CN109982778A - 流体系统及相关方法 - Google Patents

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fluid
cassette
box
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乔舒阿·斯塔尔
贾森·迈尔斯
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Asher Texas Co Ltd
ArcherDx LLC
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Asher Texas Co Ltd
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Abstract

提供了流体系统，其包括具有用于执行化学和/或生物分析的模块化部件(匣盒)和/或微流体通道的盒。本文中描述的系统包括盒，在一些实施方式中，盒包括：框架、可插入框架中的一个或更多个匣盒以及用于输送流体的通道系统。在某些实施方式中，所述一个或更多个匣盒包括被配置成包含和/或接收流体(例如，存储的试剂、样品)的一个或更多个储存器或容器。在一些情况下，存储的试剂可以包括一个或更多个冻干球(lyosphere)。本文中描述的系统和方法可以用于进行化学和/或生物反应，包括聚合酶链式反应(PCR)，例如在实验室、临床(例如医院)或研究环境中进行的那些反应。

Description

流体系统及相关方法
相关申请
本申请按照35U.S.C.§119(e)要求美国临时专利申请第62/398,841号、第62/399,152号、第62/399,157号、第62/399,184号、第62/399,195号、第62/399,205号、第62/399,211号和第62/399,219号的优先权，上述申请中的每一个均于2016年9月23日提交，并按照35U.S.C.§§120和365(c)要求于2017年9月15日提交的PCT国际申请第PCT/US2017/051924号的优先权以及于2017年9月15日提交的PCT国际申请第PCT/US2017/051927号的优先权，该PCT国际申请第PCT/US2017/051924号按照35U.S.C.§119(e)要求于2016年9月15日提交的美国临时专利申请第62/395,339号的优先权，该PCT国际申请第PCT/US2017/051927号按照35U.S.C.§119(e)要求于2016年9月15日提交的美国临时专利申请第62/395,347号的优先权，上述申请中的每一个的全部内容通过引用并入本文。
技术领域
本发明大体上涉及用于分子(例如核酸)的自动化处理的系统及相关方法。本发明还大体上涉及流体系统及相关方法。
背景技术
已经开发了许多用于处理核酸的方法。这些方法通常包括多个酶促步骤、纯化步骤和制备步骤，这些步骤使方法费力且容易出错，包括与污染相关联的错误、系统的用户错误和处理偏差。因此，通常难以可靠且可再现地执行这样的过程，特别是在这些过程在商业上进行时，例如在多路或高通量环境中。
发明内容
本发明大体上涉及用于处理核酸的系统及相关方法。在一些实施方式中，该系统包括盒(cartridge)，该盒包括促进核酸的自动化处理——包括自动化核酸库制备——的匣盒(cassette)和/或微流体通道。在一些实施方式中，提供了用于核酸的自动化处理以产生用于下一代测序和/或其他下游分析技术的材料的系统及相关方法。本发明还大体上涉及流体系统及相关方法。
在一组实施方式中，提供了一系列盒。在一个实施方式中，该盒包括：框架，该框架包括被构造并布置成容纳第一匣盒的第一开口以及容纳第二匣盒的第二开口；以及通道系统，其与框架相邻且不与框架成整体，其中，通道系统包括至少一个微流体通道，其中，匣盒被配置成在将第一匣盒和/或第二匣盒分别插入框架中时实现第一匣盒与通道系统的至少一个通道之间的流体连通和/或第二匣盒与通道系统的至少一个通道之间的流体连通。
在另一实施方式中，盒包括：框架，该框架包括被构造并布置成容纳第一匣盒的第一开口以及容纳第二匣盒的第二开口；通道系统，其与框架相邻，其中，通道系统包括至少一个微流体通道；以及第一容器集合，其中，第一容器集合中的至少一部分包含设置在其中的至少一个冻干球(lyosphere)，其中，该盒被配置成实现至少一个容器与通道系统的至少一个微流体通道之间的流体连通。
在另一实施方式中，盒包括：框架，该框架包括第一开口和第二开口；通道系统，其与框架相邻，其中，通道系统包括至少一个微流体通道；被配置成位于框架的第一开口中的第一匣盒，其中，第一匣盒包括第一容器集合；被配置成位于框架的第二开口中的第二匣盒，其中，第一匣盒包括第一容器集合；以及包含在第一匣盒的第一容器集合中的至少之一中的存储的液体试剂，其中，包含存储的液体试剂的容器被密封，以减少或防止存储的液体试剂的蒸发。
在另一实施方式中，盒包括：通道系统，其中，通道系统包括至少一个微流体通道；第一匣盒，包括第一容器集合；包含在第一容器集合中的用于进行第一PCR反应的第一存储试剂集合；第二匣盒，包括第二容器集合；以及包含在第二容器集合中的用于进行第二PCR反应的第二存储试剂集合，其中，盒被构造并布置成使得能够并行地进行第一PCR反应和第二PCR反应，并在分别进行第一PCR反应和/或第二PCR反应期间实现通道系统与第一匣盒和第二匣盒中的至少之一之间的流体连通。
在另一实施方式中，盒包括：公共微流体通道；连接至样品通道的样品入口；连接至第一容器通道的第一容器；连接至第二容器通道的第二容器；第一阀；以及第二阀；其中，公共通道、样品通道、第一容器通道和第二容器通道中的每一个从第一阀延伸，并且其中，公共微流体通道位于第一阀与第二阀之间。
在另一实施方式中，盒包括：第一容器集合；第一阀；连接至第一容器集合的第一容器通道集合，其中，来自第一容器通道集合的通道中的每一个连接至第一阀；第二容器通道集合；以及位于第一容器通道集合与第二容器通道集合之间的公共微流体通道。
在另一组实施方式中，提供了一系列方法。在一个实施方式中，方法包括：使第一流体在公共微流体通道中沿第一方向流动；使第一流体的至少一部分在公共微流体通道中沿第二方向流动，其中，第二方向与第一方向相反；使第一流体的至少一部分经由第一容器通道流动进入第一容器；使第一流体的至少一部分从第一容器流至公共微流体通道；以及使第一流体的至少一部分经由第二容器通道从公共通道流至第二容器。
在一个实施方式中，方法包括：使第一流体在公共微流体通道中流动；使第一流体的一部分流动进入第一容器；使第一流体的一部分流动进入废物容器；在第一容器中进行化学和/或生物反应以形成第二流体；使第二流体的一部分从第一容器流至公共微流体通道；以及使第二流体的一部分流动进入废物容器。
在一个实施方式中，方法包括：使第一流体流动进入公共微流体通道；对阀进行致动，使得公共微流体通道与第一容器通道流体连通；使第一流体的至少一部分流动进入第一容器通道；将第二流体引入公共微流体通道，其中，第二流体与第一流体不混溶；使第二流体的至少一部分从公共微流体通道流动进入第一容器通道；以及在第二在第一容器通道中流动期间，使受控体积的第一流体流动进入与第一容器通道连接的第一容器。
根据以下在结合附图考虑时对本发明的各种非限制性实施方式的详细描述，本发明的其他优点和新颖特征将变得明显。在本说明书和通过引用并入的文献包括冲突和/或不一致的公开内容的情况下，应以本说明书为准。
附图说明
将参考附图通过示例来描述本发明的非限制性实施方式，附图是示意性的并且不旨在按比例绘制。在附图中，示出的每个相同或几乎相同的部件通常由单个附图标记表示。为了清楚起见，在说明对于本领域普通技术人员理解本发明而言不是必需的情况下，并非在每个附图中标记每个部件，也未示出本发明的每个实施方式的每个部件。在附图中：
图1是核酸库(nucleic acid library)制备工作流程的示意图；
图2A是用于使用微流体盒进行自动化核酸库制备的系统的图；
图2B是示出用于使用微流体盒进行自动化核酸库制备的系统的内部部件的图。
图3是微流体盒隔室(bay)组件的透视图；
图4A是微流体盒载体组件的顶视图；
图4B是微流体盒的透视图；
图5是微流体盒的爆炸图；
图6A是正在插入盒中的模块的侧视图；
图6B是插入盒中的模块的侧视图；
图6C是正在插入盒中的两个模块的侧视图；
图7是包括一系列容器的模块的侧视图；
图8是包括一系列包含冻干球的容器的模块的侧视图；
图9是包括公共微流体通道、一系列容器和一系列容器通道的通道系统的顶视图；
图10是包括连接至流体通道的旋转阀的通道系统的顶视图；
图11是包括连接至容器和其他部件的一系列流体通道的通道系统的顶视图；
图12是包括朝向旋转阀流动的流体的通道系统的顶视图；
图13是包括在公共微流体通道中流动的流体的图12中示出的通道系统的顶视图；
图14是包括第一容器中的流体的图12中示出的通道系统的顶视图；
图15是包括在公共微流体通道中流动的流体的图12中示出的通道系统的顶视图；
图16是包括第二容器中的流体的图12中示出的通道系统的顶视图；
图17是示出公共流体通道中的流体的通道系统的顶视图；
图18是示出流体被从公共流体通道输送至第一容器通道的图17中示出的通道系统的顶视图；
图19是示出不混溶流体被用于分隔公共微流体通道中的流体的图17中示出的通道系统的顶视图；
图20是示出不混溶流体被用于将分隔的流体的一部分朝向第一容器推动的图17中示出的通道系统的顶视图；
图21是示出第一容器中的分隔的流体的图17中示出的通道系统的顶视图；
图22是示出微流体盒的层的透视图；
图23是示出微流体盒的层的另一透视图；
图24是示出微流体盒的各层的透视图。
图25是包括各种阀的通道系统的顶视图；以及
图26是包括各种阀的通道系统的另一顶视图。
具体实施方式
大体上提供了包括具有用于处理核酸的模块化部件(匣盒)和/或微流体通道的盒的系统。在一些实施方式中，提供了用于自动化处理核酸以产生用于下一代测序和/或其他下游分析技术的材料的系统及相关方法。在一些实施方式中，本文中描述的系统包括盒，盒包括：框架、可插入框架中的一个或更多个匣盒以及用于输送流体的通道系统。在某些实施方式中，一个或更多个匣盒包括被配置成包含和/或接收流体(例如，存储的试剂、样品)的一个或更多个储存器或容器。在一些情况下，存储的试剂可以包括一个或更多个冻干球。本文中描述的系统和方法可以用于进行化学和/或生物反应，反应包括用于核酸处理的反应，包括聚合酶链式反应(PCR)。在一些实施方式中，本文中提供的系统和方法可以用于处理核酸，如图1所描绘的。例如，在一些实施方式中，本文中更详细地描述的图1中描绘的核酸制备方法可以以多路方式进行，其中多个不同的(例如，多达8个不同的)样本以自动化方式被并行处理。这样的系统和方法可以在实验室、临床(例如，医院)或研究环境中实现。
在一些实施方式中，本文中提供的系统可以用于下一代测序(NGS)样品制备(例如，库样品制备)。在一些实施方式中，本文中提供的系统可以用于样品质量控制。图2A和图2B描绘了用作实验室台式仪器的示例性系统200，其利用多个一次性匣盒、引物匣盒和散装(bulk)流体匣盒。在一些实施方式中，该系统适合在标准实验室工作台上使用。
在一些实施方式中，系统可以具有触摸屏接口(例如，如包括触摸屏接口202的图2A的示例性系统中所示)。在一些实施方式中，接口用“估计的完成时间”、“当前处理步骤”或其他指示符显示一个或更多个盒隔室中的每一个的状态。在一些实施方式中，可以针对一个或更多个盒中的每一个来创建日志文件或报告。在一些实施方式中，日志文件或报告可以保存在仪器上。在一些实施方式中，可以从仪器发送文本文件或输出，例如针对所处理的盒的日期范围或针对具有特定序列号的盒来发送文本文件或输出。
在一些实施方式中，本文中提供的系统可以包括能够接纳一个或更多个核酸制备盒的一个或多个盒隔室(例如，两个，如包括两个盒隔室210的图2B的示例性系统中所示)。在一些实施方式中，盒隔室上方的空间被保留，以供XY定位器224在每个盒隔室的盖子(例如，加热的盖子)228上方移动光学模块226(和/或条形码扫描器，例如2-D条形码扫描器)。在一些实施方式中，系统包括驱动光学模块226和XY定位器224的电子模块222。在一些实施方式中，XY定位器224将定位光学模块226，使得光学模块可以激发容器中的材料(例如荧光团)并收集发射的荧光。在一些实施方式中，这将通过放置在每个容器上的盖子(例如，加热的盖子)中的孔而发生。在一些实施方式中，条形码扫描器将确认已将适当的盒和引物匣盒插入系统中。在一些实施方式中，光学模块226将根据需要在处理样品期间——例如在核酸扩增期间——收集来自每个盒隔室中的每个盒的光信号，以检测扩增的核酸的水平。在一些实施方式中，本文中描述的系统包括有助于对系统内的部件的温度调节的元件，例如一个或多个风扇或风扇组件(例如，图2B中描绘的风扇组件220)。
在一些实施方式中，一个或更多个盒隔室可以以任何组合来处理核酸制备盒。在一些实施方式中，每个盒隔室由例如操作员或机器人组件装载。图3描绘了微流体盒隔室组件300的示例图。在一些实施方式中，在隔室处于打开位置时，通过将盒置于载体板370中以形成载体板组件304来将盒装载至隔室中。在一些实施方式中，载体板本身是可以从盒隔室移除的独立部件。该盒隔室将盒保持在相对于仪器的已知位置。在一些实施方式中，盖子328(例如加热的盖子)包括一个或更多个孔330，以促进对在一个或更多个容器中发生的反应的处理和/或监测。在一些实施方式中，在将新盒装载到仪器上之前，可将引物匣盒安装到盒上。在一些实施方式中，引物匣盒将与盒分开包装。在一些实施方式中，可以将引物匣盒置于盒中。在一些实施方式中，将识别引物匣盒和盒两者从而将它们放置在仪器上使得仪器能够读取它们(例如，使用条形码扫描器)并启动与匣盒相关联的协议(protocol)。
在一些实施方式中，在将载体安装至仪器中之前，可将散装试剂装载到载体中。在一些实施方式中，可以通过仪器或远程样品装载站上的接口向用户或机器人组件通知关于要装载哪些试剂以及在何处装载它们。在一些实施方式中，在将具有引物匣盒的盒装载到仪器中后，用户将具有选择某些反应条件(例如，PCR循环的数量)和/或要在盒上运行的样品的量的选择权。在一些实施方式中，每个盒可以具有1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个样品的容量。
在一些实施方式中，本文中提供的系统可以被配置成处理RNA。然而，在一些实施方式中，系统可以被配置成处理DNA。在一些实施方式中，可以在系统内串行或并行地处理不同的核酸。在一些实施方式中，盒可以用于以自动化方式进行基因融合测定，例如，以检测ALK、RET或ROS1中的基因改变。这样的测定在本文中以及2013年11月14日公布的美国专利申请公开号US 2013/0303461、2013年7月20日公布的美国专利申请公开号US 2015/02011050中公开，上述申请中的每一个的全部内容通过引用并入本文。在一些实施方式中，本文中提供的系统可以以自动化方式来处理来自Integrated DNA Technologies的Xgen协议或其他类似的核酸处理协议。
在一些实施方式中，盒和匣盒将具有执行特定协议所需的全部试剂。在一些实施方式中，一旦载体被装载到盒隔室中，就关闭该隔室的访问门，并且可选地，盖子(例如，加热的盖子)可以自动下降。在一些实施方式中，盖子(例如，加热的盖子)的下降迫使(或放置)盒向下到加热器护套阵列上，加热器护套阵列与盒中的一个或更多个温度受控容器集合中的每一个容器相符。在一些实施方式中，这将盒垂直地放置在抽屉组件中的已知位置。在一些实施方式中，盖子的下降迫使盒向下到这样的位置，在该位置，存在于盒中的旋转阀能够与控制盒中的阀的旋转位置的相应驱动器接合。在一些实施方式中，提供了自动化部件以确保旋转阀与其驱动器恰当地接合。
在本文中提供的方法的一些实施方式中，存在于盒中(例如，在匣盒的容器内)的核酸样品将与冻干球混合。在一些实施方式中，冻干球将包含将附着于样品的荧光团。在一些实施方式中，在冻干球中还将存在“参考材料”，其将包含(例如合成DNA的)已知量的分子。在一些实施方式中，附着于“参考材料”的是另一荧光团，该荧光团将发射与样品的荧光团不同波长的光。在一些实施方式中，使用的荧光团可以经由嵌入染料(例如SYBR Green)或报道子/猝灭剂(reporter/quencher)化学(例如TaqMan等)附着于样品或“参考材料”。在一些实施方式中，在定量PCR(qPCR)循环期间，两种荧光团的荧光将被监测，并且然后用于通过比较CT方法来确定样品中的核酸(例如DNA、cDNA)的量。
有利地，本文中描述的某些系统可以包括模块化部件(例如，匣盒)，该模块化部件可以实现定制要进行的特定反应和/或步骤。在一些实施方式中，用于进行特定类型的反应的某些匣盒包括在盒中。例如，盒中可以存在包括容器的匣盒，该容器包含具有用于进行PCR反应的多个步骤的不同试剂的冻干球。框架或盒还可以包括空区域，以供用户将包含用于要进行的特定反应(或反应集合)的特定流体和/或试剂的一个或更多个匣盒插入盒中。例如，用户可以将包含特定缓冲剂、试剂、醇和/或引物的一个或更多个匣盒插入框架或盒中。可替选地，用户可以将包括不同流体和/或试剂集合的不同匣盒集合插入框架或匣盒的空区域中，以进行不同的反应和/或实验。在将匣盒插入框架或盒之后，匣盒可以与用于输送流体的通道系统形成流体连接，以进行反应/分析。
在一些实施方式中，可以通过将不同的匣盒插入盒中来同时或顺序地进行多个分析。例如，本文中描述的系统和方法可以有利地提供在不需要打开系统或更换盒的情况下分析两个或更多个样品的能力。例如，在一些情况下，可以并行进行与一个或更多个样品的一个或更多个反应(例如，并行进行两个或更多个PCR反应)。这种模块性和灵活性可以实现对多个样品的分析，样品中的每一个可能需要单个流体系统内的一个或多个反应步骤。因此，可以使用本文中描述的系统和方法进行多个复杂反应和分析。
与某些现有的流体系统和方法不同，本文中描述的系统和方法可以是可重复使用的(例如，可重复使用的载体板)或一次性的(例如，包括匣盒和各种流体部件的消耗部件)。在一些情况下，与用于进行类似反应和实验的某些现有流体系统相比，本文中描述的系统可以占据相对小的占地面积(footprint)。
在一些实施方式中，匣盒和/或盒包括进行与一个或更多个样品的特定反应或分析(或者反应或分析集合)所需的存储的流体和/或试剂。匣盒的示例包括但不限于试剂匣盒、引物匣盒、缓冲剂匣盒、废物匣盒、样品匣盒和输出匣盒。可以使用其他合适的模块或匣盒。这样的匣盒可以以在使用存储的试剂之前防止或消除那些试剂的污染或损失的方式配置。下面更详细地描述其他优点。
在一个实施方式中，如图4A和图4B示意性所示，盒400包括框架410和匣盒420、422、424、426、428、430、432和440。在一些实施方式中，这些匣盒中的每一个可以与通道系统(例如，位于匣盒下方，未示出)流体连通。在一些实施方式中，用户可以将匣盒428(例如，试剂匣盒)、430(例如，试剂匣盒)和432(例如，试剂匣盒)中的至少之一插入框架410中，使得匣盒与通道系统流体连通。例如，在一些实施方式中，匣盒428、430和432之一是包含反应缓冲剂(例如Tris缓冲剂)的试剂匣盒。在某些实施方式中，匣盒428、430和/或432可以包括用于反应或反应集合的一个或更多个试剂和/或反应容器。在一些实施方式中，模块440包括多个样品井(well)和/或输出井(例如，配置成接收一个或更多个样品的样品井)。在一些情况下，匣盒420、422、424和426可以包括一种或更多种存储的试剂或反应物(例如，冻干球)。例如，匣盒420、422、424和426中的每一个可以包括用于进行单独反应的不同的存储的试剂或反应物集合。例如，匣盒420可以包括用于进行第一PCR反应的第一试剂集合，并且匣盒422可以包括用于进行第二PCR反应的第二试剂集合。第一反应和第二反应可以同时(例如，并行)进行或顺序地进行。
在一些实施方式中，如图4A示意性所示，载体板组件480包括载体板470以及附加匣盒，该附加匣盒包括模块450、452、454、456、458和460。在示例性实施方式中，匣盒450、452、454、456、458和460可以各自包括一种或更多种存储的试剂和/或可以被配置并布置成接收一种或更多种流体(例如，模块458可以是配置成收集反应废物流体的废物模块)。在一些实施方式中，匣盒450、452、454、456、458和460中的一个或更多个可以是可再填充的。
图5是根据一组实施方式的示例性盒500的爆炸图。盒500包括可以被插入到框架520中的一个或更多个开口中的引物匣盒510和引物匣盒515。盒500还包括流体层组件540，流体层组件540包含与框架520相邻且不与框架520成整体的通道系统。在一些实施方式中，匣盒集合532(例如，包括一个或更多个引物匣盒、缓冲剂匣盒、试剂匣盒和/或废物匣盒，每个匣盒可选地包括一个或更多个容器)、包括反应容器的反应匣盒集合534、包括样品输入容器536和输出容器538的输入/输出匣盒533可以被插入框架520中的一个或更多个开口中。在一些实施方式中，盒500包括阀板550。在一些实施方式中，阀板550连接(例如，卡扣)至框架520并将流体层组件540和匣盒532、533和534在框架520中固定就位。在某些实施方式中，如本文中描述的，盒500包括阀560和多个密封件565。在一些情况下，框架520和/或一个或更多个模块可以被盖570、572和/或574覆盖。
微流体系统和方法
