CN109971647B

CN109971647B - 小球藻及其用途和制备方法

Info

Publication number: CN109971647B
Application number: CN201711466360.0A
Authority: CN
Inventors: 潘文欢; 顾颖; 杨勇; 宋燕子; 吴甜
Original assignee: Shenzhen Lvbei Ecological Technology Co ltd; BGI Shenzhen Co Ltd
Current assignee: Shenzhen Lvbei Ecological Technology Co ltd; BGI Shenzhen Co Ltd
Priority date: 2017-12-28
Filing date: 2017-12-28
Publication date: 2022-07-05
Anticipated expiration: 2037-12-28
Also published as: CN109971647A

Abstract

本发明提出了小球藻(Chlorella sp.XH2)，于2017年11月22日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2017716；小球藻(Chlorella sp.T1‑2)，于2017年11月22日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2017717；小球藻(Chlorella sp.XH1)，于2017年11月22日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2017718。上述小球藻的污水耐受性能高，能够在污水中具有更快的生长速度、更高的生物量累计，能够在较高浓度的污水中保持良好的长势，且对污水的处理性能优越。

Description

小球藻及其用途和制备方法

技术领域

本发明涉及生物领域，具体地，本发明涉及小球藻及其用途和制备方法。

背景技术

藻类植物的种类繁多，目前已知有3万种左右。藻类分布的范围极广，对环境条件要求不严，适应性较强，在只有极低的营养浓度、极微弱的光照强度和相当低的温度下也能生活。利用藻类处理污水始于20世纪60年代，利用污水培养藻类既可以廉价高效的去除污水中的N、P等污染物质，还可以产生大量的藻类生物量，这些生物量可以作为饲料、肥料或燃料等加以利用，在污水处理中有广阔的应用前景。

随着人民生活水平的提高和饮食结构的巨大变化，畜禽产品在饮食结构中所占比重逐渐增大，因此，养殖业也得到了迅猛发展，但同时也带来严重的环境污染问题，对我国生态环境形成了巨大的压力，使得水体、土壤以及大气等环境受到了严重的污染。因此，对畜禽粪污进行减量化、无害化和资源化，防止和消除畜禽粪便污染，对于保护生态环境，推动现代农业产业和循环经济发展具有十分积极的意义。

对于粪污水的处理，以往主要采用厌氧接触法、厌氧污泥法、生物膜法等。70年代人们开始采用酵母菌和光合细菌生物处理法，并将废水处理和单细胞蛋白生产结合起来。目前国外已开始应用藻类养殖处理系统来处理粪污水并生产一些高蛋白的藻类。这一技术具有成本低、能耗少、效率高、收益大等特点，是一项非常有潜力的生态环保工程。国内外有利用养殖螺旋藻等微藻使废水净化的报道，并收到初步成效。

利用小球藻处理水产养殖废水，一方面可以净化污水，另一方面可以获得有附加价值的小球藻，促进养殖业的可持续发展。利用藻类处理粪污废水在我国具有广阔的应用前景，也具有很好的推广应用价值。

然而该项技术目前还有一些问题有待解决。

发明内容

本申请是基于发明人对以下事实和问题的发现和认识做出的：

现有藻种的耐污能力不高，较高浓度的污水引起的藻类生长活性下降，生长速度缓慢甚至死亡，造成污水处理效果不理想。本申请的发明人通过紫外诱变及定向筛选的方法获得了污水耐受性能突出的藻种，对污水的处理性能非常优越。

为此，在本发明的第一方面，本发明提出了一种小球藻(Chlorella sp.XH2)，于2017 年11月22日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2017716，分类命名为：Chlorella sp.XH2小球藻XH2，保藏地址为：中国.武汉.武汉大学。

本发明提出了一种小球藻(Chlorella sp.T1-2)，于2017年11月22日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2017717，分类命名为：Chlorella sp.T1-2小球藻T1-2，保藏地址为：中国.武汉.武汉大学。

本发明提出了一种小球藻(Chlorella sp.XH1)，于2017年11月22日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2017718，分类命名为：Chlorella sp.XH1 小球藻XH1，保藏地址为：中国.武汉.武汉大学。

根据本发明实施例的小球藻的污水耐受性能高，能够在污水中具有更快的生长速度、更高的生物量累计，能够在较高浓度的污水中保持良好的长势，且对污水的处理性能优越。

在本发明的第二方面，本发明提出了前面所述的小球藻在处理污水中的用途。如前所述，本申请所提出的小球藻的污水耐受性能高，能够在污水中具有更快的生长速度、更高的生物量累计，能够在较高浓度的污水中保持良好的长势，且对污水的处理性能优越。

