CN109988755B - RhuA突变体及其在制备二维复合材料中的应用 - Google Patents

RhuA突变体及其在制备二维复合材料中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种RhuA突变体及其在制备二维复合材料中的应用。所述RhuA突变体由序列如SEQ ID No.1所示的天然RhuA单体氨基酸序列的第98位的天冬氨酸、第264位的甘氨酸突变为半胱氨酸而形成。它的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。本发明采用RhuA突变体作为基元构筑高度有序的二维晶体结构为模板，利用其表面暴露的功能巯基与金属纳米粒子的相互作用，通过调控溶液中pH和离子强度，调控金属纳米粒子形成高度有序的二维纳米结构，实现了基于RhuA二维晶体模板制备二维复合材料；制备方法新颖，步骤简单，条件温和，并且所获二维复合材料具有良好的分散性，在传感领域、电子学具有潜在的价值。

Description

RhuA突变体及其在制备二维复合材料中的应用
技术领域
本发明涉及一种RhuA(L-鼠李树胶糖-L-磷酸醛缩酶)突变体，尤其涉及一种RhuA蛋白突变体，以及利用该RhuA蛋白突变体自组装的高度有序二维模板制备高度有序且均一的二维复合材料的方法，属于纳米生物技术领域。
背景技术
蛋白质是生命体重要的组成部分，基于独特结构、物化性质、固有功能而成为构筑二维的纳米材料重要的基元，吸引了无数研究者广泛关注，借助基因工程和位点特异的化学修饰，将蛋白进行定向突变可控的组装形成功能化的二维模板，成功的定位功能基团和精确偶联纳米颗粒，在纳米尺度下进行功能复合材料高度有序自组装，形成大量功能化的复合材料，在生物传感、能量转移和储存、生物催化、生物成像、生物医疗等领域发挥重要意义，为纳米生物学发展做出许多贡献，极大地促进了蛋白的应用范围。
在一定的物理化学条件下，利用生物大分子的功能基团和无机纳米离子的相互作用，调控无机纳米离子矿化，从而使纳米颗粒组装成特殊结构。以RhuA蛋白为模板矿化无机纳米材料形成的功能化材料对纳米生物技术发展的具有重要价值。
二维的复合材料拥有独特的结构和机制，是诸多领域的重要材料。利用RhuA形成二维晶体结构为模板，构筑有序的二维金纳米复合材料，这对微型电子设备研发具有潜在的价值。但是当前现有技术中构建二维复合材料存在一些技术问题，如复杂的步骤、严苛的反应条件、差的分散性等等。
因此，如何对二维复合材料的构建技术进行优化，寻求一种制备方法简单、条件温和的二维复合材料制备技术是业界研发人员的重点研究领域。
发明内容
本发明的主要目的就是针对以上现状，提供一种RhuA突变体，以及利用该RhuA突变体自组装的高度有序二维模板制备高度有序且均一的二维复合材料的方法，以克服现有技术中的不足。
为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括：
本发明实施例提供了一种RhuA突变体，它由序列如SEQ ID No.1所示的天然RhuA单体氨基酸序列的第98位的天冬氨酸、第264位的甘氨酸突变为半胱氨酸而形成。
进一步地，它的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
本发明实施例还提供了用于编码前述RhuA突变体的基因。
进一步地，它的序列如SEQ ID No.3所示。
本发明实施例还提供了携带有前述基因的重组表达载体。
本发明实施例还提供了转化/转染有前述重组表达载体的宿主菌。
进一步地，所述宿主菌包括大肠杆菌。
本发明实施例还提供了构建前述的RhuA突变体的方法，其包括：
提供定点突变试剂；
以天然RhuA的DNA为模板，与所述定点突变试剂混合均匀，进行定向诱变，使天然RhuA单体氨基酸序列的第98位的天冬氨酸、第264位的甘氨酸突变为半胱氨酸，之后进行T4酶连，获得携带有前述基因的重组表达载体；
以及，将所述重组表达载体转入宿主细胞进行表达，获得所述RhuA突变体。
本发明实施例还提供了前述的RhuA突变体于制备二维复合材料中的应用。
本发明实施例还提供了一种二维复合材料的制备方法，其包括：
提供前述的RhuA突变体或按照前述的方法构建RhuA突变体；