如上面提到的，提供了流体系统，该流体系统包括具有用于进行化学和/或生物分析的模块化部件(匣盒)和/或微流体通道的盒。本文中描述的系统包括盒，在一些实施方式中，盒包括框架、可插入框架中的一个或更多个匣盒以及用于输送流体的通道系统。在某些实施方式中，一个或更多个匣盒包括被配置成包含和/或接收流体(例如，存储的试剂、样品)的一个或更多个储存器或容器。在一些情况下，存储的试剂可以包括一个或更多个冻干球。本文中描述的系统和方法可以用于进行化学和/或生物反应，包括聚合酶链式反应(PCR)，例如在实验室、临床(例如医院)或研究环境中进行的那些反应。
有利地，本文中描述的某些系统可以包括模块化部件(例如，匣盒)，该模块化部件可以实现定制要进行的特定反应和/或步骤。在一些实施方式中，用于进行特定类型的反应的某些匣盒由制造商包括在盒中。例如，盒中可以存在包括容器的匣盒，容器包含具有用于进行PCR反应的多个步骤的不同试剂的冻干球。框架或盒还可以包括空区域，以供用户将包含用于要进行的特定反应(或反应集合)的特定流体和/或试剂的一个或更多个匣盒插入盒中。例如，用户可以将包含特定缓冲剂、试剂、醇和/或引物的一个或更多个匣盒插入框架或盒中。可替选地，用户可以将包括不同流体和/或试剂集合的不同匣盒集合插入到框架或匣盒的空区域中，以进行不同的反应和/或实验。在将匣盒插入框架或盒之后，匣盒可以与用于输送流体的通道系统形成流体连接，以进行反应/分析。
在一些实施方式中，可以通过将不同的匣盒插入盒中来同时或顺序地进行多个分析。例如，本文中描述的系统和方法可以有利地提供在不需要打开系统或更换盒的情况下分析两个或更多个样品的能力。例如，在一些情况下，可以并行进行与一个或更多个样品的一个或更多个反应(例如，并行进行两个或更多个PCR反应)。这种模块性和灵活性可以实现对多个样品的分析，样品中的每一个可能需要单个流体系统内的一个或多个反应步骤。因此，可以使用本文中描述的系统和方法进行多个复杂反应和分析。
与某些现有的流体系统和方法不同，本文中描述的系统和方法可以是可重复使用的(例如，可重复使用的载体板)或一次性的(例如，包括匣盒和各种流体部件的消耗部件)。在一些情况下，与用于进行类似反应和实验的某些现有流体系统相比，本文中描述的系统可以占据相对小的占地面积。
在一些实施方式中，匣盒和/或盒包括进行与一个或更多个样品的特定反应或分析(或者反应或分析集合)所需的存储的流体和/或试剂。匣盒的示例包括但不限于试剂匣盒、引物匣盒、缓冲剂匣盒、废物匣盒、样品匣盒和输出匣盒。这样的匣盒可以以在使用存储的试剂之前防止或消除那些试剂的污染或损失的方式配置。本文中更详细地描述其他优点。
如本文中描述的，盒可以包括用于插入一个或更多个匣盒的框架或支承结构以及可以流体连接至匣盒内的流体部件(例如，容器、储存器)的通道系统。在一些实施方式中，通道系统与框架相邻并且与框架不成整体。也就是说，在某些实施方式中，框架不包括通道系统的在其中形成的通道。在一些这样的实施方式中，通道系统独立于框架形成，并且被定为成与框架相邻(例如，直接相邻)。例如，如图6A示意性所示，盒1100包括框架1110和邻近框架111定位并且不与框架1110成整体的通道系统1130。在一些实施方式中，通道系统1130包括至少一个流体(例如，微流体)通道1135。下面更详细地描述通道系统和流体通道。在一些实施方式中，框架和/或盒与载体板直接接触。在某些实施方式中，载体板可以被配置成便于输送盒和/或将盒适当插入到分析装置或仪器中。
在一些实施方式中，框架包括至少一个开口。例如，再次参照图6A，框架1110包括开口1112。开口可以被构造并布置成容纳匣盒。例如，在一些实施方式中，盒1120可以被插入(例如，定位)至开口1112中。在一些实施方式中，盒1120包括容器1140。如下面更详细描述的，模块可以包括用于特定反应或分析的一种或更多种流体和/或试剂，或者可以被配置成接收用于特定反应或分析的一种或更多种流体和/或试剂(例如，废物盒、试剂盒、引物盒、缓冲剂盒、样品盒、输出盒)。在一些情况下，一种或更多种流体和/或试剂可以存在于盒的一个或更多个容器中(例如，在储存期间，在使用期间)。在某些情况下，盒可以由用户插入盒或框架中。盒可以被配置成使得其框架的开口能够实现盒与通道系统(例如，通道系统的通道、端口或其他流体部件)之间的流体连通。
现在参照图6B，盒1100包括框架1110、通道系统1130以及插入框架1110中使得盒1120与通道系统1130相邻的盒1120。在一些实施方式中，盒1120与通道系统1130例如流体通道1135流体连通(例如，盒1120的容器1140可以与流体通道1135流体连通)。
例如，在一些实施方式中，在由用户使用盒(例如，在盒内进行反应)时，盒可能已经存在于盒中。在某些实施方式中，在制造盒(例如，盒可以由制造商插入框架/盒中)时和/或期间，盒可能存在于盒中。在一些情况下，盒可以物理地连接至盒。例如，在一些这样的实施方式中，盒可以经由粘合剂(例如，环氧树脂)、机械机构(例如，凹槽、闩锁)、摩擦或者通过本领域已知的其他手段连接至通道系统的表面，并配置成与通道系统的表面保持接触。在某些情况下，盒模块与盒的连接可以由制造商和/或由用户进行。
在某些实施方式中，框架包括两个或更多个开口，每个开口被配置成接收盒。现在参照图6C，盒1102包括与通道系统1130相邻的框架1110。在一些实施方式中，框架1110包括两个或更多个开口，例如第一开口1114和第二开口1116。在某些实施方式中，第一匣盒可以被插入到第一开口中并且第二匣盒可以被插入到第二开口中。例如，如图示意性所示，第一匣盒1122可以被插入到第一开口1114中并且/或者第二匣盒1124可以被插入到第二开口1124中。
在一些实施方式中，匣盒1122和/或匣盒1124包含或被配置成包含一种或更多种流体(例如，缓冲剂)和/或试剂。例如，在某些实施方式中，流体和/或试剂可以包含在容器1142和/或容器1144内。可选地包含一种或多种流体和/或试剂的另外的容器也可以存在于匣盒(未示出)中。在一些实施方式中，在将匣盒插入开口1114和/或1116之后，将流体和/或试剂引入盒和/或通道系统中。例如，如本文中描述的，可以将存在于匣盒中的流体和/或试剂输送至通道系统(例如，经由通道系统中的流体通道)。
在另一实施方式中，将流体和/或试剂引入匣盒的流体部件中。例如，在一些情况下，可以将一种或更多种流体和/或试剂从通道系统输送至匣盒。例如，可以将通道系统中的流体和/或试剂输送至第一匣盒(例如，可以将流体通道1139/1137中的流体和/或试剂转移到插入盒中的匣盒1122/1124)，其中可以发生第一反应。在特定的一组实施方式中，可以将所得到的流体输送回至通道系统(例如，从匣盒1122/1124输送到流体通道1139/1137中)。在某些实施方式中，可以将所得到的流体输送至第二匣盒(例如，在匣盒1124的容器1144中)，其中可以发生第二反应。在一些实施方式中，盒可以包括多个开口和/或匣盒，其被配置并布置成使得在匣盒内/之中发生多个反应。
在一些实施方式中，框架包括被配置成接纳一个或更多个匣盒的至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少8个、至少10个、至少12个、至少16个或者至少20个开口。在某些实施方式中，框架包括被配置成接纳一个或更多个模块的小于或等于24个、小于或等于20个、小于或等于16个、小于或等于12个、小于或等于10个、小于或等于8个、小于或等于6个、小于或等于5个、小于或等于4个或者小于或等于3个开口。上面提及的范围的组合也是可能的(例如，至少2个并且小于或等于24个开口)。其他范围也是可能的。在一些这样的实施方式中，盒被配置成在将第一匣盒和/或第二匣盒分别插入框架中时实现第一匣盒与通道系统(例如，通道系统的至少一个通道)之间和/或第二匣盒与通道系统(例如，通道系统的至少一个通道)之间的流体连通。
在一些实施方式中，盒被配置成实现第三匣盒和/或第四匣盒与通道系统之间的流体连通。另外的匣盒也是可能的并且在下面更详细地描述。
如本文中描述的，在一些实施方式中，一个或更多个匣盒可以包括用于特定反应或分析的试剂。例如，插入和/或固定至盒和/或框架的一个或更多个匣盒可以包含例如用于在盒上进行特定反应或分析的一种或一系列存储的试剂。在某些实施方式中，一个或更多个匣盒可以包括用于特定反应或分析的流体(例如，缓冲剂)。在一些情况下，匣盒可以包括用于发生特定反应的区域(例如，容器)。这样，匣盒的不同配置可以用于定制要利用盒进行的特定反应和/或过程。
如本文中描述的，在一些实施方式中，盒被配置成实现至少一个匣盒与通道系统(例如，通道系统的通道)之间的流体连通。在一些实施方式中，一个或更多个匣盒被插入盒和/或框架中或者被布置在盒和/或框架内，使得至少一个匣盒与通道系统流体连通。在某些实施方式中，在将匣盒插入盒中(例如，框架的开口中)之前，匣盒(或匣盒的流体部件)中的至少之一不与通道系统流体连通，但是在将匣盒插入盒中之时或之后，可以发生模块与通道系统之间的流体连通。例如，再次参照图6B，匣盒1120在插入到框架1110之时或之后，可以与通道系统1130流体连通。
在一些情况下，一个或更多个匣盒可以包含试剂(例如，存储的试剂)。例如，匣盒可以包括流体部件，例如储存器、容器和/或通道(例如，微流体通道)，流体部件可以包含一种或更多种试剂(例如，存储的试剂)。根据所需的反应，两个或更多个匣盒可以包含不同的试剂(例如，用于进行第一反应的第一试剂和用于进行第二反应的第二试剂)。例如，在一些实施方式中，第一匣盒被构造并布置成用于进行第一反应(例如，第一PCR反应)，并且第二匣盒被构造并布置成用于进行独立于第一反应的第二反应(例如，第二PCR反应)。
在一些情况下，可以密封一个或更多个匣盒。例如，在一些实施方式中，匣盒可以包含流体，使得在将匣盒插入框架之前，流体基本上不会从匣盒中逸出(例如，通过泄漏，通过蒸发)。有利地，对匣盒进行密封可以减少或防止存储的液体试剂的蒸发和/或试剂的污染。在一些实施方式中，框架或盒包括一个或更多个穿刺(puncture)部件，穿刺部件被构造并布置成在将匣盒插入框架或盒中时对匣盒的一个或更多个部分进行穿刺。在一些这样的实施方式中，在将匣盒插入框架的开口中时，穿刺部件(例如，位于匣盒被插入的开口内或附近)对匣盒进行穿刺，使得包含在匣盒内的试剂与通道系统流体连通。
在一些实施方式中，匣盒中的至少之一包含存储在其中的在将模块插入盒中之前彼此不流体连通的两种或更多种试剂。例如，在一些实施方式中，至少一个匣盒包括存储在其中的第一试剂和存储在其中的第二试剂，其中，在将该匣盒插入盒中之前第一试剂和第二试剂彼此不流体连通。在某些实施方式中，匣盒中的至少之一被插入或固定在盒中，使得存储在该匣盒中的第一试剂和/或第二试剂与通道系统(例如，通道系统的至少一个通道)流体连通。
在一些实施方式中，匣盒中的至少之一具有至少0.1mL和/或小于或等于25mL的总工作容积。在某些实施方式中，匣盒中的至少之一的总工作容积为至少0.1mL、至少0.2mL、至少0.5mL、至少约1mL、至少约2mL、至少约5mL、至少约10mL、至少约15mL或至少约20mL。在一些实施方式中，匣盒中的至少之一的总工作容积为小于或等于25mL、小于或等于20mL、小于或等于15mL、小于或等于10mL、小于或等于5mL、小于或等于2mL、小于或等于1mL、小于或等于0.5mL、小于或等于0.2mL。上面提及的范围的组合也是可能的(例如，至少0.1mL且小于或等于25mL)。其他范围也是可能的。
在某些情况下，模块中的至少之一可以是可再填充的。例如，可以使用至少一个模块进行(例如，其中存储的试剂与样品之间的)反应，并且可以在第一反应完成后用新试剂再填充模块。在一些这样的实施方式中，至少一个模块可以用于进行两个或更多个反应。在其他实施方式中，模块是不可再填充的。
在一些实施方式中，一个或更多个模块包括一个或更多个样品井(即，样品模块)。例如，在某些实施方式中，包括一个或更多个样品井的模块可以被固定至盒并与通道系统流体连通。在一些这样的实施方式中，用户可以将一个或更多个样品插入(例如，经由移液)到一个或更多个样品井中。样品可以被输送至通道系统中并输送至一个或更多个储存器或容器中以进行反应或分析。在一些实施方式中，包括一个或更多个样品井的每个模块的总容积为至少约5μL(例如，至少约10μL、至少约20μL、至少约30μL、至少约40μL、至少约50μL、至少约80μL、至少约100μL、至少约200μL)和/或小于或等于500μL(例如，小于或等于400μL、小于或等于300μL、小于或等于200μL、小于或等于100μL、小于或等于80μL、小于或等于60μL、小于或等于40μL、小于或等于20μL)。上面提及的范围的组合也是可能的。
在某些实施方式中，一个或更多个模块包括一个或更多个输出井(即，输出模块)。例如，在一些情况下，盒可以被配置并布置成使得：一个或更多个样品与盒中存在(或引入)的一种或更多种试剂反应，并且反应的产物被转移到输出井。在一些实施方式中，包括一个或更多个输出井的每个模块的总容积为至少约5μL(例如，至少约10μL、至少约20μL、至少约30μL、至少约40μL、至少约50μL、至少约80μL、至少约100μL、至少约200μL)和/或小于或等于500μL(例如，小于或等于400μL、小于或等于300μL、小于或等于200μL、小于或等于100μL、小于或等于80μL、小于或等于60μL、小于或等于40μL、小于或等于20μL)。上面提及的范围的组合也是可能的。
在一些实施方式中，一个或更多个模块包括一个或更多个废物模块。例如，在一些实施方式中，副产物和/或未使用的试剂可以在操作期间从通道系统转移至一个或更多个废物模块。在一些实施方式中，废物模块具有至少0.1mL和/或小于或等于5mL的容积。在某些实施方式中，废物模块具有至少0.1mL、至少0.2mL、至少0.5mL、至少约1mL、至少约2mL、至少约3mL、至少约4mL的容积。在一些实施方式中，废物模块具有小于或等于5mL、小于或等于2mL、小于或等于1mL、小于或等于0.5mL、小于或等于0.2mL的容积。上面提及的范围的组合也是可能的(例如，至少0.1mL且小于或等于3mL)。其他范围也是可能的。
在一些情况下，一个或更多个模块被配置成接收流体，使得可以在模块内发生反应。例如，在一些实施方式中，一个或更多个模块可以接收反应物和样品，使得反应物和样品在一个或更多个模块内反应。在一些实施方式中，一个或更多个模块包括试剂(即试剂模块)、引物(即引物模块)或缓冲剂(即缓冲模块)。例如，在一些情况下，反应物模块包含一个或更多个冻干球，如下文更详细描述的。下面还更详细地描述反应物、试剂、引物和缓冲剂。
在某些实施方式中，盒可以包括不同类型的匣盒的组合。一些模块可以由用户插入，并且其他模块可以固定至盒(例如，固定至框架)。在一些实施方式中，盒包括1个或更多个、2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、8个或更多个、10个或更多个、12个或更多个、16个或更多个或者20个或更多个模块和/或被配置成接纳模块的开口。在一些情况下，盒可以包括以下模块的组合：一个或更多个样品模块、一个或更多个输出模块、一个或更多个废物模块、一个或更多个可插入模块和/或一个或更多个包含存储的试剂的固定模块。
如上面提到的，在一个实施方式中，如图4A和图4B示意性所示，盒400包括框架410和匣盒420、422、424、426、428、430、432和440。在一些实施方式中，这些匣盒中的每一个可以与通道系统(例如，位于匣盒下方，未示出)流体连通。在一些实施方式中，匣盒428(例如，试剂匣盒)、430(例如，试剂匣盒)和432(例如，试剂匣盒)中的至少之一可以由用户插入到框架410中，使得匣盒与通道系统流体连通。例如，在一些实施方式中，匣盒428、430和432之一是包含反应缓冲剂(例如Tris缓冲剂)的试剂匣盒。在某些实施方式中，匣盒428、430和/或432可以包括用于反应或反应集合的一种或更多种试剂和/或反应容器。在一些实施方式中，模块440包括多个样品井和/或输出井(例如，配置成接收一个或更多个样品的样品井)。在一些情况下，匣盒420、422、424和426可以包括一种或更多种存储的试剂或反应物(例如，冻干球)。例如，匣盒420、422、424和426中的每一个可以包括用于进行单独反应的不同存储的试剂或反应物集合。例如，匣盒420可以包括用于进行第一PCR反应的第一试剂集合，匣盒422可以包括用于进行第二PCR反应的第二试剂集合。第一反应和第二反应可以同时(例如，并行)进行或顺序地进行。
在一些实施方式中，如图4A示意性所示，载体板组件480包括载体板470和包括模块450、452、454、456、458和460的附加匣盒。在示例性实施方式中，匣盒450、452、454、456、458和460可以各自包括一种或更多种存储的试剂和/或可以被配置并布置成接收一种或更多种流体(例如，模块458可以是被配置成收集反应废物流体的废物模块)。在一些实施方式中，匣盒450、452、454、456、458和460中的一个或更多个可以是可再填充的。
在一些实施方式中，至少一个匣盒包括一个或更多个储存器。在一些情况下，储存器是可用于包含流体和/或试剂的容器。虽然本文的大部分描述涉及容器，但是本领域技术人员基于本说明书的教导将理解其他类型的储存器也是可能的，包括但不限于：导管、通道、微通道、腔、小容器(capsule)、凹坑、细孔等。
在某些实施方式中，至少一个匣盒包括容器集合。如图7中示意性所示，匣盒1320包括容器集合1340，容器集合1340包括容器1342、1344和1346。在一些情况下，盒或载体板可以包括一个或更多个这样的匣盒。例如，在一些实施方式中，第一匣盒包括第一容器集合，第二匣盒包括第二容器集合。在某些实施方式中，第三匣盒可以包括第三容器集合。额外的容器集合也是可能的。在一些实施方式中，至少一个容器集合包括至少2个、至少4个、至少6个、至少8个、至少10个或至少15个容器。在某些实施方式中，至少一个容器集合包括少于或等于20个容器、少于或等于15个容器、少于或等于10个容器、少于或等于8个容器、少于或等于6个容器或者少于或等于4个容器。上面提及的范围的组合也是可能的(例如，至少2个并且小于或等于4个容器)。其他范围也是可能的。
如本文中描述的，在一些实施方式中，盒被配置成实现至少一个容器与通道系统(例如，通道系统的通道)之间的流体连通。再次参照图6B，盒1100包括：框架1110；包括流体通道1135的通道系统1130；以及包括位于框架1110中使得容器1140与流体通道1135流体连通的容器1140的盒1120。在一些实施方式中，模块中的容器中的每一个与通道系统之间(例如，基本上同时)发生流体连通(例如，模块中的每个容器可以与通道系统的容器通道流体连通)。
在一些情况下，至少一个容器可以包含试剂(例如，存储的试剂)。根据所需的反应，两个或更多个容器可以包含不同的试剂(例如，用于进行第一反应的第一试剂和用于进行第二反应的第二试剂)。例如，在一些实施方式中，第一容器被构造并布置成用于进行第一反应(例如，PCR反应的第一部分)，并且第二容器被构造并布置成用于进行独立于第一反应的第二反应(例如，PCR反应的第二部分)。两个或更多个容器可以与通道系统流体连通，使得流体可以在容器的每一个容器之间被输送。例如，在第一反应(例如，样品组分与位于第一容器内的第一试剂之间)在第一容器中发生之后，可以将反应产物从第一容器输送返回至通道系统并进入第二容器，以用于进行第二反应(例如，在反应产物与第二试剂之间)。可以使用相同的过程以将流体输送到各种容器中以进行各种反应(例如顺序反应)。
在一些情况下，可以密封一个或更多个容器(例如，使用合适的箔、膜、盖等)。例如，在一些实施方式中，容器可以包含流体，使得在将匣盒插入盒中之前，流体基本上不会从容器中逸出(例如，通过泄漏，通过蒸发)。有利地，对容器进行密封可以减少或防止存储的液体试剂的蒸发。
在一些实施方式中，盒(或框架)包括一个或更多个穿刺部件，穿刺部件被构造并布置成在将容器插入框架中时对容器的一个或更多个部分进行穿刺。在一些这样的实施方式中，在将容器插入盒或框架的开口中时，穿刺部件(例如，位于包含容器的匣盒所插入的开口内或附近)对容器进行穿刺，使得容器和/或容器内包含的试剂与通道系统流体连通。在一些实施方式中，盒包括一系列穿刺部件，每个穿刺部件对准以对容器的密封件进行穿刺。穿刺部件可以是任何合适的形式，例如具有倾斜前缘的探针。
在某些实施方式中，(例如，匣盒的)容器集合中的容器在插入盒中之前(例如，在将包括容器集合的匣盒插入盒和/或框架的开口之前)彼此不流体连通。在一些实施方式中，容器集合包含存储在其中的在将包括容器的匣盒插入盒中之前彼此不流体连通的两种或更多种试剂。例如，在一些实施方式中，容器集合包括存储在第一容器中的第一试剂和存储在第二容器中的第二试剂，其中，第一试剂和第二试剂(和/或第一容器和第二容器)在将包括容器集合的匣盒插入盒中之前彼此不流体连通。在某些实施方式中，将容器集合插入或固定在盒中，使得存储在其中的第一试剂和/或第二试剂与通道系统(例如，通道系统的至少一个通道)流体连通。
在一些实施方式中，至少一个容器可以被配置成接收流体(例如，包含样品的流体、反应流体、废物流体等)，例如从通道系统接收流体。在某些实施方式中，反应可以在容器中进行。例如，容器可以包含第一试剂(例如，第一存储的试剂)，并且第一试剂与流体反应以形成第二流体。在一些情况下，反应可以是化学和/或生物反应。
在一些实施方式中，至少一个容器可以被配置成递送流体(例如，包含样品的流体、反应流体等)，例如将流体递送至通道系统。在一些情况下，至少一个容器可以是可再填充的。例如，可以使用至少一个容器进行(例如，其中存储的试剂与样品之间的)反应，并且可以在第一反应完成之后用新试剂再填充容器。在一些这样的实施方式中，至少一个容器可以用于进行两个或更多个反应。
