CN110003361A - 一种高品质琼脂的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种高品质琼脂的制备方法，采用戊二酸酐对琼脂粉进行酯化改性，提高琼脂的利用价值。本发明工艺简单，制备的高品质琼脂的透明度与原琼脂相比得到了显著的提高，同时提高了琼脂的粘度，改性后的高品质琼脂具有较高的凝胶强度。

Description

一种高品质琼脂的制备方法

技术领域

本发明属于琼脂深加工技术领域，具体涉及一种高品质琼脂的制备方法。

背景技术

琼脂(agar) 是从海藻类植物中提取的多糖体藻胶，富含人体所必需的多种微量元素，在促进肠胃消化吸收方面具有一定功效。琼脂溶液加热遇冷后迅速变成胶质状，使体系由溶液或溶胶转变为一种特殊的半固体状态，因此具有很好的胶凝性和凝胶稳定性。另外，琼脂具有良好的亲水性、增稠和悬浮性等功能特性，因此广泛用于食品、医药、日用化工、生物工程等许多方面。但是目前市场上的琼脂品种单一，所以一些文献借助物理、化学或生物等方法或者多种改性方法相结合，获得不同性质的琼脂。曹明昭等以琼脂为原料，氯乙酸为羧甲基化试剂，制备了羧甲基化琼脂（CMA）；夏凯等以硫酸亚铁为催化剂，琼脂与双氧水反应，制备了氧化琼脂；徐博等以螺杆挤压改性法生产了高凝胶强度的低温溶解江蓠属琼脂。但是以上方法存在过程繁琐，耗时较长，所耗原料比较多，需要催化剂和一些危险试剂的缺点。本发明针对上述不足之处，采用化学改性的方法，简单易操作，不需催化剂，所需试剂少，且得到的琼脂具有透明度高、溶解温度低、粘度高等多项特点。

发明内容

本发明的目的是提供一种高品质琼脂的制备方法，提高琼脂的利用价值。本发明采取以下试验方案：

一种高品质琼脂的制备方法，包括如下步骤：

（1）称取一定量的琼脂粉，加入乙醇溶液；

（2）逐滴加入适量的经有机试剂溶解的戊二酸酐进行酯化，边滴加边在一定温度下进行搅拌；

（3）控制戊二酸酐在1h滴加完毕，并在反应过程中使用NaOH溶液调节反应体系pH；

（4）继续反应一定时间后，立即过滤，用去离子水洗涤、干燥、粉碎过筛得到高品质戊二酸酐改性琼脂。

以取代度、凝胶强度、透明度作为优化指标进行优选：

所述的步骤1）中：乙醇溶液体积分数为25%。

所述的步骤2）中有机试剂是无水乙醇，戊二酸酐与无水乙醇的质量体积比为1：15g/ml。

所述的步骤2）中：戊二酸酐的质量为琼脂粉的30%，搅拌温度为30℃。

所述的步骤3）中：在滴加过程中用3wt%浓度的NaOH溶液控制pH为8~8.5。

所述的步骤4）中：继续反应0.5h。

应用：将所制备的高品质琼脂，应用于菌株固载材料、组织切片中。

本发明的优点在于：

（1）本发明工艺简单，简单易操作，不需催化剂，所需试剂少；

（2）目前尚未见到有关提高琼脂透明度的文献和技术，本发明创造性地借助化学改性方法，提高了琼脂的透明度，较高的透明度琼脂可用于透明培养基、薄膜的制作；也可以更方便观察做一些观察实验，从而拓宽琼脂的应用范围，提高其利用价值。

（3）本发明提高了琼脂的粘度，较强的粘度可以增加颗粒的固水能力，提供更大的阻力使其变形，且具有稳定乳化状态和悬浊状态作用。

（4）本发明改性后得到的高品质琼脂仍具有较高的凝胶强度，琼脂强度太低的话在一些应用上会受到限制，如作为凝固剂、增稠剂等都需要一定的凝胶性和强度。

（5）本发明高品质琼脂溶解温度下降，意味着琼脂热稳定性变差，节约了工业生产中溶解琼脂所需的能源。而且使温度敏感的物质与琼脂的共同应用成为可能。

（6）本发明高品质琼脂凝固温度、融化温度下降，使温度敏感的物质与琼脂的共同应用成为可能。

（7）琼脂由琼脂糖和琼脂胶组成，其中琼脂糖是不含有硫酸酯（盐）的非离子型多糖，是形成凝胶的重要组分；而琼脂胶没有胶凝的功能，是带有硫酸酯（盐）、糖醛酸的复杂多糖。商业生产中期望获得硫酸根含量较低的琼脂，以替代价格昂贵的琼脂糖。而且硫酸盐含量与凝胶强度成反比，硫酸盐基团可能影响了分子间形成双螺旋的氢键，起扭结作用，从而阻碍凝胶网络的形成。本发明使改性后的琼脂硫酸盐含量下降，具有更高的品质。

