CN109967143B - 一种基于微流控显微系统的细胞大小检测方法 - Google Patents
一种基于微流控显微系统的细胞大小检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种基于微流控显微系统的细胞大小检测方法，将细胞稀释液通入微通道中，对图像采集软件采集到的单帧主通道的细胞初始图像进行捕获；然后对于捕获到的细胞初始图像，通过图像处理的方法对图像中的细胞进行分割得到单个细胞图像；最后基于分割出来的所有单个细胞图像统计细胞大小并且并绘制大小分布图，得到细胞大小的检测结果。本发明减小了算法对细胞大小检测带来的误差，增加了细胞大小检测的准确度，并且填补了利用基于微流控技术的无透镜显微系统进行细胞大小统计的空白，使得能够应用微流控系统进行细胞大小检测，尤其是对红细胞的大小检测能够为贫血类血液疾病的诊断提供参考。
Description
技术领域
本发明属于细胞检测分析技术领域，具体涉及一种基于微流控显微系统的细胞大小检测方法。
背景技术
血细胞检测在医学研究及临床分析上占有很重要的地位。传统的血细胞检测分析主要依赖于流式细胞仪和光学显微镜，两种方法所需要的检测仪器体积大，价格昂贵，并且后者还需要专业的医疗人员对血细胞图像进行观察，医疗成本高并且不利于在医疗条件艰苦的偏远地区或者野外对血细胞进行检测与分析。近年来微流控技术发展迅速，由于微流控检测芯片具有样品消耗少、吞吐量大、检测速度快、操作简便、多功能集成、体积小和便于携带等优点，为血细胞的检测分析提供了新的方向。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于微流控显微系统的细胞大小检测方法，能够对细胞大小分布进行准确统计，达到细胞检测目的。
本发明所采用的技术方案是，一种基于微流控显微系统的细胞大小检测方法，包括以下步骤：
步骤1)搭建微流控显微系统；
步骤2)准备细胞的观察环境，通过微流控显微系统采集细胞初始图像；
步骤3)对细胞初始图像依次进行去噪、裁剪背景，得到只包含细胞区域的粗裁剪细胞图像；
步骤4)利用最大类间差法将粗裁剪细胞图像的背景与细胞进行二值化分割，得到二值细胞图像；
步骤5)通过连通组件标记算法标记二值细胞图像中细胞的连通区域，并通过几何矩算法求取各细胞的质心位置；
步骤6)按照细胞初始图像中细胞的平均尺寸设定单个细胞的图像尺寸，在各细胞质心位置依照单个细胞的图像尺寸裁剪，得到单个细胞图像；
步骤7)通过基于梯度的边缘检测算法提取单个细胞图像的细胞边缘，根据提取的细胞边缘统计细胞边缘内像素的数量，将像素数量作为该细胞的大小，对采集到的所有细胞的大小进行统计并绘制大小分布图，得到细胞大小的检测结果。
本发明的特点还在于，
步骤1)中微流控显微系统包括微流控芯片，微流控芯片内部设置有三叉形微通道，三叉形微通道包括直线型主通道，主通道一端设置有样品入口，主通道另一端设置有样品出口，靠近主通道的样品入口端两侧对称设置有副通道，副通道一端设置有鞘液入口，副通道另一端与主通道连通，微流控芯片下表面设置有CMOS图像传感器，CMOS图像传感器连接有上位机PC，微流控芯片上方设置有平行光源。
步骤2)具体按照以下步骤实施：
步骤2.1)由样品入口向主通道注入细胞稀释液，由鞘液入口向副通道注入鞘液，并用微泵分别同时控制细胞稀释液和鞘液的流速，使得细胞聚集在主通道中间层部分，细胞实现匀速平稳的直线运动后细胞的观察环境准备完成。
步骤2.2)细胞的观察环境准备完成后保持细胞的运动状态，设置CMOS图像传感器的曝光时间和光源亮度，通过上位机PC中的图像采集软件设置CMOS图像传感器的细胞图像的捕获时间间隔，CMOS图像传感器根据捕获时间间隔采集细胞初始图像。