在某些实施方式中，容器中的至少之一具有至少约1μL(例如，至少约5μL、至少约10μL、至少约20μL、至少约30μL、至少约40μL、至少约50μL、至少约80μL、至少约100μL、至少约200μL的容积)和/或小于或等于500μL(例如，小于或等于400μL、小于或等于300μL、小于或等于200μL、小于或等于100μL、小于或等于80μL、小于或等于60μL、小于或等于40μL、小于或等于20μL)的容积。上面提及的范围的组合也是可能的。容积可以由容器侧壁和容器盖(如果存在的话)所包含的容积限定。
容器可以具有任何合适的形状。在一些实施方式中，至少一个容器具有圆锥形状。在某些实施方式中，至少一个容器具有锥形截面形状。如本文中描述的，容器可以具有任何合适的形状。在一些实施方式中，至少一个容器具有圆锥形状。在某些实施方式中，至少一个容器具有由侧壁限定的锥形截面形状。锥形形状可以是基本上圆锥形的，例如图6A中所示的容器1140的锥形形状，或者可以包括一定程度的曲率(例如，侧壁可以是/看起来是弯曲的，而不是从图6A所示的角度看到的直的)。圆锥或锥形形状的尖端可以近似为容器的入口。容器可以具有锥角，该锥角被定义为轴与表面(例如侧壁)之间形成的角度。在一些实施方式中，容器的锥角可以是至少5°、至少10°、至少20°、至少30°、至少40°、至少45°、至少50°、至少60°或至少70°。在一些实施方式中，容器的锥角可以小于或等于80°、小于或等于70°、小于或等于60°、小于或等于50°、小于或等于45°、小于或等于至40°、小于或等于30°、小于或等于20°或者小于或等于10°。上面提及的范围的组合也是可能的(例如，至少20°且小于或等于45°)。其他范围也是可能的。
容器的形状可以使得容器没有凸缘(ledge)(即无凸缘)；这样的配置可以促进混合和/或减少容器中残留物的存在。容器的形状可以促进检测仪器(例如，光学仪器)的使用，该检测仪器位于容器附近(例如，上方、下方)，使得例如容器内的表面部分和/或流体部分接收用于各种目的——包括例如度量、光化学和过程控制——的适当的光分布。
在一些实施方式中，容器被配置成承受一定的内部压力以在容器中进行反应。例如，容器可以被配置成承受至少1psi、至少1.5psi、至少2psi、至少2.5psi、至少3psi或至少3.5psi的压力。容器中的压力可以小于或等于4psi、小于或等于3psi或者小于或等于2psi。上面提及的范围的组合也是可能的(例如，至少1psi且小于或等于4psi)。上面提及的范围的组合也是可能的。使用本文中描述的盒的方法可以涉及：在一个或更多个容器中在上面描述的一种或更多种压力下进行反应。
温度控制装置
在一些实施方式中，匣盒和/或至少一个容器集合中的至少之一被构造并布置成被加热(或冷却)。在包括两个或更多个匣盒的实施方式中，第一匣盒和第二匣盒(或第一容器集合和第二容器集合)可以被构造并布置成独立地被加热(或冷却)。例如，在一些实施方式中，温度控制装置被配置成将第一温度施加至第一匣盒并且将第二温度施加至第二模块(例如，同时或顺序地)。在一些实施方式中，存在于匣盒中的各个容器可以被布置成独立地被加热或冷却。在一些实施方式中，盒可以包括温度控制装置或与温度控制装置接口。在某些实施方式中，盒可以与温度控制装置连通。在一些实施方式中，盒可以与可以被温度控制的盖子(例如，加热的盖子)接口。例如，在一些实施方式中，匣盒可以与包括温度控制装置的盖子接口。在一些实施方式中，盖子覆盖至少一个容器。在某些实施方式中，盖子(例如，温度受控的盖子)形成容器的顶部。在某些情况下，可以被温度控制的盖子可以是半透明或透明的。有利地，能够被温度控制的盖子可以被配置成使得能够通过该盖子进行光学测量。
在一些实施方式中，匣盒盖子可以由激光切割丙烯酸或注塑丙烯酸(例如，Acrylite H15)构造。然而，在一些实施方式中，盖子可以由丙烯酸树脂、聚碳酸酯、聚丙烯、烯烃聚合物、聚乙烯或聚苯乙烯构造。在一些实施方式中，加热的盖子由铝加工而成并且具有柔性电阻加热器和内部的热反馈。在一些实施方式中，温度控制装置包括一个或更多个热垫、热电部件和/或热敏电阻器。基于本说明书的教导，本领域技术人员将能够选择合适的温度控制装置。
在一些实施方式中，使用热电冷却器(也称为TEC、珀耳帖热泵或固态冷却器)来完成温度控制。在一些实施方式中，通过使用热敏电阻器、电阻温度检测器(RTD)和热电偶(K型)来收集温度反馈。在一些实施方式中，加热的盖子中的加热元件是柔性电阻加热器，并且仅能够加热而不能冷却。
存储的试剂
如本文中描述的，在一些实施方式中，匣盒和/或容器(或容器集合)中的至少之一包含试剂，例如存储的试剂。在某些实施方式中，存储的试剂可以用于进行反应，并且在一些情况下可以是反应物。在一些实施方式中，存储的试剂可以用于进行PCR反应。在一些实施方式中，可以在容器中进行以下过程(或其反应步骤)中的一个或更多个：PCR、qPCR、RT-qPCR、RT/cDNA合成、连接、末端修复/末端修平(polishing)(磷酸化、A-加尾、末端切割(cleavage))、限制酶消化、核酸酶切割、引物退火、BER(碱基切除修复)和DNA变性。
在一些实施方式中，存储的试剂是存储的液体试剂。在一些实施方式中，存储的液体试剂包括引物、缓冲剂、洗涤试剂和/或醇(例如异丙醇、乙醇、甲醇)。在一些实施方式中，引物是PCR引物、随机六聚体、RT特异引物或修饰的引物，例如生物素标记的引物、磷酸化引物、硫代磷酸酯键合引物、锁定核酸引物(LNA)或荧光团标记引物。在一些实施方式中，缓冲剂是Tris缓冲剂、HEPES缓冲剂、MOPS缓冲剂、磷酸盐缓冲剂、TE缓冲剂、TBE缓冲剂、裂解缓冲剂、提取缓冲剂、PCR缓冲剂、PBS缓冲剂或洗涤缓冲剂。在一些实施方式中，洗涤试剂是水、乙醇、异丙醇、三羟甲基氨基甲烷(tris)或洗涤剂溶液。在一些实施方式中，存储的试剂还可以包括：PEG、Tris、甜菜碱、不含甘油的酶、dNTP、盐、缓冲剂、修饰的寡核苷酸等。
在某些实施方式中，存储的试剂是存储的干燥试剂。在一些实施方式中，干燥的试剂是寡核苷酸、引物、合成模板对照、荧光标记探针、荧光染料、缓冲剂、主混合物或酶。
在一些实施方式中，匣盒和/或容器(或容器集合)中的至少之一包含一个或更多个存储的冻干球。也就是说，在某些实施方式中，存储的试剂是储存的冻干球。例如，在一个实施方式中，至少一个匣盒和/或至少一个容器包含单个冻干球。在另一实施方式中，至少一个匣盒和/或至少一个容器包含两个或更多个冻干球(例如，两个或更多个、三个或更多个或者四个或更多个冻干球)。在又一实施方式中，至少一个匣盒和/或至少一个容器包含冻干球集合。在一些实施方式中，容器集合的至少一部分包含设置在其中的至少一个冻干球。例如，如图8示意性所示，匣盒1320包括容器集合1340，每个容器包含冻干球(例如，包含冻干球1352的容器1342，包含冻干球1354的容器1344和/或包含冻干球1356的容器1346)。
虽然图8中示出了每个容器中的单个冻干球，但是本领域技术人员基于本说明书将理解，在其他实施方式中，每个容器中可以存在一个或两个或更多个冻干球。在某些实施方式中，两个或更多个匣盒包括冻干球集合(例如，图4A和图4B中的匣盒220、222、224和/或226中的一个或更多个可以包含冻干球集合)。在一些实施方式中，盒包括第一匣盒和第二模块，第一匣盒包括包含存储的冻干球的第一容器集合，第二模块包括包含存储的冻干球的第二容器集合。在一些这样的实施方式中，第一匣盒和第二匣盒彼此不流体连通(例如，在将匣盒插入盒/框架中之前或之后，和/或在存储期间)。如上面描述的，在一些实施方式中，包含存储的试剂(例如，液体试剂)的容器被密封，以减少或防止存储的试剂的蒸发和/或减少或防止存储的试剂的污染。
在一个示例性实施方式中，盒包括：第一匣盒，其包括第一容器集合；第二匣盒，其包括第二容器集合；包含在第一容器集合中的用于进行第一反应(例如，第一PCR反应)的第一存储的试剂集合；以及包含在第二容器集合中的用于进行第二反应(例如，第二PCR反应)的第二存储的试剂集合。在一些这样的实施方式中，如上面描述的，盒可以被构造并布置成使得第一反应和第二反应能够并行进行。在某些实施方式中，盒可以被构造并布置成在第一反应和/或第二反应期间分别实现通道系统与第一匣盒和第二匣盒中的至少之一之间的流体连通。如下面更详细描述的，通道系统可以包括第一通道集合和第二通道集合。第一通道集合可以与包括第一容器集合的第一匣盒流体连通，并且第二通道集合可以与包括第二容器集合的第二匣盒流体连通。第一通道集合和第二通道集合可以经由一个或更多个阀彼此流体连通。在一些实施方式中，冻干球从商业来源(例如，从Biolyph LLC)获得。在一些实施方式中，冻干球大小的直径范围为0.3cm至1cm。
可以使用任何合适的材料或材料组合来形成系统的部件(例如，模块、框架、匣盒)。在一些实施方式中，使用刚性热聚合物。热聚合物可以通过任何合适的方法例如注塑来处理。材料的非限制性示例包括：聚合物(例如，聚丙烯、聚乙烯、聚苯乙烯、聚(丙烯腈、丁二烯、苯乙烯)、聚(苯乙烯-共-丙烯酸酯)、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚碳酸酯、聚酯、聚(二甲基硅氧烷)、PVC、PTFE、PET或两种或更多种这样的聚合物的混合物)；粘合剂；金属，包括：镍、铜、不锈钢、块体金属玻璃或其他金属或合金；或陶瓷，包括：玻璃、石英、二氧化硅、氧化铝、氧化锆、碳化钨、碳化硅；或非金属材料，例如石墨、硅等。其他材料也是可能的。
系统的部件(例如，模块、框架、匣盒)可以具有任何合适的配置。在一些实施方式中，框架具有至少5英寸、至少6英寸、至少7英寸、至少8英寸、至少9英寸、至少10英寸、至少12英寸或至少20英寸；和/或小于或等于20英寸、小于或等于15英寸、小于或等于10英寸或者小于或等于5英寸的截面尺寸(例如，宽度、高度)。上面提及的范围的组合也是可能的。
如本文中描述的，在一些实施方式中，盒包括通道系统。再次参照图6A至图6C，盒1100包括与框架1110相邻且不与框架1110成整体的通道系统1130。在某些实施方式中，通道系统包括至少一个微流体通道(例如，图6A至图6B中的流体通道1135，图6C中的流体通道1137和流体通道1139)。在一些情况下，一个或更多个微流体通道可以是公共微流体通道。本文使用的术语“公共微流体通道”通常是指与一个或更多个次级通道(例如，一个或更多个容器通道)相关联(例如，与其流体连通、附接)的微流体通道，其中流体可以被输送至公共通道并且可以从公共通道被输送至次级通道。在一些实施方式中，公共微流体通道经由阀连接至次级通道。例如，阀可以允许公共微流体通道与第一通道(例如，连接至容器的第一容器通道)之间的流体连通，并且在切换阀时，可以允许公共微流体通道与第二通道(例如，连接至容器的第二容器通道)之间的流体连通。在某些实施方式中，一个或更多个流体部件(例如，阀、接头)可以流体连接至公共微流体通道和/或流体连接至一个以上的公共微流体通道，如下面更详细描述的。虽然本文中的大部分描述涉及微流体通道，但是本领域技术人员基于本说明书的教导将理解，还可以使用其他流体导管(例如，通道、导管、毛细管)。
在一些实施方式中，通道系统包括：公共微流体通道、一个或更多个阀以及一个或多个容器或容器集合。在某些情况下，每个容器可以被连接至容器通道。例如，如图9示意性所示，在一些实施方式中，通道系统1400包括：公共微流体通道1415、第一容器1420以及第二容器1430。第一容器1420可以被连接(例如，流体连接)至第一容器通道1425，并且第二容器1430可以被连接至第二容器通道1435。在一些实施方式中，通道系统可以包括1个、2个、4个、6个、8个或10个或更多个(和/或小于或等于20个、15个、10个、5个或4个)公共微流体通道，1个、2个、4个、6个、8个或10个或更多个(和/或小于或等于20个、15个、10个、5个或4个)容器集合和/或连接至每个容器的容器通道。每个容器集合可以位于本文中描述的不同匣盒中。在某些实施方式中，每个容器集合可以包括1个、2个、4个、6个、8个或10个或更多个(和/或小于或等于20个、15个、10个、5个或4个)容器。在一些这样的实施方式中，第一容器通道集合和/或第二容器通道集合包括至少2个、4个、6个、8个或10个容器通道和/或小于或等于20个、15个、10个或5个容器通道。上面提及的范围的组合也是可能的。
在一些实施方式中，每个公共微流体通道可以经由阀连接至容器或容器集合。也就是说，在一些实施方式中，每个公共微流体通道和/或每个容器通道可以从阀延伸。例如，再次参照图9，在一些实施方式中，公共微流体通道1415、第一容器通道1425和第二容器通道1435从阀1410(例如，旋转阀)延伸。在一些实施方式中，1个、2个、4个、6个、8个或10个或更多个容器通道和一个或更多个次级通道例如通道1455(例如，一个或更多个样品通道、一个或更多个废物通道、一个或更多个入口通道等)可以从阀延伸。在一些实施方式中，可以操作(例如，切换、旋转)阀，使得公共微流体通道与第一容器通道、公共微流体通道与第二容器通道或者第一容器通道与第二容器通道彼此流体连通。
在一些实施方式中，两个或更多个公共微流体通道从阀延伸。例如，如图10示意性所示，在一些实施方式中，通道系统1402包括：阀1412、连接至阀1412的公共微流体通道1415和1417以及入口通道1445。可以将次级通道(例如，容器通道)和/或容器(直接或间接地)连接至公共微流体通道中的每一个(未示出)。在一些这样的实施方式中，阀1412可以允许入口通道1445与公共微流体通道1415(而不是公共微流体通道1417)之间的流体连通，并且在切换阀1412时，阀可以允许入口通道1445与公共微流体通道1417(而不是公共微流体公道1415)之间的流体连通。在一些实施方式中，公共微流体通道1415流体连接至第一匣盒(例如，包括第一容器集合)，并且公共微流体通道1417连接至第二匣盒(例如，包括第二容器集合)。这样，入口通道可以经由公共微流体通道在下游端处流体连接至一个或更多个匣盒(或者一个或更多个匣盒的一个或更多个容器)。在另一示例中，如本文描述的，用户可以将匣盒插入盒中，并且在插入时，匣盒在上游处与入口通道流体连通，并且使得匣盒中存在的流体可以经由阀被引导至一个或更多个公共微流体通道。
在一组实施方式中，如图11示意性所示，通道系统1404包括第一通道集合1406和第二通道集合1408。第一通道集合可以用于进行第一反应集合(例如，第一PCR反应)并且第二通道集合可以用于进行第二反应集合(例如，第二PCR反应)。第一通道集合1406可以包括连接至第一容器集合1440的第一容器通道集合1422；并且第二通道集合1408可以包括连接至第二容器集合1442的第二容器通道集合1427。
在一些实施方式中，第一容器集合1440包括多个容器(和连接至容器的容器通道)，每个容器通道从阀1410延伸。阀1410可以连接至公共微流体通道1415，公共微流体通道1415可以用于将试剂/流体引入到通道系统1406中以及/或者从通道系统移除试剂/流体。在某些实施方式中，第二容器集合1442包括多个容器(和连接至容器的容器通道)，每个容器从阀1414延伸。阀1414可以连接至公共微流体通道1417，公共微流体通道1417可以用于将试剂/流体引入到通道系统1408中以及/或者从通道系统1408中移除试剂/流体。
如本文中描述的，容器可以是匣盒的一部分，匣盒被插入或者以其他方式是盒的一部分。例如，在一组实施方式中，图11中示出的第一容器集合1440(例如，容器1420和1430)可以是图6C中示出的匣盒1122的一部分，并且第二容器集合1442可以是图6C中示出的匣盒1124的一部分。通道系统1130(图6C)可以包括图1的信道系统1404。例如，通道1139(图6C)可以是容器通道1422(图11)之一，并且通道1137(图6C)可以是容器通道1427(图11)之一。其他配置也是可能的。
在本文中描述的通道系统中，通道和阀的各种配置是可能的。例如，在一些实施方式中，通道系统包括阀1412和从阀1412延伸的公共微流体通道1415和1417。如图11示意性所示，第一容器通道集合和第二容器通道集合可以通过至少一个阀和/或通过至少一个公共微流体通道彼此分开。也就是说，在一些实施方式中，一个或更多个公共微流体通道可以位于第一容器通道集合与第二容器通道集合之间。在某些实施方式中，公共微流体通道可以位于第一阀与第二阀之间。例如，图11中将公共微流体通道1415示意性示出为位于阀1412与阀1410之间。在某些实施方式中，公共微流体通道1417位于阀1412与阀1414之间。
在一些实施方式中，通道系统包括用于进行一个或更多个反应(例如，第一PCR反应、第二PCR反应等)的一个或更多个通道(或通道集合)。例如，再次参照图11，在一些实施方式中，包括连接至第一容器集合1440的第一容器通道集合1422的第一通道集合1406被配置成用于进行第一反应，并且包括连接至第二容器集合1442的第二容器通道集合1427的第二通道集合1408被配置成用于进行第二反应。第一反应和第二反应可以并行进行或顺序地进行。
在一些实施方式中，通道系统包括次级通道，例如连接至废物容器的废物通道、连接至样品井的样品入口通道和/或连接至输出井的输出通道。再次参照图11，在一些实施方式中，阀1410可以连接至样品入口通道1455、输出通道1460和/或废物通道1462。样品入口通道可以连接至一个或更多个样品井(例如，作为样品匣盒1490的一部分，与样品入口通道1455流体连通)。输出通道可以连接至一个或更多个输出井(例如，作为输出匣盒1495的一部分，与输出通道1460流体连通)。废物通道可以连接至一个或更多个废物井(例如，作为废物匣盒的一部分，未示出)。在某些实施方式中，阀1414可以连接至样品入口通道1457、输出通道1465和/或废物通道1467。样品入口通道可以连接至一个或更多个样品井(例如，作为样品匣盒的一部分，未示出)。输出通道可以连接至一个或更多个输出井(例如，作为输出匣盒的一部分，未示出)。废物通道可以连接至一个或更多个废物井(例如，作为废物匣盒的一部分，未示出)。在某些实施方式中，阀1412连接至一个或更多个流体入口通道(例如，流体入口通道1445和1447)，该一个或更多个流体入口通道可以将一种或更多种流体/试剂输送至通道系统。
在一些实施方式中，通道系统中的一个或更多个阀是旋转阀。在某些实施方式中，通道系统中的一个或更多个阀包括凸起特征，该凸起特征被配置成促进流体在公共微流体通道与另一通道之间的流动。在一些情况下，通道系统中的一个或更多个阀包括密封件。
在一些实施方式中，阀被构造并布置成与公共微流体通道和一个次级通道流体连通。例如，可以对阀进行致动，使得在致动阀时，公共微流体通道可以与期望的通道流体连通。
通常，本文中描述的通道系统或其部分可以用于控制流体的方向和/或体积。本文中描述的方法可以用于例如以受控体积混合两种或更多种试剂和/或流体和/或使它们进行反应。在一些情况下，至少一个容器可以在其中包含试剂(例如，存储的试剂)。取决于所需的反应，两个或更多个容器可以包含不同的试剂(例如，用于进行第一反应的第一试剂和用于进行第二反应的第二试剂)。两个或更多个容器可以与通道系统流体连通，使得可以在容器中的每一个之间输送流体。在一些实施方式中，可以控制混合和/或反应的顺序(例如，通过控制和/或交替改变流体流动的方向)。
在一些情况下，转移至第一容器的流体的至少一部分可以暴露于第一容器中存在的第一存储试剂(例如，与第一容器中存在的第一存储试剂反应)。在一些实施方式中，可以将所得到的流体(例如，经反应的流体)从第一容器输送至第二容器。在某些实施方式中，在进入第二容器时，流体暴露于第二试剂(例如，与第二试剂反应)。在一些实施方式中，流体中存在的样品和/或反应物与第一试剂和/或第二试剂反应。
在一些实施方式中，可以控制流体在容器之间的转移(例如，通过对设置在公共微流体通道与一个或更多个容器通道之间的阀进行致动)。例如，在某些实施方式中，可以利用公共微流体通道来促进流体(例如，流动的方向)的转移。在一些这样的实施方式中，可以将经反应的流体中的至少一部分(例如，在与第一存储试剂反应之后)从第一容器输送至公共微流体通道并随后输送至第二容器，使得流体的一部分可以与第二容器中存在的第二存储试剂反应。在一些实施方式中，可以通过使流体在公共微流体通道与两个或更多个容器之间流动来顺序地进行一系列反应(例如，PCR反应步骤)。在一些这样的实施方式中，可以对阀进行致动，使得公共微流体通道与样品入口通道、第一容器通道或第二容器通道流体连通，以促进流体的至少一部分在样品入口通道、第一容器和/或第二容器之间的转移/流动。该过程在图12至图21中示出，图12至图21大体上描绘了处于不同流体流动配置的通道系统1400。
例如，在一些实施方式中，如图12所示，流体1470A(例如，样品)可以经由样品入口通道1455(例如，连接至样品匣盒1490并与样品匣盒1490流体连通)引入通道系统。流体可以沿图12中箭头指示的方向流动。在一些情况下，流体1470A可以由用户提供或引入到连接至样品入口通道1455的样品井中。通过使流体从样品入口通道1455流过阀1410(位于公共微流体通道与容器集合之间，并且被致动使得公共微流体通道与样品入口通道彼此流体连通)，可以将流体转移至公共微流体通道1415。
