鱼2-3min，以18mg/kg的注射剂量以生殖孔注射方式向雌性牙鲆第三次注射白消安，随后在27.5℃下高温培育15天；
接着，采用200ppm MS-222麻醉实验鱼2-3min，以18mg/kg的注射剂量以生殖孔注射方式向雌性牙鲆第四次注射白消安，随后在27.5℃下高温培育15天，即完成性腺枯竭实验(即处理组2)。
实施例3
产卵季节过后，将适应实验环境的3龄实验鱼雌性牙鲆20尾的培养温度按照每天2℃的升温速度从14℃(室温)升至28℃(高温培养温度)，适应6天后进行性腺枯竭实验。
性腺枯竭实验步骤如下：
采用200ppm MS-222麻醉实验鱼2-3min，以18mg/kg的注射剂量以生殖孔注射方式向雌性牙鲆第一次注射白消安，随后在28℃下高温培育14天；
接着，采用200ppm MS-222麻醉实验鱼2-3min，以18mg/kg的注射剂量以生殖孔注射方式向雌性牙鲆第二次注射白消安，随后在28℃下高温培育14天；
接着，采用200ppm MS-222麻醉实验鱼2-3min，以18mg/kg的注射剂量以生殖孔注射方式向雌性牙鲆第三次注射白消安，随后在28℃下高温培育14天；
接着，采用200ppm MS-222麻醉实验鱼2-3min，以20mg/kg的注射剂量以生殖孔注射方式向雌性牙鲆第四次注射白消安，随后在28℃下高温培育14天，即完成性腺枯竭实验(即处理组3)。
实施例4
产卵季节过后，将适应实验环境的3龄实验鱼雌性牙鲆20尾的培养温度按照每天1℃的升温速度从18℃(室温)升至28℃(高温培养温度)，适应7天后进行性腺枯竭实验。
性腺枯竭实验步骤如下：
采用200ppm MS-222麻醉实验鱼2-3min，以20mg/kg的注射剂量以生殖孔注射方式向雌性牙鲆第一次注射白消安，随后在28℃下高温培育14天；
接着，采用200ppm MS-222麻醉实验鱼2-3min，以20mg/kg的注射剂量以生殖孔注射方式向雌性牙鲆第二次注射白消安，随后在28℃下高温培育14天，即完成性腺枯竭实验(即处理组4)。
对照例1
除进行性腺枯竭实验时，采用相同体积的二甲基亚砜替换实施例1中的白消安进行注射之外，其余与实施例1相同；本对照例作为阴性对照组(即对照组1)。
对照例2
除性腺枯竭实验中不进行麻醉和白消安注射之外，其余与实施例1相同；本对照例作为高温空白对照组(即对照组2)。
对照例3
除以腹腔注射替换实施例1中的生殖孔注射方式，同时仅进行两次注射，两次注射剂量均为40mg/kg之外，其余与实施例1相同(即对照组3)。
对照例4
除高温培养的温度为26℃之外，其余与实施例1相同(即对照组4)。
对照例5
除高温培养的温度为26℃，以腹腔注射替换实施例1中的生殖孔注射方式，同时四次注射剂量均为40mg/kg之外，其余与实施例1相同(即对照组5)。
对照例6
除采用未性成熟的2龄鱼作为实验鱼，升温至28℃后适应2个月，每次注射剂量为18mg/kg，同时注射次数仅为2次外，其余与实施1例相同(即对照组6)。
试验例1受体鱼雌性牙鲆的生长及成活率变化
对部分实施例和对照例的完成性腺枯竭实验的雌性牙鲆的初始体重(即实验前体重)及最终体重(即实验后体重)进行检测，结果见表1。
表1受体鱼雌性牙鲆的体重变化
| 体重 | 对照组2 | 对照组1 | 处理组1 |
| 初始体重(g) | 1101.85±575.25<sup>a</sup> | 1264.71±157.24<sup>a</sup> | 1386.92±293.39<sup>a</sup> |
| 最终体重(g) | 1057.68±565.02<sup>a</sup> | 1148.57±143.32<sup>a</sup> | 1217.85±274.07<sup>a</sup> |
注：不同字母表示存在显著性差异(P<0.05)；相同字母表示无显著性差异(P>0.05)。
表1结果表明：