以所述RhuA突变体作为基元构筑高度有序、具有高反应位点的RhuA二维晶体模板，所述RhuA二维晶体模板的表面具有暴露的巯基；
将所述RhuA二维晶体模板与金属纳米粒子均匀混合，通过巯基与金属纳米粒子相互作用，形成高度有序且均一的二维纳米结构，获得二维复合材料。
本发明实施例还提供了由前述方法制备的二维复合材料。
进一步地，所述二维复合材料包括RhuA二维晶体模板以及由金属纳米粒子基于该RhuA二维晶体模板形成的高度有序且均一的二维纳米结构。
与现有技术相比，本发明的优点包括：
1)本发明采用RhuA突变体作为基元构筑高度有序的二维晶体结构为模板，利用其表面暴露的功能巯基与金属纳米粒子的相互作用，通过调控溶液中pH和离子强度，调控金属纳米粒子形成高度有序的二维纳米结构，实现了基于RhuA二维晶体模板制备二维复合材料。
2)本发明基于二维蛋白模板，实现二维金纳米复合材料，所采用的制备方法新颖，步骤简单，条件温和，解决了现有技术中构建二维复合材料时复杂的步骤、严苛反应条件、差的分散性等技术问题；并且所获二维复合材料具有良好的分散性，在传感领域、电子学具有潜在的价值。
附图说明
图1a和图1b是本发明实施例2所获RhuA二维晶体模板的电镜图。
图2a-图2d是本发明实施例3所获二维金纳米结构的电镜图。
图3a和图3b是本发明实施例3所获二维金纳米结构的放大电镜图。
具体实施方式
下文将对本发明的技术方案作更为详尽的解释说明。但是，应当理解，在本发明范围内，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
鉴于现有技术中的不足，本案发明人经长期研究和大量实践，得以提出本发明的技术方案。如下将结合附图对该技术方案、其实施过程及原理等作进一步的解释说明。
天然的RhuA(L-鼠李树胶糖-L-磷酸醛缩酶)蛋白是C4对称的同源四聚体，其每个单体由274个氨基酸组成，作为重要构筑基元，被用作合成子用于超大分子组装。本发明通过基因修饰手段，将单体氨基酸序列的第98位的天冬氨酸、第264位的甘氨酸突变为半胱氨酸，变体蛋白之间自组装形成二维高反应模板。本发明所提及的二维纳米结构是上述二维高反应模板指导金属纳米粒子形成二维复合材料。
本发明所述二维复合材料的制备方法，是以具有高反应位点的二维晶体表面为模板，借助表面巯基与金属元素相互作用，实现蛋白晶体表面二维金属纳米复合材料的构建。
本发明实施例的一个方面提供的一种RhuA突变体，它由序列如SEQ ID No.1所示的天然RhuA单体氨基酸序列的第98位的天冬氨酸、第264位的甘氨酸突变为半胱氨酸而形成。
进一步地，它的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
也就是说，所述RhuA突变体序列由SEQ ID No.1所示的天然RhuA单体氨基酸序列经定向诱导突变得到，所述突变部分为：第98位、264位突变为半胱氨酸。
本发明实施例的另一个方面提供了用于编码前述RhuA突变体的基因。
进一步地，所述基因的序列如SEQ ID No.3所示。
本发明实施例的另一个方面还提供了携带有前述基因的重组表达载体。
本发明实施例的另一个方面还提供了转化/转染有前述重组表达载体的宿主菌。
进一步地，所述宿主菌包括大肠杆菌，但不限于此。
本发明实施例的另一个方面还提供了构建前述的RhuA突变体的方法，其包括：
提供定点突变试剂；
以天然RhuA的DNA为模板，与所述定点突变试剂混合均匀，进行PCR定向诱变，使天然RhuA单体氨基酸序列的第98位的天冬氨酸、第264位的甘氨酸突变为半胱氨酸，之后进行T4酶连，获得携带有前述基因的重组表达载体；
以及，将所述重组表达载体转入宿主细胞进行表达，获得所述RhuA突变体。
其中需要说明的是，在本发明中先要进行PCR进行定向诱导突变，后酶切，在经过酶连，才能得到重组的表达载体。表达载体是经过酶切的PET32a质粒与经过酶切PCR诱变的目的序列经酶连而成。
在一些实施例中，所述方法包括：
以CaCl2法将所述重组表达载体转入感受态细胞(即宿主细胞)，挑取单克隆接种(扩大培养，用于后续大量的提取蛋白。)于培养基中，加入氨苄青霉素，于35～37℃培养12～16h后，加入抗生素，于35～37℃培养2～3h，加入异丙基硫代半乳糖苷，在35～37℃继续诱导培养12～14h，获得所述RhuA突变体。
