CN109991221A - 一种脯氨酸氨基肽酶检测试纸的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种脯氨酸氨基肽酶检测试纸的制备方法，所用浸液中底物为脯氨酰类衍生物，有良好的灵敏度；分散剂单独或联合使用可以增加试纸的分散能力，有助于颜色的均匀分布；稳定剂可以保护样本中的酶类物质，提高检测的准确度；生物缓冲体系为反应体系提供一个良好的中性的反应环境。本发明采用浸渍干燥机自动化干燥方法制备检测试纸，浸渍干燥方式具有便捷、省时、可自动化的优势，有效控制试纸制备过程中人工误差带来的影响，浸渍干燥机主副加热，对温度全面进行监控，温度设定在规定的范围内，可以大大减少试纸批次之间的误差，保证试纸制备的准确性、稳定性及均一性。

Description

一种脯氨酸氨基肽酶检测试纸的制备方法
技术领域
本发明属于体外诊断试剂技术领域，具体涉及一种脯氨酸氨基肽酶检测试纸的制备方法。
背景技术
细菌性阴道病(BV)是由阴道加德纳菌和一些厌氧菌混合感染所致的无阴道粘膜炎性改变的综合征，在细菌学上表现为生殖道正常菌群(主要为乳酸杆菌)减少，代之以阴道加德纳菌、厌氧菌、嗜血杆菌、动弯杆菌(常见于BV患者阴道分泌物中的细菌)等增加的临床症侯群。同时BV可造成产褥感染、胎膜早破、早产、新生儿感染等妊娠不良和妊娠并发症。因此，在妇科、产科以及施行流产术前进行BV检查具有十分重要的意义。BV的感染率高且容易复发，常与急、慢性盆腔炎、宫颈炎、输卵管炎及相关疾病如异位妊娠、不孕症等有密切的联系。
BV诊断的传统方法是Amsel法，也是目前国际公认诊断细菌性阴道炎的金标准方法，方法中论述，NSV(非特异性阴道炎)诊断标准以下四项指标满足任意三个(线索细胞是必要项)即为细菌性阴道炎。
(1)pH＞4.5；
(2)阴道分泌物均质稀薄；
(3)胺试验阳性，即阴道分泌物有氨臭味或加入10％氢氧化钾有鱼腥味；
(4)湿片镜检(400x)，出现线索细胞。
而Nugent革兰染色评分，也被引用英国细菌性阴道病指导方针，同样作为国际诊断细菌性阴道炎的金标准方法，是20世纪90年代由RobeaNugent首先提出，之后被视为实验室诊断BV的金标准。Nugent革兰染色评分法是选定正常人和BV患者阴道分泌物中出现的4种优势菌形态并用半定量评估法对分泌物标本进行评分。
4种优势菌形态的代表菌是乳酸杆菌(大型革兰阳性杆菌)、阴道加德纳菌和普雷沃菌(小型革兰阴性菌或球杆菌)、动弯杆菌(梭形弯曲杆菌)。
通过阴道分泌物革兰氏染色涂片，在诊断BV时，从正常到BV，对乳酸杆菌、阴道加德纳杆菌、动弯杆菌，从0分到10分的打分系统。
取阴道分泌物涂片进行革兰染色，油镜下(1000x)观察20个视野找线索细胞进行细菌评分。参照Nugent评分标准大于6分诊断为BV，4-6分属于中间态，小于4分属于正常，Nugent评分＝乳酸杆菌+加特纳杆菌或类杆菌+动弯杆菌。
表1
Nugent革兰染色评分法的优势在于更适用于临床研究及普查，可将阴道菌群分为正常态(0～3分)、过渡态(4～6分)和BV态(7～10分)；缺点是由于高比例的过渡态菌群而不易确定治愈率，并需培训专业人员，临床普及受到一定限制。
脯氨酸氨基肽酶(PIP)是由阴道加德纳菌、动弯杆菌和其他一些厌氧菌产生，是BV相关病原体所分泌的特异性标志酶，同时也是诊断细菌性淋球菌的辅助手段，故阴道分泌物中存在脯氨酸氨基肽酶活性即可诊断BV。脯氨酸氨基肽酶检测试纸的诊断原理是阴道分泌物中BV相关病原体所分泌的脯氨酸氨基肽酶在室温条件下分解底物L-脯氨酰基-β-萘胺(L-Prolyl-β-naphthylamide)并显示颜色变化，在有脯氨酸氨基肽酶底物和色原的试纸上进行，将采样后的植绒拭子在细胞保存液中进行充分涮洗，将涮洗后的样本滴加至检测试纸上显现红色或黄色变化则表示BV阳性，若无颜色变化则表示为BV阴性。在阴道微生态菌群中，普雷沃菌、部分加德纳菌和拟杆菌是唾液酸苷酶活性增加的主要病原菌，而部分加德纳菌、动弯杆菌和其他一些厌氧菌则具有脯氨酸氨基肽酶活性，所以应用唾液酸苷酶结合脯氨酸氨基肽酶判断细菌性阴道病更准确和完善，能够检测95％以上的细菌性阴道病。
虽然目前临床上诊断BV仍沿用Amsel金标准方法，但在临床实践中上述诊断方法实际操作较为烦琐、费时且要借助大量的主观判断，对观察者的技能有较高的依赖性。此外，诊断时容易受阴道灌洗、近期性生活及炎症细胞的干扰，阳性标准难以统一。
发明内容
本发明要解决现有技术中的技术问题，提供一种脯氨酸氨基肽酶检测试纸的制备方法，本发明制备的检测试纸具有检测速度快，灵敏度高、特异性好的优势，与类似产品相比操作简单，适宜普及。
为了解决上述技术问题，本发明的技术方案具体如下：
一种脯氨酸氨基肽酶检测试纸的制备方法，包括以下步骤：
步骤1、浸液的制备
所述浸液包括底物、缓冲溶液、稳定剂和分散剂；
将底物溶解于带有缓冲溶液、稳定剂和分散剂的溶液中，制备得到所述浸液；
所述底物为脯氨酰类衍生物；
所述稳定剂为海藻糖、半乳糖或者阿拉伯糖；
所述分散剂为PVP-K90、PEG-2000、PEG-4000和PEG-6000中的一种或多种；