在整个实验周期，处理组1、对照组1和对照组2的雌性牙鲆均较初始体重有所下降，但各组别初始体重与最终体重之间差异不显著(P>0.05)。
此外，以自然环境中培育的雌性牙鲆作为自然温对照组(即对照组A)，对部分实施例和对照例的雌性牙鲆的存活情况进行统计；结果表明：处理组1(即实施例1)的存活率为60.60％，处理组4(即实施例4)的存活率为83.33％，对照组1(即阴性对照组)的存活率为77.78％，对照组2(即高温空白对照组)的存活率为95.00％，对照组A(即自然温对照组)的存活率为100.00％，对照组5的存活率为30.00％，对照组6的存活率为63.16％。
由此说明，本发明的方法能够保证雌性牙鲆具有一定的存活率，存活率达60.60％以上。
试验例2性腺组织学观察
采集部分实施例和对照例中的完成性腺枯竭实验的雌性牙鲆，分别鉴别牙鲆性腺中生殖细胞枯竭程度；其中，每个组别各采集3尾样品，同时采集自然环境中培养的雌性牙鲆作为自然温对照组(即对照组A)。
样品鱼通过过量的乙二醇苯醚麻醉而死，称重、称取性腺重，并将左右性腺中间部分用4％的多聚甲醛固定，进行常规脱水、石蜡包埋、连续切片100张左右，切片厚度5μm。对组织切片进行苏木素-伊红(H-E)染色，中性树胶封片，用3D Histech数字切片扫描分析系统(型号Pannoramic MIDI)进行扫描观察，结果见图1和图2。
图1结果表明：处理组4(即实施例4)的雌性牙鲆产卵板明显萎缩，整个卵巢腔隙变大，产卵板上无卵原细胞并且卵母细胞较实验前凋亡不少，在产卵板上可见正在凋亡的卵母细胞(图1的G、H)；相对于处理组4，处理组1(即实施例1)产卵板上内源性生殖细胞进一步减少，卵巢腔隙也进一步变大，凋亡效果更佳(图1的I、J)。相对地，对照组1-6中，卵母细胞部分开始退化、凋亡，产卵板较实验前较有皱缩，但凋亡效果远不如实施例1的处理组1(参见图1的C-F、K-R)。
图2结果表明：处理组1性腺指数显著低于对照组A(即实验前的自然温对照组)、对照组2(即高温空白对照组)、对照组1(即阴性对照组)和对照组6(P<0.05)；而对照组A、对照组2、对照组1、对照组6之间无显著性差异(P>0.05)，说明本发明方法对牙鲆雌鱼的卵巢生殖细胞具有的良好凋亡效果。
试验例3 vasa基因表达分析
利用实时RT-PCR测定部分实施例和对照例的完成性腺枯竭实验的雌性牙鲆中的vasa mRNA表达量，以检测牙鲆生殖细胞枯竭程度。
采集组织学样品同时采集各组别性腺中部样品，用RNAfixer 4℃固定24小时后，移除固定液转移至-80℃超低温冰箱保存，直至后续实验。
使用Primer5.0软件，分别设计牙鲆vasa和内参UbcE的Q-PCR引物，引物序列见表2。按照RNAiso Plus Total RNA Reagent(TaKaRa)试剂盒步骤进行RNA的提取。使用总RNA为模板，按照PrimeScriptR RT regent Kit With gDNA Eraser反转录试剂盒步骤进行cDNA的合成。将反转录获得的样品cDNA稀释5-20倍，采用SYBR试剂法对所有样品进行表达分析。将荧光96孔板放入LightCycler 480Real-time PCR仪中进行扩增。反应体系共20μl，其中2×SYBR Premix Ex Taq 10μl，正反向引物各0.4μl，稀释后的cDNA2μl，ddH2O 7.2μl。荧光定量PCR反应程序包括95℃，30s；95℃，5s，60℃，30s，40个循环；95℃，5s，60℃，1min，用于检测溶解曲线。采用法分析样品的相对表达量，结果见图3。
表2实时定量PCR引物序列
| 引物名称 | 引物序列(5'-3') |
| vasa-F | TAGTTCCCTCGTGGTTAGAAGAGT(SEQ ID NO:1) |
| vasa-R | GCTGTGCTGTCCTGAGAGAATC(SEQ ID NO:2) |
| UbcE-F | TTACTGTCCATTTCCCCACTGAC(SEQ ID NO:3) |
