CN110004076A - 纳米石墨烯片提高厌氧反硝化效率的方法 - Google Patents

纳米石墨烯片提高厌氧反硝化效率的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种纳米石墨烯片提高厌氧反硝化效率的方法，属于生物脱氮理技术领域。本发明通过将纳米石墨烯片加入到反硝化微生物P.denitrificans的反硝化体系中进行厌氧反硝化培养实现，其中，纳米石墨烯片在反硝化体系中的浓度为50～500mg/L；厌氧反硝化体系的碳氮比为1～10；厌氧反硝化培养的温度为20～35℃；厌氧反硝化培养的pH为6.0～9.0。本发明利用纳米石墨烯片促进反硝化微生物P.denitrificans对硝酸盐的还原，可以显著提高硝酸盐的去除效率，减少亚硝酸盐和一氧化二氮积累，并且纳米石墨烯片回收后可再次用于提高体系的厌氧反硝化效率。

Description

纳米石墨烯片提高厌氧反硝化效率的方法
技术领域
本发明具体涉及一种纳米石墨烯片提高厌氧反硝化效率的方法，属于生物脱氮理技术领域。
背景技术
在过去的几十年中，随着人类活动的加剧和含氮肥料的大规模使用，不可避免地导致了大量生物可利用氮，如硝酸盐等进入到环境中。微生物厌氧反硝化作为全球氮循环过程的一个重要组成部分，其将土壤或水体中的硝酸盐还原为氮气的过程为硝酸盐在环境中的去除转化提供了有效途径。然而实际的生物厌氧反硝化过程较慢，而且还会存在一些硝酸盐还原过程中间产物的积累，如亚硝酸盐和一氧化二氮。亚硝酸盐的存在不仅会危害水生生物的生存和人类的健康，它的积累还会影响污水处理系统中的功能微生物的正常运行。一氧化二氮则是潜在的温室气体，其所具有的温室效应潜能值是二氧化碳的300倍，同时一氧化二氮还是非常重要的臭氧消耗源，以目前的一氧化二氮排放量增长趋势(7％左右)进行估算，其会成为21世纪最大的臭氧消耗物质。由此可见，微生物厌氧反硝化与全球环境问题，包括水体的富营养化以及气候变化等都有密切的联系。因此，寻求促进厌氧反硝化过程高速进行、且无中间产物积累的方法是十分必要的。
发明内容
针对现有技术中的问题，本发明提供一种纳米石墨烯片提高厌氧反硝化效率的方法，该方法通过选择纳米石墨烯片作导电材料并将其加入反硝化微生物P.denitrificans的反硝化体系中，可以促进反硝化微生物快速脱氮，大大提高厌氧反硝化效率，减少亚硝酸盐和一氧化二氮积累。
为实现以上技术目的，本发明的技术方案是：
一种纳米石墨烯片提高厌氧反硝化效率的方法，该方法通过以下步骤实现：
反硝化体系的构建；
预先在有氧条件下用灭菌的LB培养反硝化微生物P.denitrificans到OD600为2；反硝化体系培养选用的容器为无菌厌氧瓶，培养基成分为：21.36mM KNO3,10.66mM NH4Cl,0.41mM MgSO4·7H2O,17.93mM KH2PO4,32.76mM Na2HPO4,微量元素1mL/L；所述微量元素成分为：0.0217mM Na2-EDTA、0.0090mM FeSO4·7H2O、0.001mM MnCl2·4H2O、0.0010mMNa2MoO4·2H2O、0.0008mM CuCl2·2H2O和0.0025mM ZnCl2；加入CH3COONa，用NaOH和HCl调节体系的pH；鼓吹N2 5min去除氧气，采用丁基橡胶隔膜和铝盖密封，121℃下灭菌15min；
将预先培养好的反硝化微生物P.denitrificans接种到反硝化培养基中，再加入超声分散后的纳米石墨烯片，进行厌氧反硝化培养。
优选地，所述反硝化体系的碳氮比为1～10；反硝化体系的pH为6.0～9.0；纳米石墨烯片在反硝化体系中的浓度为50～500mg/L；反硝化培养的温度为20～35℃。
优选地，所述反硝化体系的碳氮比为5；反硝化体系的pH为7.0；纳米石墨烯片在反硝化体系中的浓度为200mg/L；反硝化培养的温度为30℃。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于，