所述缓冲溶液为柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液、哌嗪-1,4-乙二磺酸缓冲液(PIPES)、4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液(HEPES)、N-(2-乙酰胺基)-2-亚氨基二乙酸缓冲液(ADA)、N-(2-乙酰氨基)-2-氨基乙烷磺酸缓冲液(ACES)、2-(N-吗啉基)乙磺酸缓冲液(MES)、3-(N-吗啡啉)丙磺酸缓冲液(MOPS)或者3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸缓冲液(MOPSO)；
步骤2、检测试纸的制备
用步骤1制备的浸液、采用浸渍干燥机自动化干燥方法制备检测试纸；
所述浸渍干燥机温度设定：
开机后将设备温度主加热设定70-90℃，副加热设定50-70℃，待主机加热温度达到70-90℃，各干燥室温度达到58-62℃时开始浸液；浸渍干燥机走速设定：6.0-12.0Hz。
在上述技术方案中，步骤2具体包括以下步骤：
(1)按开机流程将浸渍干燥机打开，开机后将设备温度主加热设定70-90℃，副加热设定50-70℃，待主机加热温度达到70-90℃，各干燥室温度达到58-62℃时开始浸液；
(2)将滤纸进行悬挂，浸液槽安装好；
(3)将步骤1配制好的浸液倒入浸渍槽中，浸液量应在浸渍槽的1/2处，调节浸液注入的速度；
(4)开启走纸开关，用压纸轮将滤纸浸入浸液中，记录浸液位置高度；浸渍干燥机走速设定：6.0-12.0Hz；
(5)待滤纸全部从干燥室走出，关闭走纸开关，将滤纸做好标识，放入装有干燥剂的自封袋中即可。
在上述技术方案中，浸渍干燥机的主加热设定为75℃-85℃。
在上述技术方案中，所述底物为L-脯氨酰对硝基苯三氟乙酸盐、N-苷氨酰-脯氨酰对硝基苯胺-对甲苯磺酸盐、甘氨酸-脯氨酰-4-甲氧基-β-萘胺盐酸盐、N-(2-苯甲酰苯基)-D-脯氨酰胺、N-(2-噻吩磺酰基)-L-脯氨酰胺三氟乙酸盐、(2R)-N-(2-苯甲酰基苯基)-1-(苯基甲基)-2-吡咯烷甲酰胺、Z-Gly-甘氨酰脯氨酰对硝基苯胺或者L-脯氨酸-α-萘胺。
在上述技术方案中，所述底物的浓度为1.00-20.00mg/mL，所述稳定剂的浓度为1.00-20.00mg/mL，所述分散剂的浓度为1.00-20.00mg/mL，所述缓冲溶液的浓度为10.0-100.0mM、pH范围在6.0-9.0。
在上述技术方案中，所述缓冲溶液的浓度为50.0-70.0mM、pH范围在6.5-8.5。
在上述技术方案中，检测体系pH值为6.5-8.5。
在上述技术方案中，所述滤纸类型为7218型滤纸、31ET型滤纸、3MM型滤纸、526型滤纸或319型滤纸。
本发明的有益效果是：
本发明提供的脯氨酸氨基肽酶检测试纸的制备方法为一步浸液法，操作方法简便、节省工时，灵敏度高，配方中所用缓冲液廉价易配易得；浸液中底物为脯氨酰类衍生物，有良好的灵敏度；分散剂PVP-K90、PEG-2000、PEG-4000、PEG-6000单独或联合使用可以增加试纸的分散能力，有助于颜色的均匀分布；稳定剂海藻糖、半乳糖或者阿拉伯糖可以保护样本中的酶类物质，提高检测的准确度；柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液、哌嗪-1,4-乙二磺酸缓冲液(PIPES)、4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液(HEPES)、N-(2-乙酰胺基)-2-亚氨基二乙酸缓冲液(ADA)、N-(2-乙酰氨基)-2-氨基乙烷磺酸缓冲液(ACES)、2-(N-吗啉基)乙磺酸缓冲液(MES)、3-(N-吗啡啉)丙磺酸缓冲液(MOPS)或3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸缓冲液(MOPSO)的生物缓冲体系为反应体系提供一个良好的中性的反应环境。
本发明提供的脯氨酸氨基肽酶检测试纸的制备方法，采用浸渍干燥机自动化干燥方法制备检测试纸，开机后将设备温度主加热设定为70℃-90℃、最佳温度75℃-85℃，副加热设定50-70℃，待主机加热温度达到70-90℃，各干燥室温度达到60℃左右时开始浸液；上述浸渍干燥方式具有便捷、省时、可自动化的优势，有效控制试纸制备过程中人工误差带来的影响，浸渍干燥机主副加热，对温度全面进行监控，温度设定在规定的范围内，可以大大减少试纸批次之间的误差，保证试纸制备的准确性、稳定性及均一性。并将浸渍干燥机走速设定：6.0-12.0Hz；走速的设定是根据试纸在验证过程中逐步确认，走速的快慢会影响试纸的干燥程度，对试纸的外观及准确度有一定影响。
本发明提供制备的脯氨酸氨基肽酶检测试纸，依据脯氨酰类衍生物为底物，阴道微生态环境中存在脯氨酸氨基肽酶，水解底物释放出对硝基苯胺，产物在白色试纸上显现出黄色，且产物的呈色深度均与酶活性成正比。本发明中试剂配制简便，使用方便，容易操作，检测时不需要显微镜等特殊设备，结合迪瑞GMD-S600全自动妇科分泌物分析系统，在8-10min内即可出结果，具有检测速度快，灵敏度高、特异性好的优势，与类似产品相比操作简单，适宜普及。