图像采集软件为AMCAP，步骤2)-7)均采用matlab软件实施。
细胞图像的捕获时间间隔为5s-8s。
步骤3)具体按照以下步骤实施：
步骤3.1)通过对细胞初始图像进行形态学操作将捕获到的单帧细胞初始图像中的噪点消除，形态学操作为膨胀和腐蚀，得到去噪细胞图像；
步骤3.2)用Sobel算子对每帧去噪细胞图像进行边缘检测，检测主通道的位置，根据主通道的位置裁减掉主通道边缘及其之外的背景，得到粗裁剪细胞图像。
步骤4)具体为，利用最大类间差法根据每帧粗裁剪细胞图像上所有像素点的灰度值计算该帧粗裁剪细胞图像的最佳灰度阈值，将该帧粗裁剪细胞图像的像素点灰度阈值设置为最佳灰度阈值对该帧粗裁剪细胞图像进行二值化，得到二值细胞图像。
最佳灰度阈值的计算过程如下：
设细胞与背景的分割阈值为w时，前景点即细胞占粗裁剪细胞图像比例为h0，细胞的灰度均值为k0，背景点占图像比例为h1，背景点的灰度均值为k1，则整幅图像的灰度均值为k＝h0*k0+h1*k1，令目标函数为g(w)＝h0*(k0-k)2+h1*(k1-k)2，目标函数g(w)取得最大值时对应的分割阈值w即为所求的最佳灰度阈值。
步骤5)具体按照以下步骤实施：
步骤5.1)扫描二值细胞图像，并扫描细胞每个像素点相邻的四邻域像素点的灰度值，对灰度值相同的像素点进行标记，标记得到细胞的连通区域。
步骤5.2)计算细胞的连通区域内像素的一阶矩，一阶矩即为对应的细胞连通区域的质心位置。
步骤7)中通过基于梯度的边缘检测算法提取单个细胞图像的细胞边缘。具体为，根据基于梯度的边缘检测算法，计算单个细胞图像各个像素点在不同方向的梯度，以梯度最大值作为该像素点的灰度梯度，然后将整幅单个细胞图像所有像素点的平均梯度幅值与所有像素点相对于梯度均值的方差之和作为梯度阈值，梯度大于梯度阈值的像素点为边缘像素，从而提取出细胞边缘。
本发明的有益效果是：
本发明一种基于微流控显微系统的细胞大小检测方法，针对无透镜显微系统所采集的低分辨率红细胞图像，基于统计的思想与图像处理算法相结合的方法对红细胞大小进行检测，减小了算法对细胞大小检测带来的误差，增加了细胞大小检测的准确度，并且填补了利用基于微流控技术的无透镜显微系统进行细胞大小统计的空白，使得能够应用微流控系统进行细胞大小检测，尤其是对红细胞的大小检测能够为贫血类血液疾病的诊断提供参考。
附图说明
图1是本发明一种基于微流控显微系统的细胞大小检测方法步骤1中的微流控显微系统的结构示意图；
图2是本发明一种基于微流控显微系统的细胞大小检测方法步骤1中微流控显微系统中微流控芯片的结构示意图；
图3是本发明一种基于微流控显微系统的细胞大小检测方法实施例中的单个红细胞图像；
图4是本发明一种基于微流控显微系统的细胞大小检测方法实施例中红细胞大小分布图。
图中，1.微流控芯片，2.主通道，3.样品入口，4.样品出口，5.副通道，6.鞘液入口，7.CMOS图像传感器，8.平行光源，9.微泵。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行详细说明。
本发明一种基于微流控显微系统的细胞大小检测方法，包括以下步骤：
步骤1)搭建微流控显微系统，如图1所示，微流控显微系统包括微流控芯片1，微流控芯片1内部设置有三叉形微通道，如图2所示，三叉形微通道包括直线型主通道2，主通道2一端设置有样品入口3，主通道2另一端设置有样品出口4，靠近主通道2的样品入口3端两侧对称设置有副通道5，副通道5一端设置有鞘液入口6，副通道5另一端与主通道2连通，微流控芯片1下表面设置有CMOS图像传感器7，CMOS图像传感器7连接有上位机PC，微流控芯片1上方设置有平行光源8，样品入口3、鞘液入口6均与微泵9相连接。