1.本发明通过选择纳米石墨烯片作导电材料并将其加入反硝化培养基中构建厌氧反硝化体系，可以促进反硝化微生物快速脱氮，大大提高厌氧反硝化效率，减少中间产物亚硝酸盐和一氧化二氮的积累；此外，纳米石墨烯片可回收再利用，且其在重复使用多次后仍然具有较佳的促进作用，仍然可以有效提高厌氧反硝化体系中硝酸盐的去除效率。
2.本发明通过优化厌氧反硝化体系及其反应条件，可以进一步提高厌氧反硝化效率，其中，当厌氧反硝化体系中纳米石墨烯片的浓度为200mg/L、碳氮比为5，厌氧反硝化温度为30℃、pH为7.0时，厌氧反硝化体系的厌氧反硝化效率最高。
附图说明
图1是实施例1中实验组(a)反硝化体系和空白组(b)添加石墨烯的反硝化体系的示意图；
图2是实施例1厌氧反硝化培养过程中硝酸盐浓度的变化；
图3是实施例1厌氧反硝化培养过程中亚硝酸盐的最大累积浓度；
图4是实施例1厌氧反硝化培养过程中一氧化二氮的最大累积浓度；
图5是实施例1中纳米石墨烯片重复使用六次时，实验组硝态氮去除效率相比空白组提高的百分比；
具体实施方式
下面通过实施例子，进一步阐述本发明的特点，但不对本发明的权利要求做任何限定。
实施例1：
预先在有氧条件下用灭菌的LB培养反硝化微生物P.denitrificans(美国模式培养物集存库，菌种编号为ATCC 19367，下同)到OD600为2；反硝化体系培养选用的容器为无菌厌氧瓶，培养基成分为：21.36mM KNO3,10.66mM NH4Cl,0.41mM MgSO4·7H2O,17.93mMKH2PO4,32.76mM Na2HPO4,微量元素1mL/L；所述微量元素成分为：0.0217mM Na2-EDTA、0.0090mM FeSO4·7H2O、0.001mM MnCl2·4H2O、0.0010mM Na2MoO4·2H2O、0.0008mM CuCl2·2H2O和0.0025mM ZnCl2；加入CH3COONa，用NaOH和HCl调节体系的pH；鼓吹N2 5min去除氧气，采用丁基橡胶隔膜和铝盖密封，121℃下灭菌15min；
实验组：将预先培养好的反硝化微生物P.denitrificans 1mL接种到100mL反硝化培养基中，加入超声分散后的纳米石墨烯片使纳米石墨烯片浓度为200mg/L，厌氧反硝化体系的碳氮比为5，厌氧反硝化体系的pH为7.0(图1)，将厌氧瓶置于150rpm的摇床上，在30℃下进行厌氧反硝化培养。
空白组：将预先培养好的反硝化微生物P.denitrificans 1mL接种到100mL与实验组相同的反硝化培养基中，不加入纳米石墨烯片，其他厌氧反硝化条件与实验组相同(图1)，进行厌氧反硝化培养；
实验组和空白组中硝酸盐浓度随时间的变化如图2所示、亚硝酸盐最高累积浓度如图3所示和一氧化二氮最高累积浓度如图4所示。结果表明，实验组硝酸盐去除率达到100％所需的时间相对于空白组缩减了47.6％，且无亚硝酸盐和一氧化二氮的积累。纳米石墨烯片重复使用六次时，实验组硝酸盐去除率达到100％所需的时间相对于空白组至少缩减了30.0％(图5)。
实施例2
实验组：将预先培养好的反硝化微生物P.denitrificans 1mL接种到100mL与实施例1相同的反硝化培养基中，加入超声分散后的纳米石墨烯片使其浓度为50mg/L，厌氧反硝化体系的碳氮比为8，厌氧反硝化体系的pH为9，将厌氧瓶置于150rpm的摇床上，在20℃下进行厌氧反硝化培养。
空白组：将预先培养好的反硝化微生物P.denitrificans 1mL接种到100mL与实验组相同的反硝化培养基中，不加入纳米石墨烯片，其他厌氧反硝化条件与实验组相同，进行厌氧反硝化培养。
结果表明，实验组硝酸盐去除率达到100％所需的时间相对于空白组缩减了20.9％，亚硝酸盐和一氧化二氮的最高积累浓度相对于空白组分别降低了52.1％和44.6％。纳米石墨烯片重复使用六次时，实验组硝酸盐去除率达到100％所需的时间相对于空白组至少缩减了21.4％。
实施例3
实验组：将预先培养好的反硝化微生物P.denitrificans 1mL接种到100mL与实施例1相同的反硝化培养基中，加入超声分散后的纳米石墨烯片使其浓度为300mg/L，厌氧反硝化体系的碳氮比为3，厌氧反硝化体系的pH为8.0，将厌氧瓶置于150rpm的摇床上，在28℃下进行厌氧反硝化培养。