本发明提供制备的脯氨酸氨基肽酶检测试纸既可作为淋病检测指标，也可作为细菌阴性病重要检测指标。医学上常用脯氨酸氨基肽酶试验和脯氨酸氨基肽酶试验均呈阳性时，诊断分泌物中含有淋球菌，同时用脯氨酸氨基肽酶试验和唾液酸苷酶试纸呈阳性，联合诊断细菌阴性病，患者的分泌物中可能存在多种致病菌群，脯氨酸氨基肽酶则主要检测动弯杆菌、阴道加德纳菌、杜克雷嗜血杆菌，而唾液酸酶主要检测加德纳菌、普雷沃菌等菌群。经大量实验证明，细菌性阴道病(BV)检测试纸选取阴道分泌物的唾液酸苷酶、脯氨酸氨基肽酶作为检测指标，阴道分泌物中的唾液酸酶、脯氨酸氨基肽酶活性与BV之间存在一定的量的关系。二者指标联合检测，相辅相成，并结合镜下线索细胞，使细菌性阴道病的检测可高达到99％以上。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明。
图1为本发明制备的脯氨酸氨基肽酶检测试纸成品的结构示意图。
图2为本发明采用浸渍干燥机自动化干燥方法制备检测试纸的干燥流程图。
具体实施方式
本发明的发明思想为：
本发明的目的是提供一种脯氨酸氨基肽酶检测试纸的制备方法，本发明提供的检测脯氨酸氨基肽酶测定干化学试纸，分散在试纸块中主要为固化的底物，所述底物为L-脯氨酰对硝基苯三氟乙酸盐等类似衍生物，也可以是Z-Gly-甘氨酰脯氨酰对硝基苯胺、L-脯氨酸-α-萘胺等类似衍生物。根据所用的底物不同，方法存在一定差异：
(1)重氮化法(以L-脯氨酰对硝基苯为例)：
脯氨酸氨基肽酶水解底物L-脯氨酰对硝基苯释放出对硝基苯胺，对硝基苯胺在酸性缓冲溶液中(如Tris-HCl缓冲液或者磷酸缓冲液)与亚硝酸钠发生重氮化反应，生成的重氮化合物与N-(1-萘基)乙二胺二盐酸在无水乙醇溶液偶合反应呈红色。产物的呈色深度均与酶活性成正比，若不显色或者呈现浅色标记为阴性，反之标记为阳性；若呈现阳性，则指示可能BV感染(指示部分细菌性阴道病)。
(2)干化学一步法(以L-脯氨酰对硝基苯为例)：
阴道分泌物存在脯氨酸氨基肽酶，在近中性及偏碱性条件下，水解L-脯氨酰对硝基苯，底物释放出对硝基苯胺，产物在白色试纸上显现出黄色对硝基苯胺，且产物的呈色深度均与酶活性成正比，
(1)当分泌物中不含有脯氨酸氨基肽酶时，不显色(标记为“-”)表示阴性，指示阴道状态正常；
(2)当分泌物含有脯氨酸氨基肽酶时，显浅红色或红色(标记为“±”或“+”)，指示可能细菌性阴道病感染；
本发明中采用干化学试纸法(以L-脯氨酰对硝基苯三氟乙酸盐为底物)：
所述固化的试纸块：所述试纸块的底物可以是脯氨酰类衍生物，如L-脯氨酰对硝基苯三氟乙酸盐、N-苷氨酰-脯氨酰对硝基苯胺-对甲苯磺酸盐、甘氨酸-脯氨酰-4-甲氧基-β-萘胺盐酸盐、N-(2-苯甲酰苯基)-D-脯氨酰胺、N-(2-噻吩磺酰基)-L-脯氨酰胺三氟乙酸盐、(2R)-N-(2-苯甲酰基苯基)-1-(苯基甲基)-2-吡咯烷甲酰胺、Z-Gly-甘氨酰脯氨酰对硝基苯胺、L-脯氨酸-α-萘胺等，本发明中以L-脯氨酰对硝基苯三氟乙酸盐等为底物，将底物先溶解于带缓冲能力及辅助试剂的浸液中，所述辅助试剂可以是稳定剂、分散剂。用浸液浸润滤纸，在进行浸渍干燥制备。所述浸液干燥的温度范围为70℃-90℃，最佳范围在75℃-85℃。所述带缓冲能力的浸液的缓冲pH范围在6.0-9.0，最佳范围在6.5-8.5，缓冲浓度在10.0-100.0mM，最佳范围在50.0-70.0mM。按照所述的最适的干燥条件，经一步浸渍干燥，再经过裁切即成为一步法检测脯氨酸氨基肽酶的检测干化学试块，用双面胶带将其固定到聚苯乙烯材质白瓷基片上即可制备成成品，其结构示意图参见图1。
这种脯氨酸氨基肽酶干化学试纸的简易测定方法为：取稀释的样本，滴加一滴样本在试纸块上，于37℃温浴8-10min，观察过脯氨酸氨基肽酶纸块的的颜色变化，试纸块有无色变成浅黄色、黄色，即判定为脯氨酸氨基肽酶阳性。
本发明提供的脯氨酸氨基肽酶检测试纸的制备方法，包括以下步骤：
步骤1、浸液的制备
所述浸液包括：底物、缓冲溶液和辅助试剂；
将底物溶于带有缓冲溶液和辅助试剂的溶液中，制备得到所述浸液；
所述浸液中：
所述缓冲溶液可以是50.0-70.0mM柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液、哌嗪-1,4-乙二磺酸缓冲液(PIPES)、4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液(HEPES)、N-(2-乙酰胺基)-2-亚氨基二乙酸缓冲液(ADA)、N-(2-乙酰氨基)-2-氨基乙烷磺酸缓冲液(ACES)、2-(N-吗啉基)乙磺酸缓冲液(MES)、3-(N-吗啡啉)丙磺酸缓冲液(MOPS)或者3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸缓冲液(MOPSO)；