在本申请的第三方面，本发明提出了一种处理污水的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：向污水中投放前面所述的小球藻。利用根据本发明实施例的方法，能够有效处理污水，尤其对高浓度污水的处理效果更优。

在本发明的第四方面，本发明提出了一种获得前面所述小球藻的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：1)将活化BD09藻种单藻落进行培养，以便获得诱变出发藻，所述诱变出发藻的OD₆₈₀为1～9；2)将所述诱变出发藻在254nm紫外下诱变8min；3)将经过步骤2)诱变后的小球藻进行暗处理和第一光照处理；4)将经过步骤3)处理后的小球藻接入第一污水进行第二光照处理，所述第一污水的浓度是BD09藻种的抑制浓度；5) 选择第一优势藻种接入第二污水进行第三光照处理，所述第二污水的浓度是BD09藻种的致死浓度；；6)选择第二优势藻种接入第三污水进行第四光照处理，所述第三污水的浓度是所述BD09藻种的抑制浓度的7/5～8/5；7)选择第三优势藻种，以便获得小球藻。通过根据本发明实施例的上述方法获得的小球藻的污水耐受性能高，能够在污水中具有更快的生长速度、更高的生物量累计，能够在较高浓度的污水中保持良好的长势，且对污水的处理性能优越。根据本发明实施例的上述方法是诱变后直接用液体定向筛选，大大提高了选育效率，节约了成本和时间。

根据本发明的实施例，上述方法还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：

根据本发明的实施例，所述BD09藻种的抑制浓度是基础污水浓度的50％，所述基础污水具有如下参数：COD：7551mg/L，BOD：1350mg/L，SS：2800mg/L，总磷：52mg/L，总氨：1282mg/L，氨氮：921mg/L，pH：7.68；所述第二污水的浓度是所述基础污水浓度的60％～70％；所述第三污水的浓度是所述基础污水浓度的70％～80％。

根据本发明的实施例，所述第一优势藻种是指在第一污水中生长速度快而且有显著优势的藻种；所述第二优势藻种是指在第二污水中生长速度快而且有显著优势的藻种；所述第三优势藻种是指在第三污水中生长速度快而且有显著优势的藻种。本领域技术人员可通过对藻种的生长指标进行统计分析，确定获得上述第一、第二、第三优势藻种。

根据本发明的实施例，步骤7)进一步包括：将所述第三优势藻种进行分离纯化处理。可进一步提高获得藻种的纯度。

根据本发明的实施例，所述分离纯化处理是通过如下方式进行的：7-1)将所述第三优势藻种涂布于50％污水板并在光照强度为3，000lx，关照周期为16/8h，温度为25℃条件下培养10～20d；7-2)将步骤7-1)获得的单藻落接入1mL无菌水；7-3)将步骤7-2)获得的含有单藻落的无菌水涂布于50％污水板并在光照强度为3，000lx，关照周期为16/8h，温度为25℃条件下培养10～20d；7-4)重复步骤7-2)和7-3)，以便获得分离纯化后所述小球藻，其中，所述50％污水板中含有所述第一污水、琼脂、卡那霉素和头孢噻肟，所述第一污水和所述琼脂的体积/质量比为1000mL/15g，所述卡那霉素和头孢噻肟在所述污水板中的浓度为50mg/L。通过上述方式对第三优势藻种进行分离纯化，藻种的纯度会进一步提高。

根据本发明的实施例，所述活化BD09藻种单藻落是通过如下方式获得的：1-1)将未活化BD09藻种单藻落接入BG11液体培养基；1-2)将步骤1-1)获得的含有未活化BD09 藻种单藻落的BG11液体培养基涂布于BG11固体培养基，并进行培养20～22天，以便获得活化BD09藻种单藻落。由此方式获得的活化BD09藻种单藻落的BD09藻种的纯度高、生长状态良好，经过后续的紫外诱变以及进一步的液体筛选，能够成功获得前面所述的具有高耐污性能的小球藻。