空白组：将预先培养好的反硝化微生物P.denitrificans 1mL接种到100mL与实验组相同的反硝化培养基中，不加入纳米石墨烯片，其他厌氧反硝化条件与实验组相同，进行厌氧反硝化培养。
结果表明，实验组硝酸盐去除率达到100％所需的时间相对于空白组缩减了17.5％，亚硝酸盐和一氧化二氮的最高积累浓度相对于空白组分别降低了49.1％和73.5％。纳米石墨烯片重复使用六次时，实验组硝酸盐去除率达到100％所需的时间相对于空白组至少缩减了25.3％。
实施例4
实验组：将预先培养好的反硝化微生物P.denitrificans 1mL接种到100mL与实施例1相同的反硝化培养基中，加入超声分散后的纳米石墨烯片使其浓度为500mg/L，厌氧反硝化体系的碳氮比为1，厌氧反硝化体系的pH为8，将厌氧瓶置于150rpm的摇床上，在35℃下进行厌氧反硝化培养。
空白组：将预先培养好的反硝化微生物P.denitrificans 1mL接种到100mL与实验组相同的反硝化培养基中，不加入纳米石墨烯片，其他厌氧反硝化条件与实验组相同，进行厌氧反硝化培养。
结果表明，实验组硝酸盐去除率达到100％所需的时间相对于空白组缩减了30.4％，亚硝酸盐和一氧化二氮的最高积累浓度相对于空白组分别降低了88.3％和69.0％。纳米石墨烯片重复使用六次时，硝酸盐去除率达到100％所需的时间相对于空白组至少缩减了27.8％。
实施例5
实验组：将预先培养好的反硝化微生物P.denitrificans 1mL接种到100mL与实施例1相同的反硝化培养基中，加入超声分散后的纳米石墨烯片使其浓度为400mg/L，厌氧反硝化体系的碳氮比为5，厌氧反硝化体系的pH为6.0，将厌氧瓶置于150rpm的摇床上，在25℃下进行厌氧反硝化培养。
空白组：将预先培养好的反硝化微生物P.denitrificans 1mL接种到100mL与实验组相同的反硝化培养基中，不加入纳米石墨烯片，其他厌氧反硝化条件与实验组相同，进行厌氧反硝化培养。
结果表明，实验组硝酸盐去除率达到100％所需的时间相对于空白组缩减了25.4％，亚硝酸盐和一氧化二氮的最高积累浓度相对于空白组分别降低了52.1％和44.6％。纳米石墨烯片重复使用六次时，实验组硝酸盐去除率达到100％所需的时间相对于空白组至少缩减了29.0％。
实施例6
实验组：将预先培养好的反硝化微生物P.denitrificans 1mL接种到100mL与实施例1相同的反硝化培养基中，加入超声分散后的纳米石墨烯片使其浓度为300mg/L，厌氧反硝化的碳氮比为4，厌氧反硝化的pH为7.0，将厌氧瓶置150rpm的摇床上，在30℃下进行厌氧反硝化培养。
空白组：将预先培养好的反硝化微生物P.denitrificans 1mL接种到100mL与实验组相同的反硝化培养基中，不加入纳米石墨烯片，其他厌氧反硝化条件与实验组相同，进行厌氧反硝化培养。
结果表明，实验组硝酸盐去除率达到100％所需的时间相对于空白组缩减了36.7％，亚硝酸盐和一氧化二氮的最高积累浓度相对于空白组分别降低了47.9％和82.4％。纳米石墨烯片重复使用六次时，实验组硝酸盐去除率达到100％所需的时间相对于空白组至少缩减了31.1％。
实施例7
实验组：将预先培养好的反硝化微生物P.denitrificans 1mL接种到100mL与实施例1相同的反硝化培养基中，加入超声分散后的纳米石墨烯片使其浓度为100mg/L，厌氧反硝化体系的碳氮比为8，厌氧反硝化体系的pH为7.0，将厌氧瓶置于150rpm的摇床上，在33℃下进行厌氧反硝化培养。
空白组：将预先培养好的反硝化微生物P.denitrificans 1mL接种到100mL与实验组相同的反硝化培养基中，不加入纳米石墨烯片，其他厌氧反硝化条件与实验组相同，进行厌氧反硝化培养。
结果表明，实验组硝酸盐去除率达到100％所需的时间相对于空白组缩减了38.4％，亚硝酸盐和一氧化二氮的最高积累浓度相对于空白组分别降低了64.7％和92.8％。纳米石墨烯片重复使用六次时，硝酸盐去除率达到100％所需的时间相对于空白组至少缩减了33.6％。
实施例8