所述底物可以是1.00-20.00mg/mL L-脯氨酰对硝基苯三氟乙酸盐、N-苷氨酰-脯氨酰对硝基苯胺-对甲苯磺酸盐、甘氨酸-脯氨酰-4-甲氧基-β-萘胺盐酸盐、N-(2-苯甲酰苯基)-D-脯氨酰胺、N-(2-噻吩磺酰基)-L-脯氨酰胺三氟乙酸盐、(2R)-N-(2-苯甲酰基苯基)-1-(苯基甲基)-2-吡咯烷甲酰胺、Z-Gly-甘氨酰脯氨酰对硝基苯胺或L-脯氨酸-α-萘胺；
所述稳定剂可以是1.00-20.00mg/mL海藻糖、半乳糖或阿拉伯糖；
所述分散剂可以是1.00-20.00mg/mL PVP-K90、PEG-2000、PEG-4000和PEG-6000中的一种或多种；
体系pH值为6.5-8.5；
本发明所用滤纸类型优选：7218型滤纸，31ET型滤纸，3MM型滤纸，526型滤纸或319型滤纸。
本发明的浸液配方优势分析：浸液中底物对脯氨酸氨基肽酶有良好的灵敏度；分散剂PVP-K90、PEG-2000、PEG-4000、PEG-6000单独或联合使用可以增加试纸的分散能力，有助于颜色的均匀分布；稳定剂海藻糖、半乳糖、阿拉伯糖可以保护样本中的酶类物质，提高检测的准确度；柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液、哌嗪-1,4-乙二磺酸缓冲液(PIPES)、4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液(HEPES)、N-(2-乙酰胺基)-2-亚氨基二乙酸缓冲液(ADA)、N-(2-乙酰氨基)-2-氨基乙烷磺酸缓冲液(ACES)、2-(N-吗啉基)乙磺酸缓冲液(MES)、3-(N-吗啡啉)丙磺酸缓冲液(MOPS)、3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸缓冲液(MOPSO)，生物缓冲体系为反应体系提供一个良好的中性的反应环境。
步骤2、检测试纸的制备
用步骤1制备的浸液、采用浸渍干燥机自动化干燥方法制备检测试纸；
所述浸渍干燥机温度设定：
开机后将设备温度主加热设定70-90℃，副加热设定50-70℃，待主机加热温度达到70-90℃，各干燥室温度达到58-62℃时开始浸液；浸渍干燥机走速设定：6.0-12.0Hz。
采用浸渍干燥机自动化干燥方法制备检测脯氨酸氨基肽酶试纸的浸渍干燥流程(浸渍干燥机自动化干燥方法)参见图2：
(1)按开机流程将浸渍干燥机打开，开机后将设备温度主加热设定70℃-90℃，副加热设定50-70℃，待主机加热温度达到70-90℃，各干燥室温度达到58-62℃时开始浸液；
(2)将滤纸进行悬挂，浸液槽安装好；
(3)将步骤1配制好的浸液倒入浸渍槽中，浸液量应在浸渍槽的1/2处，调节浸液注入的速度；
(4)开启走纸开关，用压纸轮将滤纸浸入浸液中，记录浸液位置高度；浸渍干燥机走速设定：6.0-12.0Hz；
(5)待滤纸全部从干燥室走出，关闭走纸开关，将滤纸做好标识，放入装有干燥剂的自封袋中即可。
上述浸渍干燥方式具有便捷、省时、可自动化的优势，有效控制试纸制备过程中人工误差带来的影响，浸渍干燥机主副加热，对温度全面进行监控，温度设定在规定的范围内，可以大大减少试纸批次之间的误差，保证试纸制备的准确性、稳定性及均一性。
浸渍干燥机走速设定：6.0-12.0Hz；
走速的设定是根据试纸在验证过程中逐步确认，走速的快慢会影响试纸的干燥程度，对试纸的外观及准确度有一定影响。
本发明制备的脯氨酸氨基肽酶检测试纸既可作为淋病检测指标，也可作为细菌阴性病重要检测指标。医学上常用脯氨酸氨基肽酶试验和脯氨酸氨基肽酶试验均呈阳性时，诊断分泌物中含有淋球菌，同时用脯氨酸氨基肽酶试验和唾液酸苷酶试纸呈阳性，联合诊断细菌阴性病，患者的分泌物中可能存在多种致病菌群，脯氨酸氨基肽酶则主要检测动弯杆菌、阴道加德纳菌、杜克雷嗜血杆菌，而唾液酸酶主要检测加德纳菌、普雷沃菌等菌群。经大量实验证明，细菌性阴道病(BV)检测试纸选取阴道分泌物的唾液酸苷酶、脯氨酸氨基肽酶作为检测指标，阴道分泌物中的唾液酸酶、脯氨酸氨基肽酶活性与BV之间存在一定的量的关系。二者指标联合检测，相辅相成，并结合镜下线索细胞，使细菌性阴道病的检测可高达到99％以上。
本发明依据脯氨酰类衍生物为底物，阴道微生态环境中存在脯氨酸氨基肽酶，水解底物释放出对硝基苯胺，产物在白色试纸上显现出黄色，且产物的呈色深度均与酶活性成正比。本发明中试剂配制简便，使用方便，容易操作，检测时不需要显微镜等特殊设备，结合迪瑞GMD-S600全自动妇科分泌物分析系统，在8-10min内即可出结果，具有检测速度快，灵敏度高、特异性好的优势，与类似产品相比操作简单，适宜普及。
实施案例一：脯氨酸氨基肽酶检测试纸的制备
浸液：50.0mM柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液；
5.0mg/mL L-脯氨酰对硝基苯三氟乙酸盐；
9.0mg/mL海藻糖；
7.0mg/mL PVP-K90；
pH值为7.5；
滤纸类型：31ET型滤纸
脯氨酸氨基肽酶试纸浸渍干燥机自动化干燥方法：
开机后将设备温度主加热设定80℃，副加热设定60℃，待主机加热温度达到80℃，各干燥室温度达到60℃左右时开始浸液；
浸渍干燥机走速设定：10.0Hz。
实施案例二：脯氨酸氨基肽酶检测试纸的制备
浸液：60.0mM哌嗪-1,4-乙二磺酸缓冲液；