在一些实施例中，所述方法还包括：将表达结束后获得的RhuA突变体用裂解缓冲液重悬，并置于冰上进行超声破碎，离心取上清液，之后进行过滤除杂、纯化处理。
进一步地，所述纯化处理包括超强阴离子层析柱纯化、硫酸铵纯化等，但不限于此。
本发明实施例的另一个方面还提供了前述的RhuA突变体于制备二维复合材料中的应用。
本发明实施例的另一个方面还提供了一种二维复合材料的制备方法，其包括：
提供前述的RhuA突变体或按照前述的方法构建RhuA突变体；
以所述RhuA突变体作为基元构筑高度有序、具有高反应位点的RhuA二维晶体模板，所述RhuA二维晶体模板的表面具有暴露的巯基；
将所述RhuA二维晶体模板与金属纳米粒子均匀混合，通过巯基与金属纳米粒子相互作用，形成高度有序且均一的二维纳米结构，获得二维复合材料。
在一些实施例中，所述的制备方法具体包括：
将所述RhuA突变体置于包含三(羟甲基)氨基甲烷缓冲液、β-巯基乙醇和氯化锌缓冲液的混合溶液中进行透析除盐，后利用超滤离心管浓缩，室温轻摇获得稳定的RhuA二维晶体模板。
在一些实施例中，所述的制备方法具体包括：
将所述RhuA二维晶体模板与金属纳米粒子按体积比1：100～1：300均匀混合形成混合反应体系，并于16～27℃反应4～18h，形成所述的二维复合材料。
进一步地，所述混合反应体系的pH值为6.8～7.5。
进一步地，所述混合反应体系中金属纳米粒子的浓度为200nm/L～500nm/L。
进一步地，所述金属纳米粒子包括金纳米粒子，但不限于此。
作为优选实施方案之一，所述制备方法具体包括：
(1)构建RhuA突变体：将天然RhuA单体氨基酸序列第98、264位突变为半胱氨酸，构建重组表达载体，在大肠杆菌中实现表达，经超强阴离子层析柱纯化、硫酸铵纯化，获得突变后的RhuA突变体；
(2)RhuA二维晶体模板的制备：将步骤(1)所得突变后的RhuA突变体置于三(羟甲基)氨基甲烷缓冲液中进行透析，随后进行浓缩，通过针头过滤器除杂，在混合器上轻摇3-5天，得到RhuA二维晶体模板；
(3)结构有序均一的二维复合材料的制备：将步骤(2)所得RhuA二维晶体模板与金纳米粒子按一定适当的比例混合，通过调节溶液的pH、离子强度、轻摇时间，实现蛋白二维模板与金纳米粒子相互作用，室温下制备二维金纳米复合材料。
作为一更为具体的优选实施方案，所述制备方法具体可以包括如下步骤：
(a)将重组表达载体用CaCl2法转入E.coli BL21(DE3)感受态细胞，涂平板过夜，挑取单克隆接种于5mL LB培养基中，加入氨苄青霉素，于37℃恒温振荡培养12h～16h后，转接于1L LB培养基中，加入抗生素，于37℃恒温振荡培养2～3h，加入异丙基硫代半乳糖苷，在37℃继续诱导培养12h～14h，离心收集菌体。
(b)将收集到的菌体用裂解缓冲液重悬，置于冰上进行超声破碎，4℃离心取上清液，依次进行过滤除杂、超强阴离子层析柱纯化、硫酸铵纯化，获得RhuA突变体。
(c)将步骤(b)所得RhuA突变体置于三(羟甲基)氨基甲烷、β-巯基乙醇、氯化锌缓冲液中透析3-5次，并通过SDS-PAGE进行定量分析，最后通过超滤离心管浓缩，利用酶联免疫检测仪测定浓度，在通过针头过滤器再次除杂，室温轻摇3-5天，获得RhuA二维晶体模板。
(d)将RhuA-D98C-G264C组装体(即RhuA二维晶体模板)透析到三(羟甲基)氨基甲烷与氯化锌缓冲液除去巯基乙醇，之后将金纳米粒子透析到三(羟甲基)氨基甲烷缓冲液中，后将RhuA-D98C-G264C组装体(即RhuA二维晶体模板)与金纳米粒子混合，随后加入三(羟甲基)氨基甲烷(终浓度10mM)和氯化钠(终浓度10mM)，室温轻摇过夜；离心收集沉淀，电镜表征，获得二维金纳米结构(即二维复合材料)。
更加具体地，上述基于RhuA二维晶体模板的二维复合材料的制备方法，主要包括如下三个步骤：
步骤E1：
将天然的RhuA单体氨基酸序列(SEQ ID No.1所示)中第98、264位突变为半胱氨酸，突变后的氨基酸序列为SEQ ID No.2所示，对应的突变基因编码序列为SEQ ID No.3所示，之后将突变后基因序列连接到载体中，转化、表达、分离纯化，获得目的蛋白。