（8）琼脂凝胶既可以吸收大量的水，又拥有可以封装生物活性物质的网络结构。这些优势使其成为药物应用的合适载体，本发明琼脂改性后引入了羧基基团，羧基基团在聚合物之间电离产生静电斥力，扩大了凝胶网络，同时由于改性后琼脂的热稳定性变差，因此溶胀性变好，更多的水可以渗透到水凝胶网络，有利于包埋更多的物质。

附图说明

图1为不同乙醇浓度下的琼脂性质；

图2为不同戊二酸酐含量下的琼脂性质；

图3为不同反应温度下的琼脂性质；

图4为不同反应时间下的琼脂性质；

图5为不同反应pH下的琼脂性质；

图6为原琼脂和戊二酸酐改性琼脂的红外图；

图7为原琼脂（左）和戊二酸酐改性琼脂（右）的透明度；

图8为原琼脂（左）和戊二酸酐改性琼脂（右）的溶胀性；

图9为原琼脂（左）和戊二酸酐改性琼脂（右）的生物培养基。

具体实施方式

为让本发明的上述特征和优点能更明显易懂，下文特举实施例，作详细说明。本发明的方法如无特殊说明，均为本领域常规方法。

1.高品质琼脂的优选

1.1乙醇浓度的优选

（1）称取10g的原琼脂粉，加入100mL不同体积分数的乙醇溶液；

（2）逐滴加入3g经45mL无水乙醇溶解的戊二酸酐进行酯化，边滴加边控制在30℃下进行搅拌；

（3）控制酸酐在1.0h滴加完毕，并在反应过程中使用3wt%NaOH溶液调节反应体系pH在8.0-8.5内；

（4）继续反应0.5h后，立即过滤，洗涤、干燥、粉碎过筛。

结果如图1所示，随着乙醇浓度的增加，取代度逐渐下降，强度逐渐上升，透明度在0-75%乙醇体积浓度范围时变化不大，但是当为100%时，透明度明显下降，综合透明度、强度、取代度及成本问题，选择25%的乙醇体积浓度。

1.2戊二酸酐添加量的优选

（1）称取10g的原琼脂粉，加入100mL体积分数25%的乙醇溶液；

（2）逐滴加入不同质量经无水乙醇溶解的戊二酸酐（戊二酸酐与无水乙醇质量体积比为1：15 g/ml）进行酯化，边滴加边控制在30℃下进行搅拌；

（3）控制酸酐在1.0h滴加完毕，并在反应过程中使用3wt%NaOH溶液调节反应体系pH在8.0-8.5内；

（4）继续反应0.5h后，立即过滤，洗涤、干燥、粉碎过筛。

结果如图2所示，取代度随着GA添加量上升而增加，强度随着GA添加量上升而下降，当GA添加量为30%后，透明度就不再上升，因此选择30%(3g)的GA添加量。

1.3反应温度的优选

（1）称取10g的原琼脂粉，加入100mL体积分数25%的乙醇溶液；

（2）逐滴加入3g经45mL无水乙醇溶解的戊二酸酐进行酯化，边滴加边控制在不同温度下进行搅拌；

（3）控制酸酐在1.0h滴加完毕，并在反应过程中使用3wt%NaOH溶液调节反应体系pH在8.0-8.5内；

（4）继续反应0.5h后，立即过滤，洗涤、干燥、粉碎过筛。

结果如图3所示，取代度和透明度随着温度上升而下降，强度上升，因此选择30℃。

1.4反应时间的优选

（1）称取10g的原琼脂粉，加入100mL体积分数25%的乙醇溶液；

（2）逐滴加入3g经45mL无水乙醇溶解的戊二酸酐进行酯化，边滴加边控制在30℃下进行搅拌；

（3）控制酸酐在1.0h滴加完毕，并在反应过程中使用3wt%NaOH溶液调节反应体系pH在8.0-8.5内；

（4）继续反应一段时间后，立即过滤，洗涤、干燥、粉碎过筛。

结果如图4所示，取代度、透明度、凝胶强度均随着时间增加而下降，因此选择1.5h。

1.5反应pH的优选

（1）称取10g的原琼脂粉，加入100mL体积分数25%的乙醇溶液；

（2）逐滴加入3g经45mL无水乙醇溶解的戊二酸酐进行酯化，边滴加边控制在30℃下进行搅拌；

（3）控制酸酐在1.0h滴加完毕，并在反应过程中使用3wt%NaOH溶液调节反应体系pH处于不同值；

（4）继续反应0.5h后，立即过滤，洗涤、干燥、粉碎过筛。

结果如图5所示，取代度和透明度在pH 8.0-8.5达到了最大值，因此选择反应pH为8.0-8.5。

实施例1

一种高品质琼脂的制备方法，包括如下步骤：

（1）称取10g的琼脂粉，加入100mL体积分数25%的乙醇溶液；

（2）逐滴加入3g经45mL无水乙醇溶解的戊二酸酐进行酯化，边滴加边控制在30℃下进行搅拌；

（3）控制戊二酸酐在1h滴加完毕，并在反应过程中使用3wt%NaOH溶液调节反应体系pH在8.0-8.5内；

（4）继续反应0.5h后，立即过滤，用去离子水洗涤、干燥、粉碎过筛得到高品质戊二酸酐改性琼脂。

根据以上优选结果，得到的高品质琼脂取代度为0.1009，透明度为75.53%，相较原琼脂40.8%提高了85%，凝胶强度为861 g/cm²，相较原琼脂1213.4 g/cm²降低了29.04%，但是仍在高强度标准800 g/cm²以上。