根据本发明的实施例，在步骤1)中，所述培养是在含所述BG11液体培养基的通气培养系统中进行的，其中，所述通气培养系统中含有体积比为2％～2.5％CO₂的无菌空气，所述培养是在转速为150～250rpm的匀速搅拌条件下进行的。采用上述的培养方式，可在 3～5天的时间内在500mL的培养体系中将单藻落(OD₆₈₀为0)培养成藻液浓度为OD₆₈₀为4的藻液，相比于现有的培养方式，如在500mL体系中，培养至OD₆₈₀为1需要1个月左右的时间，小球藻的生长速度大幅提高。

根据本发明的实施例，在步骤2)中，所述诱变出发藻的藻量为20，所述诱变出发藻的起始OD₆₈₀为2.0。需要说明的是，在步骤2)中的藻量是通过如下公式获得的：藻量＝藻液体积*藻液OD₆₈₀，起始OD₆₈₀是指直接用于紫外诱变的藻液的OD₆₈₀。发明人发现，诱变出发藻的藻量为20，起始OD₆₈₀为2.0，诱变出发藻在254nm紫外下诱变8min，获得诱变藻的效率高。

根据本发明的实施例，在步骤2)中，所述诱变8min是连续进行的。

根据本发明的再一具体实施例，在步骤2)中，所述诱变8min是分段进行的，第一阶段连续进行4min，第二阶段连续进行4min。在诱变过程中，不论是一直诱变8min，还是分成两个阶段进行，每个阶段4min，中间混匀藻液一次，诱变藻的获得效率和诱变程度没有显著差异。

根据本发明的实施例，在步骤3)中，所述暗处理是在25℃的条件下进行24h。进而有效避免了光复活。

根据本发明的实施例，在步骤4)和步骤5)中，接入污水的浓度分别是BD09藻种的抑制浓度(即在此浓度下，藻可以存活，但长势不佳)和致死浓度(即在此浓度下，藻刚好不生长)，这两个浓度是发明人在进行紫外诱变藻筛选之前，进行了“藻种污水耐受敏感性测试”而确定的。根据本发明的具体实施例，藻种污水耐受敏感性测试是通过如下方式进行的：将污水用自来水配制成不同浓度的污水，如30％、40％、50％、60％、70％、80％等，将步骤1)获得的所述诱变出发藻培养至对数期，接入配好的不同浓度的污水中，测得OD₆₈₀＝0.1时，培养15～25天，观察小球藻在不同浓度污水中的生长情况，选择藻刚好不生长(致死)的浓度作为致死浓度，选择抑制藻生长(藻可以存活，但长势不佳)的浓度作为抑制浓度，得出致死浓度为60％，抑制浓度为50％，该致死浓度和抑制浓度用作后续诱变藻种筛选的诱变藻筛选压。

根据本发明的实施例，所述第一光照处理是在光照强度为3，000lx，光照周期为16/8 h，温度为25℃的条件下进行1周。进而经过紫外诱变的藻种能够恢复到最佳的生长状态，为后续进一步地进行筛选奠定了良好的生长状态基础，同时使得诱变藻处于同一生长状态。

根据本发明的实施例，在步骤4)～6)中，所述第二、第三、第四光照处理是在光照强度为3，000lx，光照周期为16/8h，温度为25℃的条件下进行20～30天。第二、第三、第四光照处理在上述条件下进行，可为待筛选诱变藻提供优良的生长条件，并且光照强度和光照周期与第一光照处理强度与周期保持一致，而只逐步提升污水浓度，筛选过程中有效控制了筛选参数，获得的第三优势藻种为耐污性能藻种。

在发明的第二方面，本发明提出了一种获得耐污藻的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：将活化藻种单藻落进行培养，以便获得诱变出发藻；将所述诱变出发藻进行紫外诱变；将经过紫外诱变的诱变藻进行暗处理和第一光照处理；将经过暗处理和第一光照处理后的诱变藻接入第一污水进行第二光照处理，所述第一污水的浓度是抑制浓度；将经过第二光照处理获得的第一优势藻种接入第二污水进行第三光照处理，所述第二污水的浓度是致死浓度；将经过第三光照处理获得的第二优势藻种接入第三污水进行第四光照处理，所述第三污水的浓度是所述抑制浓度的7/5～8/5，以便获得第三优势藻种，所述第三优势藻种为所述耐污藻。根据本发明实施例的上述方法能够有效获得污水耐受性能高的藻种，且上述方法相比于现有技术(固体单藻落法)，是诱变后直接用液体定向筛选，大大提高了选育效率，节约了成本和时间。