5.0mg/mL N-苷氨酰-脯氨酰对硝基苯胺-对甲苯磺酸盐；
9.0mg/mL海藻糖；
7.0mg/mL PVP-K90；
pH值为7.5；
滤纸类型：31ET型滤纸
脯氨酸氨基肽酶试纸浸渍干燥机自动化干燥方法：
开机后将设备温度主加热设定80℃，副加热设定60℃，待主机加热温度达到80℃，各干燥室温度达到60℃左右时开始浸液；
浸渍干燥机走速设定：10.0Hz。
实施案例三：脯氨酸氨基肽酶检测试纸的制备
浸液：70.0mM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液(HEPES)；
5.0mg/mL甘氨酸-脯氨酰-4-甲氧基-β-萘胺盐酸盐；
9.0mg/mL海藻糖；
7.0mg/mL PVP-K90；
pH值为7.5；
滤纸类型：31ET型滤纸
脯氨酸氨基肽酶试纸浸渍干燥机自动化干燥方法：
开机后将设备温度主加热设定80℃，副加热设定60℃，待主机加热温度达到80℃，各干燥室温度达到60℃左右时开始浸液；
浸渍干燥机走速设定：10.0Hz。
实施案例四：脯氨酸氨基肽酶检测试纸的制备
浸液：50.0mMN-(2-乙酰胺基)-2-亚氨基二乙酸缓冲液(ADA)；
10.0mg/mLN-(2-噻吩磺酰基)-L-脯氨酰胺三氟乙酸盐；
9.0mg/mL半乳糖；
7.0mg/mL PEG-2000；
pH值为7.5；
滤纸类型：31ET型滤纸
脯氨酸氨基肽酶试纸浸渍干燥机自动化干燥方法：
开机后将设备温度主加热设定80℃，副加热设定60℃，待主机加热温度达到80℃，各干燥室温度达到60℃左右时开始浸液；
浸渍干燥机走速设定：10.0Hz。
实施案例五：脯氨酸氨基肽酶检测试纸的制备
浸液：50.0mM N-(2-乙酰氨基)-2-氨基乙烷磺酸缓冲液(ACES)；
15.0mg/mL Z-Gly-甘氨酰脯氨酰对硝基苯胺；
9.0mg/mL半乳糖；
7.0mg/mL PEG-4000；
pH值为7.5；
滤纸类型：31ET型滤纸
脯氨酸氨基肽酶试纸浸渍干燥机自动化干燥方法：
开机后将设备温度主加热设定80℃，副加热设定60℃，待主机加热温度达到80℃，各干燥室温度达到60℃左右时开始浸液；
浸渍干燥机走速设定：10.0Hz。
实施案例六：脯氨酸氨基肽酶检测试纸的制备
浸液：50.0mM2-(N-吗啉基)乙磺酸缓冲液(MES)；
10.0mg/mL L-脯氨酰对硝基苯三氟乙酸盐；
9.0mg/mL海藻糖；
7.0mg/mL PVP-K90；
pH值为7.5；
滤纸类型：31ET型滤纸
脯氨酸氨基肽酶试纸浸渍干燥机自动化干燥方法：
开机后将设备温度主加热设定80℃，副加热设定60℃，待主机加热温度达到80℃，各干燥室温度达到60℃左右时开始浸液；
浸渍干燥机走速设定：10.0Hz。
实施案例七：脯氨酸氨基肽酶检测试纸的制备
浸液：50.0mM3-(N-吗啡啉)丙磺酸缓冲液(MOPS)；
10.0mg/mL L-脯氨酰对硝基苯三氟乙酸盐；
9.0mg/mL阿拉伯糖；
7.0mg/mL PVP-K90；
pH值为7.5；
滤纸类型：31ET型滤纸
脯氨酸氨基肽酶试纸浸渍干燥机自动化干燥方法：
开机后将设备温度主加热设定80℃，副加热设定60℃，待主机加热温度达到80℃，各干燥室温度达到60℃左右时开始浸液；
浸渍干燥机走速设定：10.0Hz。
实施案例八：脯氨酸氨基肽酶检测试纸的制备
浸液：50.0mM3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸缓冲液(MOPSO)；
10.0mg/mL L-脯氨酸-α-萘胺；
9.0mg/mL半乳糖；
7.0mg/mL PEG-6000；
pH值为7.5；
滤纸类型：31ET型滤纸
脯氨酸氨基肽酶试纸浸渍干燥机自动化干燥方法：
开机后将设备温度主加热设定80℃，副加热设定60℃，待主机加热温度达到80℃，各干燥室温度达到60℃左右时开始浸液；
浸渍干燥机走速设定：10.0Hz。
实施案例九：脯氨酸氨基肽酶检测试纸的制备
浸液：50.0mM柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液；
10.0mg/mL N-苷氨酰-脯氨酰对硝基苯胺-对甲苯磺酸盐；
9.0mg/mL海藻糖；
7.0mg/mL PEG-6000；
pH值为7.5；
滤纸类型：31ET型滤纸
脯氨酸氨基肽酶试纸浸渍干燥机自动化干燥方法：
开机后将设备温度主加热设定80℃，副加热设定60℃，待主机加热温度达到80℃，各干燥室温度达到60℃左右时开始浸液；
浸渍干燥机走速设定：10.0Hz。
实施案例十：脯氨酸氨基肽酶检测试纸的制备
浸液：50.0mM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液(HEPES)；
10.0mg/mL L-脯氨酰对硝基苯三氟乙酸盐；
9.0mg/mL半乳糖；
7.0mg/mL PEG-4000；
pH值为7.5；
滤纸类型：31ET型滤纸
脯氨酸氨基肽酶试纸浸渍干燥机自动化干燥方法：
开机后将设备温度主加热设定80℃，副加热设定60℃，待主机加热温度达到80℃，各干燥室温度达到60℃左右时开始浸液；