在一些实施方式中，如图13所示，存在于公共微流体通道1455中的流体的至少一部分可以通过阀1410经由第一容器通道1425输送(例如，流动)至第一容器1420。第一容器1420可以被构造并布置成用于容纳或进行第一反应(例如，PCR反应、化学和/或生物反应的第一部分)。在一些这样的实施方式中，可以对阀1410进行致动，使得公共微流体通道1455和第一容器通道1425彼此流体连通，以使得能够将流体1470A输送至第一容器1420(图13)。在一些实施方式中，第一反应可以在第一容器1420中(例如，在位于第一容器内的样品组分与第一试剂之间)发生。在第一反应在第一容器中发生之后，反应产物可以被输送回第一容器通道，并且随后经由阀输送至公共微流体通道。例如，在一些实施方式中，如图14所示，可以将流体1470B(例如，现在包括反应产物的流体)从容器1420输送至公共微流体通道1415。在一些实施方式中，流体可以沿特定方向流动。例如，在一些情况下，流体可以沿第一方向(例如，如图13中的箭头指示的微流体通道中(例如公共微流体通道中)的朝向阀的第一方向)流动。在某些实施方式中，流体可以沿与第一方向相反的第二方向(例如，微流体通道中(例如公共微流体通道中)的远离阀的第二方向)流动。在一些实施方式中，使流体沿相反方向流动(例如，在对阀进行致动之前和之后)促进流体在公共微流体通道与两个或更多个容器通道之间的转移。
在某些实施方式中，可以经由第二容器通道将反应产物(例如，图15中包括反应产物的流体1470B)输送至第二容器。第二容器可以例如被构造并布置成用于进行独立于第一反应的第二反应(例如，PCR反应的第二部分)。如图15所示，在一些这样的实施方式中，可以对阀1415进行致动，使得公共微流体通道1415与第二容器通道1435彼此流体连通，并且可以经由阀1415将流体1470B从公共微流体通道1415输送至第二容器1430并且进入第二容器通道1435(图16)。在某些实施方式中，第二反应可以在第二容器1430中(例如，在位于第二容器内的样品组分与第二试剂之间)发生。在第二反应之后，可以将反应产物(例如，存在于流体1470C中)从第二容器1430输送至第二容器通道1435并经由阀1410输送回至公共微流体通道1415。可以使用相同的过程将流体输送至各种容器以用于进行各种反应(例如，顺序反应)。有利地，通过使用本文中描述的公共微流体通道和容器集合可以促进许多反应和混合步骤。
流体可以在一个或更多个容器和/或公共微流体通道中保留任何合适的时间量(例如，多达30分钟、多达1小时、多达2小时、多达3小时、多达4小时、多达5小时、多达6小时或更长时间)。
在一些实施方式中，流体(例如，反应的反应产物或者两个或更多个连续反应的反应产物)的至少一部分可以被输送至输出通道(例如，用于收集和/或分析)和/或被输送至废物通道。例如，在一些实施方式中，流体的至少一部分可以被转移至公共微流体通道并随后转移至输出通道(例如，连接至一个或更多个输出井的输出通道)。在一些实施方式中，公共微流体通道中存在的流体的至少一部分被转移至输出通道或废物通道(例如，连接至废物匣盒的废物通道)中。在某些实施方式中，公共微流体通道中保留的基本上全部流体被转移至输出通道和/或废物通道中。在某些实施方式中，公共微流体通道中存在的未被转移至第一容器和/或第二容器中的流体的至少一部分可以流入废物通道。
在某些实施方式中，可以控制混合和/或反应的流体的量(例如，体积)。在一些情况下，可能需要将特定体积的流体添加至容器中(例如，以促进与反应物和/或样品的受控反应)。在一些实施方式中，特定体积的流体可以在容器和/或公共微流体通道内分离。有利地，本文中描述的系统和方法可以促进已知/预定体积的流体至容器和/或通道的转移。例如，可以在第一容器与公共微流体通道之间转移至少1微升、至少2微升、至少5微升或至少10微升。有利地，可以通过本文中描述的方法将所需体积的反应物和/或样品与一种或更多种流体反应，使得可以精确地进行特定的反应步骤。
在一些实施方式中，第二流体(例如，与第一流体不混溶的流体)可以用于在公共微流体通道与一个或更多个容器通道之间引导(例如，推动)特定体积的第一流体。在示例性实施方式中，如图17所示，(第一)流体1470被设置在公共微流体通道1415内。可以通过对阀1410进行致动以使得第一容器通道1425与公共微流体通道1415流体连通，来将流体1470的至少一部分输送至第一容器1420。如图18所示，可以将流体1470的至少一部分输送至第一容器通道1425的至少一部分中。在一些这样的实施方式中，可以选择输送至第一容器通道1425的至少一部分中的流体1470的一部分的体积。例如，可以对与公共微流体通道1415流体连通的泵(例如，注射泵)进行致动，使得已知体积的流体1470被设置在第一容器通道1425内。再次参照图11，在某些实施方式中，泵可以流体连接至入口通道1447，并且可以对阀1412进行致动，使得入口通道1447与公共微流体通道1415流体连通。
再次参照图18，可以向样品入口通道1455提供第二流体1480。如图19所示，可以通过对阀1410进行致动以使得样品入口通道1455与公共微流体通道1415流体连通，将第二流体1480输送至公共微流体通道(例如，有效地将流体1470进一步移位至公共微流体通道中)。第二流体1480可以沿第一方向(如图19中的箭头所示)流动。在一些实施方式中，该第二流体可以将第一流体1470分隔成至少几部分，例如，如图19中示意性所示的部分1470A和1470B。流体部分可以是由至少第二流体分开的流体塞(fluid plug)(例如，第一流体塞和第二流体塞)的形式，该第二流体在某些情况下可以与第一流体不混溶。
现在参照图20，可以对阀1410进行致动，使得公共微流体通道1415与第一容器通道1425流体连通。第二流体1480的至少一部分可以被朝向第一容器通道1425输送(沿图20中的箭头指示的与第一方向相反的第二方向流动)，使得流体1470A被移位。在一些这样的实施方式中，由第二流体1480将所需体积的流体1470A输送至第一容器1420(例如，如图21中所示)。在一些实施方式中，第二流体的至少一部分也被引入第一容器中。然而，在其他实施方式中，基本上没有第二流体被引入容器中。
虽然上面的大部分描述涉及在公共微流体通道与第一容器通道之间转移所需体积的流体，但是本领域的技术人员基于说明书的教导将理解，一系列步骤例如上面描述的那些步骤可用于促进所需体积的流体在公共微流体通道与一个或更多个容器、一个或更多个容器通道、一个或更多个输出通道和/或一个或更多个废物通道之间的转移。例如，在一些实施方式中，可能期望将第一体积的流体输送至第一容器，并且将不同于第一体积的第二体积的流体输送至第二容器。在一些这样的实施方式中，可以利用上述步骤来促进流体体积的这样的转移。
在一些情况下，上面描述的第二流体与第一流体(例如含水流体)不混溶(例如，第二流体是空气)。在一些实施方式中，第二流体可以用于沿特定方向(例如，公共微流体通道中的方向)推动第一流体和/或将第一流体推入通道或其他部件(例如，公共微流体通道、容器通道、输出通道、废物通道)中。在某些实施方式中，第二流体可以用于保持流体分离(例如，作为流体塞)。例如，在一些情况下，第二流体可以存在于通道中并且被设置在两个流体部分(例如，第一流体与第三流体)之间。在一些这样的实施方式中，第一流体与第三流体可以相同或不同。
如上面描述的，在一些实施方式中，第二流体促进受控体积的第一流体的流动。在一些实施方式中，受控体积的体积为至少约5μL(例如，至少约10μL、至少约20μL、至少约30μL、至少约40μL、至少约50μL、至少约80μL、至少约100μL、至少约200μL)和/或小于或等于500μL(例如，小于或等于400μL、小于或等于300μL、小于或等于200μL、小于或等于100μL、小于或等于80μL、小于或等于60μL、小于或等于40μL、小于或等于20μL、小于或等于10μL、小于或等于5μL、小于或等于2μL)。上面提及的范围的组合也是可能的。其他体积也是可能的。
通常，一个或更多个容器通道和公共微流体通道的内部容积可以是已知的，并且可以用于分隔特定体积的流体。例如，在一些这样的实施方式中，可以利用设置有流体的特定通道的尺寸(例如，长度、截面尺寸)来确定设置在通道内的流体的体积。作为说明性示例，在特定实施方式中，第一容器通道可以具有2微升的内部容积。在这样的实施方式中，如果期望将1微升的流体添加至第一容器，则可以对公共微流体通道(与第一容器通道流体连通)施加压力，使得流体被一半地设置到第一容器通道中。如上面描述的可以对阀进行致动，并且可以将第二流体(例如，与第一流体不混溶的流体，例如空气)引入公共微流体通道中并重新引导至第一容器通道中，使得1μL的第一流体由第二流体移位并输送至第一容器中。在一些这样的实施方式中，可以将第二流体的至少一部分输送至第一容器中。然而，在某些实施方式中，基本上没有第二流体被输送至第一容器中(例如，将压力施加至公共微流体通道，使得第一流体被输送至第一容器，但基本上没有第二流体被输送至第一容器)。
可以使用任何合适的部件例如泵、注射器、加压容器或任何其他压力源将流体转移(例如，输送、流动、移位)至微流体通道(例如，公共微流体通道、容器通道等)、容器或匣盒中。可替选地，可以通过在通道或装置的下游侧施加真空或减小的压力来将流体拉入微流体通道、容器或匣盒中。可以通过能够提供比存在于通道或装置上游的压力条件更低的压力条件的任何源来提供真空。这些源可以包括真空泵、文丘里管、注射器和抽空容器。然而，应该理解的是，在某些实施方式中，可以通过使用毛细管流动、使用阀或者改变压力和/或流速的其他外部控制装置改变微流体装置的入口和出口的压降，来执行本文中描述的方法。
在一些实施方式中，使流体(例如，第一流体、第二流体)或流体的至少一部分流动包括：向公共微流体通道施加压力，使得第一流体的至少一部分进入容器通道。在某些实施方式中，使流体流动包括：向公共微流体通道施加压力，使得第一流体的至少一部分从容器通道转移至容器(或从容器转移至容器通道)。在一些实施方式中，压力是正压力。在某些实施方式中，压力是负压力或减小的压力。在某些实施方式中，存在于容器通道和/或连接至容器路径的容器中的流体的体积由施加至公共微流体通道的压力控制。
在一些实施方式中，如上面描述的，阀可以引导各种通道之间(例如，在第一容器通道与公共微流体通道之间、在第一容器通道与废物通道之间、在样品入口与微流体通道之间等)的流体的转移。在一些实施方式中，使流体(例如，第一流体、第二流体)的至少一部分流动包括：对阀进行致动，使得公共微流体通道与容器通道(例如，第一容器通道、第二容器通道)流体连通。
在一些实施方式中，第一流体可以是液体样品、试剂、水、缓冲剂等。在某些实施方式中，第二流体可以是液体样品、试剂、水、缓冲剂等。在一些情况下，第二流体可以与第一流体不混溶。在一些这样的实施方式中，第二流体可以是气体(例如空气、氮气)。在一些实施方式中，流体可以选自：矿物油、硅酮油、乙醇、三羟甲基氨基甲烷、水、PEG溶液、荧光团、碳氟化合物或氟硅基化合物，例如全氟化合物。
在某些实施方式中，通道系统的一个或更多个通道具有特定的平均截面尺寸。垂直于流体流动方向来测量通道的“截面尺寸”(例如，直径)。在一些实施方式中，通道的平均或最大截面尺寸小于或等于约2mm、小于或等于约1mm、小于或等于约800微米、小于或等于约600微米、小于或等于约500微米、小于或等于约400微米或者小于或等于约300微米。在某些实施方式中，通道的平均或最大截面尺寸大于或等于约50微米、大于或等于约100微米、大于或等于约150微米、大于或等于约200微米、大于或等于约250微米、大于或等于约300微米、大于或等于约400微米、大于或等于约500微米、大于或等于约600微米、大于或等于等于约800微米或者大于或等于约1mm。上面提及的范围的组合也是可能的(例如，在约250微米与约2mm之间，在约400微米与约1mm之间，在约300微米与约600微米之间)。其他范围也是可能的。在某些情况下，可以使用多于一个通道或毛细管。“微流体通道”是指平均截面尺寸小于1mm的通道。
通道系统的一个或更多个微流体通道可以具有任何合适的内部容积。在一些实施方式中，通道(例如，微流体通道、公共通道、容器通道)的内部容积可以是至少0.1微升、至少0.5微升、至少1微升、至少2微升、至少5微升、至少7微升、至少10微升、至少12微升、至少15微升、至少20微升、至少30微升或者至少50微升。在某些实施方式中，微流体通道的内部容积可以小于或等于200微升、小于或等于150微升、小于或等于100微升、小于或等于80微升、小于或等于70微升、小于或等于50微升、小于或等于25微升、小于或等于10微升或者小于或等于5微升。上面提及的范围的组合也是可能的(例如，在1微升与10微升之间)。其他范围也是可能的。在一些实施方式中，第一容器通道的内部容积小于第二容器通道的内部容积。
通道系统的一个或更多个通道(例如，微流体通道)可以具有任何合适的截面形状(圆形、椭圆形、三角形、不规则形、梯形、正方形或矩形等)。微流体通道还可以具有至少2：1更典型地至少3：1、5：1或10：1或更大的纵横比(长度与平均截面尺寸之比)。通道内的流体(例如，样品)可以部分地或完全地填充通道。
在一些实施方式中，一个或更多个通道(例如，微流体通道)可以具有特定配置。在某些实施方式中，一个或更多个微流体通道的至少一部分在流体流动方向上可以基本上是线性的。在一些实施方式中，基本上所有的一个或更多个微流体通道在流体流动方向上基本上是线性的。在一些实施方式中，一个或更多个微流体通道(例如，公共微流体通道)的至少一部分可以是曲线的、弯曲的、蛇形的、交错的、锯齿形的、螺旋形的或前述的组合。有利地，与线性微流体通道相比，非线性微流体通道(例如，蛇形公共通道)的使用允许在平均流体流动方向上测量的盒的每单位长度的通道的保持容积增加。
本文中描述的通道系统或其部分(例如，阀、微流体通道)可以由任何合适的材料制成。材料的非限制性示例包括：聚合物(例如，聚丙烯、聚乙烯、聚苯乙烯、聚(丙烯腈、丁二烯、苯乙烯)、聚(苯乙烯-共-丙烯酸酯)、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚碳酸酯、聚酯、聚(二甲基硅氧烷)、PVC、PTFE、PET或两种或更多种这样的聚合物的混合物)；粘合剂；或金属，包括：镍、铜、不锈钢、块体金属玻璃或其他金属或合金；或陶瓷，包括：玻璃、石英、二氧化硅、氧化铝、氧化锆、碳化钨、碳化硅；或非金属材料，例如石墨、硅等。在一些实施方式中，使用压敏粘合剂，如丙烯酸粘合剂和硅酮粘合剂。在一些情况下，也可以使用热固性粘合剂。在某些实施方式中，通道可以通过以下方式产生：将通道注塑到基底中并用顶部树脂层覆盖该基底，其中通过压敏粘合剂、热固性粘合剂、激光焊接、超声结合或者将覆盖层在通道附近密封至基底并形成密封的任何其他结合方法来固定该顶部树脂层。
在一些实施方式中，通道系统或其部分由多个层例如交替的聚合物层和粘合剂层形成，从而在其中形成微流体通道。在示例性实施方式中，如图22至图23所示，匣盒1600包括容器集合(例如，包括容器1620和容器1622)和通道系统1610，其中通过组装多个交替的聚合物层和粘合剂层制成通道系统1610，每个层包括在组装时形成多个通道的图案。盒1600可以包括框架1630，其中，匣盒1640和1645插入框架内的开口中。在一些实施方式中，盒1600包括：一个或更多个阀(例如，阀1650)，其被构造并布置成与通道系统1610的公共微流体通道流体连通。在一组实施方式中，组件包括交替的压敏粘合剂层和聚酯树脂层。例如，在关于图23的一些实例中，较暗的层是粘合剂层并且较亮的层是树脂。可以通过在压机中将各层压在一起并等待几秒钟以使结合发生来固化压敏粘合剂。如果使用热固性粘合剂，则可以使用热和压力来固化粘合剂。在一些实施方式中，多个层是如图24中描绘示出的层1至层10。
用于形成微流体通道的其他方法在本领域中是已知的，并且包括例如微制造、模塑、铸造、化学蚀刻、光刻以及前述的组合。
扩增(AMP)方法
本文中描述了确定与已知靶核苷酸序列邻接的核苷酸序列的方法。可以使用本文中公开的系统以自动化方式实现这些方法。传统的测序方法随机地产生序列信息(例如，“鸟枪”测序)或在用于设计引物的两个已知序列之间产生序列信息。相比之下，在一些实施方式中，本文中描述的某些方法使得能够以高的特异性和灵敏度水平来确定已知序列的单个区域的上游或下游的核苷酸序列(例如，测序)。
在一些实施方式中，本文中提供的系统可以被配置成例如以自动化方式实现如下方法，该方法在使用下一代测序技术确定核苷酸序列之前富集(enrich)特定核苷酸序列。在一些实施方式中，本文中提供的方法可以涉及：富集包括脱氧核糖核酸(DNA)的样品。在一些实施方式中，本文中提供的方法包括：(a)将包括已知靶核苷酸序列的靶核酸与通用寡核苷酸尾部衔接子连接；(b)用第一衔接子引物和第一靶特异性引物来扩增通用寡核苷酸尾部衔接子的扩增链和靶核酸的一部分；(c)用第二衔接子引物和第二靶特异性引物来扩增从步骤(b)得到的扩增子的一部分；以及(d)将DNA溶液转移给用户。在一些实施方式中，方法的一个或更多个步骤可以在本文中提供的盒的不同容器内进行。在一些实施方式中，盒中的微流体通道和阀促进反应材料/流体从盒中的一个容器至另一个容器的转移，以允许反应以自动化方式进行。在一些实施方式中，随后可以使用下一代测序技术用第一测序引物和第二测序引物对DNA溶液进行测序。
在一些实施方式中，使用本文中提供的系统处理的样品包括基因组DNA。在一些实施方式中，包括基因组DNA的样品包括步骤(a)之前的断裂(fragmentation)步骤。在一些实施方式中，每个连接和扩增步骤可以可选地包括随后的纯化步骤(例如，步骤(a)与步骤(b)之间的样品纯化、步骤(b)与步骤(c)之间的样品纯化和/或步骤(c)之后的样品纯化)。例如，富集包括基因组DNA的样品的方法可以包括：(a)基因组DNA的断裂；(b)将包括已知靶核苷酸序列的靶核酸与通用寡核苷酸尾部衔接子连接；(c)连接后样品纯化；(d)用第一衔接子引物和第一靶特异性引物来扩增通用寡核苷酸尾部衔接子的扩增链和靶核酸的一部分；(e)扩增后样品纯化；(f)用第二衔接子引物和第二靶特异性引物来扩增从步骤(d)得到的扩增子的一部分；(g)扩增后样品纯化；以及(h)将经纯化的DNA溶液转移给用户。在一些实施方式中，方法的步骤可以在本文中提供的盒的不同容器内进行。在一些实施方式中，盒中的微流体通道和阀以自动化方式促进反应材料/流体从盒中的一个容器至另一个容器的转移。随后可以使用下一代测序技术用第一测序引物和第二测序引物对经纯化的样品进行测序。
在一些实施方式中，本文中提供的系统和方法可以用于处理核酸，如图1中的示例性工作流程描述的。提供了核酸样品120。在一些实施方式中，样品包含RNA。在一些实施方式中，样品包含DNA(例如，双链互补DNA(cDNA)和/或双链基因组DNA(gDNA)102)。在一些实施方式中，使核酸样品经历包括核酸末端修复和/或dA加尾的步骤102。在一些实施方式中，使核酸样品经历包括衔接子连接的步骤104。在一些实施方式中，通用寡核苷酸衔接子122与核酸样品中的一种或更多种核酸连接。在一些实施方式中，连接步骤包括平末端连接。在一些实施方式中，连接步骤包括粘性末端连接。在一些实施方式中，连接步骤包括突出端连接。在一些实施方式中，连接步骤包括TA连接。在一些实施方式中，进行dA加尾步骤102以在核酸样品中生成与通用寡核苷酸衔接子中的突出端互补的突出端(例如，TA连接)。在一些实施方式中，将通用寡核苷酸衔接子连接至核酸样品中的一个或更多个核酸的两端，以生成侧面连接有通用寡核苷酸衔接子的核酸124。在一些实施方式中，使用衔接子引物130和第一靶特异性引物132进行初始一轮扩增。在一些实施方式中，使用衔接子引物和第二靶特异性引物134对经扩增的样品进行第二轮扩增。在一些实施方式中，第二靶特异性引物相对于第一靶特异性引物嵌套。在一些实施方式中，第二靶特异性引物包括杂交序列(例如，公共序列)的额外序列5'，其可以包括条形码、索引、衔接子序列或测序引物位点。在一些实施方式中，第二靶特异性引物进一步与额外的引物接触，该额外的引物与如134所示的第二靶特异性引物的公共序列杂交。在一些实施方式中，第二轮扩增产生适于核酸测序(例如，下一代测序方法)的核酸126。
在一些实施方式中，本文中提供的系统和方法可以用于处理核酸，如以下专利中描述的：2017年9月15日提交的PCT国际申请第PCT/US2017/051924号，其按照35U.S.C.§119(e)要求于2016年9月15日提交的美国临时专利申请第62/395,339号的优先权；以及2017年9月15日提交的PCT国际申请第PCT/US2017/051927号，其按照35U.S.C.§119(e)要求于2016年9月15日提交的美国临时专利申请第62/395,347号的优先权，其中每一个专利中与核酸库制备有关的全部内容通过引用在此并入。
在一些实施方式中，使用本文中提供的系统处理的样品包括核糖核酸(RNA)。在一些实施方式中，本文中提供的系统可以用于通过包括以下操作的方法处理RNA：(a)在杂交条件下使包括已知靶核苷酸序列的靶核酸分子与随机引物群接触；(b)进行模板相关的延伸反应，该延伸反应由杂交的随机引物引发并使用杂交位点下游的靶核酸分子的一部分作为模板；(c)在杂交条件下使步骤(b)的产物与初始靶特异性引物接触；(d)进行模板相关的延伸反应，该延伸反应由杂交的初始靶特异性引物引发并使用靶核酸分子作为模板；(e)使核酸经历末端修复、磷酸化和腺苷酸化；(f)将包括已知靶核苷酸序列的靶核酸与通用寡核苷酸尾部衔接子连接；(g)用第一衔接子引物和第一靶特异性引物来扩增通用寡核苷酸尾部衔接子的扩增链和靶核酸的一部分；(h)用第二衔接子引物和第二靶特异性引物来扩增从步骤(g)得到的扩增子的一部分；以及(i)将cDNA溶液转移给用户。在一些实施方式中，方法的一个或更多个步骤可以在本文中提供的盒的不同容器内进行。在一些实施方式中，随后可以使用下一代测序技术用第一测序引物和第二测序引物对cDNA溶液进行测序。