步骤2)准备细胞的观察环境，通过微流控显微系统采集细胞初始图像步骤2.1)由样品入口3向主通道2注入细胞稀释液，由鞘液入口6向副通道5注入鞘液，并用微泵9分别同时控制细胞稀释液和鞘液的流速，使得细胞聚集在主通道2中间层部分，细胞实现匀速平稳的直线运动后细胞的观察环境准备完成。
步骤2.2)细胞的观察环境准备完成后保持细胞的运动状态，设置CMOS图像传感器7的曝光时间和光源亮度，通过上位机PC中的图像采集软件设置CMOS图像传感器7的细胞图像的捕获时间间隔5s-8s，CMOS图像传感器7根据捕获时间间隔采集细胞初始图像。
步骤3)对细胞初始图像依次进行去噪、裁剪背景，得到只包含细胞区域的粗裁剪细胞图像
步骤3.1)通过对细胞初始图像进行形态学操作将捕获到的单帧细胞初始图像中的噪点消除，形态学操作为膨胀和腐蚀，得到去噪细胞图像。
步骤3.2)用Sobel算子对每帧去噪细胞图像进行边缘检测，检测主通道2的位置，根据主通道2的位置裁减掉主通道2边缘及其之外的背景，得到粗裁剪细胞图像。
步骤4)利用最大类间差法将粗裁剪细胞图像的背景与细胞进行二值化分割，得到二值细胞图像，
步骤4)具体为，利用最大类间差法根据每帧粗裁剪细胞图像上所有像素点的灰度值计算该帧粗裁剪细胞图像的最佳灰度阈值，将该帧粗裁剪细胞图像的像素点灰度阈值设置为最佳灰度阈值对该帧粗裁剪细胞图像进行二值化，得到二值细胞图像。
最佳灰度阈值的计算过程如下：
设细胞与背景的分割阈值为w时，前景点即细胞占粗裁剪细胞图像比例为h0，细胞的灰度均值为k0，背景点占图像比例为h1，背景点的灰度均值为k1，则整幅图像的灰度均值为k＝h0*k0+h1*k1，令目标函数为g(w)＝h0*(k0-k)2+h1*(k1-k)2，目标函数g(w)取得最大值时对应的分割阈值w即为所求的最佳灰度阈值。
步骤5)通过连通组件标记算法标记二值细胞图像中细胞的连通区域，并通过几何矩算法求取各细胞的质心位置；
步骤5.1)扫描二值细胞图像，并扫描细胞每个像素点相邻的四邻域像素点的灰度值，对灰度值相同的像素点进行标记，标记得到细胞的连通区域；
步骤5.2)计算细胞的连通区域内像素的一阶矩，一阶矩即为对应的细胞连通区域的质心位置。
步骤6)按照细胞初始图像中实际的单细胞尺寸的最大值设定单个细胞的图像尺寸，在各细胞质心位置依照单个细胞的图像尺寸裁剪，得到单个细胞图像。
步骤7)通过基于梯度的边缘检测算法提取单个细胞图像的细胞边缘，根据提取的细胞边缘统计细胞边缘内像素的数量，将像素数量作为该细胞的大小，对采集到的所有细胞的大小进行统计并绘制大小分布图，得到细胞大小的检测结果。
步骤7)中通过基于梯度的边缘检测算法提取单个细胞图像的细胞边缘具体为，根据基于梯度的边缘检测算法，计算单个细胞图像各个像素点在不同方向的梯度，以梯度最大值作为该像素点的灰度梯度，然后将整幅单个细胞图像所有像素点的平均梯度幅值与所有像素点相对于梯度均值的方差之和作为梯度阈值，梯度大于梯度阈值的像素点为边缘像素，从而提取出细胞边缘。
图像采集软件为AMCAP，步骤2)-7)均采用matlab软件实施。
实施例
本实施例提供一种基于微流控显微系统的细胞大小检测方法，包括以下步骤：
步骤1)搭建微流控显微系统，微流控显微系统包括微流控芯片1，微流控芯片1内部设置有三叉形微通道，三叉形微通道包括直线型主通道2，主通道2一端设置有样品入口3，主通道2另一端设置有样品出口4，靠近主通道2的样品入口3端两侧对称设置有副通道5，副通道5一端设置有鞘液入口6，副通道5另一端与主通道2连通，微流控芯片1下表面设置有CMOS图像传感器7，CMOS图像传感器7连接有上位机PC，微流控芯片1上方设置有平行光源8，样品入口3、鞘液入口6均与微泵9相连接。
步骤2)准备红细胞的观察环境，通过微流控显微系统采集红细胞初始图像。