浸渍干燥机走速设定：10.0Hz。
实施案例十一：脯氨酸氨基肽酶检测试纸的制备
浸液：50.0mM2-(N-吗啉基)乙磺酸缓冲液(MES)；
10.0mg/mL L-脯氨酰对硝基苯三氟乙酸盐；
9.0mg/mL阿拉伯糖；
7.0mg/mL PEG-2000；
pH值为7.5；
滤纸类型：31ET型滤纸
脯氨酸氨基肽酶试纸浸渍干燥机自动化干燥方法：
开机后将设备温度主加热设定80℃，副加热设定60℃，待主机加热温度达到80℃，各干燥室温度达到60℃左右时开始浸液；
浸渍干燥机走速设定：10.0Hz。
实施案例十二：脯氨酸氨基肽酶检测试纸的制备
浸液：50.0mM柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液；
5.0mg/mL L-脯氨酰对硝基苯三氟乙酸盐；
9.0mg/mL海藻糖；
7.0mg/mL PEG-4000；
pH值为7.5；
滤纸类型：31ET型滤纸
脯氨酸氨基肽酶试纸浸渍干燥机自动化干燥方法：
开机后将设备温度主加热设定80℃，副加热设定60℃，待主机加热温度达到80℃，各干燥室温度达到60℃左右时开始浸液；
浸渍干燥机走速设定：10.0Hz。
实施案例十三：脯氨酸氨基肽酶检测试纸的制备
浸液：60.0mM柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液；
5.0mg/mL N-(2-噻吩磺酰基)-L-脯氨酰胺三氟乙酸盐；
9.0mg/mL海藻糖；
7.0mg/mL PVP-K90；
pH值为7.5；
滤纸类型：31ET型滤纸
脯氨酸氨基肽酶试纸浸渍干燥机自动化干燥方法：
开机后将设备温度主加热设定80℃，副加热设定60℃，待主机加热温度达到80℃，各干燥室温度达到60℃左右时开始浸液；
浸渍干燥机走速设定：10.0Hz。
实施案例十四：脯氨酸氨基肽酶检测试纸的制备
浸液：70.0mM柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液；
5.0mg/mL L-脯氨酰对硝基苯三氟乙酸盐；
9.0mg/mL阿拉伯糖；
7.0mg/mL PVP-K90；
pH值为7.5；
滤纸类型：31ET型滤纸
脯氨酸氨基肽酶试纸浸渍干燥机自动化干燥方法：
开机后将设备温度主加热设定80℃，副加热设定60℃，待主机加热温度达到80℃，各干燥室温度达到60℃左右时开始浸液；
浸渍干燥机走速设定：10.0Hz。
实施案例十五：脯氨酸氨基肽酶检测试纸的制备
浸液：50.0mM3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸缓冲液(MOPSO)；
5.0mg/mL L-脯氨酰对硝基苯三氟乙酸盐；
9.0mg/mL半乳糖；
7.0mg/mL PEG-2000；
pH值为7.5；
滤纸类型：3MM型滤纸
脯氨酸氨基肽酶试纸浸渍干燥机自动化干燥方法：
开机后将设备温度主加热设定80℃，副加热设定60℃，待主机加热温度达到80℃，各干燥室温度达到60℃左右时开始浸液；
浸渍干燥机走速设定：10.0Hz。
实施案例十六：脯氨酸氨基肽酶检测试纸的制备
浸液：50.0mM 2-(N-吗啉基)乙磺酸缓冲液(MES)；
5.0mg/mL(2R)-N-(2-苯甲酰基苯基)-1-(苯基甲基)-2-吡咯烷甲酰胺；
9.0mg/mL海藻糖；
7.0mg/mL PVP-K90；
pH值为7.5；
滤纸类型：319型滤纸
脯氨酸氨基肽酶试纸浸渍干燥机自动化干燥方法：
开机后将设备温度主加热设定80℃，副加热设定60℃，待主机加热温度达到80℃，各干燥室温度达到60℃左右时开始浸液；
浸渍干燥机走速设定：10.0Hz。
实施案例十七：脯氨酸氨基肽酶检测试纸的制备
浸液：15.0mM 2-(N-吗啉基)乙磺酸缓冲液(MES)；
5.0mg/mL N-(2-苯甲酰苯基)-D-脯氨酰胺；
1.5mg/mL海藻糖；
1.0mg/mL PVP-K90；
pH值为7.0；
滤纸类型：7218型滤纸
脯氨酸氨基肽酶试纸浸渍干燥机自动化干燥方法：
开机后将设备温度主加热设定70℃，副加热设定60℃，待主机加热温度达到70℃，各干燥室温度达到60℃左右时开始浸液；
浸渍干燥机走速设定：7.0Hz。
实施案例十八：脯氨酸氨基肽酶检测试纸的制备
浸液：90.0mM2-(N-吗啉基)乙磺酸缓冲液(MES)；
20.0mg/mL(2R)-N-(2-苯甲酰基苯基)-1-(苯基甲基)-2-吡咯烷甲酰胺；
18.0mg/mL海藻糖；
17.0mg/mL PVP-K90；
pH值为8.0；
滤纸类型：526型滤纸
脯氨酸氨基肽酶试纸浸渍干燥机自动化干燥方法：
开机后将设备温度主加热设定90℃，副加热设定60℃，待主机加热温度达到90℃，各干燥室温度达到60℃左右时开始浸液；
浸渍干燥机走速设定：10.0Hz。
本发明实施例1制备的脯氨酸氨基肽酶的试纸性能评估
①外观目测
随机抽取制备试纸10条，以正常视力检查试纸外观性能指标，应符合要求：1)表面应平整、边缘无毛刺；2)测试块外观整齐、色泽均匀。10次目测结果均合格。