根据本发明的实施例，所述方法进一步包括：将所述第三优势藻种进行分离纯化。可进一步提高获得耐污藻种的纯度。

在本发明的第三方面，本发明提出了一种获得耐污藻的系统。根据本发明的实施例，所述系统包括，参考图6：诱变出发藻培养装置100，所述诱变出发藻培养装置100用于将活化藻种单藻落进行培养，以便获得诱变出发藻；诱变装置200，所述诱变装置200与所述诱变出发藻培养装置100相连，用于将所述诱变出发藻进行紫外诱变；暗处理和第一光照处理装置300，所述暗处理和第一光照处理装置300与所述诱变装置200相连，用于将经过紫外诱变的诱变藻进行暗处理和第一光照处理；第二光照处理装置400，所述第二光照处理装置400与所述暗处理和第一光照处理装置300相连，用于将经过暗处理和第一光照处理后的诱变藻接入第一污水进行第二光照处理，所述第一污水的浓度是抑制浓度；第三光照处理装置500，所述第三光照处理装置500与所述第二光照处理装置400相连，用于将经过第二光照处理获得的第一优势藻种接入第二污水进行第三光照处理，所述第二污水的浓度是致死浓度；第四光照处理装置600，所述第四光照处理装置600与所述第三光照处理装置500相连，用于将经过第三光照处理获得的第二优势藻种接入第三污水进行第四光照处理，所述第三污水的浓度是所述抑制浓度的7/5～8/5，以便获得第三优势藻种，所述第三优势藻种为所述耐污藻。根据本发明实施例的上述系统，适于实施根据本发明实施例的上述获得耐污藻的方法，进而获得污水耐受性能高的藻种，且筛选效率高，节约了成本和时间。

根据本发明的实施例，上述系统还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：

根据本发明的实施例，参考图7，所述系统进一步包括：分离纯化装置700，所述分离纯化装置700与所述第四光照处理装置600相连，用于将所述第三优势藻种进行分离纯化处理。进而进一步提高获得耐污藻种的纯度。

附图说明

图1是根据本发明实施例的T1-2、XH1、XH2和BD09在BG11中生长情况；

图2是根据本发明实施例的T1-2、XH1、XH2和BD09在30％污水中生长情况；

图3是根据本发明实施例的T1-2、XH1、XH2和BD09在50％污水中生长情况；

图4是根据本发明实施例的T1-2、XH1、XH2和BD09在60％污水中生长情况；

图5是根据本发明实施例的获得耐污藻种的流程图；

图6是根据本发明实施例的获得耐污藻的系统的结构示意图；以及

图7是根据本发明实施例的获得耐污藻的系统的结构示意图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

实施例

1)藻种活化

使用发明人实验室前期保存的BD09藻种，挑取单藻落在BG11液体培养基中用移液器吹打均匀，然后涂布在BG11固体培养基中，培养约21天长出单藻落，再次挑取单藻落均匀分散于BG11培养基中并涂布于BG11固体培养基中获得纯化的单藻落，25℃保存备用。

BG11培养基配方如表1所示

表1：

组分	量	母液
			(1)NaNO<sub>3</sub>	100mL/L	15.0g/L H<sub>2</sub>O
(2)K<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>	10mL/L	4.0g/L H<sub>2</sub>O
			(3)MgSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O	10mL/L	7.5g/L H<sub>2</sub>O
(4)Citric acid	10mL/L	0.6g/L H<sub>2</sub>O
			(5)Ferric ammonium citrate	10mL/L	0.6g/L H<sub>2</sub>O
(6)Na2EDTA	10mL/L	0.1g/L H<sub>2</sub>O
			(7)CaCl<sub>2</sub>·2H<sub>2</sub>O	10mL/L	3.6g/L H<sub>2</sub>O
(8)Na<sub>2</sub>CO<sub>3</sub>	10mL/L	2.0g/L H<sub>2</sub>O
			(9)A5(Trace mental solution)	1mL/L

A5组分如表2所示

表2：

2)藻种培养

挑取获得的单藻落接入含BG11液体培养基的通气培养系统培养，所谓通气培养是将无菌的含体积比为2％～2.5％CO₂的空气通入培养体系中，同时用磁力搅拌器和转子的作用下，使整个培养体系处于匀速搅拌状态，转速为150～250rpm。采用统计培养，可将在3～5 天的时间内在500mL的培养体系中将单藻落培养成藻液浓度为OD₆₈₀为4的藻液(传统培养， 500mL体系中，培养至OD₆₈₀为1需要1个月左右的时间)。藻液浓度在OD₆₈₀＝2～9可作为诱变藻种。培养4天，OD₆₈₀＝4.3。