具体地，本步骤中将天然RhuA单体氨基酸序列中第98、264位突变为半胱氨酸，以此RhuA突变体为基准，并在熟知以上突变体氨基酸序列和天然RhuA单体的cDNA全基因序列前提下，同时方便于本领域普通技术人员获取，实现重组载体构建，将重组载体转入E.coliBL21(DE3)感受态细胞，挑取、培养以及表达重组蛋白，其后经过离心、破碎、柱纯化、硫酸铵纯化以及过滤除杂，获得突变后的RhuA突变单体。
步骤E1的操作过程更加具体为：将重组用CaCl2法转入E.coli BL21(DE3)感受态细胞，无菌环境涂LB平板，过夜后从平板上挑取单克隆株，接种于5mL LB试管培养基中，加入氨苄青霉素，37℃恒温下培养12h-16h；将5mL菌液转接入1L LB三角瓶中，加入氨苄青霉素，37℃恒温下振荡培养2-3h左右后(OD600为0.4～0.6之间)，加异丙基硫代半乳糖苷诱导剂，在37℃下继续振荡诱导培养12h-14h，离心收集菌体；将收集的菌体用三(羟甲基)氨基甲烷缓冲液清洗一次，后重悬于裂解缓冲液中，在冰浴中超声破碎，离心收集上清液。
步骤E2：
制备RhuA二维晶体模板：将步骤E1所得目的蛋白透析到三(羟甲基)氨基甲烷缓冲液中，通过SDS-PAGE进行定量，随后浓缩，室温轻摇进行组装，3-5天出现晶体，即为所述的RhuA二维晶体模板。
步骤E3：
制备金二维纳米结构，将步骤E2所得RhuA二维晶体模板与金纳米粒子混合，再加入三(羟甲基)氨基甲烷缓冲液；继续加氯化钠进行混合，室温轻摇过夜，形成金二维纳米结构。
上述步骤中所用试剂的浓度，如RhuA突变体、金纳米粒子、金二维纳米结构以及纯化步骤中所用具体试剂的浓度均为本领域普通技术人员在上述制备方法的精神下根据具体情况进行的选择，均在本发明的保护范围之内。
本发明实施例的另一个方面还提供了由前述方法制备的二维复合材料。
进一步地，所述二维复合材料包括RhuA二维晶体模板以及由金属纳米粒子基于该RhuA二维晶体模板形成的高度有序且均一的二维纳米结构。
进一步地，所述金属纳米粒子包括金纳米粒子，但不限于此。
以下通过具体若干实施例及附图进一步阐述本发明，这些实施例仅用于举例说明的目的，并没有限制本发明的范围。除有具体注明，下列实施例中的条件和操作方法均按照本领域常规操作进行。
以下具体实施例中所提及RhuA变体表示将RhuA衣壳蛋白单体氨基酸序列第98、264位突变为半胱氨酸后所形成的突变体，即为改造后的单体，所提及的重组表达载体PET32a-RhuA-D98C-G264C表示将RhuA-D98C-G264C的编码基因连接到质粒载体PET32a后所形成。下述具体实施例中所提及单位“mM”表示“mmol/L”(毫摩尔每升)。
实施例1
RhuA突变体表达质粒的构建、原核的表达以及分离纯化
A1：根据野生型RhuA单体的cDNA核苷酸序列SEQ ID No.3所示的突变体编码基因，通过分子生物学手段转入PET32a载体中，成功构建重组载体PET32a-RhuA-D98C-G264C；
A2：经DNA测序测定转入载体中突变体基因序列完全正确，后将重组载体PET32a-RhuA-D98C-G264C用CaCl2法转入E.coli BL21感受态细胞中，无菌环境涂LB平板，37℃恒温培养过夜后，从平板上挑取单克隆株，接种于5mL LB试管培养基中，加入氨苄青霉素(终浓度50μg/mL)，37℃恒温下，200r/min培养12h-16h；按照0.5％的接种量，将5mL菌液转接入1LLB三角瓶中，加入氨苄青霉素(终浓度50μg/mL)，37℃恒温下，200r/min振荡培养2-3h左右后(OD600在0.4～0.6之间)，加入异丙基硫代半乳糖苷诱导剂(终浓度为1mM的IPTG)，在37℃下继续振荡诱导培养12h-14h，8000rmp离心5min收集菌体；将收集的菌体用三(羟甲基)氨基甲烷缓冲液清洗一次，后重悬于40mL的裂解缓冲液中进行冰浴超声破碎，12000r/min离心30min收集上清液。