②准确度检测
取用制备的试纸对检测项目各浓度水平的参考溶液进行检测，每个浓度水平重复测定5次，阳性参考溶液不得出现阴性结果，阴性参考溶液不得出现阳性结果。(结果如表2所示)
表2准确度数据
测定次数 阴性参考溶液 阳性低值 阳性高值
Rep1 阴性 弱阳性 阳性
Rep2 阴性 弱阳性 阳性
Rep3 阴性 弱阳性 阳性
Rep4 阴性 弱阳性 阳性
Rep5 阴性 弱阳性 阳性
③重复性检测
随机抽取制备的试纸条10条，对第一个非阴性量级进行检测，所有检测结果不为阴性，第一个非阴性量级均应能准确检出。(结果如表3所示)
表3检出限数据
本发明实施例4制备的脯氨酸氨基肽酶的试纸性能评估
①外观目测
随机抽取制备试纸10条，以正常视力检查试纸外观性能指标，应符合要求：1)表面应平整、边缘无毛刺；2)测试块外观整齐、色泽均匀。10次目测结果均合格。
②准确度检测
取用制备的试纸对检测项目各浓度水平的参考溶液进行检测，每个浓度水平重复测定5次，阳性参考溶液不得出现阴性结果，阴性参考溶液不得出现阳性结果。(结果如表4所示)
表4准确度数据
测定次数 阴性参考溶液 阳性低值 阳性高值
Rep1 阴性 弱阳性 阳性
Rep2 阴性 弱阳性 阳性
Rep3 阴性 弱阳性 阳性
Rep4 阴性 弱阳性 阳性
Rep5 阴性 弱阳性 阳性
③重复性检测
随机抽取制备的试纸条10条，对第一个非阴性量级进行检测，所有检测结果不为阴性，第一个非阴性量级均应能准确检出。(结果如表5所示)
表5检出限数据
测定次数 阳性低值
Rep1 弱阳性
Rep2 弱阳性
Rep3 弱阳性
Rep4 弱阳性
Rep5 弱阳性
Rep6 弱阳性
Rep7 弱阳性
Rep8 弱阳性
Rep9 弱阳性
Rep10 弱阳性
本发明实施例6制备的脯氨酸氨基肽酶的试纸性能评估
①外观目测
随机抽取制备试纸10条，以正常视力检查试纸外观性能指标，应符合要求：1)表面应平整、边缘无毛刺；2)测试块外观整齐、色泽均匀。10次目测结果均合格。
②准确度检测
取用制备的试纸对检测项目各浓度水平的参考溶液进行检测，每个浓度水平重复测定5次，阳性参考溶液不得出现阴性结果，阴性参考溶液不得出现阳性结果。(结果如表6所示)
表6准确度数据
测定次数 阴性参考溶液 阳性低值 阳性高值
Rep1 阴性 弱阳性 阳性
Rep2 阴性 弱阳性 阳性
Rep3 阴性 弱阳性 阳性
Rep4 阴性 弱阳性 阳性
Rep5 阴性 弱阳性 阳性
③重复性检测
随机抽取制备的试纸条10条，对第一个非阴性量级进行检测，所有检测结果不为阴性，第一个非阴性量级均应能准确检出。(结果如表7所示)
表7检出限数据
测定次数 阳性低值
Rep1 弱阳性
Rep2 弱阳性
Rep3 弱阳性
Rep4 弱阳性
Rep5 弱阳性
Rep6 弱阳性
Rep7 弱阳性
Rep8 弱阳性
Rep9 弱阳性
Rep10 弱阳性
本发明实施例12制备的脯氨酸氨基肽酶的试纸性能评估
①外观目测
随机抽取制备试纸10条，以正常视力检查试纸外观性能指标，应符合要求：1)表面应平整、边缘无毛刺；2)测试块外观整齐、色泽均匀。10次目测结果均合格。
②准确度检测
取用制备的试纸对检测项目各浓度水平的参考溶液进行检测，每个浓度水平重复测定5次，阳性参考溶液不得出现阴性结果，阴性参考溶液不得出现阳性结果。(结果如表8所示)
表8准确度数据
测定次数 阴性参考溶液 阳性低值 阳性高值
Rep1 阴性 弱阳性 阳性
Rep2 阴性 弱阳性 阳性
Rep3 阴性 弱阳性 阳性
Rep4 阴性 弱阳性 阳性
Rep5 阴性 弱阳性 阳性
③重复性检测
随机抽取制备的试纸条10条，对第一个非阴性量级进行检测，所有检测结果不为阴性，第一个非阴性量级均应能准确检出。(结果如表9所示)
表9检出限数据
本发明实施例17制备的脯氨酸氨基肽酶的试纸性能评估
①外观目测
随机抽取制备试纸10条，以正常视力检查试纸外观性能指标，应符合要求：1)表面应平整、边缘无毛刺；2)测试块外观整齐、色泽均匀。10次目测结果均合格。
②准确度检测
取用制备的试纸对检测项目各浓度水平的参考溶液进行检测，每个浓度水平重复测定5次，阳性参考溶液不得出现阴性结果，阴性参考溶液不得出现阳性结果。(结果如表10所示)
表10准确度数据
测定次数 阴性参考溶液 阳性低值 阳性高值
Rep1 阴性 弱阳性 阳性
Rep2 阴性 弱阳性 阳性
Rep3 阴性 弱阳性 阳性
Rep4 阴性 弱阳性 阳性
Rep5 阴性 弱阳性 阳性
③重复性检测
随机抽取制备的试纸条10条，对第一个非阴性量级进行检测，所有检测结果不为阴性，第一个非阴性量级均应能准确检出。(结果如表11所示)
表11检出限数据
测定次数 阳性低值
Rep1 弱阳性
Rep2 弱阳性
Rep3 弱阳性
Rep4 弱阳性
Rep5 弱阳性
Rep6 弱阳性
Rep7 弱阳性
Rep8 弱阳性
Rep9 弱阳性
Rep10 弱阳性
本发明实施例18制备的脯氨酸氨基肽酶的试纸性能评估
①外观目测
随机抽取制备试纸10条，以正常视力检查试纸外观性能指标，应符合要求：1)表面应平整、边缘无毛刺；2)测试块外观整齐、色泽均匀。10次目测结果均合格。