3)藻种污水耐受敏感性测试

取养猪场污水，将污水(污水参数为：COD：7551mg/L，BOD：1350mg/L，SS：2800mg/L，总磷：52mg/L，总氨：1282mg/L，氨氮：921mg/L，pH：7.68)用自来水配制成不同浓度的污水：30％、40％、50％、60％、70％、80％，将步骤2)培养的藻种接入用自来水配好的30％、40％、50％、60％、70％、80％污水中，起始OD₆₈₀＝0.1，培养15～25天，根据小球藻在不同浓度污水中的生长情况，确定选择藻刚好不生长(致死)60％浓度的污水、和抑制藻生长(藻可以存活，但长势不佳)50％浓度的污水为诱变藻筛选压。

4)藻种紫外随机诱变

a)超净工作台用酒精擦拭干净并紫外灯照射30min，待用。

b)将移液器、无菌枪头、藻种、BG11液体培养基、培养皿用酒精壶喷洒后拿到超净台。

c)测量藻种OD值：手动晃动培养瓶以混匀藻液，移液器吸取藻液稀释用紫外分光光度计测量藻液OD₆₈₀值，测得OD₆₈₀＝4.3。

d)计算待诱变藻量(诱变筛选培养体系为50mL，诱变藻液OD₆₈₀＝0.4)：

4.3×藻液量＝0.4×50mL 藻液量＝4.65mL

e)制备诱变藻体系：用移液器吸取4.65mL藻液值无菌培养皿中，再吸取5.35mLBG11 液体培养基至培养皿中，即总体积为10mL，用移液器将藻液与BG11液体培养基吹打混匀。

f)诱变：打开紫外诱变箱门，将盛有混匀的藻液的培养皿(不盖皿盖，敞开诱变)放到诱变室内，关上紫外诱变箱门，打开电源，打开254nm紫外灯，紫外连续诱变8min，或紫外诱变8min，4min混匀一次。

g)暗处理：诱变后，盖上培养皿盖，将整个培养皿移至一纸箱，封好纸箱使纸箱内部呈黑暗的环境，置25℃下暗处理24h。

h)光培养：将暗处理后的藻液(培养皿)置于光照强度为3，000lx，光照周期16/8h，培养室温度25℃培养1周。

5)诱变藻种筛选

a)将光培养一周的藻液接入50％的污水(终浓度为50％的盐碱污水，下同)中培养，光照强度为3，000lx，光照周期16/8h，培养20～30天，将能存活且长势较好的藻挑出。

b)将挑选的长势较好的诱变藻，继代到60％污水中培养，光照强度为3，000lx，光照周期16/8h，培养20～30天，将能存活且长势较好的藻挑出。

c)挑选长势较好的诱变藻，继代到70％和80％污水中培养，光照强度为3，000lx，光照周期16/8h，培养20～30天，跟踪、统计生长情况。

d)在70％污水或80％污水长势良好的藻液，获得的盐碱污水耐受藻种T1-2、XH1、XH2，保种。

6)耐污性能测试。

将诱变后并经过筛选获得的藻种T1-2、XH1、XH2和出发藻种BO09分别投入到BG11、30％、50％、60％的污水中培养(三个平行实验)，定期测定小球藻的OD₆₈₀值，绘制生长曲线，获得诱变藻和出发藻种在不同污水中的生长速度、生长曲线及所能达到的最高密度，以鉴定诱变藻的耐污性能。测试结果为：T1-2、XH1、XH2藻种具有较好的耐污性能，特别是在高浓度污水(50％、60％)中具有明显的耐污性能。其中，在低浓度30％的污水中具有明显的生长速度优势。图1～图4，表3～表7是T1-2、XH1、XH2和BD09在BG11、30％、50％、 60％的生长曲线图及相关数据及分析。

表3：T1-2、XH1、XH2和BD09在BG11中生长情况

培养天数	BD09	T1-2	XH1	XH2
					2	0.6113333	0.507333	0.5686667	0.53
4	0.9493333	0.815333	0.8653333	0.8193333
					7	1.506	1.334	1.377	1.29
9	1.903	1.617	1.6736667	1.61
					11	2.315	1.919	1.926	1.991
15	2.8466667	2.258667	2.3933333	2.4866667
					18	3.4613333	2.621333	2.6693333	2.8453333
21	4.0116667	2.911667	3.0983333	3.2333333
					23	4.2783333	3.065	3.225	3.4766667
25	4.3783333	3.02	3.2916667	3.3716667
					28	4.805	3.151667	3.56	3.5983333
30	5.136	3.12	3.63	3.586
					32	5.314	3.052	3.638	3.4