A3：RhuA-D98C-G264C的纯化；将步骤A2所得上清液经0.22μm针头过滤器过滤除杂，同时将Hi TraP Q HP预装柱用蠕泵进行上样缓冲液平衡，后用蠕泵进行上样，后将吸附有目的蛋白Hi TraP Q HP预装柱装入AKTA Prime plus FPLC系统中，采用梯度洗脱，洗脱梯度为0-1M NaCl，洗脱流速为3mL/min，在冰上分别收集洗脱峰，后缓慢加入1.7M固体硫酸铵纯化，4℃静置三十分钟，12000rpm离心收集沉淀。将沉淀用溶解缓冲液(5mM磷酸三钠，pH8，25mMβ-巯基乙醇)重悬。低温下缓慢振荡过夜，4℃下，12000rpm离心15min，取上清，之后用SDS-PAGE检测目的蛋白纯度，将纯度高的蛋白液置-80℃冻存。
本实施例所得蛋白RhuA-D98C-G264C即为突变后的RhuA蛋白单体，氨基酸序列第98、264位突变为半胱氨酸，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
实施例2
RhuA二维晶体模板的生成
将实施例1所得的高纯度RhuA-D98C-G264C蛋白单体透析于三(羟甲基)氨基甲烷(pH7.5，10mM Tris-HCl，10mMβ-巯基乙醇，1mM ZnCl2)缓冲液中，透析3-5次除去硫酸铵和钠盐，用核酸蛋白仪测定浓度，后用10KD超滤离心管浓缩，利用酶联免疫检测仪测定浓度，用针头过滤器再次除杂，在上述三(羟甲基)氨基甲缓冲液中孵育3-5天，出现浑浊的沉淀，将沉淀用超纯水清洗一次，后进行电镜表征，并将自组装产物保存于4℃冰箱中，RhuA二维晶体模板的电镜照片如图1a和图1b所示，可见其形成了二维晶体，阵列可达微米级。
实施例3
金二维纳米结构生成
以实施例2所得的RhuA模板为基础，构建二维的金纳米粒子阵列，具体步骤为：
将RhuA-D98C-G264C组装体透析到三(羟甲基)氨基甲(pH7，10mM Tris-HCl，1mMZnCl2)缓冲液中除去巯基乙醇，之后将金纳米粒子透析到上述三(羟甲基)氨基甲缓冲液中孵育2-3次，后在10μL蛋白组装体中加1000μL金纳米粒子，随后加入三(羟甲基)氨基甲缓冲液(终浓度10mM)和氯化钠(终浓度10mM)，室温轻摇过夜；离心收集沉淀，电镜表征，所得金二维纳米结构如图2a-图2b以及图3a和图3b所示。
综上所述，本发明藉由上述技术方案，采用RhuA突变体作为基元构筑高度有序的二维晶体结构为模板，利用其表面暴露的功能巯基与金属纳米粒子的相互作用，通过调控溶液中pH和离子强度，调控金属纳米粒子形成高度有序的二维纳米结构，实现了基于RhuA二维晶体模板制备二维复合材料。本发明的制备方法新颖，步骤简单，条件温和，解决了现有技术中构建二维复合材料时复杂的步骤、严苛反应条件、差的分散性等技术问题；并且所获二维复合材料具有良好的分散性，在传感领域、电子学具有潜在的价值。
此外，本案发明人还利用前文所列出的其它原料以及其它工艺条件等替代实施例1-3中的各种原料及相应工艺条件进行了相应试验，例如，“以CaCl2法将所述重组表达载体转入宿主细胞，挑取单克隆菌接种于培养基中，加入氨苄青霉素，于35～37℃培养12～16h后，加入抗生素，于35～37℃培养2～3h，加入异丙基硫代半乳糖苷，在35～37℃继续诱导培养12～14h，获得所述RhuA突变体”以及“将所述RhuA二维晶体模板与金属纳米粒子按体积比1：100～1：300均匀混合形成混合反应体系，并于16～27℃反应4～18h，形成所述的二维复合材料”等等，所获二维复合材料的性能等亦较为理想，基本与实施例1-3相似。
应当理解，上述实施例仅为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Figure BDA0001538254850000111
Figure BDA0001538254850000121
Figure BDA0001538254850000131
序列表
<110> 中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所
<120> RhuA突变体及其在制备二维复合材料中的应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 274
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 1