步骤2.1)由样品入口3向主通道2注入红细胞稀释液，由鞘液入口6向副通道5注入鞘液，并用微泵9分别同时控制红细胞稀释液和鞘液的流速，使得红细胞聚集在主通道2中间层部分，红细胞实现匀速平稳的直线运动后细胞的观察环境准备完成；红细胞稀释液由已知正常无贫血类血液疾病的血液样本进行离心并且分离出红细胞，然后稀释得到。
步骤2.2)红细胞的观察环境准备完成后保持细胞的运动状态，设置CMOS图像传感器7的曝光时间和光源亮度，通过上位机PC中的图像采集软件AMCAP设置CMOS图像传感器7的细胞图像的捕获时间间隔5s-8s，CMOS图像传感器7根据捕获时间间隔采集红细胞初始图像。
步骤3)对红细胞初始图像依次进行去噪、裁剪背景，得到只包含红细胞区域的粗裁剪细胞图像。
步骤3.1)通过对红细胞初始图像进行形态学操作将捕获到的单帧细胞初始图像中的噪点消除，形态学操作为膨胀和腐蚀，得到去噪红细胞图像；
步骤3.2)用Sobel算子对每帧去噪红细胞图像进行边缘检测，检测主通道2的位置，根据主通道2的位置裁减掉主通道2边缘及其之外的背景，得到粗裁剪红细胞图像。
步骤4)利用最大类间差法将粗裁剪红细胞图像的背景与红细胞进行二值化分割，得到二值红细胞图像。
步骤4)具体为，利用最大类间差法根据每帧粗裁剪红细胞图像上所有像素点的灰度值计算该帧粗裁剪红细胞图像的最佳灰度阈值，将该帧粗裁剪红细胞图像的像素点灰度阈值设置为最佳灰度阈值对该帧粗裁剪红细胞图像进行二值化分割，得到二值红细胞图像。
步骤5)通过连通组件标记算法标记二值红细胞图像中红细胞的连通区域，并通过几何矩算法求取各红细胞的质心位置。
步骤5.1)扫描二值红细胞图像，并扫描红细胞每个像素点相邻的四邻域像素点的灰度值，对灰度值相同的像素点进行标记，标记得到红细胞的连通区域。
步骤5.2)计算红细胞的连通区域内像素的一阶矩，一阶矩即为对应的红细胞连通区域的质心位置。
步骤6)按照细胞初始图像中实际的单细胞尺寸的最大值设定单个细胞的图像尺寸，在各红细胞质心位置依照单个细胞的图像尺寸裁剪，得到单个红细胞图像，如图3所示。
步骤7)通过基于梯度的边缘检测算法提取单个红细胞图像的细胞边缘，根据提取的细胞边缘统计细胞边缘内像素的数量，将像素数量作为该细胞的大小，对采集到的所有红细胞的大小进行统计并绘制大小分布图，如图4所示，图中横坐标为红细胞像素数量，纵坐标为红细胞数量，得到红细胞大小的检测结果。
由图4可以观察到，该血液中红细胞的像素数量分布有一个明显的范围220-300，此范围较集中、不分散，没有其他的集中区域出现，因此可以说明此血液中红细胞大小较集中，没有出现较多大红细胞或者其他异常尺寸的红细胞，初步说明此血液样本无贫血类血液疾病，这与实际样本血液的情况相符。因此本发明一种基于微流控显微系统的细胞大小检测方法被证实准确有效，并且可以对贫血类血液疾病的诊断提供初步的参考。
Claims (9)
1.一种基于微流控显微系统的细胞大小检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1)搭建微流控显微系统；
步骤2)准备细胞的观察环境，通过微流控显微系统采集细胞初始图像；
步骤3)对细胞初始图像依次进行去噪、裁剪背景，得到只包含细胞区域的粗裁剪细胞图像；
步骤4)利用最大类间差法将粗裁剪细胞图像的背景与细胞进行二值化分割，得到二值细胞图像；
步骤5)通过连通组件标记算法标记二值细胞图像中细胞的连通区域，并通过几何矩算法求取各细胞的质心位置；
步骤6)按照细胞初始图像中实际的单细胞尺寸的最大值设定单个细胞的图像尺寸，在各细胞质心位置依照单个细胞的图像尺寸裁剪，得到单个细胞图像；
步骤7)通过基于梯度的边缘检测算法提取单个细胞图像的细胞边缘，根据提取的细胞边缘统计细胞边缘内像素的数量，将像素数量作为该细胞的大小，对采集到的所有细胞的大小进行统计并绘制大小分布图，得到细胞大小的检测结果。