实验组：将预先培养好的反硝化微生物P.denitrificans 1mL接种到100mL接种到与实施例1相同的反硝化培养基中，加入超声分散后的纳米石墨烯片使其浓度为400mg/L，厌氧反硝化体系的碳氮比为10，厌氧反硝化体系的pH为8.0，将厌氧瓶置于150rpm的摇床上，在23℃下进行厌氧反硝化培养。
空白组：将预先培养好的反硝化微生物P.denitrificans 1mL接种到100mL接种到与实验组相同的反硝化培养基中，不加入纳米石墨烯片，其他厌氧反硝化条件与实验组相同，进行厌氧反硝化培养。
结果表明，实验组硝酸盐去除率达到100％所需的时间相对于空白组缩减了40.4％，亚硝酸盐和一氧化二氮的最高积累浓度相对于空白组分别降低了53.1％和88.6％。纳米石墨烯片重复使用六次时，实验组硝酸盐去除率达到100％所需的时间相对于空白组至少缩减了35.9％。
对比例1
实验组：将预先培养好的反硝化微生物P.denitrificans 1mL接种到100mL与实施例1相同的反硝化培养基中，加入超声分散后的纳米四氧化三铁使纳米四氧化三铁浓度为200mg/L，厌氧反硝化体系的碳氮比为5，厌氧反硝化体系的pH为7.0，将厌氧瓶置于150rpm的摇床上，在30℃下进行厌氧反硝化培养。
空白组：将预先培养好的反硝化微生物P.denitrificans 1mL接种到100mL与实验组相同的反硝化培养基中，不加入纳米四氧化三铁，其他厌氧反硝化条件与实验组相同，进行厌氧反硝化培养。
结果表明，实验组硝酸盐去除率达到100％所需的时间相对于空白组增加了5.6％，亚硝酸盐和一氧化二氮的最高积累浓度相对于空白组分别升高了25.9％和158.3％。这说明尽管纳米四氧化三铁也具有较好的导电性，但是却对微生物厌氧反硝化有抑制作用。
对比例2
实验组：将预先培养好的反硝化微生物P.denitrificans 1mL接种到100mL与实施例1相同的反硝化培养基中，加入超声分散后的碳纳米管使碳纳米管浓度为200mg/L，厌氧反硝化体系的碳氮比为5，厌氧反硝化体系的pH为7.0，将厌氧瓶置于150rpm的摇床上，在30℃下进行厌氧反硝化培养。
空白组：将预先培养好的反硝化微生物P.denitrificans 1mL接种到100mL与实验组相同的反硝化培养基中，不加入碳纳米管，其他厌氧反硝化条件与实验组相同，进行厌氧反硝化培养。
结果表明，实验组硝酸盐去除率达到100％所需的时间相对于空白组缩减了6.4％，亚硝酸盐和一氧化二氮的最高积累浓度相对于空白组分别降低了2.1％和4.9。碳纳米管重复使用效果使用六次时，实验组硝酸盐去除率达到100％所需的时间相对于空白组仅仅缩短了3.5％。这说明尽管碳纳米管也具有较好的导电性，但是却对微生物厌氧反硝化没有明显的促进作用。
对比例3
实验组：将预先培养好的反硝化微生物P.denitrificans 1mL接种到100mL与实施例1相同的反硝化培养基中，加入超声分散后的纳米石墨烯片使其浓度为200mg/L，厌氧反硝化体系的碳氮比为8，厌氧反硝化体系的pH为5.0，将厌氧瓶置于150rpm的摇床上，在20℃下进行厌氧反硝化培养。
空白组：将预先培养好的反硝化微生物P.denitrificans 1mL接种到100mL与实验组相同的反硝化培养基中，不加入纳米石墨烯片，其他厌氧反硝化条件与实验组相同，进行厌氧反硝化培养。
结果表明，实验组硝酸盐去除率达到100％所需的时间相对于空白组缩减了4.6％，亚硝酸盐和一氧化二氮的最高积累浓度相对于空白组分别降低了3.3％和9.2％。纳米石墨烯片重复使用六次时，实验组硝酸盐去除率达到100％所需的时间相对于空白组最高缩减5.7％。
对比例4
实验组：将预先培养好的反硝化微生物P.denitrificans 1mL接种到100mL与实施例1相同的反硝化培养基中，加入超声分散后的纳米石墨烯片使其浓度为30mg/L，厌氧反硝化体系的碳氮比为5，厌氧反硝化体系的pH为7.0，将厌氧瓶置于150rpm的摇床上，在30℃下进行厌氧反硝化培养。
空白组：将预先培养好的反硝化微生物P.denitrificans 1mL接种到100mL与实验组相同的反硝化培养基中，不加入纳米石墨烯片，其他厌氧反硝化条件与实验组相同，进行厌氧反硝化培养。