Met Gln Asn Ile Thr Gln Ser Trp Phe Val Gln Gly Met Ile Lys Ala
1 5 10 15
Thr Thr Asp Ala Trp Leu Lys Gly Trp Asp Glu Arg Asn Gly Gly Asn
20 25 30
Leu Thr Leu Arg Leu Asp Asp Ala Asp Ile Ala Pro Tyr His Asp Asn
35 40 45
Phe His Gln Gln Pro Arg Tyr Ile Pro Leu Ser Gln Pro Met Pro Leu
50 55 60
Leu Ala Asn Thr Pro Phe Ile Val Thr Gly Ser Gly Lys Phe Phe Arg
65 70 75 80
Asn Val Gln Leu Asp Pro Ala Ala Asn Leu Gly Ile Val Lys Val Asp
85 90 95
Ser Asp Gly Ala Gly Tyr His Ile Leu Trp Gly Leu Thr Asn Glu Ala
100 105 110
Val Pro Thr Ser Glu Leu Pro Ala His Phe Leu Ser His Cys Glu Arg
115 120 125
Ile Lys Ala Thr Asn Gly Lys Asp Arg Val Ile Met His Cys His Ala
130 135 140
Thr Asn Leu Ile Ala Leu Thr Tyr Val Leu Glu Asn Asp Thr Ala Val
145 150 155 160
Phe Thr Arg Gln Leu Trp Glu Gly Ser Thr Glu Cys Leu Val Val Phe
165 170 175
Pro Asp Gly Val Gly Ile Leu Pro Trp Met Val Pro Gly Thr Asp Glu
180 185 190
Ile Gly Gln Ala Thr Ala Gln Glu Met Gln Lys His Ser Leu Val Leu
195 200 205
Trp Pro Phe His Gly Val Phe Gly Ser Gly Pro Thr Lys Asp Glu Thr
210 215 220
Phe Gly Leu Ile Asp Thr Ala Glu Lys Ser Ala Gln Val Leu Val Lys
225 230 235 240
Val Tyr Ser Met Gly Gly Met Lys Gln Thr Ile Ser Arg Glu Glu Leu
245 250 255
Ile Ala Leu Gly Lys Arg Phe Gly Val Thr Pro Leu Ala Ser Ala Leu
260 265 270
Ala Leu
<210> 2
<211> 274
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 2
Met Gln Asn Ile Thr Gln Ser Trp Phe Val Gln Gly Met Ile Lys Ala
1 5 10 15
Thr Thr Asp Ala Trp Leu Lys Gly Trp Asp Glu Arg Asn Gly Gly Asn
20 25 30
Leu Thr Leu Arg Leu Asp Asp Ala Asp Ile Ala Pro Tyr His Asp Asn
35 40 45
Phe His Gln Gln Pro Arg Tyr Ile Pro Leu Ser Gln Pro Met Pro Leu
50 55 60
Leu Ala Asn Thr Pro Phe Ile Val Thr Gly Ser Gly Lys Phe Phe Arg
65 70 75 80
Asn Val Gln Leu Asp Pro Ala Ala Asn Leu Gly Ile Val Lys Val Asp
85 90 95