T1-2、XH1、XH2和BD09在BG11中生长情况如图1所示。

T1-2、XH1、XH2在生长速度及所能达到的藻细胞密度均不如BD09。诱变藻T1-2、XH1、 XH2反而不适于在BG11中生长。

表4：T1-2、XH1、XH2和BD09在30％污水中生长情况

培养天数	BD09	T1-2	XH1	XH2
					2	0.758667	0.592	0.59	0.695333
4	0.992667	1.016667	1.001333	1.080667
					7	1.507	1.634	1.578	1.616
9	1.486	1.823	1.748	1.757
					11	1.805	2.415	2.31	2.268
15	2.150667	3.326667	3.052	2.917333
					18	2.465	4.008333	3.661667	3.556667
21	2.766667	4.458333	4.093333	3.926667
					23	3.116	5.036	4.532	4.462
25	3.482	5.244	4.752	4.738
					28	4.366	5.94	5.406	5.288
30	4.941333	6.373333	5.826667	5.664
					32	5.461333	6.629333	6.048	5.917333

T1-2、XH1、XH2和BD09在30％污水生长情况如图2所示。

30％的污水是T1-2、XH1、XH2最适生长的浓度。T1-2、XH1、XH2比BD09具有更快的生长速度。培养13天，T1-2、XH1、XH2藻细胞沉降，培养体系上层液澄清透亮，BD09 悬浮、藻液浑浊；培养23天后T1-2、XH1、XH2生长速度变缓而BD09保持比较快的生长速度考虑是T1-2、XH1、XH2前期的快速生长已将营养物质具有较大较完全的消耗。

表5：T1-2、XH1、XH2和BD09在50％污水中生长情况

T1-2、XH1、XH2和BD09在50％污水生长情况如图3所示。

50％的污水中培养11天起，BD09基本完全死亡，T1-2、XH1、XH2培养前28天，藻液呈深绿色，藻液状态良好。

表6：T1-2、XH1、XH2和BD09在60％污水中生长情况

培养天数	BD09	T1-2	XH1	XH2
					2	0.314	0.077333	0.282	0.719333
4	1.041333	0.646	0.783333	0.89
					7	0.888	0.85	0.959	1.073
9	0.795	0.893	0.984	1.072
					11	0.623	1.038	1.153	1.299
15	0.364	1.17	1.268	1.457
					18	0.277	1.293	1.414	1.584
21	0.372	1.361	1.489	1.647
					23	0.294	1.362	1.507	1.705
25	0.271	1.337	1.584	1.724
					28	0.24	1.288	1.691	1.837
30	0.217	1.423667	1.863667	2.028667
					32	0.23	1.578667	1.980333	2.172

T1-2、XH1、XH2和BD09在60％污水生长情况如图4所示。

60％污水培养11天起，BD09基本完全死亡。培养前32天，T1-2、XH1、XH2呈绿色，长势良好。

7)耐污藻种分离纯化及保藏

a)配置50％污水板(取500mL污水和500mL自来水混匀，加15g琼脂粉，121℃高压蒸汽灭菌20min后，待温度降至约60℃时加入卡那霉素和头孢噻肟，终浓度均为50mg/L，倒平板待用)(注：BD09及绝大部分的小球藻对卡那霉素和头孢噻肟不敏感)。

b)超净台中无菌操作吸取20μL藻液涂布于配置好的50％污水板，3，000lx，16/8h，25℃，培养约10～20d长出单藻落，再次挑起单藻落溶于1mL无菌水中，吸取20μL再次涂布于配置好的50％污水板中培养。如此几次，直至完全分离纯化得到无菌的耐污藻种。

c)上述获得的藻种置于25℃保藏。

此外，为了便于理解，发明人将上述获得耐污藻种的流程总结于图5中。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims

1.一种小球藻(Chlorela sp.)XH2，于2017年11月22日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2017716；或

一种小球藻(Chlorela sp.)T1-2，于2017年11月22日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2017717；或

一种小球藻(Chlorela sp.)XH1，于2017年11月22日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2017718。

2.权利要求1所述的小球藻在处理养猪场污水中的用途。

3.一种处理养猪场污水的方法，其特征在于，包括：

向养猪场污水中投放权利要求1所述的小球藻。