2.根据权利要求1所述的一种基于微流控显微系统的细胞大小检测方法，其特征在于，所述步骤1)中微流控显微系统包括微流控芯片，所述微流控芯片内部设置有三叉形微通道，所述三叉形微通道包括直线型主通道，所述主通道一端设置有样品入口，所述主通道另一端设置有样品出口，所述靠近主通道的样品入口端两侧对称设置有副通道，所述副通道一端设置有鞘液入口，所述副通道另一端与主通道连通，所述微流控芯片下表面设置有CMOS图像传感器，所述CMOS图像传感器连接有上位机PC，所述微流控芯片上方设置有平行光源。
3.根据权利要求2所述的一种基于微流控显微系统的细胞大小检测方法，其特征在于，所述步骤2)具体按照以下步骤实施：
步骤2.1)由样品入口向主通道注入细胞稀释液，由鞘液入口向副通道注入鞘液，并用微泵分别同时控制细胞稀释液和鞘液的流速，使得细胞聚集在主通道中间层部分，细胞实现匀速平稳的直线运动后细胞的观察环境准备完成；
步骤2.2)细胞的观察环境准备完成后保持细胞的运动状态，设置CMOS图像传感器的曝光时间和光源亮度，通过上位机PC中的图像采集软件设置CMOS图像传感器的细胞图像的捕获时间间隔，CMOS图像传感器根据捕获时间间隔采集细胞初始图像。
4.根据权利要求3所述的一种基于微流控显微系统的细胞大小检测方法，其特征在于，所述细胞图像的捕获时间间隔为5s-8s。
5.根据权利要求1所述的一种基于微流控显微系统的细胞大小检测方法，其特征在于，所述步骤3)具体按照以下步骤实施：
步骤3.1)通过对细胞初始图像进行形态学操作将捕获到的单帧细胞初始图像中的噪点消除，所述形态学操作为膨胀和腐蚀，得到去噪细胞图像；
步骤3.2)用Sobel算子对每帧去噪细胞图像进行边缘检测，检测主通道的位置，根据主通道的位置裁减掉主通道边缘及其之外的背景，得到粗裁剪细胞图像。
6.根据权利要求1所述的一种基于微流控显微系统的细胞大小检测方法，其特征在于，所述步骤4)具体为，利用最大类间差法根据每帧粗裁剪细胞图像上所有像素点的灰度值计算该帧粗裁剪细胞图像的最佳灰度阈值，将该帧粗裁剪细胞图像的像素点灰度阈值设置为最佳灰度阈值对该帧粗裁剪细胞图像进行二值化分割，得到二值细胞图像。
7.根据权利要求6所述的一种基于微流控显微系统的细胞大小检测方法，其特征在于，所述最佳灰度阈值的过程如下：
设细胞与背景的分割阈值为w时，前景点即细胞占粗裁剪细胞图像比例为h0，细胞的灰度均值为k0，背景点占图像比例为h1，背景点的灰度均值为k1，则整幅图像的灰度均值为k＝h0*k0+h1*k1，令目标函数为g(w)＝h0*(k0-k)2+h1*(k1-k)2，目标函数g(w)取得最大值时对应的分割阈值w即为所求的最佳灰度阈值。
8.根据权利要求1所述的一种基于微流控显微系统的细胞大小检测方法，其特征在于，所述步骤5)具体按照以下步骤实施：
步骤5.1)扫描二值细胞图像，并扫描细胞每个像素点相邻的四邻域像素点的灰度值，对灰度值相同的像素点进行标记，标记得到细胞的连通区域；步骤5.2)计算细胞的连通区域内像素的一阶矩，一阶矩即为对应的细胞连通区域的质心位置。
9.根据权利要求1所述的一种基于微流控显微系统的细胞大小检测方法，其特征在于，所述步骤7)中通过基于梯度的边缘检测算法提取单个细胞图像的细胞边缘具体为，根据基于梯度的边缘检测算法，计算单个细胞图像各个像素点在不同方向的梯度，以梯度最大值作为该像素点的灰度梯度，然后将整幅单个细胞图像所有像素点的梯度均值与所有像素点相对于梯度均值的方差之和作为梯度阈值，梯度大于梯度阈值的像素点为边缘像素，从而提取出细胞边缘。
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