Ser Cys Gly Ala Gly Tyr His Ile Leu Trp Gly Leu Thr Asn Glu Ala
100 105 110
Val Pro Thr Ser Glu Leu Pro Ala His Phe Leu Ser His Cys Glu Arg
115 120 125
Ile Lys Ala Thr Asn Gly Lys Asp Arg Val Ile Met His Cys His Ala
130 135 140
Thr Asn Leu Ile Ala Leu Thr Tyr Val Leu Glu Asn Asp Thr Ala Val
145 150 155 160
Phe Thr Arg Gln Leu Trp Glu Gly Ser Thr Glu Cys Leu Val Val Phe
165 170 175
Pro Asp Gly Val Gly Ile Leu Pro Trp Met Val Pro Gly Thr Asp Glu
180 185 190
Ile Gly Gln Ala Thr Ala Gln Glu Met Gln Lys His Ser Leu Val Leu
195 200 205
Trp Pro Phe His Gly Val Phe Gly Ser Gly Pro Thr Lys Asp Glu Thr
210 215 220
Phe Gly Leu Ile Asp Thr Ala Glu Lys Ser Ala Gln Val Leu Val Lys
225 230 235 240
Val Tyr Ser Met Gly Gly Met Lys Gln Thr Ile Ser Arg Glu Glu Leu
245 250 255
Ile Ala Leu Gly Lys Arg Phe Cys Val Thr Pro Leu Ala Ser Ala Leu
260 265 270
Ala Leu
<210> 3
<211> 825
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 3
atgcaaaaca ttactcagtc ctggtttgtc cagggaatga tcaaagccac caccgacgcc 60
tggctgaaag gctgggatga gcgcaacggc ggcaacctga cgctacgcct ggatgacgcc 120
gatatcgcac catatcacga caatttccac caacaaccgc gctatatccc gctcagccag 180
cccatgcctt tactggcaaa tacaccgttt attgtcaccg gctcgggcaa attcttccgt 240
aacgtccagc ttgatcctgc ggctaactta ggcatcgtaa aagtcgacag ctgcggcgcg 300
ggctaccaca ttctttgggg gttaaccaac gaagccgtcc ccacttccga acttccggct 360
cacttccttt cccactgcga gcgcattaaa gccaccaacg gcaaagatcg ggtgatcatg 420
cactgccacg ccaccaacct gatcgccctc acctatgtac ttgaaaacga caccgcggtc 480
ttcactcgcc aactgtggga aggcagcacc gagtgtctgg tggtattccc ggatggcgtt 540
ggcattttgc cgtggatggt gcccggcacg gacgaaatcg gccaggcgac cgcacaagag 600
atgcaaaaac attcgctggt gttgtggccc ttccacggcg tcttcggcag cggaccgacg 660
ctggatgaaa ccttcggttt aatcgacacc gcagaaaaat cagcacaagt attagtgaag 720
gtttattcga tgggcggcat gaaacagacc atcagccgtg aagagttgat agcgctcggc 780