表（1）

由表1中数据可以直观看出，改性后的高品质琼脂凝固温度、融化温度、溶解温度、3-6内醚、硫酸根含量下降，粘度上升。

从图6中可以看出，酯化反应过后，所制得的琼脂不仅存在原琼脂的吸收振动峰，还在1716.33cm^-1与1583.67cm^-1处出现新的振动吸收峰根据化合物基团的振动规律可知，在1716.33cm^-1处的吸收峰是由于酯类化合物的C=O伸缩振动产生的，1583.67cm^-1处的吸收峰是由于RCOO-不对称振动产生的。这说明经改性处理后，琼脂与戊二酸酐成功地发生了酯化反应。

从图7可直观看出，原琼脂经酯化改性后，其透明度得到了显著的提高。这是由于琼脂经过改性后，酯化反应使琼脂分子中的羟基(-OH) 被开环所取代，阻止了琼脂分子间氢键的形成，这会破坏分子间的氢键作用，使分子间变得松散，阻碍了琼脂分子间的相互缔合，缔合作用的减少使得光线更易穿透；同时由于亲水性羧基的引入增大了琼脂分子在水中的分散程度，使光线对其的通透性增强，而且琼脂颗粒的吸水膨胀能力增强，更容易水合，因此透明度上升。

图8 可以看出改性后的高品质琼脂不易溶胀。

实施例2

高品质琼脂作乳化剂的应用，包括如下步骤：

（1）分别取 0.45g 高品质戊二酸酐改性琼脂和原琼脂，加入30 mL 水，微波溶解；

（2）将琼脂溶液置于75℃水浴锅中保温 10min；

（3）加入 1mL 大豆油，进行高速剪切 3 min，得到乳液。

（4）对制备好的乳液，利用分光光度计法测定其乳化性大小和乳化稳定性，乳化性大小为戊二酸酐改性琼脂：0.151±0.026，原琼脂：0.188±0.035，而且乳化稳定性也有所提高，说明改性琼脂作乳化剂时性能跟原琼脂有所提高。

实施例3

高品质琼脂作生物培养基（LB培养基）的应用，包括如下步骤：

（1）培养基的制备：称取1 g细菌学蛋白胨，0.5 g酵母粉，1 g NaCl，再加入占总体系2%的改性琼脂和原琼脂，加水100 ml，用1 mol/L的NaOH溶液调节pH为7.5。在高温灭菌锅中灭菌21 min。

（2）将灭菌之后的培养液冷却至60℃左右后，在超净工作台上，倒入培养皿中。待凝固后，采用平板划线法接大肠杆菌。

（3）完成上述步骤后，将培养皿置于37℃培养箱中培养24h。观察其成长状态。

（4）通过图9说明改性琼脂培养基比原琼脂更加透明，更利于观察菌落的生长情况。

以上为本发明的优选实施例，仅用于更好的理解本发明，并不能对本发明做任何限定。对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。因此依本发明权利要求所作的等同变化，均可认为是本发明所涵盖的范围。

Claims (6)

1.一种高品质琼脂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）称取一定量的琼脂粉，加入乙醇溶液；

（2）逐滴加入适量的经有机试剂溶解的戊二酸酐进行酯化，边滴加边在一定温度下进行搅拌；

（3）控制戊二酸酐在1h滴加完毕，并在反应过程中使用NaOH溶液调节反应体系pH；

（4）继续反应一定时间后，立即过滤，用去离子水洗涤、干燥、粉碎过筛得到高品质戊二酸酐改性琼脂。

2.根据权利要求1所述的一种高品质琼脂的制备方法，其特征在于，所述的步骤1）中：乙醇溶液体积分数为25%。

3.根据权利要求1所述的一种高品质琼脂的制备方法，其特征在于，所述的步骤2）中有机试剂是无水乙醇，戊二酸酐与无水乙醇的质量体积比为1：15 g/ml。

4.根据权利要求1所述的一种高品质琼脂的制备方法，其特征在于，所述的步骤2）中：戊二酸酐的质量为琼脂粉的30%，搅拌温度为30℃。

5.根据权利要求1所述的一种高品质琼脂的制备方法，其特征在于，所述的步骤3）中：在滴加过程中用3wt%浓度的NaOH溶液控制pH为8~8.5。

6.根据权利要求1所述的一种高品质琼脂的制备方法，其特征在于，所述的步骤4）中：继续反应0.5h。