在一些实施方式中，每个连接和扩增步骤可以可选地包括随后的样品纯化步骤(例如，步骤(f)与步骤(g)之间的样品纯化步骤、步骤(g)与步骤(h)之间的样品纯化步骤和/或步骤(h)之后的样品纯化)。例如，富集包括RNA的样品的方法可以包括：(a)在杂交条件下使包括已知靶核苷酸序列的靶核酸分子与随机引物群接触；(b)进行模板相关的延伸反应，该延伸反应由杂交的随机引物引发并使用杂交位点下游的靶核酸分子的一部分作为模板；(c)在杂交条件下使步骤(b)的产物与初始靶特异性引物接触；(d)进行模板相关的延伸反应，该延伸反应由杂交的初始靶特异性引物引发并使用靶核酸分子作为模板；(e)使核酸经历末端修复、磷酸化和腺苷酸化；(f)将包括已知靶核苷酸序列的靶核酸与通用寡核苷酸尾部衔接子连接；(g)连接后样品纯化；(h)用第一衔接子引物和第一靶特异性引物来扩增通用寡核苷酸尾部衔接子的扩增链和靶核酸的一部分；(i)扩增后样品纯化；(j)用第二衔接子引物和第二靶特异性引物来扩增从步骤(h)得到的扩增子的一部分；(k)扩增后样品纯化；以及(1)将经纯化的cDNA溶液转移给用户。在一些实施方式中，方法的一个或更多个步骤可以在本文中提供的盒的不同容器内进行。随后可以使用下一代测序技术用第一测序引物和第二测序引物对经纯化的样品进行测序。
在一些实施方式中，本文中提供的系统可以被配置成例如以自动化方式实现富集核苷酸序列的方法，该核苷酸序列包括来自未知核苷酸序列的邻近区域下游的已知靶核苷酸序列(例如，包括包含未知序列的5'区域和包含已知序列的3'区域的核苷酸序列)。在一些实施方式中，该方法包括：(a)在杂交条件下使包括已知靶核苷酸序列的靶核酸分子与初始靶特异性引物接触；(b)进行模板相关的延伸反应，该延伸反应由杂交的初始靶特异性引物引发并使用靶核酸分子作为模板；(c)在杂交条件下使步骤(b)的产物与加尾的随机引物群接触；(d)进行模板相关的延伸反应，该延伸反应由杂交的加尾随机引物引发并使用杂交位点下游的靶核酸分子的一部分作为模板；(e)用第一尾引物和第一靶特异性引物来扩增加尾随机引物序列和靶核酸分子的一部分；(f)用第二尾引物和第二靶特异性引物来扩增从步骤(e)得到的扩增子的一部分；以及(g)将cDNA溶液转移给用户。随后可以使用下一代测序技术用第一测序引物和第二测序引物对cDNA溶液进行测序。在一些实施方式中，加尾的随机引物群包括单链寡核苷酸分子，单链寡核苷酸分子具有与第一测序引物相同的5'核酸序列和包括从约6个至约12个随机核苷酸的3'核酸序列。在一些实施方式中，第一靶特异性引物包括可以在退火温度下与靶核酸的已知靶核苷酸序列特异性退火(anneal)的核酸序列。在一些实施方式中，第二靶特异性引物包含3'部分和5'部分，3'部分包括可以与从步骤(e)得到的扩增子所包括的已知靶核苷酸序列的一部分特异性退火的核酸序列，5'部分包括与第二测序引物相同的核酸序列，并且第二靶特异性引物相对于第一靶特异性引物嵌套。在一些实施方式中，第一尾引物包括与加尾随机引物相同的核酸序列。在一些实施方式中，第二尾引物包括与第一测序引物的一部分相同的核酸序列，并且第二尾引物相对于第一尾引物嵌套。在一些实施方式中，该方法的一个或更多个步骤可以在本文提供的盒的不同容器内进行。
在一些实施方式中，本文中提供的系统可以被配置成例如以自动化方式实现富集核苷酸序列的方法，该核苷酸序列包括来自未知核苷酸序列的邻近区域上游的已知靶核苷酸序列(例如，包括包含已知序列的5'区域和包含未知序列的3'区域的核苷酸序列)。在一些实施方式中，该方法包括：(a)在杂交条件下使包括已知靶核苷酸序列的靶核酸分子与加尾随机引物群接触；(b)进行模板相关的延伸反应，该延伸反应由杂交的加尾随机引物引发并使用杂交位点下游的靶核酸分子的一部分作为模板；(c)在杂交条件下使步骤(b)的产物与初始靶特异性引物接触；(d)进行模板相关的延伸反应，该延伸反应由杂交的初始靶特异性引物引发并使用靶核酸分子作为模板；(e)用第一尾引物和第一靶特异性引物来扩增加尾随机引物序列和靶核酸分子的一部分；(f)用第二尾引物和第二靶特异性引物来扩增从步骤(e)得到的扩增子的一部分；以及(g)将cDNA溶液转移给用户。随后可以使用下一代测序技术用第一测序引物和第二测序引物对cDNA溶液进行测序。在一些实施方式中，加尾随机引物群包括单链寡核苷酸分子，单链寡核苷酸分子具有与第一测序引物相同的5'核酸序列以及包括从约6个至约12个随机核苷酸的3'核酸序列。在一些实施方式中，第一靶特异性引物包括可以在退火温度下与靶核酸的已知靶核苷酸序列特异性退火的核酸序列。在一些实施方式中，第二靶特异性引物包括3'部分和5'部分，3'部分包括可以与从步骤(c)得到的扩增子所包括的已知靶核苷酸序列的一部分特异性退火的核酸序列，5'部分包括与第二测序引物相同的核酸序列，并且第二靶特异性引物相对于第一靶特异性引物嵌套。在一些实施方式中，第一尾引物包括与加尾随机引物相同的核酸序列。在一些实施方式中，第二尾引物包括与第一测序引物的一部分相同的核酸序列，并且第二尾引物相对于第一尾引物嵌套。在一些实施方式中，该方法的一个或更多个步骤可以在本文中提供的盒的不同容器内进行。在一些实施方式中，该方法还涉及在延伸初始靶特异性引物之后使样品与核糖核酸酶接触的步骤。在一些实施方式中，加尾随机引物可以形成发夹环结构。在一些实施方式中，初始靶特异性引物和第一靶特异性引物是相同的。在一些实施方式中，加尾随机引物还包括在与第一测序引物相同的5'核酸序列与包括6至12个随机核苷酸的3'核酸序列之间包括6至12个随机核苷酸的条形码部分。
通用寡核苷酸尾部衔接子
如本文所用，术语“通用寡核苷酸尾部衔接子”是指由两条链(阻断链和扩增链)组成并包括第一可连接双链体末端和第二未配对末端的核酸分子。通用寡核苷酸尾部衔接子的阻断链包括5'双链体部分。扩增链包括未配对的5'部分、3'双链体部分、3'T突出端以及与第一测序引物和第二测序引物相同的核酸序列。阻断链和扩增链的双链体部分基本上互补，并形成包括3'T突出端的第一可连接双链体末端，并且双链体部分具有足够的长度以在连接温度下保持双链体形式。
在一些实施方式中，包括与第一测序引物和第二测序引物相同的核酸序列的扩增链的一部分可以至少部分地由扩增链的5'未配对部分包括。
在一些实施方式中，通用寡核苷酸尾部衔接子可以包括双链体部分和未配对部分，其中未配对部分仅包括扩增链的5'部分，即整个阻断链是双链体部分。
在一些实施方式中，通用寡核苷酸尾部衔接子可以具有“Y”形状，即未配对部分可以包括未配对的阻断链和扩增链两者的部分。阻断链的未配对部分可以比扩增链的未配对部分在长度上短、长或相等。在一些实施方式中，阻断链的未配对部分可以比扩增链的未配对部分短。Y形通用寡核苷酸尾部衔接子具有以下优点：在PCR方案期间，阻断链的未配对部分不会经历3'延伸。
在一些实施方式中，通用寡核苷酸尾部衔接子的阻断链还可以包括3'未配对部分，该3'未配对部分基本上不与扩增链的5'未配对部分互补；并且其中，阻断链的3'未配对部分基本上不与任何引物互补或基本上不与任何引物相同。在一些实施方式中，通用寡核苷酸尾部-衔接子的阻断链还可以包括3'未配对部分，该3'未配对部分在退火温度下不会与扩增链的5'未配对部分特异性退火；并且其中，阻断链的3'未配对部分在退火温度下不会与任何引物或其互补物特异性退火。
第一扩增步骤
如本文所用，术语“第一靶特异性引物”是指包括可以在合适的退火条件下与具有靶核酸的链特性的核酸模板特异性退火的核酸序列的单链寡核苷酸。
在一些实施方式中，引物(例如，靶特异性引物)可以包括5'标签序列部分。在一些实施方式中，反应中存在的多个引物(例如，所有第一靶特异性引物)可以包括相同的5'标签序列部分。在一些实施方式中，在多重PCR反应中，不同的引物种类可以以脱靶方式彼此相互作用，从而导致通过DNA聚合酶的引物延伸并随后扩增。在这样的实施方式中，这些引物二聚体往往是短的，并且它们的有效扩增可以超过反应并占优势，从而导致所需靶序列的扩增不良。因此，在一些实施方式中，在引物中(例如，在靶特异性引物上)包括5'标签序列可以导致在两端上含有相同互补尾的引物二聚体的形成。在一些实施方式中，在随后的扩增循环中，这样的引物二聚体将变性为单链DNA引物二聚体，每个单链DNA引物二聚体在其两端上包括由5'标签引入的互补序列。在一些实施方式中，代替与这些单链DNA引物二聚体退火的引物，可以发生分子内发夹(类似锅柄的结构)形成，这是由于相同引物二聚体分子上的互补标签的近似可接近性，而不是与不同分子上的新引物的相互作用。因此，在一些实施方式中，这些引物二聚体可以被低效扩增，使得引物不会被二聚体指数地消耗用于扩增；而是，经标记的引物可以保持高和足够的浓度，用于靶序列的所需特异性扩增。在一些实施方式中，在多重扩增的背景下可能不期望引物二聚体的积累，因为它们在反应中竞争并消耗其他试剂。
在一些实施方式中，5'标签序列可以是富含GC的序列。在一些实施方式中，5'标签序列可以包括至少50％的GC含量、至少55％的GC含量、至少60％的GC含量、至少65％的GC含量、至少70％的GC含量、至少75％的GC含量、至少80％的GC含量或者更高的GC含量。在一些实施方式中，标签序列可以包括至少60％的GC含量。在一些实施方式中，标签序列可以包括至少65％的GC含量。
如本文所用，术语“第一衔接子引物”是指包括与第一测序引物的5'部分相同的核酸序列的核酸分子。因为第一尾部衔接子引物因此与扩增链的序列的至少一部分相同(与互补相反)，因此它将不能与通用寡核苷酸尾部衔接子本身的任何部分特异性退火。
在第一扩增步骤的第一PCR扩增循环中，第一靶特异性引物可以与包括已知靶核苷酸序列的任何核酸的模板链特异性地退火。根据第一靶特异性引物被设计的方向，将已知靶核苷酸序列上游或下游的序列合成为与模板链互补的链。如果在PCR的延伸阶段期间，模板链的5'末端终止于连接的通用寡核苷酸尾部衔接子，则新合成的产物链的3'末端将包含与第一尾部衔接子引物互补的序列。在随后的PCR扩增循环中，第一靶特异性引物和第一尾部衔接子引物两者都将能够与靶核酸序列的适当链特异性退火，并且已知核苷酸靶序列与通用寡核苷酸尾部衔接子之间的序列可以被扩增(即复制)。
第二扩增步骤
如本文所用，术语“第二靶特异性引物”是指包括3'部分和5'部分的单链寡核苷酸，该3'部分包括能够与由从前面的扩增步骤得到的扩增子所包括的已知靶核苷酸序列的一部分特异性退火的核酸序列，5'部分包括与第二测序引物相同的核酸序列。第二靶特异性引物可以由与第二靶特异性引物的公共序列杂交的额外的引物(例如，具有3'测序衔接子/索引序列的引物)进一步接触。在一些实施方式中，额外的引物可以包括杂交序列的额外序列5'，其可以包括条形码、索引、衔接子序列或测序引物位点。在一些实施方式中，额外的引物是通用测序衔接子/索引引物。第二靶特异性引物相对于第一靶特异性引物嵌套。在一些实施方式中，第二靶特异性引物相对于第一靶特异性引物通过至少3个核苷酸来嵌套，通过例如3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个或者15个或更多个核苷酸来嵌套。
在一些实施方式中，反应中存在的所有第二靶特异性引物包括相同的5'部分。在一些实施方式中，第二靶特异性引物的5'部分可以用于抑制引物二聚体，如针对本文中上面描述的第一靶特异性引物的5'标签描述的。
在一些实施方式中，第一靶特异性引物和第二靶特异性引物与靶核酸的相同链基本上互补。在一些实施方式中，与已知靶序列特异性退火的第一靶特异性引物和第二靶特异性引物的部分可以包括已知靶核苷酸序列的总共至少20个独特碱基，例如20个或更多个独特碱基、25或更多个独特碱基、30个或更多个独特碱基、35个或更多个独特碱基、40个或更多个独特碱基或者50个或更多个独特碱基。在一些实施方式中，与已知靶序列特异性退火的第一靶特异性引物和第二靶特异性引物的部分可以包括已知靶核苷酸序列的总共至少30个独特碱基。
如本文所用，术语“第二衔接子引物”是指包括与第一测序引物的一部分相同的核酸序列的核酸分子，并且第二衔接子引物相对于第一衔接子引物嵌套。因为第二尾部衔接子引物因此与扩增链的序列的至少一部分相同(与互补相反)，因此它将不能与通用寡核苷酸尾部衔接子本身的任何部分特异性退火。在一些实施方式中，第二衔接子引物与第一测序引物相同。
第二衔接子引物应当相对于第一衔接子引物嵌套，即第一衔接子引物包括与扩增链相同的核酸序列，该扩增链不被第二衔接子引物包括并且被定位成比与第二衔接子引物所包括的扩增链相同的任何序列更靠近扩增引物的5'末端。在一些实施方式中，第二衔接子引物通过至少3个核苷酸嵌套，例如通过3个核苷酸、4个核苷酸、5个核苷酸、6个核苷酸、7个核苷酸、8个核苷酸、9个核苷酸、10个核苷酸或者更多个核苷酸嵌套。
在一些实施方式中，第一衔接子引物可以包括与通用寡核苷酸尾部衔接子的扩增链的约20个5'最多碱基(most base)相同的核酸序列，并且第二衔接子引物可以包括与通用寡核苷酸尾部衔接子的扩增链的约30个碱基相同的核酸序列，其中5'碱基是扩增链的5'终端的至少3个核苷酸3'。
在一些实施方式中，可以使用嵌套的引物集合。在一些实施方式中，嵌套的衔接子引物的使用消除了产生可扩增(例如，在桥式PCR或乳液PCR期间)但不能使用某些技术来有效测序的最终扩增子的可能性。在一些实施方式中，可以使用半嵌套的引物集合。
样品纯化步骤
在一些实施方式中，可以在方法的任何适当步骤之前和/或之后将酶、引物或缓冲剂组分与靶核酸和/或其扩增产物分离。可以使用用于分离核酸的任何合适的方法。在一些实施方式中，分离可以包括固相可逆固定(SPRI)净化。用于SPRI净化的方法是本领域已知的，例如Agencourt AMPure XP-PCR Purification(Cat No.A63880，Beckman Coulter；Brea，CA)。在一些实施方式中，酶可以通过热处理而失活。
在一些实施方式中，可以使用适当的方法(例如，纯化、消化等)从核酸制备物中除去未杂交的引物。在一些实施方式中，核酸酶(例如外切核酸酶I)用于从制备物中除去引物。在一些实施方式中，这样的核酸酶在引物消化之后被加热灭活。一旦核酸酶失活，则可以将另一引物集合与其他合适的组分(例如酶、缓冲剂)一起加入以进行进一步的扩增反应。
测序
在一些方面，本文中描述的技术涉及富集核酸样品以用于寡核苷酸测序的方法。在一些实施方式中，可以通过下一代测序方法进行测序。如本文所用，“下一代测序”是指这样的寡核苷酸测序技术，该寡核苷酸测序技术具有以高于利用常规测序方法(例如，Sanger测序)可能实现的速度的速度对寡核苷酸进行测序的能力，这是因为并行地进行和读出数千至数百万的测序反应。下一代测序方法/平台的非限制性示例包括：大规模并行签名测序(Lynx Therapeutics)；454焦磷酸测序(454Life Sciences/Roche Diagnostics)；固相可逆染料终止子测序(Solexa/Illumina)；SOLiD技术(Applied Biosystems)；离子半导体测序(ION Torrent)；DNA纳米球测序(Complete Genomics)；以及可以从PacificBiosciences，Intelligen Bio-systems和Oxford Nanopore Technologies获得的技术。在一些实施方式中，测序引物可以包括与所选择的下一代测序方法兼容的部分。下一代测序技术以及相关联的测序引物的限制和设计参数是本领域已知的(参见，例如，Shendure,etal.,“Next-generation DNAsequencing,”Nature,2008,vol.26,No.10,1135-1145；Mardis,“The impact of next-generation sequencing technology on genetics,”Trends in Genetics,2007,vol.24,No.3,pp.133-141；Su,et al.,“Next-generationsequencing and its applications in molecular diagnostics”Expert Rev MolDiagn,2011,11(3):333-43；Zhang et al.,“The impact of next-generationsequencing on genomics”,J Genet Genomics,2011,38(3):95-109；(Nyren,P.etal.Anal Biochem 208:17175(1993)；Bentley,D.R.Curr Opin Genet Dev 16:545-52(2006)；Strausberg,R.L.,et al.Drug Disc Today 13:569-77(2008)；美国专利第7,282,337号；美国专利第7,279,563号；美国专利第7,226,720号；美国专利第7,220,549号；美国专利第7,169,560号；美国专利第6,818,395号；美国专利第6,911,345号；美国专利公开第2006/0252077号、第2007/0070349号以及第20070070349号，其全部内容通过引用并入本文)。
在一些实施方式中，测序步骤依赖于第一测序引物和第二测序引物的使用。在一些实施方式中，选择第一测序引物和第二测序引物以与本文中描述的下一代测序方法兼容。
将测序读数与基因组序列和/或cDNA序列的已知序列数据库比对的方法是本领域已知的，并且针对该过程的软件在商业上可获得。在一些实施方式中，其整体不能映射至野生型序列数据库的读数(较少的测序引物和/或衔接子核苷酸序列)可以是基因组重排或大的插入缺失突变。在一些实施方式中，包括映射至基因组中的多个位置的序列的读数(较少的测序引物和/或衔接子核苷酸序列)可以是基因组重排。
AMP引物
在一些实施方式中，四种类型的引物(第一靶特异性引物和第二靶特异性引物以及第一衔接子引物和第二衔接子引物)被设计成使得：它们将在如下退火温度下与其互补序列特异性退火，退火温度是约61℃至72℃，例如，约61℃至69℃、约63℃至69℃、约63℃至67℃、约64℃至66℃。在一些实施方式中，四种类型的引物被设计成使得它们将在小于72℃的退火温度下与其互补序列特异性退火。在一些实施方式中，四种类型的引物被设计成使得它们将在小于70℃的退火温度下与其互补序列特异性退火。在一些实施方式中，四种类型的引物被设计成使得它们将在小于68℃的退火温度下与其互补序列特异性退火。在一些实施方式中，四种类型的引物被设计成使得它们将在约65℃的退火温度下与其互补序列特异性地退火。在一些实施方式中，本文中提供的系统被配置成改变容器温度(例如，通过在不同温度范围之间循环)以促进引物退火。
在一些实施方式中，与已知靶核苷酸序列特异性退火的靶特异性引物的部分将在如下温度下特异性退火，退火温度是约61℃至72℃，例如，约61℃至69℃、约63℃至69℃、约63℃至67℃、约64℃至66℃。在一些实施方式中，与已知靶核苷酸序列特异性退火的靶特异性引物的部分将在PCR缓冲剂中在约65℃的温度下特异性退火。
在一些实施方式中，本文中描述的引物和/或衔接子不能包括经修饰的碱基(例如，引物和/或衔接子不能包括阻断3'胺)。
核酸延伸、扩增和PCR
在一些实施方式中，本文中描述的方法包括延伸方案或步骤。在这样的实施方式中，可以使用与引物杂交的核酸分子作为模板从一个或更多个杂交的加尾随机引物进行延伸。本文中描述了延伸步骤。在一些实施方式中，一个或更多个加尾随机引物可以与样品中的基本上所有的核酸杂交，其中许多核酸可能不包括已知的靶核苷酸序列。因此，在一些实施方式中，随机引物的延伸可能由于与不包括已知靶核苷酸序列的模板杂交而发生。
在一些实施方式中，本文中描述的方法可以涉及聚合酶链式反应(PCR)扩增方案，从而涉及一个或更多个扩增循环。本文中描述的方法的扩增步骤可以各自包括PCR扩增方案，即聚合酶链式反应(PCR)扩增循环集合。在一些实施方式中，本文中提供的系统被配置成改变容器温度(例如，通过在不同温度范围之间循环)以促进不同的PCR步骤，例如解链、退火、延长等。
在一些实施方式中，本文中提供的系统被配置成以自动化方式实现扩增方案。如本文所用，术语“扩增方案”是指特异性扩增(增加其丰度)感兴趣的核酸的过程。在一些实施方式中，当先前聚合酶延伸的产物作为用于相继轮次延伸的模板时，发生指数扩增。在一些实施方式中，根据本文中公开的方法的PCR扩增方案可以包括至少一个迭代循环，并且在一些情况下至少5个或更多个迭代循环。在一些实施方式中，每个迭代循环包括以下步骤：1)链分离(例如，热变性)；2)寡核苷酸引物与模板分子退火；以及3)退火引物的核酸聚合酶延伸。应当理解的是，可以使用这些步骤中的每一个中涉及的任何合适的条件和时间。在一些实施方式中，选择的条件和时间可以取决于长度、序列含量、解链温度、二级结构特征或者与反应中使用的核酸模板和/或引物有关的其他因素。在一些实施方式中，根据本文中描述的方法的扩增方案在热循环仪中进行，许多的热循环仪是商业上可获得的。
在一些实施方式中，核酸延伸反应涉及核酸聚合酶的使用。如本文所用，短语“核酸聚合酶”是指催化核苷三磷酸的模板相关的聚合以形成与模板核酸序列互补的引物延伸产物的酶。核酸聚合酶在退火引物的3'末端处发起合成，并沿朝向模板的5'末端的方向继续进行。许多核酸聚合酶是本领域已知的并且是商业上可获得的。一组核酸聚合酶是热稳定的，即它们在经受足以使互补核酸的退火链变性的温度——例如94℃或有时更高——之后保持功能。用于扩增的协议的非限制性示例涉及在以下条件下使用聚合酶(例如，Phoenix Taq、VeraSeq)：98℃持续30秒，然后是包括在98℃下解链10秒的14至22个循环，然后是在68℃下退火30秒，然后是在72℃下延伸3分钟，然后是在4℃下保持反应。然而，也可以使用其他合适的反应条件。在一些实施方式中，可以调节退火/延伸温度以考虑盐浓度的差异(例如，高出3℃对应于更高的盐浓度)。在一些实施方式中，减慢例如从98℃至65℃的斜坡速率(例如，1℃/s、0.5℃/s、0.28℃/s、0.1℃/s或更慢)提高了高度复合样品中的引物性能和覆盖均匀性。在一些实施方式中，本文中提供的系统被配置成改变容器温度(例如，通过在不同温度范围之间循环，具有受控的斜升速率或斜降速率)以促进扩增。