aagcgtttct gcgttacgcc actcgccagt gcgctggcgc tgtaa 825

Claims (21)

1.一种RhuA突变体，其特征在于：它由序列如SEQ ID No.1所示的天然RhuA单体氨基酸序列的第98位的天冬氨酸、第264位的甘氨酸突变为半胱氨酸而形成。
2.根据权利要求1所述的RhuA突变体，其特征在于：它的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
3.用于编码权利要求1-2中任一项所述RhuA突变体的基因。
4.根据权利要求3所述的基因，其特征在于：它的序列如SEQ ID No.3所示。
5.携带有权利要求3或4所述基因的重组表达载体。
6.转化/转染有权利要求5所述重组表达载体的宿主菌。
7.根据权利要求6所述的宿主菌，其特征在于：所述宿主菌包括大肠杆菌。
8.构建权利要求1-2中任一项所述的RhuA突变体的方法，其特征在于包括：
提供定点突变试剂；
以天然RhuA的DNA为模板，与所述定点突变试剂混合均匀，进行定向诱变，使天然RhuA单体氨基酸序列的第98位的天冬氨酸、第264位的甘氨酸突变为半胱氨酸，之后进行T4酶连，获得携带有权利要求3或4所述基因的重组表达载体；
以及，将所述重组表达载体转入宿主细胞进行表达，获得所述RhuA突变体。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于包括：
以CaCl2法将所述重组表达载体转入宿主细胞，挑取单克隆菌接种于培养基中，加入氨苄青霉素，于35~37℃培养12~16h后，加入抗生素，于35~37℃培养2~3h，加入异丙基硫代半乳糖苷，在35~37℃继续诱导培养12~14h，获得所述RhuA突变体。
10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于还包括：将表达结束后获得的RhuA突变体用裂解缓冲液重悬，并置于冰上进行超声破碎，离心取上清液，之后进行过滤除杂、纯化处理。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于：所述纯化处理包括超强阴离子层析柱纯化和/或硫酸铵纯化。
12.权利要求1-2中任一项所述的RhuA突变体在制备金属纳米二维复合材料中的应用。
13.一种二维复合材料的制备方法，其特征在于包括：
提供权利要求1-2中任一项所述的RhuA突变体或按照权利要求8-11中任一项所述的方法构建RhuA突变体；
以所述RhuA突变体作为基元构筑高度有序、具有高反应位点的RhuA二维晶体模板，所述RhuA二维晶体模板的表面具有暴露的巯基；
将所述RhuA二维晶体模板与金属纳米粒子均匀混合，通过巯基与金属纳米粒子相互作用，形成高度有序且均一的二维纳米结构，获得二维复合材料。
14.根据权利要求13所述的制备方法，其特征在于具体包括：
将所述RhuA突变体置于包含三（羟甲基）氨基甲烷缓冲液、β-巯基乙醇和氯化锌缓冲液的混合溶液中进行透析除盐，之后浓缩，获得RhuA二维晶体模板。
15.根据权利要求13所述的制备方法，其特征在于具体包括：
将所述RhuA二维晶体模板与金属纳米粒子按体积比1：100~1：300均匀混合形成混合反应体系，并于16~27℃反应4~18h，形成所述的二维复合材料。
16.根据权利要求15所述的制备方法，其特征在于：所述混合反应体系的pH值为6.8~7.5。
17.根据权利要求15所述的制备方法，其特征在于：所述混合反应体系中金属纳米粒子的浓度为200~500nm/L。
18.根据权利要求13或15或17所述的制备方法，其特征在于：所述金属纳米粒子包括金纳米粒子。
19.由权利要求13-18中任一项所述方法制备的二维复合材料。
20.根据权利要求19所述的二维复合材料，其特征在于：所述二维复合材料包括RhuA二维晶体模板以及由金属纳米粒子基于该RhuA二维晶体模板形成的高度有序且均一的二维纳米结构。
21.根据权利要求20所述的二维复合材料，其特征在于：所述金属纳米粒子包括金纳米粒子。
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