| UbcE-R | GACCACTGTGACCTCAAGATG(SEQ ID NO:4) |
图3结果表明：处理组1的vasa基因表达量比对照组A(即自然温对照组)出现显著性下降(P<0.05)；同时，处理组1的vasa基因表达量显著性地低于对照组2(即高温对照组)(P<0.05)；此外，处理组1的vasa基因表达量也明显低于对照组6，说明本发明方法对牙鲆雌鱼的卵巢生殖细胞具有的良好凋亡效果。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (10)
1.一种诱导鲆鲽鱼类卵巢生殖细胞凋亡的方法，其特征在于，包括如下步骤：
在产卵季节过后对鲆鲽雌鱼进行高温培养，在高温培养阶段向鲆鲽雌鱼多次注射用于使生殖细胞凋亡的药物。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述药物为白消安；
优选地，以生殖孔注射方式进行所述注射。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，控制所述高温培养的温度为所述鲆鲽鱼类养殖水温的极限高温温度。
4.根据权利要求1至3任一所述的方法，其特征在于，控制所述高温培养的时间为54-72天，优选为58-68天，更优选为60-65天。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述高温培养之前还包括：将培养温度从正常养殖温度梯度升温至所述高温培养的温度。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述梯度升温的速率为1-2℃/天，优选为1℃/天。
7.根据权利要求1至6任一所述的方法，其特征在于，所述注射分四次进行，每次注射的剂量为15-20mg/kg，优选为18-20mg/kg。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，控制相邻两次注射的间隔时间为12-16天，优选为13-15天，更优选为14天；
优选地，控制第四次注射后进行的高温培养的时间为12-16天，优选为13-15天，更优选为14天。
9.根据权利要求1至8任一所述的方法，其特征在于，包括如下顺序进行的步骤：
在产卵季节过后将鲆鲽雌鱼高温培养6-8天；
对鲆鲽雌鱼第一次注射药物，随后继续高温培养12-16天；
对鲆鲽雌鱼第二次注射药物，随后继续高温培养12-16天；
对鲆鲽雌鱼第三次注射药物，随后继续高温培养12-16天；
对鲆鲽雌鱼第四次注射药物，随后继续高温培养12-16天。
10.根据权利要求1至9任一所述的方法，其特征在于，所述鲆鲽雌鱼为牙鲆、大菱鲆、半滑舌鳎、条斑星鲽或圆斑星鲽；
优选地，所述鲆鲽雌鱼为牙鲆雌鱼，优选为≥3龄的牙鲆雌鱼，更优选为3-6龄的牙鲆雌鱼；
优选地，所述鲆鲽雌鱼为牙鲆雌鱼，其高温培养的温度为25-29℃，优选为27.5-28.5℃，更优选为28℃；正常养殖温度为5-22℃，其中最低养殖温度为5-6℃，最适养殖温度为16-22℃；
优选地，所述鲆鲽雌鱼为大菱鲆雌鱼，其高温培养的温度为23-27℃，正常养殖温度为7-17℃，其中最低养殖温度为7-8℃，最适养殖温度为14-17℃；
优选地，所述鲆鲽雌鱼为半滑舌鳎雌鱼，其高温培养的温度为28-32℃，正常养殖温度为4-24℃，其中最低养殖温度为4-6℃，最适养殖温度为14-24℃；
优选地，所述鲆鲽雌鱼为条斑星鲽雌鱼，其高温培养的温度为25-28℃，正常养殖温度为2-23℃，其中最低养殖温度为2-6℃，最适养殖温度为15-23℃；
优选地，所述鲆鲽雌鱼为圆斑星鲽雌鱼，其高温培养的温度为25-28℃，正常养殖温度为2-23℃，其中最低养殖温度为2-6℃，最适养殖温度为15-23℃。
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