在一些实施方式中，在酶执行模板相关的延伸的条件下使用核酸聚合酶。在一些实施方式中，核酸聚合酶是DNA聚合酶I、Taq聚合酶、Phoenix Taq聚合酶、Phusion聚合酶、T4聚合酶、T7聚合酶、Klenow片段、Klenow exo-、phi29聚合酶、AMV逆转录酶、M-MuLV逆转录酶、HIV-1逆转录酶、VeraSeq ULtra聚合酶、VeraSeq HF 2.0聚合酶、EnzScript或其他合适的聚合酶。在一些实施方式中，核酸聚合酶不是逆转录酶。在一些实施方式中，核酸聚合酶作用于DNA模板。在一些实施方式中，核酸聚合酶作用于RNA模板。在一些实施方式中，延伸反应涉及对RNA进行的以产生互补DNA分子的逆转录(RNA相关的DNA聚合酶活性)。在一些实施方式中，逆转录酶是小鼠莫洛尼鼠白血病病毒(M-MLV)聚合酶、AMV逆转录酶、RSV逆转录酶、HIV-1逆转录酶、HIV-2逆转录酶或另外合适的逆转录酶。
在一些实施方式中，核酸扩增反应涉及包括链分离步骤的循环，链分离步骤通常涉及加热反应混合物。如本文所用，术语“链分离”或“对链进行分离”意指处理核酸样品，使得互补的双链分子分离成可用于与寡核苷酸引物退火的两条单链。在一些实施方式中，根据本文中描述的方法的链分离通过将核酸样品加热至其解链温度(Tm)以上来实现。在一些实施方式中，对于在适合于核酸聚合酶的反应制备物中包含核酸分子的样品，加热至94℃足以实现链分离。在一些实施方式中，合适的反应制备物包含一种或更多种盐(例如，1mM至100mM KCl、0.1mM至10mM MgCl2)、至少一种缓冲剂(例如，1mM至20mM Tris-HCl)以及载体(例如，0.01％至0.5％BSA)。合适缓冲剂的非限制性示例包括50mM KCl、10mM Tris-HCl(25℃下pH 8.8)，0.5mM至3mM MgCl2和0.1％BSA。
在一些实施方式中，核酸扩增涉及将引物与具有靶核酸的链特性的核酸模板退火。在一些实施方式中，靶核酸的链可以用作模板核酸。
如本文所用，术语“退火”是指在两个核酸之间形成一个或更多个互补碱基对。在一些实施方式中，退火涉及杂交在一起的两条互补或基本上互补的核酸链。在一些实施方式中，在延伸反应的背景下，退火涉及引物与模板的杂交，使得形成用于模板相关的聚合酶的引物延伸底物。在一些实施方式中，退火的条件(例如，在引物与核酸模板之间)可以基于引物的长度和序列而变化。在一些实施方式中，退火的条件基于引物的Tm(例如，计算的Tm)。在一些实施方式中，延伸方案的退火步骤涉及将链分离步骤后的温度降低至基于引物的Tm(例如，计算的Tm)的温度，达足以允许这样的退火的时间。在一些实施方式中，可以使用许多算法中的任何一种来确定Tm(例如，OLIGOTM(Molecular Biology InsightsInc.Colorado)引物设计软件和VENTRO NTITM(Invitrogen，Inc.California)引物设计软件和互联网上可获得的程序，包括Primer3、Oligo Calculator和NetPrimer(PremierBiosoft；Palo Alto，CA；以及在万维网上免费可获得的(例如，在premierbiosoft.com/netprimer/netprlaunch/Help/xnetprlaunch.html))。在一些实施方式中，可以使用下面的公式来计算引物的Tm，该公式由NetPrimer软件使用并且在Frieir,et al.PNAS 198683:9373-9377中更详细地描述，该文献的全部内容通过引用并入本文。
Tm＝ΔH/(ΔS+R*ln(C/4))+16.6log([K+]/(1+0.7[K+]))-273.15
其中：ΔH是螺旋形成的焓；ΔS是螺旋形成的熵；R是摩尔气体常数(1.987cal/℃*mol)；C是核酸浓度；以及[K+]是盐浓度。对于大多数扩增方案，退火温度选择为比预测的Tm低约5℃，尽管可以使用接近并高于Tm的温度(例如，比预测的Tm低1℃至5℃或比预测的Tm高1℃至5℃)，可以例如，使用比预测的Tm低5℃以上的温度(例如，比预测的Tm低6℃、低8℃、低10℃或更低)。在一些实施方式中，退火温度越接近Tm，退火越特异。在一些实施方式中，用于在延伸反应期间(例如，在PCR扩增方案的背景内)进行引物退火的时间至少部分地基于反应的体积来确定(例如，其中较大的体积涉及较长时间)。在一些实施方式中，用于在延伸反应期间(例如，在PCR扩增方案的背景内)进行引物退火的时间至少部分地基于引物浓度和模板浓度来确定(例如，其中引物与模板的较高相对浓度与较低相对浓度相比涉及更少的时间)。在一些实施方式中，取决于体积和相对引物/模板浓度，延伸反应中(例如，在扩增方案的背景内)的引物退火步骤可以在1秒至5分钟、10秒至2分钟或30秒至2分钟的范围内。如本文所用，“基本上退火”是指在两个核酸之间形成互补碱基对的程度，该程度在PCR扩增方案的背景下使用时，足以产生可检测水平的特异性扩增产物。
如本文所用，术语“聚合酶延伸”是指通过核酸聚合酶将至少一个互补核苷酸模板相关地添加至与核酸模板退火的引物的3'末端。在一些实施方式中，聚合酶延伸添加多于一个核苷酸，例如，多达并包括对应于模板全长的核苷酸。在一些实施方式中，聚合酶延伸的条件至少部分基于所用的聚合酶的特性。在一些实施方式中，用于聚合酶延伸的温度基于酶的已知活性性质。在一些实施方式中，在退火温度低于酶的最佳温度的情况下，使用较低的延伸温度可能是可接受的。在一些实施方式中，酶在低于其最佳延伸温度时可以保持至少部分活性。在一些实施方式中，聚合酶延伸(例如，用热稳定聚合酶例如Taq聚合酶及其变体进行的)在65℃至75℃或68℃至72℃下进行。在一些实施方式中，本文中提供的方法涉及在PCR扩增方案的每个循环中与核酸模板退火的引物的聚合酶延伸。在一些实施方式中，使用具有相对强的链置换活性的聚合酶进行聚合酶延伸。在一些实施方式中，具有强的链置换的聚合酶可以用于制备核酸，以用于检测融合(例如，5'融合)的目的。
在一些实施方式中，在允许退火的寡核苷酸引物延伸的条件下进行引物延伸。如本文所用，术语“允许退火的寡核苷酸的延伸使得生成延伸产物的条件”是指核酸聚合酶催化引物延伸的条件集合(例如，温度、盐浓度和辅因子浓度、pH和酶浓度)。在一些实施方式中，这样的条件至少部分基于所用的核酸聚合酶。在一些实施方式中，聚合酶可以在合适的反应制备物中进行引物延伸反应。在一些实施方式中，合适的反应制备物包含一种或更多种盐(例如，1mM至100mM KCl、0.1mM至10mM MgCl2)、至少一种缓冲剂(例如，1mM至20mMTris-HCl)、载体(例如，0.01％至0.5％BSA)以及一种或更多种NTP(例如，dATP、dTTP、dCTP和dGTP各自10μM至200μM)。非限制性条件集合是50mM KCl、10mM Tris-HCl(25℃下pH8.8)、0.5mM至3mM MgCl2、200μM每种dNTP和72℃的0.1％BSA，在这样的条件集合下聚合酶(例如，Taq聚合酶)催化引物延伸。在一些实施方式中，起始和延伸的条件可以包括在合适的缓冲剂中存在一种、两种、三种或四种不同的脱氧核糖核苷三磷酸(例如，选自dATP、dTTP、dCTP和dGTP)和聚合诱导剂，例如DNA聚合酶或逆转录酶。在一些实施方式中，“缓冲剂”可以包括溶剂(例如含水溶剂)加上影响pH、离子强度等的合适的辅因子和试剂。
在一些实施方式中，本文中提供的系统被配置成以自动化方式实现多个核酸扩增循环。在一些实施方式中，核酸扩增涉及多达5个、多达10个、多达20个、多达30个、多达40个或更多个扩增轮次(循环)。在一些实施方式中，核酸扩增可以包括PCR扩增方案的长度为5个循环至20个循环的循环集合。在一些实施方式中，扩增步骤可以包括PCR扩增方案的长度为10个循环至20个循环的循环集合。在一些实施方式中，每个扩增步骤可以包括PCR扩增方案的长度为12个循环至16个循环的循环集合。在一些实施方式中，退火温度可以小于70℃。在一些实施方式中，退火温度可以小于72℃。在一些实施方式中，退火温度可以为约65℃。在一些实施方式中，退火温度可以为约61℃至约72℃。
在各种实施方式中，本文中描述的方法和组合物与利用本文中描述的一种或更多种类型的引物进行PCR扩增方案有关。如本文所用，“引物”是指能够与核酸模板特异性地退火并提供用作用于模板相关的聚合酶的底物的3'末端以产生与模板互补的延伸产物的寡核苷酸。在一些实施方式中，引物是单链的，使得引物及其互补物可以退火以形成双链。根据本文中描述的方法和组合物的引物可以包括长度小于或等于300个核苷酸的杂交序列(例如，与核酸模板退火的序列)，长度例如小于或等于300个、或250个、或200个、或150个、或100个、或90个、或80个、或70个、或60个、或50个、或40个、或30个或更少个、或20个或更少个、或15个或更少个核苷酸，但至少为6个核苷酸。在一些实施方式中，引物的杂交序列可以长度为6至50个核苷酸、长度为6至35个核苷酸、长度为6至20个核苷酸、长度为10至25个核苷酸。
任何合适的方法可以用于合成寡核苷酸和引物。在一些实施方式中，商业来源提供适合于提供用于本文中描述的方法和组合物的引物的寡核苷酸合成服务(例如，INVITROGENTM Custom DNA Oligos(Life Technologies，Grand Island，NY)或来自Integrated DNA Technologies的custom DNA Oligos(Coralville，IA))。
DNA剪切/断裂
本文中使用的核酸(例如，在测序之前)可以被剪切，例如机械地或酶促地剪切，以产生任何所需大小的片段。机械剪切过程的非限制性示例包括超声处理、雾化和可从Covaris(Woburn，MA)获得的AFATM剪切技术。在一些实施方式中，可以通过超声处理机械地剪切核酸。在一些实施方式中，这里提供的系统可以具有一个或更多个容器，例如，在安装在盒内的匣盒内的容器，其中核酸被例如机械地或酶促地剪切。
在一些实施方式中，靶核酸不被剪切或消化。在一些实施方式中，制备步骤的核酸产物(例如延伸产物、扩增产物)不被剪切或酶促地消化。
在一些实施方式中，当靶核酸是RNA时，样品可以经历逆转录酶方案以生成DNA模板，并且然后可以剪切DNA模板。在一些实施方式中，可以在进行逆转录酶方案之前剪切靶RNA。在一些实施方式中，可以使用从新鲜或降解的试样中提取的所有核酸将包括靶RNA的样品用于本文中描述的方法中；不需要针对cDNA测序的基因组DNA去除；不需要针对cDNA测序的核糖体RNA耗尽；在任何步骤中都不需要机械剪切或酶促剪切；通过使用随机六聚体对RNA进行双链cDNA合成。
靶核酸
如本文所用，术语“靶核酸”是指感兴趣的核酸分子(例如，待分析的核酸)。在一些实施方式中，靶核酸包括靶核苷酸序列(例如，已知或预定的核苷酸序列)和要确定的相邻核苷酸序列(其可以称为未知序列)。靶核酸可以具有任何合适的长度。在一些实施方式中，靶核酸是双链的。在一些实施方式中，靶核酸是DNA。在一些实施方式中，靶核酸是基因组或染色体DNA(gDNA)。在一些实施方式中，靶核酸可以是互补DNA(cDNA)。在一些实施方式中，靶核酸是单链的。在一些实施方式中，靶核酸可以是RNA(例如，mRNA、rRNA、tRNA、长的非编码RNA、微RNA)。
在一些实施方式中，靶核酸可以被基因组DNA包括。在一些实施方式中，靶核酸可以被核糖核酸(RNA)例如mRNA包括。在一些实施方式中，靶核酸可以被cDNA包括。适用于本文中描述的方法的许多测序方法提供了具有数十至数百个核苷酸碱基的最佳读取长度的测序运行(例如，Ion Torrent技术可以产生200bp至400bp的读取长度)。例如基因组DNA或mRNA中包括的靶核酸可以被基本上长于该最佳读取长度的核酸分子包括。为了使得由第二扩增步骤产生的扩增的核酸部分具有用于特定测序技术的适合长度，已知靶核苷酸序列与通用寡核苷酸尾部衔接子可以连接的靶核酸的末端之间的平均距离应该尽可能接近所选技术的最佳读取长度。例如，如果给定测序技术的最佳读取长度是200bp，则根据本文中描述的方法扩增的核酸分子应具有约400bp或更短的平均长度。例如基因组DNA或mRNA包括的靶核酸可以被剪切，例如机械地或酶促地剪切，以产生任何所需大小的片段。机械剪切过程的非限制性示例包括超声处理、雾化和可从Covaris(Woburn，MA)获得的AFATM剪切技术。在一些实施方式中，可以通过超声处理来机械地剪切由基因组DNA包括的靶核酸。
在一些实施方式中，当靶核酸被RNA包括时，可以对样品进行逆转录酶方案以产生DNA模板，并且然后可以剪切DNA模板。在一些实施方式中，可以在进行逆转录酶方案之前剪切靶RNA。在一些实施方式中，可以使用从新鲜或降解的试样中提取的全部核酸将包括靶RNA的样品用于本文中描述的方法中；不需要针对cDNA测序的基因组DNA去除；不需要针对cDNA测序的核糖体RNA耗尽；在任何步骤中都不需要机械剪切或酶促剪切；通过使用随机六聚体对RNA进行双链cDNA合成；以及通过使核酸经历末端修复、磷酸化和腺苷酸化。
在一些实施方式中，已知的靶核苷酸序列可以被基因重排包括。本文中描述的方法适用于确定基因重排的存在和/或特性，因为基因重排的仅一半的特性必须先前已知(即，基因重排的一半由基因特异性引物靶向)。在一些实施方式中，基因重排可以包括致癌基因。在一些实施方式中，基因重排可以包括融合致癌基因。
如本文所用，术语“已知靶核苷酸序列”是指序列(例如，核酸的核苷酸碱基的特性和顺序)已知的靶核酸的一部分。例如，在一些实施方式中，已知的靶核苷酸序列是已知的核酸的核苷酸序列或者是在核酸的相邻未知序列的询问之前已经确定的核酸的核苷酸序列。已知的靶核苷酸序列可以具有任何合适的长度。
在一些实施方式中，靶核苷酸序列(例如，已知靶核苷酸序列)具有10个或更多个核苷酸、30个或更多个核苷酸、40个或更多个核苷酸、50个或更多个核苷酸、100个或更多个核苷酸、200个或更多个核苷酸、300个或更多个核苷酸、400个或更多个核苷酸、500个或更多个核苷酸的长度。在一些实施方式中，靶核苷酸序列(例如，已知的靶核苷酸序列)具有10至100个核苷酸、10至500个核苷酸、10至1000个核苷酸、100至500个核苷酸、100至1000个核苷酸、500至1000个核苷酸、500至5000个核苷酸的范围内的长度。
在一些实施方式中，本文提供了用于确定核酸的邻接(或相邻)部分的序列的方法。如本文所用，术语“与……邻接的核苷酸序列”是指在另一核苷酸序列(例如，已知核苷酸序列)的紧上游或紧下游的核酸分子(例如，靶核酸)的核苷酸序列。在一些实施方式中，与已知靶核苷酸序列邻接的核苷酸序列可以具有任何合适的长度。在一些实施方式中，与已知靶核苷酸序列邻接的核苷酸序列包括1kb或更少的核苷酸序列，例如1kb或更少的核苷酸序列、750bp或更少的核苷酸序列、500bp或更少的核苷酸序列、400bp或更少的核苷酸序列、300bp或更少的核苷酸序列、200bp或更少的核苷酸序列、100bp或更少的核苷酸序列。在一些实施方式中，在样品包括含有已知靶核苷酸序列的不同靶核酸(例如，其中已知靶核苷酸序列在其基因组中或在分开的、不同的染色体上多次出现的细胞)的情况下，可以存在包括“与已知靶核苷酸序列邻接的核苷酸序列”的多个序列。如本文所用，术语“确定核苷酸序列”是指确定核酸的核苷酸碱基的特性和相对位置。
在一些实施方式中，已知的靶核酸可以包括从基因重排产生的融合序列。在一些实施方式中，本文中描述的方法适合于确定基因重排的存在和/或特性。在一些实施方式中，基因重排的一部分的特性是先前已知的(例如，基因重排的要由基因特异性引物靶向的部分)，并且其他部分的序列可以使用本文中公开的方法确定。在一些实施方式中，基因重排可以涉及致癌基因。在一些实施方式中，基因重排可以包括融合致癌基因。
样品
在一些实施方式中，靶核酸存在于合适的样品中或从合适的样品中获得(例如，食物样品、环境样品、生物样品例如血液样品等)。在一些实施方式中，靶核酸是从受试者获得的生物样品。在一些实施方式中，样品可以是从受试者获得的诊断样品。在一些实施方式中，样品还可以包括蛋白质、细胞、流体、生物流体、防腐剂和/或其他物质。作为非限制性示例，样品可以是脸颊拭子、血液、血清、血浆、痰、脑脊髓液、尿液、泪液、肺泡分离物、胸膜液、心包液、囊液、肿瘤组织、组织、活组织检查、唾液、吸出物或其组合。在一些实施方式中，可以通过切除或活组织检查获得样品。
在一些实施方式中，样品可以从需要针对与遗传改变相关联的疾病例如癌症或遗传性疾病进行治疗的受试者获得。在一些实施方式中，已知的靶序列存在于疾病相关联的基因中。
在一些实施方式中，样品是从需要针对癌症进行治疗的受试者获得。在一些实施方式中，样品包括肿瘤细胞群，例如至少一个肿瘤细胞。在一些实施方式中，样品包括肿瘤活组织检查，包括但不限于未处理的活组织检查组织或经处理的活组织检查组织(例如，福尔马林固定的和/或石蜡包埋的活组织检查组织)。
在一些实施方式中，样品是被新鲜收集的。在一些实施方式中，样品在被用于本文中描述的方法和组合物之前被存储。在一些实施方式中，样品是未处理的样品。如本文所用，“未处理的样品”是指除了在溶液中稀释和/或悬浮之外没有任何先前样品预处理的生物样品。在一些实施方式中，样品从受试者获得并在用于本文中描述的方法和组合物之前被保存或处理。作为非限制性示例，样品可以被包埋在固体石蜡中、冷藏或冷冻。在根据本文中描述的方法和组合物确定核酸的存在之前，可以解冻冷冻的样品。在一些实施方式中，样品可以是经加工或处理的样品。用于处理或加工样品的示例性方法包括但不限于离心、过滤、超声处理、匀化、加热、冷冻和解冻、与防腐剂(例如，抗凝剂或核酸酶抑制剂)接触及其任何组合。在一些实施方式中，可以用化学试剂和/或生物试剂处理样品。化学试剂和/或生物试剂可以被采用以在处理和/或存储期间保护和/或维持样品或样品中包括的核酸的稳定性。另外，或可替选地，化学试剂和/或生物试剂可以被采用以从样品的其他组分中释放核酸。作为非限制性示例，血液样品可以在被用于本文中描述的的方法和组合物之前用抗凝剂来处理。用于样品的加工、保存或处理以进行核酸分析的合适方法和过程可以用于本文中公开的方法中。在一些实施方式中，样品可以是澄清的流体样品。在一些实施方式中，可以通过低速离心(例如，3,000x g或更低)并收集包含澄清的流体样品的上清液来对样品进行澄清。
在一些实施方式中，样品中存在的核酸可以在被用于本文中描述的方法和组合物之前被分离、富集或纯化。可以使用从样品中分离、富集或纯化核酸的合适方法。例如，用于从各种样品类型中分离基因组DNA的试剂盒(kit)是商业上可获得的(例如，目录第51104号、第51304号、第56504号和第56404号；Qiagen；Germantown，MD)。在一些实施方式中，本文中描述的方法涉及针对靶核酸的富集——例如在对靶核酸的测序之前——的方法。在一些实施方式中，在测序之前不知道待富集的靶核酸的一个末端的序列。在一些实施方式中，本文中描述的方法涉及在使用下一代测序技术确定核苷酸序列之前富集特定核苷酸序列的方法。在一些实施方式中，富集特定核苷酸序列的方法不包括杂交富集。
靶基因(ALK、ROS1、RET)和治疗应用
在本文中描述的方法的一些实施方式中，确定与已知寡核苷酸靶序列邻接的序列可以提供与疾病治疗相关的信息。因此，在一些实施方式中，本文中公开的方法可以用来帮助治疗疾病。在一些实施方式中，样品可以来自需要治疗与基因改变相关联的疾病的受试者。在一些实施方式中，已知靶序列是疾病相关联的基因例如致癌基因的序列。在一些实施方式中，与已知寡核苷酸靶序列和/或所述已知寡核苷酸靶序列邻接的序列可以包括与疾病相关联的突变或基因异常，例如SNP、插入、缺失和/或基因重排。在一些实施方式中，与已知靶序列和/或样品中存在的已知靶序列邻接的序列包括基因重排产物的序列。在一些实施方式中，基因重排可以是致癌基因，例如融合致癌基因。
某些癌症治疗对于包括某些致癌基因的肿瘤特别有效，例如，靶向给定融合致癌基因的活动或表达的治疗剂可以有效对抗包括该融合致癌基因的肿瘤，但不会对抗缺乏融合致癌基因的肿瘤。本文中描述的方法可以促进对揭示致癌基因状态(例如，突变、SNP和/或重排)的特定序列的确定。在一些实施方式中，本文中描述的方法还可以使得能够在侧翼区域的序列已知时确定特定序列，例如，本文中描述的方法可以确定涉及已知基因(例如致癌基因)的基因重排的存在和特性，其中，在执行本文描述的方法之前，不知道精确位置和/或重排配偶体。
在一些实施方式中，受试者需要针对肺癌进行治疗。在一些实施方式中，例如，当样品是从需要针对肺癌进行治疗的受试者获得的时，已知的靶序列可以包括来自选自ALK、ROS1和RET的组的基因的序列。因此，在一些实施方式中，基因重排导致涉及ALK、ROS1或RET的融合。涉及ALK、ROS1或RET的基因重排的非限制性示例在以下文献中进行了描述：例如Soda et al.Nature 2007 448561-6；Rikova et al.Cell 2007 131：1190-1203；Kohno etal.Nature Medicine 2012 18：375-7；Takouchi et al.Nature Medicine 2012 18：378-81；其全部内容通过引用并入本文。然而，应当理解的是，基因重排的精确位置和重排中涉及的第二基因的特性可能不是提前已知的。因此，在本文中描述的方法中，可以检测这样的重排的存在和特性，而不必知道重排的位置或基因重排中涉及的第二基因的特性。
在一些实施方式中，已知的靶序列可以包括来自选自ALK、ROS1和RET的组的基因的序列。