②准确度检测
取用制备的试纸对检测项目各浓度水平的参考溶液进行检测，每个浓度水平重复测定5次，阳性参考溶液不得出现阴性结果，阴性参考溶液不得出现阳性结果。(结果如表12所示)
表12准确度数据
测定次数 阴性参考溶液 阳性低值 阳性高值
Rep1 阴性 弱阳性 阳性
Rep2 阴性 弱阳性 阳性
Rep3 阴性 弱阳性 阳性
Rep4 阴性 弱阳性 阳性
Rep5 阴性 弱阳性 阳性
③重复性检测
随机抽取制备的试纸条10条，对第一个非阴性量级进行检测，所有检测结果不为阴性，第一个非阴性量级均应能准确检出。(结果如表13所示)
表13检出限数据
测定次数 阳性低值
Rep1 弱阳性
Rep2 弱阳性
Rep3 弱阳性
Rep4 弱阳性
Rep5 弱阳性
Rep6 弱阳性
Rep7 弱阳性
Rep8 弱阳性
Rep9 弱阳性
Rep10 弱阳性
由检测结果显示本发明中所述的试纸，外观表面应平整、测试块外观整齐、色泽均匀，具有可观察性；检测阳性参考溶液、阴性参考溶液结果准确无偏差；重复性检测具有均一性和一致性，所有检测指标测试结果均符合产品要求。本发明产品具有检测速度快、可目测验视、灵敏度高、稳定性好的优势，与类似产品相比操作简单，适宜普及。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (8)

1.一种脯氨酸氨基肽酶检测试纸的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1、浸液的制备
所述浸液包括底物、缓冲溶液、稳定剂和分散剂；
将底物溶解于带有缓冲溶液、稳定剂和分散剂的溶液中，制备得到所述浸液；
所述底物为脯氨酰类衍生物；
所述稳定剂为海藻糖、半乳糖或者阿拉伯糖；
所述分散剂为PVP-K90、PEG-2000、PEG-4000和PEG-6000中的一种或多种；
所述缓冲溶液为柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液、哌嗪-1,4-乙二磺酸缓冲液、4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液、N-(2-乙酰胺基)-2-亚氨基二乙酸缓冲液、N-(2-乙酰氨基)-2-氨基乙烷磺酸缓冲液、2-(N-吗啉基)乙磺酸缓冲液、3-(N-吗啡啉)丙磺酸缓冲液或者3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸缓冲液；
步骤2、检测试纸的制备
用步骤1制备的浸液、采用浸渍干燥机自动化干燥方法制备检测试纸；
所述浸渍干燥机温度设定：
开机后将设备温度主加热设定70-90℃，副加热设定50-70℃，待主机加热温度达到70-90℃，各干燥室温度达到58-62℃时开始浸液；浸渍干燥机走速设定：6.0-12.0Hz。
2.根据权利要求1所述的脯氨酸氨基肽酶检测试纸的制备方法，其特征在于，步骤2具体包括以下步骤：
(1)按开机流程将浸渍干燥机打开，开机后将设备温度主加热设定70-90℃，副加热设定50-70℃，待主机加热温度达到70-90℃，各干燥室温度达到58-62℃时开始浸液；
(2)将滤纸进行悬挂，浸液槽安装好；
(3)将步骤1配制好的浸液倒入浸渍槽中，浸液量应在浸渍槽的1/2处，调节浸液注入的速度；
(4)开启走纸开关，用压纸轮将滤纸浸入浸液中，记录浸液位置高度；浸渍干燥机走速设定：6.0-12.0Hz；
(5)待滤纸全部从干燥室走出，关闭走纸开关，将滤纸做好标识，放入装有干燥剂的自封袋中即可。
3.根据权利要求2所述的脯氨酸氨基肽酶检测试纸的制备方法，其特征在于，浸渍干燥机的主加热设定为75℃-85℃。
4.根据权利要求1所述的脯氨酸氨基肽酶检测试纸的制备方法，其特征在于，所述底物为L-脯氨酰对硝基苯三氟乙酸盐、N-苷氨酰-脯氨酰对硝基苯胺-对甲苯磺酸盐、甘氨酸-脯氨酰-4-甲氧基-β-萘胺盐酸盐、N-(2-苯甲酰苯基)-D-脯氨酰胺、N-(2-噻吩磺酰基)-L-脯氨酰胺三氟乙酸盐、(2R)-N-(2-苯甲酰基苯基)-1-(苯基甲基)-2-吡咯烷甲酰胺、Z-Gly-甘氨酰脯氨酰对硝基苯胺或者L-脯氨酸-α-萘胺。
5.根据权利要求1所述的脯氨酸氨基肽酶检测试纸的制备方法，其特征在于，所述底物的浓度为1.00-20.00mg/mL，所述稳定剂的浓度为1.00-20.00mg/mL，所述分散剂的浓度为1.00-20.00mg/mL，所述缓冲溶液的浓度为10.0-100.0mM、pH范围在6.0-9.0。
6.根据权利要求5所述的脯氨酸氨基肽酶检测试纸的制备方法，其特征在于，所述缓冲溶液的浓度为50.0-70.0mM、pH范围在6.5-8.5。
7.根据权利要求1所述的脯氨酸氨基肽酶检测试纸的制备方法，其特征在于，检测体系pH值为6.5-8.5。
8.根据权利要求1所述的脯氨酸氨基肽酶检测试纸的制备方法，其特征在于，所述滤纸类型为7218型滤纸、31ET型滤纸、3MM型滤纸、526型滤纸或319型滤纸。
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