结果表明，实验组硝酸盐去除率达到100％所需的时间相对于空白组缩减了9.0％，亚硝酸盐和一氧化二氮的最高积累浓度相对于空白组分别降低了5.5％和10.1％。纳米石墨烯片重复使用六次时，实验组硝酸盐去除率达到100％所需的时间相对于空白组最高缩减了11.6％。
对比例5
实验组：将预先培养好的反硝化微生物P.denitrificans 1mL接种到100mL与实施例1相同的反硝化培养基中，加入超声分散后的纳米石墨烯片使其浓度为500mg/L，厌氧反硝化体系的碳氮比为0.5，厌氧反硝化体系的pH为8.0，将厌氧瓶置于150rpm的摇床上，在35℃进行厌氧反硝化培养。
空白组：将预先培养好的反硝化微生物P.denitrificans 1mL接种到100mL与实验组相同的反硝化培养基中，不加入纳米石墨烯片，其他厌氧反硝化条件与实验组相同，进行厌氧反硝化培养。
结果表明，实验组硝酸盐去除率达到100％所需的时间相对于空白组缩减了7.9％，亚硝酸盐和一氧化二氮的最高积累浓度相对于空白组分别降低了8.4％和5.9％。纳米石墨烯片重复使用六次时，实验组硝酸盐去除率达到100％所需的时间相对于空白组最高缩减了10.4％。
对比例6
实验组：将预先培养好的反硝化微生物P.denitrificans 1mL接种到100mL与实施例1相同的反硝化培养基中，加入超声分散后的纳米石墨烯片使其浓度为100mg/L，厌氧反硝化体系的碳氮比8，厌氧反硝化体系的pH为7.0，将厌氧瓶置于150rpm的摇床上，在40℃下进行厌氧反硝化培养。
空白组：将预先培养好的反硝化微生物P.denitrificans 1mL接种到100mL与实验组相同的反硝化培养基中，不加入纳米石墨烯片，其他厌氧反硝化条件与实验组相同，进行厌氧反硝化培养。
结果表明，实验组硝酸盐去除率达到100％所需的时间相对于空白组缩减了11.9％，亚硝酸盐和一氧化二氮的最高积累浓度相对于空白组分别降低了4.3％和10.5％。纳米石墨烯片重复使用六次时，实验组硝酸盐去除率达到100％所需的时间相对于空白组最高缩减了14.1％。
可以理解的是，以上关于本发明的具体描述，仅用于说明本发明而并非受限于本发明实施例所描述的技术方案。本领域的普通技术人员应当理解，仍然可以对本发明进行修改或等同替换，以达到相同的技术效果；只要满足使用需要，都在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.一种纳米石墨烯片提高厌氧反硝化效率的方法，其特征在于，该方法通过以下步骤实现：
反硝化体系的构建；
预先在有氧条件下用灭菌的LB培养反硝化微生物P.denitrificans到OD600为2；反硝化体系培养选用的容器为无菌厌氧瓶，培养基成分为：21.36mM KNO3,10.66mM NH4Cl,0.41mMMgSO4·7H2O,17.93mM KH2PO4,32.76mM Na2HPO4,微量元素1mL/L；所述微量元素成分为：0.0217mM Na2-EDTA、0.0090mM FeSO4·7H2O、0.001mM MnCl2·4H2O、0.0010mM Na2MoO4·2H2O、0.0008mM CuCl2·2H2O和0.0025mM ZnCl2；加入CH3COONa，用NaOH和HCl调节体系的pH；鼓吹N2 5min去除氧气，采用丁基橡胶隔膜和铝盖密封，121℃下灭菌15min；
将预先培养好的反硝化微生物P.denitrificans接种到反硝化培养基中，再加入超声分散后的纳米石墨烯片，进行厌氧反硝化培养。
2.如权利要求1所述的纳米石墨烯片提高厌氧反硝化效率的方法，其特征在于，所述反硝化体系的碳氮比为1～10；反硝化体系的pH为6.0～9.0；纳米石墨烯片在反硝化体系中的浓度为50～500mg/L；反硝化培养的温度为20～35℃。
3.如权利要求1所述的纳米石墨烯片提高厌氧反硝化效率的方法，其特征在于，所述反硝化体系的碳氮比为5；反硝化体系的pH为7.0；纳米石墨烯片在反硝化体系中的浓度为200mg/L；反硝化培养的温度为30℃。
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