在一些实施方式中，从受试者的肿瘤获得的样品中的ALK的基因重排的存在可以指示肿瘤易于利用选自由以下治疗组成的组的治疗进行治疗：ALK抑制剂；克唑替尼(PF-02341066)；AP26113；LDK378；3-39；AF802；IPI-504；ASP3026；AP-26113；X-396；GSK-1838705A；CH5424802；ALK激酶活性的二氨基和氨基嘧啶抑制剂例如NVP-TAE684和PF-02341066(参见，例如，Galkin et al.，Proc Natl Acad Sci USA，2007,104：270-275；Zouet al.，Cancer Res，2007，67：4408-4417；Hallberg和Palmer F1000 Med Reports 20113：21；Sakamoto et al.，Cancer Cell 2011 19：679-690；以及WO 04/079326中公开的分子)。所有前述参考文献的全部内容都通过引用并入本文。ALK抑制剂可以包括减少ALK或其一部分的表达和/或激酶活性的任何试剂，包括例如减少ALK或其一部分的表达和/或活性的寡核苷酸、小分子和/或肽。如本文所用，“间变性淋巴瘤激酶”或“ALK”是指野生型形式的神经元调节通常涉及的跨膜tyROS1ine激酶。ALK基因和mRNA的核苷酸序列对于许多物种包括人类而言是已知的(例如，在NCBI基因ID：238下注释)。
在一些实施方式中，从受试者中的肿瘤获得的样品中的ROS1的基因重排的存在可以指示肿瘤易于利用选自由以下治疗组成的组的治疗进行治疗：如本文中上面描述的ROS1抑制剂和ALK抑制剂(例如，克唑替尼)。ROS1抑制剂可以包括减少ROS1或其一部分的表达和/或激酶活性的任何试剂，包括例如减少ROS1或其一部分的表达和/或活性的寡核苷酸、小分子和/或肽。如本文所用，“c-ros致癌基因1”或“ROS1”(在本领域中也称为ros-1)是指与PTPN6相互作用的无七(sevenless)亚家族的跨膜酪氨酸激酶。ROS1基因和mRNA的核苷酸序列对于许多物种包括人类而言是已知的(例如，在NCBI基因ID：6098下注释)。
在一些实施方式中，从受试者中的肿瘤获得的样品中的RET的基因重排的存在可以指示肿瘤易于利用选自由以下治疗组成的组的治疗进行治疗：RET抑制剂；DP-2490，DP-3636，SU5416；BAY43-9006，BAY73-4506(瑞格拉菲尼)，ZD6474，NVP-AST487，索拉非尼，RPI-1，XL184，凡德他尼，舒尼替尼，伊马替尼，帕唑帕尼，阿西替尼，莫特塞尼，吉非替尼和维沙菲宁A(参见例如Samadi et al.，Surgery 2010 148：1228-36；Cuccuru et al.，JNCI 200413：1006-1014；Akeno-Stuart et al.，Cancer Research 2007 67：6956；Grazma et al.，JClin Oncol 2010 28：15s 5559；Mologni et al.，J Mol Endocrinol 2006 37：199-212；Calmomagno et al.，Journal NCI 2006 98：326-334；Mologni，Curr Med Chem 2011 18：162-175；和WO 06/034833中公开的化合物；美国专利公开2011/0201598和美国专利8,067,434)。所有前述参考文献的全部内容都通过引用并入本文。RET抑制剂可以包括减少RET或其一部分的表达和/或激酶活性的任何试剂，包括例如减少RET或其一部分的表达和/或活性的寡核苷酸、小分子和/或肽。如本文所用，“在转染期间重排”或“RET”是指神经嵴发育中涉及的钙粘蛋白超家族的受体酪氨酸激酶并且识别胶质细胞系衍生的神经营养因子家族信号分子。RET基因和mRNA的核苷酸序列对于许多物种包括人类而言是已知的(例如，在NCBI基因ID：5979下注释)。
本文中描述的方法的应用的其他非限制性示例包括：检测血液恶性肿瘤标志物及其组(例如，包括检测淋巴瘤和白血病中的基因组重排的那些应用)，检测肉瘤相关的基因组重排及其组；以及检测用于淋巴瘤测试的IGH/TCR基因重排及其组。
在一些实施方式中，本文中描述的方法涉及利用针对癌症的治疗来治疗患有或被诊断为患有例如癌症的受试者。患有癌症的受试者可以由医生使用当前诊断癌症的方法来识别。例如，表征这些病症并有助于诊断的肺癌的症状和/或并发症是本领域公知的，并且包括但不限于呼吸弱、锁骨上方淋巴结肿大、肺部异常声音、当胸部被敲击时浊音和胸部疼痛。可以帮助诊断例如肺癌的测试包括但不限于：X射线、针对高水平的某些物质(例如钙)的血液测试、CT扫描和肿瘤活组织检查。肺癌的家族史或暴露于肺癌的风险因素(例如，吸烟或暴露于烟雾和/或空气污染)也可以帮助确定受试者是否可能患有肺癌或帮助进行对肺癌的诊断。
癌症可以包括但不限于癌，包括腺癌、淋巴瘤、胚细胞瘤、黑色素瘤、肉瘤、白血病、鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、胃肠癌、霍奇金和非霍奇金淋巴瘤、胰腺癌、胶质母细胞瘤、基底细胞癌、胆道癌、膀胱癌、包括胶质母细胞瘤和成神经管细胞瘤的脑癌；乳腺癌、宫颈癌、绒毛膜癌；结肠癌、结直肠癌、子宫内膜癌、子宫内膜癌症；食道癌、胃癌；各种类型的头颈部癌症、包括Bowen病和Paget病的上皮内肿瘤；包括急性淋巴细胞和骨髓性白血病的血液肿瘤；卡波西氏肉瘤、毛细胞白血病；慢性粒细胞白血病、艾滋病相关联的白血病和成人T细胞白血病淋巴瘤；肾癌例如肾细胞癌、T细胞急性淋巴细胞白血病/淋巴瘤、包括霍奇金病和淋巴细胞淋巴瘤的淋巴瘤；肝部癌症例如肝癌和肝细胞瘤、Merkel细胞癌、黑色素瘤、多发性骨髓瘤；神经母细胞瘤；包括鳞状细胞癌的口腔癌；卵巢癌，包括由上皮细胞引起的卵巢癌；肉瘤包括平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、脂肪肉瘤、fibROS1肉瘤和骨肉瘤；胰腺癌；包括黑色素瘤、基质细胞、生殖细胞和间充质细胞的皮肤癌；pROS1tate癌症、直肠癌；外阴癌、包括腺癌的肾癌；包括生殖器肿瘤的睾丸癌，例如精原细胞瘤、非精原细胞瘤(畸胎瘤、绒毛膜癌)、间质瘤和生殖细胞肿瘤；包括甲状腺腺癌和髓样癌的甲状腺癌；食道癌、唾液腺癌和肾母细胞瘤。在一些实施方式中，癌症可以是肺癌。
多重方法
本文中描述的方法可以以多重格式采用。在本文中描述的方法的实施方式中，多重应用可以包括：确定与一个或更多个已知靶核苷酸序列邻接的核苷酸序列。如本文所用，“多重扩增”是指涉及在一个或更多个反应容器中同时扩增多于一种的靶核酸的过程。在一些实施方式中，方法涉及后续使用一个或更多个引物集合来确定多重扩增产物的序列。多重可以指在单个反应中的约2个至1,000个不同的靶序列之间的检测。如本文所用，多重是指在单个反应中的2个至1,000个例如5个至500个、25个至1,000个或10个至100个不同靶序列等的任何范围的检测。应用于PCR的术语“多重”意味着在同一PCR反应中存在针对至少两种不同靶序列的引物。
在一些实施方式中，可以用多个引物(例如，多个第一靶特异性引物和第二靶特异性引物)扩增样品中的靶核酸或样品的不同部分。在一些实施方式中，多个引物(例如，多个第一靶特异性引物和第二靶特异性引物)可以存在于单个反应混合物中，例如，可以在相同的反应混合物中产生多种扩增产物。在一些实施方式中，多个引物(例如，第一靶特异性引物和第二靶特异性引物的多个集合)可以与由不同基因包括的已知靶序列特异性退火。在一些实施方式中，至少两个引物集合(例如，第一靶特异性引物和第二靶特异性引物的至少两个集合)可以与已知靶序列的不同部分特异性退火。在一些实施方式中，至少两个引物集合(例如，第一靶特异性引物和第二靶特异性引物的至少两个集合)可以与由单个基因包括的已知靶序列的不同部分特异性地退火。在一些实施方式中，至少两个引物集合(例如，第一靶特异性引物和第二靶特异性引物的至少两个集合)可以与包括已知靶序列的基因的不同外显子特异性退火。在一些实施方式中，多个引物(例如，第一靶特异性引物)可以包括相同的5'标签序列部分。
在本文中描述的方法的实施方式中，多重应用可以包括：在一个测序反应或测序运行中确定与多个样品中的一个或更多个已知靶核苷酸序列邻接的核苷酸序列。在一些实施方式中，多个样品可以具有不同的来源，例如来自不同组织和/或不同受试者。在这样的实施方式中，引物(例如，加尾随机引物)还可以包括条形码部分。在一些实施方式中，具有独特条形码部分的引物(例如，加尾随机引物)可以被添加至每个样品并连接至其中的核酸；随后可以集中样品。在这样的实施方式中，扩增产物的每个所得测序读取将包括条形码，该条形码标识含有该扩增产物所源自的模板核酸的样品。
分子条形码
在一些实施方式中，引物可以含有额外的序列，例如标识符序列(例如条形码、索引)、测序引物杂交序列(例如Rd1)和衔接子序列。在一些实施方式中，衔接子序列是与下一代测序系统一起使用的序列。在一些实施方式中，衔接子序列是基于Illumina的测序技术的P5和P7序列。在一些实施方式中，衔接子序列是与Ion Torrent测序技术兼容的P1和A。
在一些实施方式中，如本文所用，“分子条形码”、“分子条形码标签”和“索引”可以互换使用，并且通常是指用作标识符例如源标识符、位置标识符、日期或时间标识符(例如，采样或处理的日期或时间)或核酸的其他标识符的核酸的核苷酸序列。在一些实施方式中，这样的分子条形码或索引序列用于识别核酸群中存在的核酸的不同方面。在一些实施方式中，分子条形码或索引序列可以提供靶核酸的源标识符或位置标识符。例如，分子条形码或索引序列可以用于识别核酸被获得的患者。在一些实施方式中，分子条形码或索引序列使得能够在单个反应上对多个不同样品进行测序(例如，在单个流动细胞中进行)。在一些实施方式中，索引序列可以用于定向序列成像仪以检测各个测序反应。在一些实施方式中，分子条形码或索引序列可以是长度为2至25个核苷酸、长度为2至15个核苷酸、长度为2至10个核苷酸、长度为2至6个核苷酸。在一些实施方式中，条形码或索引包括至少2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个或至少25个核苷酸。
在一些实施方式中，当根据本文中描述的方法使用加尾随机引物群时，在扩增后可以存在多种可区分的扩增产物。在一些实施方式中，因为加尾随机引物在遍及样品的核酸分子的各个位置处杂交，因此靶特异性引物集合可以对由多于1个杂交事件产生的延伸产物进行杂交(和扩增)，例如，一个加尾随机引物可以在距靶特异性引物杂交位点的第一距离(例如，100个核苷酸)处杂交，并且另一加尾随机引物可以在距靶特异性引物杂交位点的第二距离(例如，200个核苷酸)处杂交，从而产生两种扩增产物(例如，包括约100bp的第一扩增产物和包括约200bp的第二扩增产物)。在一些实施方式中，可以使用下一代测序技术对这些多种扩增产物进行测序。在一些实施方式中，对这些多种扩增产物的测序是有利的，因为它提供了多个重叠序列读数，该序列读数可以相互比较以检测在扩增过程或测序过程中引入的序列错误。在一些实施方式中，可以比对各个扩增产物，并且在它们在特定碱基处存在的序列不同的情况下，可以存在PCR和/或测序的假象或错误。
计算机和控制设备
本文中提供的系统包括若干部件，包括传感器、环境控制系统(例如，加热器、风扇)、机器人(例如，XY定位器)等，其可以在计算机、处理器、微控制器或其他控制器的指导下一起操作。部件可以包括例如XY定位器、液体处理装置、微流体泵、线性致动器、阀驱动器、门操作系统、光学组件、条形码扫描仪、成像或检测系统、触摸屏接口等。
在一些情况下，可以使用硬件、软件或其组合来实现操作，例如系统和/或其中提供的部件的控制操作或者与其接口。当在软件中实现时，软件代码可以在任何合适的处理器或处理器集合上执行，无论是在单个部件中提供还是在多个部件之间分布。这样的处理器可以实现为集成电路，其中集成电路部件中具有一个或更多个处理器。可以使用任何合适格式的电路来实现处理器。
计算机可以体现为多种形式中的任何一种，例如机架式计算机、台式计算机、膝上型计算机或平板计算机。另外，计算机可以嵌入通常不被视为是计算机但具有合适处理能力的装置中，包括个人数字助理(PDA)、智能电话或任何其他合适的便携式、移动或固定电子装置，包括其本身的系统。
在一些情况下，计算机可以具有一个或更多个输入装置和输出装置。除其他之外，这些装置可以用于呈现用户接口。可以用于提供用户接口的输出装置的示例包括：用于输出的视觉呈现的打印机或显示屏以及用于输出的听觉呈现的扬声器或其他声音生成装置。可以用于用户接口的输入装置的示例包括：键盘和指向装置，诸如鼠标、触摸垫和数字化平板电脑。在其他示例中，计算机可以通过语音识别或其他可听格式、通过可见手势、通过触觉输入(例如，包括振动、触觉和/或其他力)或其任何组合来接收输入信息。
一个或更多个计算机可以通过一个或更多个网络以任何合适的形式互连，包括如局域网或广域网，例如企业网络或因特网。这样的网络可以基于任何合适的技术，并且可以根据任何合适的协议操作，并且可以包括无线网络、有线网络或光纤网络。
本文中概述的各种方法或过程可以被编码为可以在采用各种操作系统或平台中的任何一个的一个或更多个处理器上执行的软件。可以使用许多合适的编程语言和/或编程或脚本工具中的任何一种来编写这样的软件，并且可以将这些软件编译为在框架或虚拟机上执行的可执行机器语言代码或中间代码。
用于控制本文中提供的方法或过程的一个或更多个算法可以体现为编码有一个或更多个程序的可读存储介质(或多个可读介质)(例如，计算机存储器、一个或更多个软盘、压缩盘(CD)、光盘、数字视频盘(DVD)、磁带、闪存、现场可编程门阵列或其他半导体装置中的电路配置或者其他有形存储介质)，所述一个或更多个程序当在一个或更多个计算机或其他处理器上执行时执行实现本文中描述的各种方法或过程的方法。
在一些实施方式中，计算机可读存储介质可以将信息保留足够的时间以提供非暂态形式的计算机可执行指令。这样的计算机可读存储介质可以是可移植的，使得存储在其上的一个或多个程序可以被加载到一个或更多个不同的计算机或其他处理器上，以实现本文中描述的方法或过程的各个方面。如本文所用，术语“计算机可读存储介质”仅包括可以被认为是制造品(例如，制品)或机器的计算机可读介质。可替选地或另外地，本文中描述的方法或过程可以体现为除计算机可读存储介质之外的计算机可读介质，例如传播信号。
术语“程序”或“软件”在本文中以一般含义使用，以指代可以用来对计算机或其他处理器进行编程以实现本文中描述的方法或过程的各个方面的任何类型的代码或可执行指令集合。另外，应当理解的是，根据该实施方式的一个方面，在被运行时执行本文中描述的方法或过程的一个或更多个程序不需要驻留在单个计算机或处理器上，而是可以以模块化方式分布在多个不同计算机或处理器之间以实现各种过程或操作。
可执行指令可以处于由一个或更多个计算机或其他装置执行的许多形式，例如程序模块。通常，程序模块包括执行特定任务或实现特定抽象数据类型的例程、程序、对象、部件、数据结构等。通常，在各种实施方式中可以根据需要组合或分布程序模块的功能。
另外，数据结构可以以任何合适的形式存储在计算机可读介质中。数据存储的非限制性示例包括结构化存储、非结构化存储、本地化存储、分布式存储、短期存储和/或长期存储。可以用于传送数据的协议的非限制性示例包括：专有和/或行业标准协议(例如，HTTP、HTML、XML、JSON、SQL、web服务、文本、电子表格等，或其任何组合)。为了简化说明，可以示出具有与数据结构中的位置相关的字段的数据结构。这样的关系同样可以通过为字段的存储分配传达字段之间的关系的计算机可读介质中的位置来实现。然而，可以使用任何合适的机制来建立数据结构的字段中的信息之间的关系，包括通过使用指针、标签或建立数据元素之间的关系的其他机制。
在一些实施方式中，与系统的操作有关的信息(例如，温度、成像或光学信息、荧光信号、部件位置(例如，加热的盖子位置、旋转阀位置)、液体处理状态、条形码状态、隔室访问门位置或者其任何组合)可以从与系统相关联(例如，位于系统内)的一个或更多个传感器或读取器获得，并且可以被存储在计算机可读介质中以提供关于过程(例如，自动化库准备过程)期间的状况的信息。在一些实施方式中，可读介质包括数据库。在一些实施方式中，所述数据库包含来自单个系统(例如，来自一个或更多个隔室)的数据。在一些实施方式中，所述数据库包含来自多个系统的数据。在一些实施方式中，以使数据防篡改的方式存储数据。在一些实施方式中，存储由系统生成的所有数据。在一些实施方式中，存储数据子集。示例
以下示例旨在说明本文中描述的某些实施方式，包括本发明的某些方面，但不举例说明本发明的全部范围。
示例1
以下示例说明了通道系统的操作，使得将样品流体转移至通道系统的容器。
在图25至图26中示出了示例性信道系统1700。
1)对阀1710进行致动，使得第一公共微流体通道1750与第二公共微流体通道1760流体连通。
2)对阀1720进行致动，使得第二公共微流体通道1760与注射泵1780流体连通。
3)可选地，对阀1730进行致动，使得第一公共微流体通道1750与入口通道1770流体连通。
4)可选地，如果执行了步骤3，则用注射泵1780进行抽吸，使得空气被吸入第一公共微流体通道1750。
5)对第一阀1730进行致动，使得第一公共微流体通道1750与样品井1790流体连通。
6)用注射泵1780进行抽吸，使得样品井1790中的样品流体被吸入第一公共微流体通道1750中。
7)对阀1730进行致动，使得第一公共微流体通道1750与容器1795流体连通。
8)通过操作注射泵将样品流体分配到容器中。
示例2
以下示例说明了通道系统的操作，使得将散装流体转移至通道系统的容器。
在图25至图26中示出了示例性通道系统1700。
1)对阀1710进行致动，使得第二公共微流体通道1760与微流体通道1742流体连通。
2)对阀1740进行致动，使得微流体通道1742和散装流体容器1745流体连通。
3)用注射泵1780进行抽吸，使得来自散装流体容器1745的散装流体被吸入第二公共微流体通道1760中。
4)对阀1710进行致动，使得第一公共微流体通道1750与第二微流体通道1760流体连通。
5)对阀1730进行致动，使得第一公共微流体通道1750与废物通道1775流体连通。
6)用注射泵1780进行抽吸，使得第二公共微流体通道1760中的散装流体被吸入第一公共微流体通道1750中并且使得散装流体的前缘进入废物通道1775(例如，使得不是散装流体的任何流体被吸入废物通道中)。
7)可选地，对阀1730进行致动，使得第一公共微流体通道1750与入口通道1770流体连通，并且用注射泵1780进行抽吸，使得空气被吸入第一公共微流体通道1750中。
8)对阀1730进行致动，使得第一公共微流体通道1750与容器1795流体连通。
9)通过操作注射泵将散装流体分配到容器中。
尽管本文已经描述并说明了本发明的若干实施方式，但是本领域普通技术人员将容易想到用于执行功能和/或获得本文中描述的结果和/或一个或更多个优点的各种其他装置和/或结构，并且这些变化和/或修改中的每一个被认为是在本发明的范围内。更一般地，本领域技术人员将容易理解的是，本文中描述的所有参数、尺寸、材料和配置意在是示例性的，并且实际参数、尺寸、材料和/或配置将取决于本发明的教导被用于的具体应用。本领域技术人员将认识到或能够使用仅常规实验确定本文中描述的本发明的具体实施方式的许多等同体。因此，应当理解的是，前述实施方式仅作为示例呈现，并且在所附权利要求及其等同体的范围内，本发明可以以不同于具体描述和要求保护的方式实施。本发明涉及本文中描述的每个单独的特征、系统、物品、材料、试剂盒和/或方法。此外，如果这些特征、系统、物品、材料、试剂盒和/或方法不相互矛盾，则两个或更多个这样的特征、系统、物品、材料、试剂盒和/或方法的任何组合包括在本发明的范围内。
除非明确相反指出，否则本文在说明书和权利要求书中使用的不定冠词“一(a)”和“一个(an)”应被理解为意指“至少一个”。
本文在说明书和权利要求书中使用的短语“和/或”应当被理解为意指如此结合的元素即在某些情况下结合存在以及在其他情况下分离存在的元素中的“任一个或两个”。除非明确地相反指出，否则除了由“和/或”子句具体标识的元素之外，可以可选地存在其他元素，无论与具体标识的那些元素相关或不相关。因此，作为非限制性示例，当与诸如“包括”的开放式语言结合使用时，对“A和/或B”的提及在一个实施方式中可以指代A而没有B(可选地包括除了B之外的元素)；在另一实施方式中，指代B而没有A(可选地包括除了A之外的元素)；在又一实施方式中，指代A和B两者(可选地包括其他元素)；等等。
如本文在说明书和权利要求书中所用，“或”应当被理解为具有与如上定义的“和/或”相同的含义。例如，当分隔列表中的项时，“或”或“和/或”应当被解释为是包括性的，即包括多个元素或元素列表的至少一个元素，但也包括多于一个元素，以及可选地另外的未列出的项。只有明确相反指出的术语，例如“仅一个”或“恰好一个”，或者，当在权利要求中使用时，“由……组成”，将指的是包括多个元素或元素列表中的确切元素。通常，中文中使用的术语“或”仅应被解释为指示排他性术语例如“任一”、“之一”、“仅一个”或“恰好一个”之前的独有替选方案(即“一个或另一个但不是两者”)。“基本上由……组成”在权利要求中使用时将具有其在专利法领域中使用的普通含义。
如本文在说明书和权利要求书中所用，关于一个或更多个元素的列表，短语“至少一个”应当被理解为意指选自元素列表中的任何一个或更多个元素的至少一个元素，但不一定包括元素列表中具体列出的每个元素中的至少一个元素，并且不排除元素列表中的元素的任何组合。该定义还允许除了短语“至少一个”涉及的元素列表内具体标识的元素之外，可以可选地存在元素，无论是与具体标识的那些元素相关还是不相关。因此，作为非限制性示例，“A和B中的至少一个”(或等同地，“A或B中的至少一个”，或等同地“A和/或B中的至少一个”)可以在一个实施方式中指代至少一个A，可选地包括多于一个A，而不存在B(并且可选地包括除B之外的元素)；在另一实施方式中，指代至少一个B，可选地包括多于一个B，而不存在A(并且可选地包括除A之外的元素)；在又一实施方式中，指代至少一个A，可选地包括多于一个A，以及至少一个B，可选地包括多于一个B(并且可选地包括其他元素)；等等。
在上面的权利要求以及说明书中，诸如“包含”、“包括”、“携带”、“具有”、“含有”、“涉及”、“保持”等的所有过渡短语都被理解为是开放式的，即意指包括但不限于。只有过渡短语“由……组成”和“基本上由……组成”应当分别是封闭或半封闭的过渡短语，如美国专利局专利审查程序手册第2111.03节阐述的。
除非另外定义或指明，否则如本文中使用的与例如一个或更多个物品、结构、力、场、流、方向/轨迹和/或其子部件和/或其组合和/或可以由术语表征的上面未列出的任何其他有形或无形元素的或之间的形状、取向、对齐和/或几何关系有关的任何这样的术语应当被理解为不要求绝对符合这样的术语的数学定义，而是，对于如与该主题最密切相关的本领域技术人员将理解的如此表征的主题而言，应当被理解为指示符合这样的术语的数学定义至可能的程度。与形状、取向和/或几何关系有关的这些术语的示例包括但不限于描述以下的术语：形状——例如弧形、正方形、圆形的/圆形、矩形的/矩形、三角形的/三角形、圆柱形的/圆柱形、椭圆的/椭圆、(n)多边形的/(n)多边形等；角度取向——例如垂直、正交、平行、竖直、水平、共线等；轮廓和/或轨迹——例如平面/平面的、共面的、半球形的、部分半球形的、线/线性的、双曲线的、抛物线的、平的、弯曲的、直的、弓形的、正弦的、切线/切线的等；方向——例如北、南、东、西等；表面和/或散装材料特性和/或空间/时间分辨率和/或分布——例如光滑的、反射的、透明的、澄清的、不透明的、刚性的、不可渗透的、均匀的(地)、惰性的、不可润湿的、不溶的、稳定的、不变的、恒定的、同质的等；以及对于相关领域的技术人员而言明显的许多其他内容。作为一个示例，本文中描述为“正方形”的制造物品不需要这样的物品具有完全平面或线性并且以恰好90度的角度相交的面和侧面(实际上，这样的物品只能作为数学抽象存在)，而是，如本领域技术人员将理解的或者如具体描述的，这种物品的形状应该被解释为近似于数学上定义的“正方形”，达到列举的制造技术通常可实现和取得的程度。作为另一示例，在本文中描述为“对齐”的两个或更多个制造物品将不要求这样的物品具有完全对齐的面或侧面(实际上，这样的物品只能作为数学抽象存在)，而是，如本领域技术人员所理解或如具体描述的，这样的物品的布置应该被解释为近似于数学上定义的“对齐”，达到列举的制造技术通常可实现和取得的程度。

Claims (110)

1.一种盒，包括：
公共微流体通道；
连接至样品通道的样品入口；
连接至第一容器通道的第一容器；
连接至第二容器通道的第二容器；
第一阀；以及
第二阀；
其中，所述公共通道、所述样品通道、所述第一容器通道和所述第二容器通道中的每一个从所述第一阀延伸，并且
其中，所述公共微流体通道位于所述第一阀与所述第二阀之间。
2.一种盒，包括：
第一容器集合；
第一阀；
连接至所述第一容器集合的第一容器通道集合，其中，来自所述第一容器通道集合的通道中的每一个连接至所述第一阀；
第二容器通道集合；以及
位于所述第一容器通道集合与所述第二容器通道集合之间的公共微流体通道。
3.根据前述权利要求中任一项所述的盒，其中，所述盒还包括框架，所述框架包括：被构造并布置成容纳第一匣盒的第一开口以及容纳第二匣盒的第二开口。
4.根据前述权利要求中任一项所述的盒，其中，所述公共微流体通道是与所述框架相邻且不与所述框架成整体的通道系统的一部分。
5.根据前述权利要求中任一项所述的盒，其中，所述盒还包括：包含在所述第一容器或所述第一容器集合中的至少之一中的存储的液体试剂。
6.根据前述权利要求中任一项所述的盒，其中，包含所述存储的液体试剂的所述容器被密封，以减少或防止所述存储的液体试剂的蒸发。
7.根据前述权利要求中任一项所述的盒，其中，所述盒还包括存储的基本上干燥的试剂。
8.根据前述权利要求中任一项所述的盒，其中，所述存储的试剂包括用于进行第一PCR反应的试剂。
9.根据前述权利要求中任一项所述的盒，其中，所述盒与能够被温度控制的盖子接口。
10.根据前述权利要求中任一项所述的盒，其中，所述盖子覆盖所述容器。
11.根据前述权利要求中任一项所述的盒，其中，所述盖子形成所述容器的顶部。
12.根据前述权利要求中任一项所述的盒，其中，被加热的所述盖子是半透明或透明的。
13.根据前述权利要求中任一项所述的盒，其中，被加热的所述盖子被配置成使得能够通过被加热的所述盖子进行光学测量。
14.根据前述权利要求中任一项所述的盒，其中，所述盒与温度控制装置连通。
15.根据前述权利要求中任一项所述的盒，其中，所述温度控制装置被配置成向第一匣盒施加第一温度并且向第二匣盒施加第二温度。
16.根据前述权利要求中任一项所述的盒，其中，所述温度控制装置包括一个或更多个热垫、热电部件和/或热敏电阻器。
17.根据前述权利要求中任一项所述的盒，其中，所述盒包括一个或更多个穿刺部件，所述穿刺部件被构造并布置成在所述匣盒插入所述盒中时对所述匣盒的一个或更多个部分进行穿刺。
18.根据前述权利要求中任一项所述的盒，其中，所述第一匣盒和/或所述第二匣盒包括容器集合。
19.根据前述权利要求中任一项所述的盒，其中，所述盒包括第三匣盒。
20.根据前述权利要求中任一项所述的盒，其中，所述第一匣盒被配置成位于所述框架的第一开口中。
21.根据前述权利要求中任一项所述的盒，其中，所述第二匣盒被配置成位于所述框架的第二开口中。
22.根据前述权利要求中任一项所述的盒，其中，所述第三匣盒包括容器集合。
23.根据前述权利要求中任一项所述的盒，其中，所述容器集合中的容器在插入所述盒中之前彼此不流体连通。
24.根据前述权利要求中任一项所述的盒，其中，所述匣盒中的至少之一包括存储在其中的试剂。
25.根据前述权利要求中任一项所述的盒，其中，所述匣盒中的至少之一被密封，并且其中，所述匣盒中的所述容器中的至少一部分容器包含存储在其中的试剂。
26.根据前述权利要求中任一项所述的盒，其中，所述匣盒中的至少之一包含存储在其中的第一试剂和存储在其中的第二试剂，并且其中，在将该匣盒插入所述盒中之前，所述第一试剂和所述第二试剂彼此不流体连通。
27.根据前述权利要求中任一项所述的盒，其中，在将所述匣盒中的至少之一插入所述盒中之前，该匣盒不与所述通道系统流体连通。
28.根据前述权利要求中任一项所述的盒，其中，所述匣盒中的至少之一位于所述盒中，使得存储在该匣盒中的第一试剂和/或第二试剂与所述通道系统的至少一个通道流体连通。
29.根据前述权利要求中任一项所述的盒，其中，所述匣盒和/或所述容器集合中的至少之一包含冻干球集合。
30.根据前述权利要求中任一项所述的盒，其中，所述容器中的至少之一包含单个冻干球。
31.根据前述权利要求中任一项所述的盒，其中，所述容器中的至少之一包含两个或更多个冻干球。
32.根据前述权利要求中任一项所述的盒，其中，所述匣盒和/或所述容器集合中的至少之一包含引物集合。
33.根据前述权利要求中任一项所述的盒，其中，所述匣盒和/或所述容器集合中的至少之一包含缓冲剂、洗涤试剂和/或醇。
34.根据前述权利要求中任一项所述的盒，其中，所述匣盒和/或所述容器集合中的至少之一被构造并布置成被加热。
35.根据前述权利要求中任一项所述的盒，其中，所述匣盒中的至少之一包括微流体通道。
36.根据前述权利要求中任一项所述的盒，其中，所述匣盒中的至少之一是可再填充的。
37.根据前述权利要求中任一项所述的盒，其中，所述匣盒中的至少之一不可逆地附接至所述框架和/或所述盒。
38.根据前述权利要求中任一项所述的盒，其中，所述匣盒中的至少之一具有至少约0.1mL且小于或等于25mL的总工作容积。
39.根据前述权利要求中任一项所述的盒，其中，所述匣盒中的至少之一是废物匣盒。
40.根据前述权利要求中任一项所述的盒，其中，所述废物匣盒具有至少1mL且小于或等于30mL的容积。
41.根据前述权利要求中任一项所述的盒，其中，所述盒包括第一匣盒和第二匣盒，所述第一匣盒包括包含存储的冻干球的第一容器集合，所述第二匣盒包括包含存储的冻干球的第二第一容器集合，其中，所述第一匣盒和所述第二匣盒彼此不流体连通。
42.根据前述权利要求中任一项所述的盒，其中，所述第一匣盒和所述第二匣盒被构造并布置成被独立地加热。
43.根据前述权利要求中任一项所述的盒，其中，所述第一匣盒被构造并布置成用于进行第一PCR反应，并且所述第二匣盒被构造并布置成用于进行独立于所述第一PCR反应的第二PCR反应。
44.根据前述权利要求中任一项所述的盒，其中，所述盒包括通道系统。
45.根据前述权利要求中任一项所述的盒，其中，所述通道系统包括用于进行第一PCR反应的第一通道集合。
46.根据前述权利要求中任一项所述的盒，其中，所述通道系统包括用于进行第二PCR反应的第二通道集合。
47.根据前述权利要求中任一项所述的盒，其中，所述第一通道集合和所述第二通道集合由至少一个阀分开。
48.根据前述权利要求中任一项所述的盒，其中，所述公共通道包括蛇形通道。
49.根据前述权利要求中任一项所述的盒，其中，所述第一容器通道的内部容积小于所述第二容器通道的内部容积。
50.根据前述权利要求中任一项所述的盒，其中，所述第一容器通道集合和/或所述第二容器通道集合包括：至少2个、4个、6个、8个或10个通道和/或小于或等于20个、15个、10个或5个通道。
51.根据前述权利要求中任一项所述的盒，其中，所述公共通道具有至少2μL和/或小于或等于200μL的容积。
52.根据前述权利要求中任一项所述的盒，其中，所述通道系统包括连接至所述第二容器通道集合的第二容器集合。
53.根据前述权利要求中任一项所述的盒，其中，所述通道系统包括第二阀，其中，来自所述第二容器通道集合的通道中的每一个连接至所述第二阀。
54.根据前述权利要求中任一项所述的盒，其中，所述公共微流体通道、所述第一容器通道和/或所述第二容器通道具有大于或等于约50微米和/或小于或等于1mm的最大截面尺寸。
55.根据前述权利要求中任一项所述的盒，其中，每个容器具有至少约1μL和/或小于或等于200μL的容积。
56.根据前述权利要求中任一项所述的盒，其中，所述第一容器集合和/或所述第二容器集合包括：至少2个、4个、6个、8个或10个容器和/或小于或等于20个、15个、10个或5个容器。
57.根据前述权利要求中任一项所述的盒，其中，至少一个容器具有锥形截面形状。
58.根据前述权利要求中任一项所述的盒，其中，至少一个容器在形状上是圆锥形的。
59.根据前述权利要求中任一项所述的盒，其中，所述框架和/或所述盒与载体板直接接触。
60.根据前述权利要求中任一项所述的盒，其中，所述载体板被配置成在没有包含所述框架和/或所述盒的用户的情况下促进对所述框架和/或所述盒的输送。
61.根据前述权利要求中任一项所述的盒，其中，所述框架包括被配置成接收一个或更多个样品的一个或更多个样品井。
62.根据前述权利要求中任一项所述的盒，其中，所述一个或更多个样品井与所述通道系统流体连通。
63.根据前述权利要求中任一项所述的盒，其中，所述框架包括一个或更多个输出井。
64.根据前述权利要求中任一项所述的盒，其中，所述一个或更多个输出井与所述通道系统流体连通。
65.根据前述权利要求中任一项所述的盒，其中，所述框架包括废物匣盒。
66.根据前述权利要求中任一项所述的盒，其中，所述第一阀和/或所述第二阀是旋转阀。
67.根据前述权利要求中任一项所述的盒，其中，所述第一阀和/或所述第二阀包括凸起特征，所述凸起特征被配置成促进流体在所述公共微流体通道与另一通道之间的流动。
68.根据前述权利要求中任一项所述的盒，其中，所述阀包括密封件。
69.根据前述权利要求中任一项所述的盒，其中，所述通道系统包括连接至废物容器的废物通道。
70.一种方法，包括：
使第一流体在公共微流体通道中沿第一方向流动；
使所述第一流体的至少一部分在所述公共微流体通道中沿第二方向流动，其中，所述第二方向与所述第一方向相反；
使所述第一流体的至少一部分经由第一容器通道流动进入第一容器；
使所述第一流体的至少一部分从所述第一容器流至所述公共微流体通道；以及
使所述第一流体的至少一部分经由第二容器通道从所述公共通道流至第二容器。
71.一种方法，包括：
使第一流体在公共微流体通道中流动；
使所述第一流体的一部分流动进入第一容器；
使所述第一流体的一部分流动进入废物容器；
在所述第一容器中进行化学和/或生物反应以形成第二流体；
使所述第二流体的一部分从所述第一容器流至所述公共微流体通道；以及
使所述第二流体的一部分流动进入所述废物容器。
72.一种方法，包括：
使第一流体流动进入公共微流体通道；
对阀进行致动，使得所述公共微流体通道与第一容器通道流体连通；
使所述第一流体的至少一部分流动进入所述第一容器通道；
将第二流体引入所述公共微流体通道，其中，所述第二流体与所述第一流体不混溶；
使所述第二流体的至少一部分从所述公共微流体通道流动进入所述第一容器通道；以及
在所述第二在所述第一容器通道中流动期间，使受控体积的所述第一流体流动进入与所述第一容器通道连接的第一容器。
73.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述盒包括通道系统。
74.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述通道系统包括用于进行第一PCR反应的第一通道集合。
75.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述通道系统包括用于进行第二PCR反应的第二通道集合。
76.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述第一通道集合和所述第二通道集合由至少一个阀分开。
77.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述公共通道包括蛇形通道。
78.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述第一容器通道的内部容积小于所述第二容器通道的内部容积。
79.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述第一容器通道集合和/或所述第二容器通道集合包括：至少2个、4个、6个、8个或10个通道和/或小于或等于20个、15个、10个或5个通道。
80.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述公共通道具有至少2μL和/或小于或等于200μL的容积。
81.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述通道系统包括连接至所述第二容器通道集合的第二容器集合。
82.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述通道系统包括第二阀，其中，来自所述第二容器通道集合的通道中的每一个连接至所述第二阀。
83.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述公共微流体通道、所述第一容器通道和/或所述第二容器通道具有大于或等于约50微米和/或小于或等于1mm的最大截面尺寸。
84.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，在进入所述第一容器时，所述流体被暴露于第一试剂。
85.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，在进入所述第二容器时，所述流体被暴露于第二试剂。
86.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，存在于所述流体中的样品和/或反应物与所述第一试剂反应。
87.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，存在于所述流体中的所述样品和/或所述反应物与所述第二试剂反应。
88.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，使所述第一流体流动包括：对阀进行致动，使得所述公共微流体通道与第一容器通道流体连通。
89.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，使所述第一流体流动包括：向所述公共微流体通道施加第二压力，使得第二流体的至少一部分进入所述容器通道。
90.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，通过施加至所述公共微流体通道的第一压力和/或第二压力来控制存在于所述容器通道和/或与所述容器路径连接的容器中的流体的体积。
91.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述公共通道和所述容器通道中的每一个从所述阀延伸。
92.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，使所述第一流体的至少一部分流动包括：对阀/所述阀进行致动，使得所述公共微流体通道与所述第一容器通道流体连通。
93.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，使所述第一流体的至少一部分经由所述第一容器通道流动进入所述第一容器包括：向所述公共微流体通道施加第一压力。
94.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，使所述第一流体的至少一部分从所述第一容器流至所述公共微流体通道包括：向所述公共微流体通道施加第二压力。
95.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，使所述第一流体的至少一部分经由所述第二容器通道从所述公共通道流至所述第二容器包括：对所述阀进行致动，使得所述公共微流体通道与所述第二容器通道流体连通。
96.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，使所述第一流体的至少一部分经由所述第二容器通道从所述公共通道流至所述第二容器包括：向所述微流体通道施加第三压力。
97.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，使所述第二流体的至少一部分流动包括：向所述微流体通道施加压力。
98.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，压力(所述第一压力、所述第二压力和/或所述第三压力)是正压力。
99.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，压力(所述第一压力、所述第二压力和/或所述第三压力)是负压力或减小的压力。
100.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，使所述第二流体的至少一部分流动包括：对所述阀进行致动，使得所述公共微流体通道与所述第一容器通道流体连通。
101.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，使所述第二流体的至少一部分从所述公共微流体通道流动进入所述第一容器通道包括：防止所述第二流体进入所述第一容器。
102.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，将所述第二流体引入所述公共微流体通道包括：使所述第二流体通过样品入口流动，其中，所述样品入口连接至从所述阀延伸并与所述公共微流体通道流体连通的样品通道。
103.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述受控体积的体积小于或等于小于或等于100μL、小于或等于80μL、小于或等于60μL、小于或等于40μL、小于或等于20μL、小于或等于10μL、小于或等于5μL或者小于或等于2μL。
104.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述第一流体是液体样品。
105.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述第一流体是试剂。
106.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述第二流体是气体。
107.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述气体是空气。
108.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述第二流体是试剂。
109.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述第二流体是液体样品。
110.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述第二流体是水或缓冲剂。
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